DE2746275A1 - Adsorptionsmittel fuer proteine, ihre verwendung und dabei gewonnene verbundmaterialien - Google Patents

Adsorptionsmittel fuer proteine, ihre verwendung und dabei gewonnene verbundmaterialien

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DE2746275A1 DE19772746275 DE2746275A DE2746275A1 DE 2746275 A1 DE2746275 A1 DE 2746275A1 DE 19772746275 DE19772746275 DE 19772746275 DE 2746275 A DE2746275 A DE 2746275A DE 2746275 A1 DE2746275 A1 DE 2746275A1
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Description

VONKREISLER SCHÖNWALD MEYER EISHOLD FUES VONKREISLER KELLER SELTINtS' 4 b l
PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler -J- 1973
Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln
Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln
Dr.-Infj. K. W. Eishold, Bad Soden
Dr. J. F. Fuüs, Köln
Dipl.-Chem. AIek von Kreisler, Köln
Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln
Dipl.-Im). G. Selling, Köln
5 Köln 1 14· Okt· 1977/Fu/Ax
ÜHaiMANNHAU) AM HAUP1KAIINHOF
Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha,
25-1, Dojima-hama-dori 1-chome, Kita-ku, Osaka-shi,
Osaka, Japan
Adsorptionsmittel für Proteine, ihre Verwendung und dabei gewonnene Verbundmaterialien.
8098 1 8/0732
: 10221) 23 4541 - 4 Telex- 838^307 dopo d ■ Ti-Iciiroinm ■ Dompaltnt Köln
Die Erfindung betrifft ein neues Adsorptionsmittel für Proteine, das aus einem porösen Copolymerisat eines speziellen, Cyangruppen enthaltenden Monomeren mit einem vernetzbaren Monomeren besteht und durch den speziellen Bereich des mittleren Porendurchmessers und durch sein spezielles ! Gesamtporenvolumen gekennzeichnet ist, wodurch sein Adsorptionsvermögen für Proteine erheblich gesteigert werden I kann. '
i Proteine werden bekanntlich an verschiedenen Stoffen, ζ. Β.
anorganischen Substanzen wie Aktivkohle, Kieselsäureanhydrid, Celite, Aluminiumoxyd, Kieselgel, Hydroxyapatit, Calciumphosphat und Magnesiumsilicat, und natürlichen polymeren Substanzen wie Stärke, Gluten und Inulin physikalisch adsorbiert. Diese Substanzen werden in der Praxis zur Klärung von proteinhaltigen Flüssigkeiten, zur Entfernung i von in sehr geringen Mengen vorliegenden Proteinen und zur j
Reinigung oder Trennung von Proteinen verwendet. Es besteht jedoch die Tatsache, daß die Anwendungsbereiche der vorstehend genannten Adsorptionsmittel aus verschiedenen Gründen erheblich begrenzt sind. Beispielsweise weisen diese, Substanzen häufig spezielle Eigenschaften gegenüber Prote- | inen, z. B. eine begrenzte Selektivität auf. Außerdem unterliegen die Lösungsbedingungen, z. B. der pH-Wert und dergleichen bei der Adsorption, für die sie verwendet werden, Begrenzungen. Ferner verursachen sie gelegentlich eine chemische Reaktion mit gewissen Proteinen oder Substanzen, mit denen sie gleichzeitig vorliegen, und einige dieser Adsorptionsmittel haben ungenügende mechanische Festigkeit.
Angesichts dieses Standes der Technik wurden von der Anmelderin Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, ein vielseitiges Adsorptionsmittel für Proteine zu entwickeln. Als Ergebnis wurde gefunden, daß ein poröses Copolymerisat vom Polyacrylnitriltyp die Fähigkeit hat, die verschiedensten Proteine in großen Mengen zu adsorbieren. Der Erfindung liegt diese Feststellung zu Grunde.
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Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Adsorptionsmittel für Proteine, das im wesentlichen aus einem porösen Polymerisat besteht, das hergestellt worden ist durch Copolymerisation eines Monomerengemisches aus 2 bis 98 Gewr% wenigstens eines Cyangruppen enthaltenden Monomeren der allgemeinen Formel
CN '
CH2=\ (A)
R 10
in der R ein Wasserstoffatom, ein Alkylrest mit 1 bis 1o C-Atomen, ein Hologenatom, eine Cyangruppe, ein Methoxyrest, ein Acetoxyrest oder ein unsubstituierter oder substituierter Phenylrest der Formel
\—yL. Ri ι
ist (worin R' Wasserstoff, ein Alkylrest mit 1 bis IO
C-Atomen, ein Halogenatom, eine Cyangruppe, j
ein Methoxyrest oder Acetoxyrest ist, und 2-98 Gew.-%wenigstens eines vernetzbaren Monomeren, wobei das Copolymerisat einen mittleren Porendurchmesser !
(d) von 4o bis 9.ooo A und ein Gesamtporenvolumen von ; o,o5 »X ml bis 1,5 s/5T" ml/Gramm Copolymerisat im trocke- j nen Zustand hat, worin X der Gewichtsanteil des vernetz- ! baren Monomeren in Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmonomeren,
bezeichnet.
Wie nachstehend ausführlicher dargelegt werden wird, hat das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung eine äußerst poröse Stuktur und die Fähigkeit, die verschiedensten Proteine in großen Mengen zu adsorbieren. Ferner ist das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung chemisch stabil und zersetzt Proteine nicht. Außerdem weist es eine ausgezeichnete mechanische Festigkeit auf. Bei Verwendung des Protein-Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung kann daher das Adsorptionsverfahren erheblich vereinfacht und erleichtert und leicht im großtechnischen Maßstab durchge-
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führt werden. Ferner läßt sich das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung leicht herstellen. Dies sind · Vorteile des Protein-Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung gegenüber den vorstehend genannten üblichen Adsorptionsmitteln für Proteine.
Als spezielle Beispiele von Cyangruppen enthaltenden ■ Monomeren der allgemeinen Formel (A), die eine wieder- | kehrende Einheit des Copolymerisats des Protein-Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung darstellen, seien genannt:
Acrylnitril, Methacrylnitril, a-Chloracfylnitril, Vinylidencyanid, cc-Bromacrylnitril, a-Fluoracrylnitril, a-Methoxyacrylnitril, a-Acetoxyacrylnitril, a-Äthylacrylnitril, a-Isopropylacrylnitril, a-n-Amylacrylnitril, a-Phenylacrylnitril, a-(Methoxyphenyl)acrylnitrile, a-Tolyl- !
acrylnitrile, a-(Chlorphenyl)acrylnitrile, oc-(Cyanphenyl)· j acrylnitrile, a-n-Hexylacrylnitril und a-Neopentylacryl- j nitril. Diese Monomeren können allein oder in Mischung I verwendet werden. Der Gehalt an Cyangruppen enthaltendem I Monomerem im Copolymeren beträgt 2 bis 98%, vorzugsweise | 4 bis 95%, wobei ein Gehalt von 6 bis 90 Gew.-% ;
besonders bevorzugt wird. |
Der bevorzugte Gehalt des Cyangruppen enthaltenden Monomeren hängt weitgehend von denEigenschaften eines zu adsorbierenden Proteins oder einer Lösung, die ein zu adsorbierendes Protein enthält, ab. Wenn jedoch der Anteil des Cyangruppen enthaltenden Monomeren zu hoch ist, wird im allgemeinen der Vernetzungsgrad verringert, wodurch sich Nachteile wie Instabilität der Porenstuktur, übermäßiges Quellen oder Schrumpfen und Verschlechterung der mechanischen Festigkeit ergeben. Wenn andererseits der Anteil des Cyangruppen enthaltenden Monomeren zu niedrig ist, kann keine ausreichende Adsorptionswirkung im erhaltenen Adsorptionsmittel erreicht werden. Demgemäß ist die Verwendung einer zu großen oder einer zu kleinen Menge des Cyangruppen enthaltenden Monomeren zu vermeiden.
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Das Copolymerisat gemäß der Erfindung kann auch ein oder
mehrere andere Monomere, die mit dem die Cyangruppe enthaltenden Monomeren copolymerisierbar sind, enthalten.
Als Beispiele solcher Monomerer seien genannt:
Kohlenwasserstoffverbindungen, z. B. Styrol, Methylstyrole, Äthylstyrole, Vinylnaphthaline, I
Butadien, Isopren und Piperylen, Styrolderivate, z. B. ; Chlorstyrole, Bromstyrole, N,N-Dimethylaminostyrole,
Nitrostyrole und Chlormethylaminostyrole, Vinylsulfid- ; derivate, z. B. Methylvinylsulfid , Phenylvinylsulfid,
Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure, Acrylsäureester,
z. B. Methylacrylat und Chlormethylacrylat, Methacrylsäureester z. B. Cylohexylmethacrylat, Dime thy laminoäthyl
methacrylat, Glycidylmethacrylat, Tetrahydrofurfurylmeth'-acrylat und Hydroxyäthylmethacrylat, Itaconsäureester, | z. B. Dimethylitaconat, Diäthylitaconat und Di-n-butyl- : itaconat, Vinylketone, z. B. Methylvinylketon und Äthylisopropenylketon, Vinylidenverbindungen, z. B. Vinyliden- ; chlorid und Vinylindenbromid, Acrylamidderivate, z. B. ' Acrylamid, N-Butoxymethylacrylamid und Ν,Ν-Dimethylamino- j äthylacrylamid, Vinylester von Fettsäuren, z. B. Vinyl- j acetat und Vinylcaprat, Thiofettsäurederivate, z. B. j Methylthioacrylat und Vinylthioacetat, und heterocyclische | Vinylverbindungen, z. 3. N-Vinylsuccinimid, N-Vinylpyrroli-j don, N-Vinylphthalimid, N-Vinylcarbazol, Vinylfurane, j Vinylimidazole, Methylvinylimidazole, Vinylpyrazole, | Vinyloxazolidone, Vinylthiazole, Vinylpyridine, Methylvinylpyridine und 2,4-Dimethyl-6-Vinyl-triazin.
Diese Monomeren können allein oder in Mischung verwendet
werden.
Der hier gebrauchte Ausdruck "vernetzbare Monomere" bezeichnet Monomere, die mehrere Gruppen der Formel
CH2=CC enthalten.
Als spezielle Beispiele vernetzbarer Monomerer, die die
andere wiederkehrende Einheit des Copolymerisats des
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-W-
Protein-Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung darstellen, seien genannt: Divinylbenzole, Divinyltoluole, Divinylxylole, Divinylnaphthaline, Divinyläthylbenzole, Trivinylbenzole, Divinyldiphenyle, Divinyldibenzyle, Divinylphenyläther, Divinyldiphenylamine, Divinylsulfon, \ Divinylketon, Divinylpyridine, Divinylchinoline, Diallylphthalat, Diallylmaleat, Diallylfumarat, Diallylcarbonat, Diallyloxalat, Diallyladipat, Diallyltartrat, Diallylamin, Triallylamin, Triallylphosphat, Triallyl- j tricarballylat, NjN'-Äthylendiacrylamid, N,N1-Methylen- ι dimethacrylamid, Äthylenglykoldimethacrylat, PoIyäthylenglykoldiraethacrylat, 1,3-Butylenglykoldimethacrylat^ Dipropylenglykoldimethacrylat, Polyäthylenglykoldiacrylat,i Polypropylenglykoldiacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat, Pentaerythrittetramethacrylat, 1,3-Butylenglykoldiycrylat,! Trimethylolpropantriacrylat, Pentaerythrittetraacrylat, j Triallylisocyanurat, 1,3,5-Triacryloylhexahydro-1,3,5-triazin und Diallylmelamin. Diese Monomeren werden allein oder in Mischung verwendet. Bevorzugt hiervon werden ο Monomere mit 2 bis 4 Vinylgruppen. Vernetzbare Monomere, beispielsweise Vernetzungsmittel vom Kohlenwasserstoffen?, z. B. Divinylbenzole, und Vernetzungsmittel vom Typ der Fettsäureester, z. B. Äthylenglykoldimethacrylat, werden besonders bevorzugt. Beispielsweise haben Vernetzungsmittel vom Fettsäureestertyp die folgende allgemeine Formel (B):
CH9 R ο R1
\ i2 Ii / x
C-C- O eCH - CH0 -O]—C-C (B)
/Il 2 n \
Rl ° CH2
Hierin stehen R. und Rp für ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest, und η ist eine ganze Zahl von 1 bis 3o. Der Anteil des vernetzbaren Monomeren beträgt 2 bis 98 %t vorzugsweise 5 - 9o %, wobei 8 bis 8o Gew.-% besonders bevorzugt werden.. V/enn der Gehalt an vßrnetzbarem
Monomerem zu niedrig ist, werden Quellung oder Schrumpfung in ungünstiger Weise verstärkt, während die mechanische 809818/0732
Festigkeit verschlechtert wird. Wenn andererseits der Gehalt an vernetzbarem Monomerem zu hoch ist und der Vernetzungsgrad übermäßig stark erhöht wird, wird die Geschwindigkeit der Diffusion eines Proteins in die Poren des Copolymerisats verringert.
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Das Copolymerisat, das das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung darstellt, hat eine Porenstruktur aus zahllosen Poren mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von 40 bis 9000 Ä, vorzugsweise von 50 bis 5000 8, wobei ein Durchmesser von 60 bis 3000 8 besonders bevorzugt wird. Wenn der mittlere Porendurchmesser zu klein ist, wird das Eindringen oder die Adsorption eines Proteins in die Poren des Copolymerisats unmöglich oder die Diffusionsgeschwindigkeit sehr stark verringert. Ein zu großer mittlerer Porendurchmesser hat Nachteile wie Verkleinerung der Oberfläche mit großem Einfluß auf das Adsorptionsvermögen und Verschlechterung der mechanischen Festigkeit zur Folge.
Die Verteilung des Porendurchmessers ist ebenfalls ein Faktor mit großem Einfluß auf das Adsorptionsvermögen. Bevorzugt wird ein Volumen der Poren mit einem Durchmesser von 0,5 d bis 2 d (wobei d der mittlere Porendurchmesser ist) von nicht mehr als 60%, insbesondere von nicht mehr als 50% des gesamten Porenvolumens. Zwar kann keine untere Grenze dieses Wertes festgelegt werden, da das Volumen der Poren mit einem Durchmesser, der sich dem mittleren Porendurchmesser nähert, natürlicherweise groß sein muß, jedoch muß die untere Grenze des genannten Wertes unbedingt 20% oder mehr betragen, und im allgemeinen liegt die untere Grenze bei 30%. Wie die nachstehende Beschreibung zeigt, hat das poröse Copolymerisat gemäß der Erfindung mit einer Verteilung des Porendurchmessers in einem solchen weiten Bereich ein sehr hohes Adsorptionsvermögen für Proteine.
Das Porenvolumen ist ferner ein Faktor mit großem Einfluß auf das Adsorptionsvermögen für Proteine. Speziell ist es im Rahmen der Erfindung unerlässlich, daß das gesamte Porenvolumen im Bereich von 0,05 \/X~ ml bis 1,5 V^ ml pro Gramm des trockenen Copolymerisats liegt, wobei X der Gewichtsanteil des vernetzbaren Monomeren in
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Gew.-% der Gesamtmonomeren ist und das gesamte Porenvolumen vorzugsweise im Bereich von 0,2 VX ml bis 1,3\/X~ ml pro Gramm des trockenen Polymerisats liegt. Wenn das Porenvolumen zu gering ist, steht keine ausreichende Oberfläche für die Adsorption zur Verfügung. Wenn das Porenvolumen zu groß ist, wird nicht nur die mechanische Festigkeit des Copolymerisats verschlechtert, sondern auch das Adsorptionsvermögen, d.h. die Proteinmenge, die pro Volumeneinheit des Copolymerisats adsorbiert werden kann, stark verringert. Im letzteren Fall neigt das Copolymerisat zu Deformierung, so daß bei Verwendung des Copolymerisats bei dem Säulenverfahren der Druckab- J fall häufig außergewöhnlich stark in einem solchen Maße steigt, daß eine Lösung des Proteins die Säule nicht zu
15 durchdringen vermag.
Nachstehend werden die Methoden beschrieben, die im Rahmen der Erfindung zur Bestimmung der Porencharakteristiken angewandt wurden.
Der mittlere Porendurchmesser, die Verteilung des Poren-ι durchmessers und das Porenvolumen werden unter Verwen— \ dung eines Quecksilber-Penetrationsporosimeters gemessen.
Hierbei wird Quecksilber unter steigendem Druck in die ;
i Poren des zu prüfenden porösen Materials gepreßt. Das I Porenvolumen wird aus der in den Poren der Probe ein- J geschlossenen Quecksilbermenge bestimmt. Der Poren- ί durchmesser wird auf der Grundlage des Prinzips berechnet, daß der Durchmesser einer Pore umgekehrt proportional dem Druck ist, der notwendig ist, um das Quecksilber in die Poren zu pressen. Diese Meßmethode wird ausführlieh in Kapitel 10 von "Fine Particle Measurement" von
Clyde Orr, Jr. und J.M.Dal lavalle (herausgegeben von | The Macmillan Company, New York 1959) und in "Industrial | and Engineering Chemistry" 17, Heft 12 (1945) 782-786 von H.L. Ritter und L.C.Drake beschrieben. Die Messung wurde grundsätzlich gemäß ANSI/ASTM D2873-7O (Reapproved 1976) unter Verwendung eines Quecksilber-Penetrations-
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porosimeters, Modell 905-1 (Hersteller Micromeritics Instrument Corporation, USA) durchgeführt. Die Werte des eingedrungenen Volumens wurden ermittelt, indem Quecksilber unter den in der folgenden Tabelle genannten Drücken in die Poren gepreßt wurde.
psi kg/cm
psi kg/cm
psi
kg/cm"
14,7 1,03 350 24,6 5000 352
20 1,4 450 31,6 7000 492
35 2,5 650 45,7 10000 703
45 3,2 850 59,8 15000 · 1055
85 6 1150 81 20000 1406
100 7 1500 105 30000 2109
125 8,8 2000 140 40000 2812
175 12,3 3000 211 50000 3515
250 17,6 4000 281
Mit Hilfe dieser Methode können sogar Poren mit einem j Porendurchmesser bis hinab zu 35 bis 40 A gemessen j werden. Im Rahmen der Erfindung bedeutet der Ausdruck | "Pore" eine mit der Außenseite des Copolymerisate in Verbindung stehende offene Pore mit einem Durchmesser von wenigstens 40 A, und das Porenvolumen wird für diese offenen Poren bestimmt. Die Penetrometerwerte wurden in Abhängigkeit vom absoluten Gesamtdruck auf halblogarithmischem Vierphasen-Koordinatenpapier gezeichnet, und die Punkte wurden mit einem Bogenlineal verbunden. Die erhaltene Kurve stellt ein Profil der scheinbaren Intervall-Porengrößenverteilung dar. Der "mittlere Porendurchmesser" wird als Wert von r definiert, mit dem ein maximaler Wert von dV/d log r in der erhaltenen Kurve erhalten wird, wobei r den Porendurchmesser und V das mit dem Quecksilber-Penetrationsporosimeter gemessene kumulative Porenvolumen bezeichnet; Im Rahmen der Erfindung wird das "gesamte Porenvolumen" als Volumen des Quecksilbers definiert, das während der
2 Zeit, in der der Quecksilberdruck von 3,93 kg/cm bis
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3515 kg/cm bei der Quecksilber-Penetrationsmethode erhöht wird, in die Poren einer Probe von 1 g des trockenen Copolymerisats gepreßt wird.
Das Schüttgewicht ist als weiterer Index oder Anhaltspunkt für die Porosität zu nennen. Im Rahmen der Erfindung wurde das Schüttgewicht nach der folgenden Methode bestimmt:
Eine Probe des Copolymerisats wurde in eine mit einem Glasfilter versehene Kolonne gefüllt, worauf genügend Wasser durch die Kolonne geleitet und das Volumen des mit der Probe gefüllten Teils der Kolonne gemessen wurde. Dann wurde die Probe ausreichend getrocknet und ; ihr Gewicht ermittelt. Das Schüttgewicht wurde durch ι Dividieren des Gewichts durch das Volumen berechnet.
Nachstehend wird eines der Verfahren zur Herstellung der als Adsorptionsmittel dienenden Copolymerisate gemäß der Erfindung beschrieben. j
Ein Verfahren zur Herstellung von hochporösen vernetzten Copolymerisaten wurde bereits beschrieben (siehe DT-PS j
(Patentanmeldung P 2 618 481.6), US-Patentan- ! meldung 677 120, britische Patentanmeldung 17 664/76 , und französische Patentanmeldung 76-11 919). Dieses Verfahren ist auf die Herstellung der porösen Copolymerisate gemäß der Erfindung wirksam anwendbar, d.h. das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung kann hergestellt werden durch Copolymerisation eines Mono— merengemisches aus 2 bis 98 Gew.-% wenigstens eines Cyangruppen enthaltenden Monomeren der allgemeinen Formel
,CN
30 CH2 = C (A)
worin R ein Wasserstoffatom, ein Alkylrest mit 1 bis 10
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C-Atomen, ein Halogenatom, eine Cyangruppe, ein Methoxyrest, ein Acetoxyrest oder ein unsubstituierter oder substituierter Phenylrest der Formel -/~~\ *st
worin R· ein Wasserstoffatom, ein Alkylrest mit 1 bis
10 C-Atomen, ein Halogenatom, eine Cyangruppe, ein ι
Methoxyrest oder ein Acetoxyrest ist , und 2 bis 98 j
Gew.-% wenigstens eines vernetzbaren Monomeren in !
Gegenwart eines organischen Mediums, das mit keinem der Monomeren reagiert und aus der folgenden Gruppe ausge- ; wählt ist: · ·
(I) ein gemischtes organisches Medium, das im wesent- \ liehen aus wenigstens einer aus Flüssigkeiten der j Gruppe (i) gewählten Flüssigkeit und wenigstens einer anderen, aus Flüssigkeiten der Gruppe (III)
15 gewählten Flüssigkeit besteht,
(II) ein gemischtes organisches Medium, das im wesentlichen aus wenigstens einer aus Flüssigkeiten der Gruppe (ii) gewählten Flüssigkeit und wenigstens einer anderen, aus Flüssigkeiten der Gruppe (iii)
20 gewählten Flüssigkeit besteht,
(III) ein organisches Medium, das aus einer aus Flüssigkeiten der Gruppe (iii) gewählten Flüssigkeit besteht und
(IV) ein gemischtes organisches Medium, das aus wenigstens zwei aus Flüssigkeiten der Gruppe (iii)
gewählten Flüssigkeiten besteht,
worin die Flüssigkeiten der Gruppe (i) alle Homopolymeren der gewählten Monomeren lösen,
die Flüssigkeiten der Gruppe (ii) keines der gewählten Homopolymeren lösen und
die Flüssigkeiten der Gruppe (iii) wenigstens ein Homopolymeres der gewählten Monomeren, aber wenigstens ein
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Αϊ
anderes Homopolymeres aus dem gewählten Monomeren nicht lösen.
Im Rahmen der Erfindung wird die folgende Methode zur Auswahl einer organischen Flüssigkeit angewandt:
Zu einer organischen Flüssigkeit werden 5 Gew.-% eines Monomeren und 0,1 Gew.-% 2,2-Azobisisobutyronitril gegeben. Die erhaltene Lösung wird in einem verschlossenen Glasrohr 8 Stunden bei der gleichen Temperatur, wie sie für die Polymerisationsreaktion gemäß der Erfindung anzuwenden ist, polymerisiert, worauf das Reaktionsgemisch beobachtet wird. Wenn das gebildete Polymerisat ausgefällt worden ist, wird die organische Flüssigkeit als "organische Flüssigkeit, die ein Homopolymeres des Monomeren nicht löst", bezeichnet. Wenn das gebildete Polymerisat in der organischen Flüssigkeit gelöst ist, wird die organische Flüssigkeit als "organische Flüssigkeit, die ein Homopolymeres des Monomeren löst", bezeichnet. Ferner wird bei einem als Monomeres verwendeten vernetzbaren Monomeren, das mehrere Gruppen der Formel CH- = C<C enthält, in Fällen, in denen das Reaktionsgemisch des gebildeten Polymerisats und die organische Flüssigkeit undurchsichtig ist, die organische Flüssigkeit als "organische Flüssigkeit, die ein Homopolymeres des Monomeren nicht löst", bezeichnet, und wenn das Reaktionsgemisch durchsichtig ist, wird die organische Flüssigkeit als "organische Flüssigkeit, die ein Homopolymeres des Monomeren löst", bezeichnet.
Die Löslichkeiten bestimmter Polymerisate in organischen Flüssigkeiten werden von J.Brandrup und E.H.Immergut in "Polymer Handbook", Kapitel IV, Seite 185-234 (1966) und Kapitel IV, Seite 241-265, 2.Auflage 1975, angegeben. Dieses Handbuch ist vorteilhaft bei der Wahl von Lösungsmitteln und Nichtlösern.
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-IB-
Man ist allgemein der Ansicht, daß die Löslichkeit von Polymerisaten in organischen Flüssigkeiten nach dem relativen Wert der jeweiligen Löslichkeitsparameter bewertet wird. Diese Methode ist jedoch nur auf PoIymerisate mit verhältnismäßig niedriger Polarität anwendbar. Wenn eine solche Methode auf Polymerisate, die eine polare Monomereinheit, z.B. eine Cyangruppen enthaltende Monomereinheit enthalten, angewandt wird, führt die Wahl von organischen Flüssigkeiten nach Löslichkeitsparametern häufig zu Irrtümern.
Das Verfahren zur Herstellung eines Copolymerisats mit einer gewünschten Porenstruktur wird nachstehend beschrieoen.
Zunächst kann der gewünschte Porendurchmesser nach den folgenden Methoden erhalten werden: Die Polymerisation wird unter Verwendung eines organischen Mediums durchgeführt, das wenigstens eine geeignete Flüssigkeit, die aus Flüssigkeiten der Gruppe (iii) gewählt ist, enthält Wenn der Porendurchmesser eines erhaltenen Polymerisats kleiner ist als gewünscht, kann er durch Zusatz wenigstens einer Flüssigkeit, die aus Flüssigkeiten der Gruppe (ii) gewählt ist, zum organischen Medium vergrößert werden. Wenn der Porendurchmesser größer ist als gewünscht, kann er durch Zusatz wenigstens einer Flüssigkeit, die aus Flüssigkeiten der Gruppe (i) gewählt ist, zum organischen Medium verkleinert werden. Wenn ein organisches Medium, das wenigstens zwei Flüssig·!- keiten enthält, die aus Flüssigkeiten der Gruppe (iii) gewählt sind, verwendet wird, kann der Porendurchmesser genau eingestellt werden. Im allgemeinen kann bei Verwendung mehrerer Flüssigkeiten der Porendurchmesser im gebildeten Copolymerisat durch entsprechende Veränderung des Mischungsverhältnisses der Flüssigkeiten stufenlos verändert werden.
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Zweitens kann das gewünschte Porenvolumen durch Einstellung der folgenden Bedingungen erhalten werden: Das Porenvolumen des gebildeten Copolymerisate hängt von seinem Porendurchmesser und von tier verwendeten Menge des organischen Mediums ab. Wenn der Porendurchmesser gering ist, wird der größte Teil des organischen Mediums zum Quellen des Polymernetzwerks verbraucht.
Dies hat zur Folge, daß das Porenvolumen kleiner wird. Andererseits ist es mit steigendem Anteil des vernetzbaren Monomeren an den Gesamtmonomeren zur Sicherstellung des genügenden Porenvolumens erforderlich, die zuzusetzende Menge des organischen Mediums zu erhöhen. Einer der Gründe hierfür liegt darin, daß zwar die Neigung eines schwach vernetzten Copolymerisate in einer wässrigen Lösung zum Quellen zu einer Vergrößerung seines Porenvolumens führt, jedoch ein stark vernetztes Copolymerisat eine geringere Quellneigung hat und daher ! die Vergrößerung seines Porenvolumens durch Quellen in ' einer wässrigen Lösung geringer ist. Ein anderer Grund liegt darin, daß, je höher der Vernetzungsgrad ist, um j so dichter die dreidimensionale Struktur der Polymerkette des gebildeten Copolymerisats und es um so schwie-i riger wird, Mikroporen zu bilden, die Adsorptionsstellen für ein daran zu adsorbierendes Protein darstellen.
Wenn beispielsweise die auf die Gesamtmonomeren bezogene Menge der gesamten Flüssigkeiten in Gew.-% mit D und i
ι die auf die Gesamtmonomeren bezogene Menge des vernetz— baren Monomeren in Gew.-% mit X bezeichnet wird, wird vorzugsweise die Bedingung 7 \lx < D < 500 \jx, insbesondere die Bedingung 20 V"x<D<200 \lx erfüllt, wobei die ' Erfüllung der Beziehung 34 \Tx<D<150 \Jx besonders bevor-
zugt wird. j
Nachstehend werden spezielle Beispiele von Kombinationen j von Flüssigkeiten, die für die Herstellung von Copolymerisaten gemäß der Erfindung zu verwenden sind, genannt
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Im Falle der Copolymerisation von Acrylnitril mit Divinylbenzol und Äthylstyrol können Dimethylformamid, N-Methylacetamid, Nitromethan, Dimethylsulfoxyd, Benzonitril, γ-Butyrolacton, Ν,Ν-Dimethylacetamid, Acetophenon u.dgl. als Flüssigkeit der Gruppe (i), aromatische Kohlenwasserstoffe, z.B. Toluol, Xylol, Äthylbenzol oder Tetralin, und Cyclohexanon, Anisol, Chlor- \ benzol, Dichlorbenzol, Methylbenzoate, Äthylbenzoate, Benzylalkohol, Methylenchlorid, Chloroform und Dioxan u.dgl. als Flüssigkeit der Gruppe (iii) und aliphati- ; sehe Kohlenwasserstoffe, z.B. Heptan und Decalin, aliphatische Alkohle, z.B. n-Butanol, Cyclohexanol und Isooctylalkohol, und Amylacetat, Dibutylphthalat, Dioctylphthalat u.dgl. als Flüssigkeit der
15 Gruppe (ii) verwendet werden.
j i
Im Falle der Copolymerisation von Acrylnitril mit Athy- ' lenglykoldimethacrylat können beispielsweise Dimethyl- > formamid, Dimethylsulfoxyd, γ-Butyrolacton und N,N- j
Dimethylacetemid als Flüssigkeit der Gruppe (i), Toluol, j Methylethylketon, Dioxan, Cyclohexanon, Methylenchlorid,! Chlorbenzol u.dgl. als Flüssigkeit der Gruppe (iii) | und Heptan, Octan, n-Butanol und Isopropanol als Flüssigkeit der Gruppe (ii) verwendet werden. I
Für die Copolymerisation von Methacrylnitril mit Divinyl-· benzol und Äthylvinylbenzol können beispielsweise Pyridin, Nitromethan, Benzonitril, Cyclohexanon, Methylethylketon und γ-Butyrolacton als Flüssigkeit der Gruppe (i), Toluol, Äthylbenzol, Tetralin, Butylacetat, Äthylpropionat u.dgl. als Flüssigkeit der Gruppe (iii) und Heptan, Butanol, Isooctanol, Cyclohexanol, Dioctylphthalat u.dgl. als Flüssigkeit der Gruppe (ii) verwendet werden.
Außer den vorstehend als Beispiele genannten Flüssigkeiten können die verschiedensten anderen Flüssigkeiten
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verwendet werden, nachdem die Lösungseigenschaften dieser Flüssigkeiten untersucht worden sind.
Die Polymerisation zur Herstellung der Copolymerisate gemäß der Erfindung kann entweder als radikalische Polymerisation oder ionische Polymerisation durchgeführt werden, jedoch ist es im allgemeinen zweckmäßig, ein Polymerisationsverfahren anzuwenden, bei dem eine Lösung oder eine wässrige Suspension eines Gemisches aus Medium und Monomerem, in dem ein freie Radikale bildender Initiator gelöst ist, erhitzt wird. Ein freiradikalischer Initiator, der im Gemisch des Mediums und der Monomeren löslich und bei der Reaktionstemperatur zersetzbar ist, wird für die radikalische Polymerisation verwendet. Als Beispiele bevorzugter freiradikalischer Initiatoren seien genannt: Acylperoxyde, z.B. Benzoylperoxyd und Lauroylperoxyd, Azonitrile, z.B. 2,2'-Azobisisobutyronitril und 1,l'-Azobis(cyclohexancarbonitril), Peroxyde, z.B. Di-t-butylperoxyd, Dicumylperoxyd und Methyläthylketonperoxyd, und Hydroperoxyde, z.B. Cumolhydroperoxyd und t-Butylhydroperoxyd. Die Reaktion wird bei Temperaturen von 10° bis 2000C, vorzugsweise 20° bis 150°C durchgeführt, wobei Temperaturen von 30° bis 100°C besonders bevorzugt werden. Wenn Monomere einschließlich Acrylnitril im offenen System polymerisiert werden, muß die Polymerisationstemperatur erniedrigt werden, da Acrylnitril einen niedrigen Siedepunkt hat. Daher wird in diesem Fall als Polymerisationsinitiator teilweise oder ganz ein Initiator des Typs mit niedriger Zersetzungstemperatur, z.B. 2,2«-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril), 2f2'-Azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitril), t-Butylpervalerat oder Diisobutylperoxycarbonat, verwendet.
Besonders bevorzugt als Polymerisationsverfahren für die Herstellung der Copolymerisate gemäß der Erfindung wird die Suspensionspolymerisation unter Verwendung von
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Wasser als Suspendiermedium, wobei ein körniges Harz leicht erhältlich ist. Acrylnitril ist in Wasser leicht ' löslich. Wenn jedoch Acrylnitril mit einer in Wasser unlöslichen Flüssigkeit oder einem in Wasser unlösliehen Monomeren gemischt wird, wird die Löslichkeit in Wasser stark verringert.
Bei Verwendung einer wasserlöslichen organischen Flüssigkeit oder eines wasserlöslichen Monomeren für die Durchführung der Polymerisation ist die Suspensions- ' polymerisation nicht zweckmäßig. In diesem Fall wird vorzugsweise ein Verfahren angewandt, bei dem zunächst [ durch Lösungspolymerisation ein voluminöses Produkt j hergestellt und dann auf eine geeignete Korngröße ge- !
mahlen wird. j
Als Beispiele geeigneter Suspendiermittel, die für die j Zwecke der Erfindung verwendet werden können, seien genannt: Natürlich polymere Substanzen, z.B. Stärke, Tragantgummi und Gelatine, modifizierte natürliche polymere Substanzen, z.B. Hydroxyäthylcellulose, Methylcellulose.und Carboxymethylcellulose, wasserlösliche synthetische polymere Substanzen, z.B. Polyacrylsäure, Polyvinylpyrrolidon, teilweise verseiftes Polyvinylacetat und Polyvinylalkohol, und anorganische Substanzen, z.B. Bariumsulfat, Talkum, Hydroxyapatit, Bentonit,
25 Kieselsäureanhydrid und Calciumcarbonat.
Bei Verwendung von leicht wasserlöslichen organischen Flüssigkeiten oder Monomeren wie Acrylnitril wird zur Regelung ihrer leichten Löslichkeit vorzugsweise ein anorganisches Salz, z.B. Natriumchlorid oder Calclumchlorid, der wässrigen Phase zugesetzt.
Es hat sich gezeigt, daß die Cyangruppen enthaltenden, porösen, vernetzten Copolymerisate gemäß der Erfindung, die nach dem vorstehend beschriebenen typischen Verfahren hergestellt worden sind, ausgezeichnete Eigen-
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schäften als Adsorptionsmittel für Proteine haben. Auf diese ausgezeichneten Eigenschaften wird im folgenden nacheinander eingegangen.
1) Das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung hat eine poröse Struktur
Die Eignung und Leistungsfähigkeit eines Adsorptionsmittels wird in erster Linie nach der Adsorptionsge- ; schwindigkeit und nach dem Adsorptionsvermögen bewertet. Die Zahl der verfügbaren üblichen Adsorptionsmittel mit Porenstruktur ist nicht gering. Eines der charakteristischen Merkmale der Adsorptionsmittel gemäß der Er- , findung gegenüber diesen üblichen Adsorptionsmitteln '■ besteht darin, daß die Porenstruktur nach Belieben eingestellt und verändert werden kann. Beispielsweise kann j im Copolymerisat gemäß der Erfindung der mittlere Porendurchmesser nach Belieben auf einen Wert im Bereich von 40 bis 9000 S eingestellt werden. Andererseits j wird es bevorzugt, daß der Bereich der Porendurchmesser-· verteilung eine gewisse Breite hat. Die Anwesenheit von j Poren mit großem Durchmesser erhöht erheblich die Diffusionsgeschwindigkeit eines Porteins in die Poren des Copolymerisats, und wenn Poren mit kleinem Durch- ' messer in großen Mengen vorhanden sind, wird die innere Oberfläche des Copolymerisats vergrößert. Es hat sich gezeigt, daß ein Copolymerisat gemäß der Erfindung mit einer Porendurchmesserverteilung in einem verhältnismäßig weiten Bereich hohe Adsorptionsgeschwindigkeit und hohes Adsorptionsvermögen aufweist. Wenn ein bestimmtes Protein adsorbiert werden soll, ist eine Porenstruktur vorhanden, die für die Adsorption dieses Proteins optimal ist. Richtlinien für die Einstellung einer optimalen Porenstruktur können nicht einfach gegeben werden, jedoch muß für die Erzielung einer optimalen Porenstruktur in erster Linie die Molekülgröße eines zu adsorbierenden Proteins berücksichtigt werden. Im allge meinen haben Proteine eine Molekülgröße im Bereich von
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etwa 10 8 bis zu einigen Hundert 8. Damit das Protein in die Poren des Copolymerisate diffundieren kann und das Protein in der Porenstruktur adsorbiert wird, müssen im Copolymerisat Poren ausgebildet werden, deren Durchmesser größer ist als wenigstens die Molekülgröße des Proteins.
Es wurde gefunden, daß ein optimaler mittlerer Porendurchmesser in Abhängigkeit von der Molekülgröße eines zu adsorbierenden Proteins vorliegt. Beispielsweise lassen die Ergebnisse der in den folgenden Beispielen 8 bis 12 beschriebenen Versuche erkennen, daß Proteine mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 80.000 in größten Mengen an einem Copolymerisat mit einem mittleren Porendurchmesser von 200 A adsorbiert werden, während Proteine mit einem Molekulargewicht von mehr
i als etwa 100.000 in großen Mengen an einem Copolymer!- !
sat mit einem mittleren Porendurchmesser von 1200 A adsorbiert werden. Diese Ergebnisse lassen erkennen, ! daß bei einem Protein mit großer Molekülgröße ein großer^ Porendurchmesser notwendig ist, damit das Protein in ! genügendem Maße diffundieren kann. Im einzelnen kann eine optimale Porenstruktur erreicht werden, indem im Copolymerisat geeignete Porencharakteristiken in Abhängigkeit von der Molekülgröße und -form eines zu adsorbierenden Proteins eingestellt werden. Gelegentlich ist es möglich, ein bestimmtes Protein allein aus mehreren Proteinen selektiv zu adsorbieren.
2) Das als Adsorptionsmittel dienende Copolymerisat gemäß der Erfindung hat die Fähigkeit, verschiedene Proteine in großen Mengen zu adsorbieren.
Die Ergebnisse der in den Beispielen beschriebenen Versuche zeigen, daß die verschiedensten Proteine von den Peptiden mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bis zu makromolekularen Proteinen mit Molekulargewichten von einigen Hunderttausend durch das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung in großen Mengen von beispielsweise j
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einigen hundert mg pro Gramm des trockenen Copolymeri- j sats adsorbiert werden können. Außerdem wird das Adsorptionsvermögen der Copolymerisate gemäß der Erfindung für Proteine in keiner Weise durch den isoelektrischen ! Punkt beeinflußt, der als weiterer wichtiger Faktor, der das Protein kennzeichnet, anzusehen ist. Beispielsweise zeigen die Beispiele 8 bis 12, daß die Copolymerisate gemäß der Erfindung ein sehr hohes Adsorptionsvermögen für die verschiedensten Proteine mit einem isoelektrisehen Punkt im weiten Bereich von 4,7 bis 10,4 aufweisen.
Es hat sich gezeigt, daß die als Adsorptionsmittel dienenden Copolymerisate gemäß der Erfindung ein hohes Adsorptionsvermögen für Enzyme sowie für gewöhnliche einfache Proteine aufweisen. !
3) Das als Adsorptionsmittel dienende Copolymerisat ' gemäß der Erfindung zeichnet sich durch hohe mechanische1 Festigkeit aus. ^^
Von Stärke, Cellulose, Dextran u.dgl. abgeleitete Polymerisate wurden bisher in großem Umfang als Träger für | die Trennung, Reinigung und Bindung von Proteinen ver- j wendet. Als typische Beispiele solcher Polymerisate sindj vernetztes Dextran der Handelsbezeichnung "Sephadex" j (Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) und vernetzte Agarose der Handelsbezeichnung "Sepharose" (Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) zu nennen. Diese von natür-i liehen Stoffen abgeleitete Träger quellen jedoch in hohem Maße und haben schlechte mechanische Festigkeit. Daher werden sie unter Druck leicht deformiert oder gebrochen, so daß der Durchlauf von proteinhaltigen Flüssigkeiten häufig durch den Druckanstieg gehemmt wird. Daher können diese Adsorptionsmittel kaum in großtechnischem Maßstab verwendet werden. Im Gegensatz hierzu haben die Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung eine hohe mechanische Festigkeit, die für dreidimensionale vernetzte Polymerisate naturgegeben ist. Daher können die Copolymerisate
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gemäß der Erfindung vorteilhaft in dem in eine Kolonne j gepackten Zustand für die Chromatographie verwendet werden.
4) Es ist allgemein bekannt, daß hinsichtlich des Ad-
sorptionsvermogens, der mechanischen Festigkeit und der Leichtigkeit des Durchgangs einer Flüssigkeit Adsorp- ; tionsmittel mit Kugelform besonders bevorzugt werden. Im Rahmen der Erfindung kann ein Protein-Adsorptionsmittel, das aus einem Copolymerisat mit Kugelform besteht, durch Suspensionspolymerisation unter Verwendung von Wasser als Suspensionsmittel leicht hergestellt ;
ι werden. :
5) Eine der bevorzugten Eigenschaften eines Adsorptions-, harzes besteht darin, daß das Harz inaktiv ist und in ι
einem weiten pH-Bereich verwendet werden kann. Da Poly- ' acrylnitril, Polydivinylbenzol u.dgl. diese Eigenschaft verleihen, weist das Copolymerisat gemäß der Erfindung , diese Eigenschaft auf, falls nicht ein Monomeres mit i hohem Reaktionsvermögen dem als Ausgangsmaterial verwendeten Monomerengemisch zugesetzt wird. Vielseitige \ anorganische Adsorptionsmittel wie aktiviertes Aluminium-oxyd und Kieselgel zersetzen ein Adsorbat zuweilen.Im Segensatz hierzu weist das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung Vorteile gegenüber diesen vielseitigen anorganischen Adsorptionsmitteln auf,weil es für die verschiedensten Substrate unter Arbeitsbedingungen in einem weiten Bereich anwendbar ist.
6) Ferner kann das Copolymerisat gemäß der Erfindung wiederholt eingesetzt und sein Adsorptionsvermogen für lange Zeiträume mit geringerer Verschlechterung hoch gehalten werden. Das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung weist somit einen sehr hohen praktischen Wert und Nutzen auf.
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Wie die vorstehende Beschreibung zeigt, weist das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung verschiedene vorteilhafte Eigenschaften auf. Einer der Gründe hierfür liegt darin, daß das vernetzbare Monomere in die Struktureinheiten des Copolymerisats, das das Protein-Ad- ; sorptionsmittel gemäß der Erfindung darstellt, eingebaut ist. Eine Cyangruppen enthaltende poröse Masse ■ kann beispielsweise erhalten werden, indem eine Poly- | merlösung, die Polyacrylnitril enthält, einem Nichtlöseri ι zugesetzt und hierdurch das Polymerisat ausgefällt wird, oder indem Polyacrylnitril auf die Oberfläche einer porösen Substanz beispielsweise nach einem Verfahren | aufgebracht wird, bei dem eine Polyacrylnitrillösung mit der porösen Substanz zusammengeführt und das
Lösungsmittel abgedampft wird. j
Das Copolymerisat gemäß der Erfindung mit dreidimensio- ; naler vernetzter Struktur weist in verschiedener Hin-
sieht Vorteile gegenüber solchen porösen Produkten auf. Beispielsweise kann die Porenstruktur im Copolymerisat gemäß der Erfindung leicht eingestellt und geregelt werden, und die einmal gebildete Porenstruktur verändert oder deformiert sich in geringerem Maße beim Durchleiten von Flüssigkeiten oder durch Anwendung von äußerem Druck. Demgemäß zeigt das Copolymerisat gemäß der Erfindung ein hohes Adsorptionsvermogen, das für lange Zeiträume unverändert bleibt. Ferner hat das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung hohe mechanische Festigkeit, und das Copolymerisat, das das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung darstellt, wird in den zu behandelnden Flüssigkeiten nicht gelöst.
Der hier gebrauchte Ausdruck "trockenes Copolymerisat" oder "Copolymerisat im trockenen Zustand" bezeichnet das Copolymerisat, dessen Gewicht nach dem folgenden Trockenverfahren im wesentlichen konstant geworden ist.
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Nach der Copolymerisation wird das erhaltene Copolymerisat mit einem nicht über 120°C siedenden Lösungsmittel gut gewaschen und dann bei 70°C getrocknet. Das Gewicht des Copolymerisats wird in bestimmten Abständen gemessen. Wenn der Unterschied zwischen zwei gemessenen Gewichten des Copolymerisats in einem Abstand von 24 Stunden geringer als 1% des später gemessenen Gewichts ist, gilt ' das Copolymerisat als ein Copolymerisat, dessen Gewicht
im wesentlichen konstant geworden ist. Das Trocknen kann ', unter vermindertem Druck durchgeführt werden, um die Trockenzeit zu verkürzen.
Im Rahmen der Erfindung ist unter "Protein" eine makro- \ molekulare stickstoffhaltige Verbindung zu verstehen, die ein Molekulargewicht von nicht weniger als 500 hat ! und im wesentlichen aus mehreren α-Aminosäuren besteht, i die über eine Säureamidbindung, d.h. eine Peptidbindung, ■ aneinander gebunden sind. !
Als Beispiele von Proteinen, die durch das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung adsorbiert werden können, \ seien genannt: Avidin, Albumine, z.B. Serumalbumin, ι Ovalbumin, Conalbumin, Lactalbumin. Leucosin, Ricin und | Legumelin, Erythrocruorin, Phosphoproteine, z.B. Casein, | Vitellin und Phosvitin, Globuline, z.B. Serumglobulin, j Ovoglobulin, Lactoglooulin, Legumin, Edestin, Phaseolin, und Glycinin, Protamine, z.B. Salmin und Clupein, Myoproteine, z.B. Myosin, Actin, Tropomyosin und Myogen, Histon, Prothrombin, Hämerythrin, Hämoglobin, Hämocyanin, Myoglobin, Lipoproteine, z.B. Rhodopsin, Lipovitellin und Proteolipid, Glykoproteine, z.B. Ovomucoid, Kallidin und Bradykinin, Inhibitoren gegen Enzyme, z.B. Antipain und Pepstatin, Plasmaproteine, z.B. Antitrypsin, Ceruloplasmin, Haptoglobin, Makroglobulin, Hämopexin, Transferrin, Glykoprotein, Prothrombin und Fibrinogen, toxische Proteine, z.B. Erabutoxin, Butulinustoxin, Cardiotoxin, Bungarotoxin, Ricin und Abrin, Hormone,
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z.B. Angiotensin, Glucagon, Oxytocin, Vasopressin, Argininvasotocin, Insulin, somalotropische Hormone, ; lactogenes Hormon, adrenocorticotropisches Hormon, somatotropische Hormone und Melanocyt-stimulierende Hormone, Antibiotika, z.B. Gramicidine, Collistin, Tyrocidine, Bacitracin und Polymyxin, und Enzyme.
Als spezielle Beispiele der Enzyme seien genannt: i
Oxidoreduktasen, z.B. Alkoholdehydrogenase (1.1.1.1), Glycerindehydrogenase (1.1.1.6), Glycerinphosphatdehydrogenase (1.1.1.8), ß-Hydroxybutyratdehydrogenase (1.1.1.30), Malatdehydrogenase (1.1.1.37), Isocitratdehydrogenase ι (1.1.1.41), Lactatdehydrogenase (1.1.1.27), Galactose- ' dehydrogenase (1.1.1.48), Glucose-6-phosphatdehydrogenasei (1.1.1.49), Glucoseoxydase (1.1.3.4), Cholesterinoxydase i (1.1.3.6), Galactoseoxydase (1.1.3.9), Xanthinoxydase ι (1.2.3.2), Glutamatdehydrogenase (1.4.1.2), L-Amino- j säureoxydase (1.4.3.2), D-Aminosäureoxydase (1.4.3.3), Pyridinnucleotidtranshydrogenase (1.6.1.1), Uricase (1.7.3.3), Cytochrom (1.9.3.1), Tyrosinase (1.10.3.1), Katalase (1.11.1.6), Peroxydase (1.11.1.7) und Lipoxygenäse (1.13.1.13), Transferasen, z.B. Transaldolase (2.2.1.2), Phosphorylase (2.4.1.D, Dextransaccharase (2.4.1.5), Levansaccharase (2.4.1.14), Purinnucleosidphosphorylase (2.4.2.1), trans-N-Glykosidase (2.4.2.6), Glutamin-brenztraubensäuretransaminase (2.6.1.2) , Hexokinase (2.7.1.1), Pyruvatkinase (2.7.1.40, Carbamatkinase (2.7.2.2), Phosphoglyceratkinase (2.7.2.3), Creatinkinase (2.7.3.2), NAD-Pyrophosphorylase (2.7.7.1), RNA-Nucleotidyltransferase (2.7.7.6), Polynucleotidphosphorylase (2.7.7.8 und Ribonucease (2.7.7.16), Hydrolasen, z.B. Lipase (3.1.1.3), Acetylcholinesterase (3.1.1.7), Cholesterinesterase (3.1.1.13), Lipoproteinlipase (3.1.1.34), alkalische Phosphatasen (3.1.3.1), Säurephosphatasen (3.1.3.2), Phosphodiesterase (3.1.4.1), Desoxyribonuclease (3.1.4.5), a-Amylase (3.2.1.1), ß-Amylase (3.2.1.2), Cellulase (3.2.1.4), Dextranase
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(3.2.1.11), Pectinase (3.2.1.15), Lysozym (3.2.1.17), Neuraminidase (3.2.1.18), a-Galactosidase (3.2.1.22), ß-Galactosidase (3.2.1.23), Invertase (3.2.1.26), Hyaluronidase (3.2.1.35), Leucinaminopeptidase (3.4.1.1. Carboxypeptidase (3.4.2.3), Prolidase (3.4.3.7), Pepsin (3.4.4.1), Rennin (3.4.4.3), Urokinase, Trypsin (3.4. 4.4), Elastase (3.4.4.7), Papain (3.4.4.10), Ficin (3.4.4.12), Renin, Thrombin (3.4.4.13), Subtilisin (3.4.4.16), Subtilopeptidase A (3.4.4.16), Chymotrypsin (3.4.4.5), Kallikrein (3.4.21.8), Asparaginase (3.5.1.1), Glutaminase (3.5.1.2), Urease (3.5.1.5), Penicillinamidase(3.5.1.11), Aminocylase (3.5.1.14), Penicillinase (3.5.2.6), Adenindeaminase (3.5.4.2), ATPase (3.6.1.3), Myosin-ATPase (3.6.1.3), Apyrase (3.6.1.5), ATP-Deaminase, AMP-Deaminase, Glucosidase, Subtilisin und Cephalosporinacylase, Lyasen, z.B. Asparagat-4-decarboxylase (4.1.1.12), Aldolase (4.1.2.7), Aminosäuredecarboxylase, Fumarase (4.2.1.2), Tryptophanase, 2-Phosphoglyceratdehydrase (4.2.1.11), Tryptophansynthase (4.2.1.20), Asparagase (4.3.1.1), und Cysteindesulfhydrase (4.4.1.1), Isomerasen, z.B. Aminosäureracemase, Glucosephosphatisomerase (5.3.1.9) und Glucose-
isomerase und Ligasen, z.B. Succinyl-CoA-Synthetase ! (6.2.1.4) und Citratsäuresynthase. Die Zahlen in Klammern; entsprechen der Enzym-Nomenklatur (Recommendations of | the International Union of Biochemistry on the Nomenclature and Classification of Enzyme).
Auf Grund der vorstehend genannten verschiedenen Eigenschaften können die Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung für die verschiedensten Anwendungsgebiete, die nachstehend beschrieben werden, wirksam eingesetzt werden.
1) Reinigung und Abtrennung von Proteinen
Die Adsorptionsmittel gemSß der Erfindung vermögen auf Grund ihrer hervorragenden selektiven Adsorptionseigen-
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schäften Proteine, die in wässrigen Medien enthalten sind, wirksam und selektiv zu adsorbieren.
Die Adsorption von Proteinen aus Proteinlösungen oder Proteindispersionen unter Verwendung des Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung wird im allgemeinen bei einem pH-Wert von 7 durchgeführt, kann jedoch auch bei einem pH-Wert im weiten Bereich von 1 bis 11 durchgeführt werden. Der für die Adsorption geeignete pH-Wert hängt von der Stabilität und dem isoelektrischen Punkt des zu adsorbierenden Proteins ab und wird daher in Abhängigkeit von der Art des zu adsorbierenden Proteins bestimmt. Es ist zweckmäßig, daß das Protein während des Adsorptionsvorganges in einer Pufferlösung gelöst ist, so daß der pH-Wert konstant gehalten werden kann. Als Beispiele geeigneter Pufferlösungen sind Puffer des Typs Glycin-Natriumchlorid-Salzsäure, Puffer des Typs Essigsäure-Natriumacetat, Puffer des Typs Kaliumdihydrogenphosphat-Dinatriumhydrogenphosphat, Puffer des Typs Natriumhydroxyd-Natriumchlorid-Glycin und Tris(hydroxymethyl)aminomethan zu nennen. Die Adsorption kann bei Temperaturen im Bereich von 2° bis 95°C, vorzugsweise 5° bis 60°C durchgeführt werden, wobei eine Temperatur von 10° bis 40°C besonders bevorzugt wird. Bei einer zu hohen Temperatur besteht die Möglichkeit, daß das Protein abgebaut wird. Bei zu niedriger Temperatur kann die Adsorptionsgeschwindigkeit des Proteins geringer werden.
Die Adsorption von Proteinen gemäß der Erfindung kann im allgemeinen durchgeführt werden, indem das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung mit einer Lösung oder Dispersion des Proteins zusammengeführt wird. Das Adsorptionsverfahren wird nachstehend ausführlich erläutert.
Die Adsorption von Proteinen kann vorgenommen werden, indem das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung Proteinlösungen oder Proteindispersionen zugesetzt wird (Chargenverfahren). Das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung
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kann für die Adsorption ohne Trocknung nach der Copolymerisation verwendet werden. Die pro Liter der zu behandelnden Lösung oder Dispersion zu verwendende Menge des Adsorptionsmittels muß im Bereich von 0,02 g bis 300 g, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 200 g liegen, wobei eine Menge von 1 bis 100 g auf Trockenbasis besonders bevorzugt wird. Da die adsorbierte Proteinmenge um so größer und die Adsorptionsgeschwindigkeit um so höher ist, je größer die Adsorptionsmittelmenge ist, sollte die zu verwendende Menge des Adsorptionsmittels in Abhängigkeit von der Menge des zu adsorbierenden Proteins und von der gewünschten Adsorptionszeit bestimmt werden. Die Adsorptionszeit liegt vorzugsweise im Bereich von 1 Minute bis 500 Stunden, insbesondere im Bereich von 5 Minuten bis 200 Stunden. Nach Bedarf wird die Lösung bewegt oder geschüttelt, um die Adsorption zu erleichtern und die für die Adsorption erforderliche Zeit zu verkürzen. Wenn die Lösung oder Dispersion bewegt oder geschüttelt wird, kann die Adsorptionszeit im Bereich von 10 Sekunden bis 100 Stunden, vorzugsweise im Bereich von 1 Minute bis 50 Stunden, insbesondere im Bereich von 10 Minuten bis 20 Stunden liegen.
Die Adsorption von Proteinen kann auch durchgeführt werden, indem Proteinlösungen oder -dispersionen durch eine Kolonne oder ein Filter, das mit dem Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung gefüllt ist, geleitet werden (kontinuierliches Verfahren). Das Mengenverhältnis zwischen Adsorptionsmittel und der zu behandelnden Lösung oder Dispersion ist fast das gleiche wie beim Chargenverfahren* Bei diesem kontinuierlichen Verfahren kann die Raumströmungsgeschwindigkeit der zu behandelnden Lösung oder Dispersion im Bereich von 0,01 Std. bis 1000 Std. , vorzugsweise im Bereich von 0,02 bis 500 Std.~ , insbesondere im Bereich von 0,04 bis 100 Std." liegen. Eine zu hohe Raumströmungsgeschwindigkeit hat Druckabfall und/
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oder Verringerung der Adsorptionsgeschwindigkeit zur Folge.
Anorganische oder organische Salze können einer Proteinlösung oder -dispersion zugesetzt werden, um den pH-Wert einzustellen, die Löslichkeit des Proteins zu steigern und/oder die zu adsorbierende Menge des Proteins zu erhöhen. Als spezielle Beispiele solcher Salze sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kaliumdihydrogenphosphat, Natriumacetat und Natriumeitrat zu nennen. Die zuzusetzende Menge des Salzes beträgt im allgemeinen nicht mehr als 30 Gew.-%, vorzugsweise nicht mehr als 20 Gew.-%, bezogen auf die Proteinlösung oder -dispersion. Zu dem gleichen Zweck können wasserlösliche organische Substanzen der Proteinlösung oder -dispersion zugesetzt werden. Als spezielle Beispiele solcher wasserlöslichen organischen Substanzen sind Aceton, Methanol, Äthanol und Dimethylformamid zu nennen. Die zuzusetzende Menge der wasserlöslichen organischen Substanz beträgt nicht mehr als 50 Gew.-%, vorzugsweise nicht mehr als 30 Gew.-% insbesondere nicht mehr als 20 Gew.-% der Proteinlösung oder -dispersion.
Die Adsorptionszeit wird in geeigneter Weise in Abhängigkeit vom Zustand und von der Konzentration der zu behandelnden Proteinlösung und vom Adsorptionssystem, von der Adsorptionstemperatur und von anderen Bedingungen festgelegt.
Vor der Durchführung der Adsorption in der Praxis müssen optimale Bedingungen eingestellt werden. Dies wird erreicht, indem das Adsorptionsvermögen des Adsorptionsmittels im Verlaufe der Zeit quantitativ bestimmt wird. Das Adsorptionsvermögen des Adsorptionsmittels für Proteine wurde nach den folgenden Methoden bestimmt: Zunächst wurde für den Fall der Durchführung der Adsorption nach dem Chargenverfahren die Konzentration des
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Proteins in der zu behandelnden Lösung oder Dispersion bestimmt. Die durch das Adsorptionsmittel adsorbierte Proteinmenge wurde aus dem Unterschied zwischen der Konzentration des Proteins in der ursprünglichen Lösung oder Dispersion und derjenigen in der behandelten Lösung oder Dispersion berechnet. Zweitens wurde im Falle der Durchführung der Adsorption nach dem kontinuierlichen Verfahren die zwischen dem Granulat des Adsorptionsmittels vorhandene Proteinlösung oder -dispersion mit dem gleichen Lösungsmittel, das die Proteinlösung oder -dispersion enthielt, herausgewaschen. Das zum Waschen verwendete Volumen des Lösungsmittels betrug das 5-fache des scheinbaren Volumens des Adsorptionsmittels. Die Menge des Proteins in der behandelten Lösung oder Dispersion einschließlich der Waschflüssigkeit wurde bestimmt. Der Unterschied zwischen der Proteinmenge in der ursprünglichen Lösung oder Dispersion und derjenigen in der behandelten Lösung oder Dispersion ist die vom Adsorptionsmittel adsorbierte Proteinmenge. Das Adsorptions-
vermögen des Adsorptionsmittels für Proteine wird in
mg adsorbiertes Protein pro g des trockenen Adsorptions- | mittels angegeben. j
In letzter Zeit wurden technische Anwendungen von Proteinen eingehend auf verschiedenen Gebieten untersucht.
Hierbei hat sich gezeigt, daß die Entwicklung eines Adsorptionsverfahrens, das in allen vorstehend genannten funktioneilen Aspekten ausgezeichnet ist, in der Technik gewünscht wird. In diesem Sinne stellen die Adsorptionsmittel für Proteine und das Verfahren gemäß der Erfindung einen großen technischen Fortschritt dar.
Bei der Adsorptionschromatographie, die ein typisches Beispiel einer Abtrennung und Reinigung von natürlichen organischen Verbindungen im Laboratoriumsmaßstab ist, ! wird der Unterschied der Adsorptionskraft zwischen einem j Adsorptionsmittel und zu behandelnden Substanzen oder |
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einem Lösungsmittelmolekül ausgenutzt. Bei diesem Trenn- und Reinigungsverfahren werden heute anorganische Substanzen wie Aktivkohle, Aluminiumoxyd, Siliciumdioxyd, Calciumphosphat und Magnesiumsilicat als Adsorptionsmittel verwendet. Das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung weist Vorteile in verschiedener Hinsicht gegenüber diesen üblichen Adsorptionsmitteln auf. Beispielsweise kann das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung in einer \ viel besseren Kugelform hergestellt werden. Seine mechanische Festigkeit ist sehr hoch, und das Adsorptions- i mittel kann wiederholt verwendet werden. Daher ist es , bei Verwendung des Adsorptionsmittels gemäß der Erfin- j dung möglich, die Adsorptionschromatographie im großen j Maßstab durchzuführen. Ferner ist das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung frei von einem bei anorganischen Adsorptionsmitteln häufig vorhandenem Nachteil, d.h. ; den Nachteil, daß zu trennende Substanzen durch die Ad- . sorptionsmittel zersetzt werden. Das Adsorptionsmittel ! gemäß der Erfindung ermöglicht daher eine sehr stabile Handhabung instabiler Proteine. Auf Grund dieser Vorteilej kann das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung wirksam ι als Träger für die Adsorptionschromatographie verwendet ι werden. Ferner ist bei geschickter Ausnutzung der vorstehend genannten Beziehung zwischen dem Porendurchmesser und dem Adsorptionsvermögen für Proteine auch eine selektive Trennung von Proteinen möglich.
Die Desorption eines vom Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung adsorbierten Proteins kann durch Schwächen der Adsorptionskraft zwischen dem Adsorptionsmittel und dem Protein beispielsweise nach einer der folgenden repräsentativen Methoden oder einer Kombination dieser Methoden erreicht werden:
1) ^ine Methode, bei der eine Elutionslösung, die ein Salz enthält für den Fall verwendet wird, in dem die Proteinlösung oder -dispersion kein Salz enthält·
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2) Ein Verfahren, bei dem eine Elutionslösung, die ein
Salz enthält, dessen Konzentration von derjenigen des
Salzes in der Proteinlösung oder -dispersion verschieden ist, für den Fall verwendet wird, in dem die
Art des Salzes in der Elutionslösung die gleiche ist . wie in der Proteinlösung oder -dispersion.
3) Ein Verfahren, bei dem eine Elutionslösung, die ein
anderes Salz als die Proteinlösung oder -dispersion
enthält, verwendet wird. '
4) Ein Verfahren, bei dem in Fällen, in denen die Pro- ι teinlösung oder -dispersion kein wasserlösliches , organisches Lösungsmittel enthält, eine Elutionslösungi verwendet wird, die ein wasserlösliches organisches ', Lösungsmittel enthält. ;
5) Ein Verfahren, bei dem in Fällen, in denen die Art ι des Lösungsmittels in der Elutionslösung die gleiche j ist wie in der Proteinlösung oder -dispersion, eine | Elutionslösung verwendet wird, die ein wasserlösliches] organisches Lösungsmittel enthält, dessen Konzentra- : tion von derjenigen des Lösungsmittels in der Protein-' lösung oder -dispersion verschieden ist.
6) Ein Verfahren, bei dem eine Elutionslösung verwendet
wird, die eine andere Art eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels als die Proteinlösung oder
-dispersion enthält.
7) Ein Verfahren, bei dem eine Elutionslösung, die ein
Tensid enthält, verwendet wird.
8) Ein Verfahren, bei dem die Desorption bei einer anderen Temperatur als die Adsorption durchgeführt wird.
9) Ein Verfahren, bei dem eine Elutionslösung, die einen
anderen pH-Wert als die Proteinlösung oder -dispersion
hat, verwendet wird.
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Als spezielle Beispiele der vorstehend genannten Salze sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kaliumdihydrogenphosphat, Natriumacetat und Natriumeitrat zu nennen. Als spezielle Beispiele der vorstehend genannten wasserlösliehen organischen Lösungsmittel sind Aceton, Methanol, Äthanol und Dimethylformamid zu nennen. Geeignete Bedingungen für die Elutionsbehandlung werden in Abhängigkeit von der Art des zu eluierenden adsorbierten Proteins und von der Zusammensetzung und Struktur des Adsorptionsmittels gewählt.
2) Entfernung von Proteinen
Bei gewissen Produkten wird die Qualität äußerst stark verschlechtert, wenn geringfügige Proteinmengen darin enthalten sind. Als Beispiel solcher Produkte kann roher
japanischer Sake genannt werden. Roher japanischer Sake ist trübe, wenn Proteine darin enthalten sind. Durch Verwendung des Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung können Proteine, die in rohem japanischem Sake enthalten sind, mit Sicherheit mit hohem Wirkungsgrad entfernt werden, und die Qualität des Sake kann ohne jede Verschlechterung der Eigenschaften des Produkts erheblich verbessert werden. Ferner weist das Verfahren zur Abtrennung der Proteine unter Verwendung des Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung große Vorteile gegenüber üblichen Verfahren wie Koagulierung und Fällung unter Verwendung von Persimonen-Tannin, Superzentrifugalabscheidung und Trennverfahren unter Verwendung eines Enzyms hinsichtlich der Leichtigkeit des Adsorptionsvorganges und der Nachbehandlung auf. Dieses Verfahren ermöglicht die vollständige, wirtschaftlich vorteilhafte Entfernung der Proteine. Das Verfahren gemäß der Erfindung eignet sich ebenso für die Klärung von Getränken wie Bier, Wein u.dgl. und von anderen Produkten.
Das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung eignet sich ferner für die Entfernung von Proteinen aus protein-
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- se -2ft 274627b
reichen Abwässern (z.B. Abwässern, die bei Lebensmittelverarbeitungsverfahren anfallen). In diesem Fall weist das Verfahren unter Verwendung des Protein-Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung Vorteile gegenüber üblichen biologischen Verfahren, z.B. gegenüber dem Belebtschlammverfahren u.dgl. auf, weil die Behandlung in kürzerer j Zeit durchgeführt und der Raumbedarf für die Behandlung erheblich verringert werden kann. !
3) Verwendung als Copolymer-Protein-Verbundmaterialien !
Vorstehend v/urde die Verwendung des erfindungsgemäßen ;
Copolymerisats selbst als Adsorptionsmittel beschrieben· !
Nachstehend wird auf die Vorteile eines Verbundmaterials ' eingegangen, das ein poröses Copolymerisat und ein
Protein enthält. !
Im lebenden Körper sind paarweise die verschiedensten Substanzen mit bestimmter Wechselwirkung, beispielsweise ein Enzym und ein Substrat, ein Enzym und ein Inhibitor sowie ein Antigen und ein Antikörper vorhanden. Ein Komplex wird aus diesen paarweise vorliegenden Substanzen gebildet. Einige Komplexe sind sehr stabil, jedoch sind einige der anderen Komplexe nur vorübergehend als ] Zwischenstufen vorhanden und werden leicht zersetzt. \ Enzym-Substrat-Komplexe gehören zum letztgenannten Typ. I Unter diesen Substanzen befinden sich zahlreiche Proteine» und wenn sie am Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung adsorbiert und fixiert werden, können sie den verschiedensten Anwendungen zugeführt werden.
Ein an einem in Wasser unlöslichen Träger fixiertes Enzym ist als immobilisiertes Enzym allgemein bekannt. Ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen durch physikalische Adsorption hat gegenüber der chemischen Bindungsmethode den Vorteil, daß das Enzym durch die Fixierbehandlung kaum abgebaut wird und der Träger mit dem daran fixierten Enzym ständig gebraucht werden
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kann, während ihm frisches Enzym zugeführt wird. Die praktische Anwendung dieses Verfahrens ist jedoch nicht weit fortgeschritten, weil das Adsorptionsvermögen des Trägers gering und die am Träger adsorbierte Enzymmenge begrenzt ist.
Im Gegensatz hierzu hat das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung ein so hohes Adsorptionsvermögen für
ι Proteine, daß wenigstens einige zehn mg eines Proteins ]
pro g des trockenen Copolymerisats adsorbiert werden ; können. Ferner läßt sich das einmal adsorbierte Protein : durch destilliertes Wasser, entionisiertes Wasser und Gebrauchswasser kaum eluieren, so daß das Verbundmaterial! aus dem Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung und dem daran adsorbierten Enzym als solches für enzymatische j
Reaktionen verwendet werden kann. ;
Die Affinitätschromatographie ist ein Trennverfahren, das auf dem Prinzip beruht, daß eine physiologisch ak-
tive Substanz an einem Träger fixiert wird und eine j andere physiologisch aktive Substanz durch Ausnutzung i der Wechselwirkung zwischen den beiden physiologisch j aktiven Substanzen abgetrennt wird. In letzter Zeit hat j dieses Verfahren große Aufmerksamkeit in der Technik ; auf sich gezogen. Das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung wird wirksam als Träger für die Durchführung dieses Trennverfahrens verwendet. Als typische Beispiele von Stoffen, die im Adsorptionsmittel adsorbiert und fixiert werden, sind Enzyme, Antigene und Antikörper zu nennen. Übrigens verursacht die Verwendung eines bifunktionellen Reaktanten, der als Proteinvernetzungsmittel bekannt ist, z.B. Glutaraldehyd, keinerlei Störung, wenn diese Proteine am Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung adsorbiert sind. Im Gegenteil kann in diesem Fall die Bindungskraft zwischen dem Adsorptionsmittel und dem Protein und die Bindungskraft zwischen den Proteinen selbst gesteigert und der Anwendungsbereich des Verfahrens erweitert werdeni
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Bei einem Copolymer-Protein-Verbundmaterial beträgt die Proteinmenge vorzugsweise wenigstens 10 mg, insbesondere wenigstens 20 mg pro Gramm des trockenen Copolymerisate.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele ausführlicher erläutert.
Beispiel 1
In einen mit Rückflußkühler, doppelflügeligem Rührer und Thermometer versehenen Dreiliter-Dreihalskolben wurden 55 g frisch destilliertes Acrylnitril, 45 g Divinylbenzol (das eine Reinheit von 56% hatte und 44% Vinyläthylbenzol als Verunreinigung enthielt, nachstehend als "56%iges Divinylbenzol" bezeichnet), 130 g Acetophenon, 120 g Decalin, 1 g 2,2'-Azobisisobutyronitril und 1 g 2,2·- Azoblsi2,4-dimethylvaleronitril) gegeben. Durch Rühren wurde eine homogene Lösung gebildet. Dieser Lösung wurden 1270 g destilliertes Wasser zugesetzt, in dem 6,25 g teilweise verseiftes Polyvinylacetat (mit einer Viskosität von 23 cPs, gemessen bei 20°C an einer 2%igen wässrigen Lösung, und einem Verseifungsgrad von 88%) und 12,5 g Natriumchlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 45°C, 2 Stunden bei 50°C, 2 Stunden bei 600C und 4 Stunden bei 70°C erhitzt, während es mit 300 UpM gerührt wurde. Während der Reaktion wurden Proben in j bestimmten Abständen genommen. Ein Benzolextrakt der !
Probe wurde durch Gaschromatographie analysiert. Die Menge der verbliebenen Monomeren wurde gemessen, um die Ausbeute an Copolymerisat zu bestimmen. Hierbei wurde bestätigt, daß unter den vorstehend genannten Bedingungen die Ausbeute an Copolymerisat über 98% lag. Da Acrylnitril einen niedrigen Siedepunkt hat, mußte der Wirkungsgrad des Rückflußkühlers durch Durchleiten von kaltem Wasser gesteigert werden.
Das erhaltene Copolymerisat hatte eine gute Kugelform. Der Korndurchmesser war im Bereich von 60 bis 120 u
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verteilt. Nach Naßklassierung unter Verwendung eines Siebes mit einer Maschenweite von 74 η wurden nicht umgesetzte Monomere und organische Flüssigkeiten mit Methanol entfernt. Ein Teil des als Rückstand verbleibenden Copolymerisats wurde entnommen und 18 Stunden bei 600C unter vermindertem Druck getrocknet, wobei eine Probe für die Messung mit einem Porosimeter erhalten wurde. Der Rest des Copolymerprodukts wurde mehrmals mit Wasser gewaschen.
Die Messungen ergaben, daß das gebildete Copolymerisat ein Schüttgewicht von 0,21 g/ml, einen mittleren Porendurchmesser von 1200 A und ein gesamtes Porenvolumen von 2,28 cm /g hatte. Ferner wurde festgestellt, daß das Volumen der Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 600 bis 2400 8 0,87 cm /g betrug. Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als "R-I" bezeichnet.
Beispiel 2
Ein Copolymerisat in Granulatform wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt, wobei jedoch das Acetophenon in einer Menge von 200 g und das Decalin in einer Menge von 50 g verwendet wurden. Der Korndurchmesser war im Bereich von 80 bis 14Ou verteilt, und das Copolymerisat hatte ein Schüttgewicht von 0,25 g/cm , einen mittleren Porendurchmesser von 200 8 und ein Gesamtporenvolumen von 1,83 cm /g. Ferner wurde festgestellt, daß die Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 100 bis 400 8 ein Volumen von 0,86 cm /g hatten·
Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als "R-2" bezeichnet.
30 Beispiel 3
Ein Copolymerisat in Granulatform wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt, wobei jedoch 250 g Benzonitril an Stelle des flüssigen Gemisches von Acetophenon und Decalin zugesetzt wurden. Es wurde fest-
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gestellt, daß der Korndurchmesser im Bereich von 70 bis 150 u verteilt war und das Copolymerisat ein Schüttge-
' 3
wicht von 0,28 g/cm , einen mittleren Porendurchmesser
von 80 8 und ein Gesamtporenvolumen von 1,18 ml/g hatte. Das Volumen der Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 40 bis 160 A betrug 0,50 cm /g. Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als "R-3" bezeichnet.
Verqleichsbeispiel 1
In den bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch verwendeten Kolben wurden 110 g Acetonitril, 90 g 56%iges Divinylbenzol, 2 g 2,2'-Azobisisobutyronitril und 2 g 2,2'-Azobisi2,4-dimethylvaleronitril) gegeben. Dem Ansatz im Kolben wurden 1000 g destilliertes Wasser zugesetzt, das 5 g des gleichen teilweise verseiften PoIyvinylacetals wie in Beispiel 1 und 15 g Natriumchlorid gelöst enthielt. Während das Gemisch mit 350 UpM gerührt wurde, wurde die Polymerisation nach dem gleichen Temperaturprogramm wie in Beispiel 1 durchgeführt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet. Die Ausbeute an Copolymerisat betrug 97%. Messungen ergaben, daß das erhaltene Copolymerisat ein Schüttgewicht von 0,62 g/cm hatte. Die Messung mit dem Porosimeter ergab, daß keine Porenstruktur im Copolymerisat ausgebildet worden war. Dieses Copolymerisat wird nachstehend als "C-I" bezeichnet.
Beispiel 4
Ein Copolymerisat wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt, wobei jedoch 100 g Acetophenon und 50 g Decalin als Flüssigkeiten verwendet wurden. Es zeigte sich, daß der Korndurchmesser im Bereich von 100 ι bis 180 μ verteilt war und das Copolymerisat ein Schütt-
3
gewicht von 0,31 g/cm , einen mittleren Porendurchmesser von 1100 Ä und ein Gesamtporenvolumen von 0,97 cm /g J hatte. Ferner wurde gefunden, daß das Volumen der Poren I mit einem Durchmesser im Bereich von 550 bis 2200 8
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0,40 cm /g betrug. Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als "R-4" bezeichnet.
Beispiel 5
In den in Beispiel 1 beschriebenen Kolben wurden 10 g Hydroxyapatit, 10 g Hydroxyäthylcellulose mit einer Viskosität von 250 cPs, gemessen bei 200C an einer 2%igen wässrigen Lösung, 20 g Calciumchlorid und 2000 ml destilliertes Wasser gegeben. Das Gemisch wurde bei 700C gerührt, bis sich eine homogene Lösung bildete. Die Temperatur der Flüssigkeit wurde dann auf 300C gesenkt. Während die wässrige Lösung mit 300 UpM gerührt wurde, wurde eine homogene Lösung aus 50 g Acrylnitril, 10 g Äthylenglykoldimethacrylat, 40 g Styrol, 300 g Chlorbenzol, 0,25 g t-Butylpervalerat und 0,75 g Benzoylperoxyd auf einmal der wässrigen Lösung zugesetzt. Die Reaktion wurde nach dem vorbestimmten Temperaturprogramm, nämlich 30 Minuten bei 30°C, 1 Stunde bei 40°C, 2 Stunden bei 500C, 2 Stunden bei 60°C, 2 Stunden bei 70°C und 2 Stunden bei 80°C durchgeführt. Das erhaltene Copolymerisat wurde mit Wasser gut gewaschen, worauf die Porencharakteristiken gemessen wurden. Es wurde gefunden, daß der Korndurchmesser im Bereich von 90 bis 26Ou verteilt war und das Copolymerisat einen mittleren Porendurchmesser von 500 A und ein Gesamtporenvolumen von 2,02 ml/gi hatte. Ferner wurde festgestellt, daß das Volumen der | Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 250 bis j lOCO S 1,03 cm /g betrug. Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als "R-5" bezeichnet.
Beispiel 6
In den in Beispiel 1 beschriebenen Kolben wurde eine Lösung aus 50 g Methacrylnitril, 50 g Divinylbenzol von 80% Reinheit, 200 g Äthylbenzol, 100 g Isooctanol und 1 g Lauroylperoxyd gegeben. Eine gesondert hergestellte Suspendierlösung (1650 g einer wässrigen Lösung, die 8g Methylcellulose mit einer Viskosität von 100 cPs,
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gemessen bei 20°C an einer 2%igen wässrigen Lösung, und 4B g Natriumchlorid enthielt) wurde dem Ansatz im Kolben zugesetzt. Während das Gemisch bei 200 UpM gerührt wurde, wurde es eine Stunde bei 6O0C, 4 Stunden bei 75°C und 3 Stunden bei 90°C gerührt. Das erhaltene Copolymerisat wurde mit Wasser gewaschen, worauf seine Porencharakteristiken gemessen wurden. Es wurde gefunden, daß der Korndurchmesser im Bereich von 150 bis 250 u \ verteilt war und das Copolymerisat ein Schüttgewicht von 0,20 g/cm , einen mittleren Porendurchmesser von 3000 A und ein Gesamtporenvolumen von 2,68 cm /g hatte. Es wurde ferner gefunden, daß das Volumen der Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 1500 bis 6000 8 1,05 cm /g betrug. Dieses poröse Copolymerisat wird nach-
15 stehend als "R-6" bezeichnet.
Beispiel 7 ;
In ein druckfestes 100 ml-Glasgefäß wurden 20 g Acryl- J
nitril, 5 g N,N«-Athylendiacrylamid, 0,2 g 2,2'-Azobis- | (2,4-dimethylvaleronitril), 30 g Dimethylformamid und 20 g Toluol gegeben. Das Gefäß wurde verschlossen und das Gemisch bewegt, bis sich eine homogene Lösung bildete. Die Lösung wurde 2 Stunden bei 40°C, 4 Stunden bei 6O0C und 2 Stunden bei 800C erhitzt. Das verschlossene Gefäß wurde gekühlt und dann zerbrochen. Das erhaltene Copolymerisat wurde isoliert, gemahlen, nach der Naßmethode unter Verwendung von Sieben mit Maschenweiten von 74 bis 177 u klassiert und mit einer genügenden Menge Aceton gewaschen, um die flüssigen Komponenten zu entfernen. Dann wurden die Eigenschaften des Copolymerisats mit- einem Porosimeter bestimmt. Das Copolymerisat hatte ein Schüttgewicht von 0,26 g/cm , einen mittleren Porendurchmesser von 800 α und ein Gesamtporenvolumen von 1,65 cm /g. Das Volumen der Poren mit Durchmessern im Bereich von 400 bis 1600 S betrug 0,73 cm /g. Das poröse Copolymerisat wird nachstehend als "R-7" bezeichnet.
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Beispiel 8
Zu 10 ml einer Lösung, die 30 mg eines der in Tabelle 1 genannten Proteine enthielt, wurden 0,5 g des nassen porösen Copolymerisats R-I gegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 30°C geschüttelt. Eine Fällung wurde durch Zentrifugalabscheidung entfernt. Die Konzentration des Proteins im Überstand wurde nach der Methode von , Lowry und Mitarbeitern gemessen (O.H.Lowry und Mitar- | beiter, J.Biol.Chem. 193 (1951) 265). Der Unterschied i zwischen der so bestimmten Proteinkonzentration und der für das vom Copolymerisat R-I freie Sys'tem gemessenen Proteinkonzentration wurde als die Menge des adsorbier- j ten Proteins angenommen. Für Urease, Katalyse, ot-Chymotrypsin, Trypsin und Pepsin wurde ferner die restliche :
enzymatische Aktivität im Überstand gemessen. i
ί Ferner wurde die enzymatische Aktitität der am Copoly- j
merisat adsorbierten Enzyme nach den nachstehend beschriebenen üblichen Methoden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 genannt. Die adsorbierte Menge der Proteine ist in mg/g trockenes Copolymerisat angegeben.
Die Aktivität der Urease wurde nach der Methode von D.D.Vanslyke und Mitarbeitern (J.Biol.Chem. 154 (1944) 623 und die Aktivität der Katalase nach der Methode von H.U.Bergmeyer bestimmt (Biochem. Z. 327 (1955) 255). Die Aktivität von a-Chymotrypsin wurde nach der Methode G.W.Schwert und Mitarbeitern (Biochem. Biophysica Act» 16 (1955) 570) und die Aktivität von Pepsin nach der Methode von L.M. Baker und Mitarbeitern (J.Biol. Chem. 211 (1954) 701) bestimmt.
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Vv
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Tabelle 1
Protein Molekular- Isoelek- Menge des Aktivigewlcht trischer adsor- tat des Punkt bierten adsor-
Proteins, bierten mg Enzyms,%
Restliche Aktivität des Enzyms im Überstand,%
Urease der
Jackbaumfrucht
470 000
5.0-5.1
Katalase
von Rinds- 240 000 leber
Menschl. 160 000 5.8-7.3 γ-Globulin
Menschl. 68.000 6.8-7.0 Hämoglobin
Ovalbumin 45 000
Pepsin
35 000
γ-Chymo-
trypsin 25 000 von Rinder-
pankreas
4.7
1.0
9.1
160 60
100 110
120 110
11
10
Beispiel 9
Auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurde Trypsin (mit einem Molekulargewicht von 20.000 und einem isoelektrischen Punkt von 10,0) am porösen Copolymerisat R-I adsorbiert. Die Menge des adsorbierten Proteins betrug 130 mg/g trockenes Copolymerisat und die restliche enzymatische Aktivität im Überstand 45%. Das erhaltene Copolymer-Protein-Verbundmaterial wurde in eine Kolonne gefüllt. Eine 0,05-molare Tris(Hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung von Benzoylargininäthylesterhydrochlorid als Substrat (Konzentration 34 g/l, pH 8,0) wurde mit einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 2 Std."~ durch die Säule geleitet. Nach einer Kontaktdauer von 96 Std. betrug die relative Aktivität des adsorbierten Enzyms 70%.
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Die Aktivität des Trypsins v/urde nach der Methode von G.W. Schwert und Mitarbeitern (Biochem. Biophysica Acta 16 (1955) 570) bestimmt.
Beispiel 10 und Vergleichsbeispiel 2
Auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden die Mengen des an den porösen Copolymeren R-2 und R-3 adsorbierten Proteins für die in Tabelle 1 genannten Proteine und Trypsin bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 genannt.
Zum Vergleich wurden die am nicht-porösen Harz C-I adsorbierten Mengen dieser Proteine bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2 genannt.
Tabelle 2
Protein Menge des adsorbierten Proteins. C-I
mg/g trockenes Copolymerisat 0
R-2 0
Urease 20 0
Catalase 30 _♦
γ-Globulin 10 IO
Hämoglobin 110
Ovalbumin 50 10
Pepsin 80 5
a-Chymotrypsin 130
Trypsin 140
R-3
10
20
0
50
30
60
80
80
-* : Nicht gemessen.
25 Beispiel 11
Auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden die in Tabelle 3 genannten Proteine am Copolymerisat R-I adsorbiert. Das Copolymer-Protein-Verbundmaterial wurde in eine Kolonne gefüllt. Dann wurde das Verbundmaterial mit Wasser in einer Menge, die dem 3-fachen Fassungsvermögen der Kolonne entsprach, gewaschen. Das Protein wurde mit einer Elutionslösung in einer Menge, die dem 5-fachen Fassungsvermögen der Kolonne entsprach, eluiert, Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.
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Ma
Tabelle 3
Protein Moleku- Isoelektr. Menge des lar- Punkt adsorbiergewicht ten Pro
teins (mg/g trockenes Copolymeres)
Elutions- Proteingelösung winnung, %
Albumin von
menschl.
Serum 65.000 4,7
Cytochrom C
vom Pferdeherz 13.000 10
Bacitracin 1.40O
20%iges
(V/V)
Aceton
0,2-molarer
Phosphatpuffer
0,In-HCl
91
70
85
Beispiel 12 und Vergleichsbeispiel 3
Die Mengen des an den porösen Copolymerisaten R-2 und R-3 adsorbierten Proteins wurden für die in Tabelle genannten Proteine nach der in Beispiel 8 beschriebenen Methode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt. Zum Vergleich wurden die Mengen der am nicht porösen Harz C-I adsorbierten Proteine in der gleichen Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 4 genannt.
Protein
Tabelle 4 Menge des adsorbierten Proteins,
■ ■ ■ ^4 f ^fl ^* ^,^ h^
R-2		 R-3 ^ ^^ fh^ ^^ ^ W w ' ^"* * ^ ^' ^— ^ 9^
C-I
Serumalbumin 180 100 _·
Cytochrom C 30 10 0
Bacitracin 150 120 20
-·: Nicht gemessen.
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SO
Beispiel 13
Durch eine Kolonne, die einen Innendurchmesser von 1,1 cm hatte und mit 10 ml des porösen Copolymerisats R-I gefüllt war, wurden 2 1 roher japanischer Sake, der nach dem üblichen Verfahren hergestellt worden war, mit einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 10 Std. geleitet. Vor [ und nach der Behandlung wurde die Flüssigkeit der Super- | zentrifugalabscheidung (30 Minuten unter 50 000 G) unterworfen. Die Trockengewichte der vor und nach der Behänd- j lung in der Kolonne erhaltenen Fällungen wurden gemessen und verglichen. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Fällung Roher japanischer Sake Behandelter japanischer Sake Entfernte Menge der Fällung
Beispiel 14
105 ppm 5 ppm 95%
Auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden die Trypsinmengen, die an den porösen Copolymerisaten R-4 R-5, R-6 und R-7 adsorbiert wurden, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 genannt.
Copolymerisat
R-4 R-5 R-6 R-7
Tabelle 5
Menge des adsorbierten Trypsins, mq/q des trockenen Copolymerisats
80 120 100 150
Beispiele 15 bis 18
Die Polymerisation wurde in dem gleichen Kolben wie in Beispiel 1 auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt, wobei jedoch die Zusammensetzung des Ansatzes unterschiedlich war. Die Zusammensetzung des Ansatzes und die Porencharakteristiken sind in Tabelle 6 genannt.
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OO O CD
Tabelle 6
Beispiel Monomeres Flüssig- Schüttge- Mittlerer Gesamt- Porenvolumen Nr. keit wicht Poren- poren- (0,5 d bis
durchmesser volumen 2d) (d)
15(R-15) AN 10g CH 20g 0,22 g/ml 1.400 A 1,88 ml/g 0,77 ml/g
o DVB 90g IAA 180g
co 16(R-16) AN 46g CH 66g 0,19 g/ml 500 A 1,52 ml/g 0,61 ml/g
_* DVB 54g IAA 154g
00 ο
**- 17(R-17) AN 64g CH 40g 0,19 g/ml 2-800 A 1,99 ml/g 0,98 ml/g (Ji
° DVB 36g IAA 160g ^>
i^ 18(R-18) AN 82g CH 100g 0,17 g/ml 2*400 A 1,44 ml/g 0,60 ml/g
DVB 18g IAA 100g
AN » Acrylnitril. DVB = 56%iges Divinylbenzol
CH = Cyclohexanon. IAA = Isoamylacetat
Porenvolumen (0,5 d bis 2d): Volumen der Poren mit einem Porendurchmesser im Bereich
von 0,5d bis 2d.
Die gemäfi den Beispielen 15 bis 18 erhaltenen porösen Copolymerisate werden nach- ^°
stehend als "R-15", "R-16", "R-17" und "R-18" bezeichnet. 4>
CD KJ ■^J
Verqleichsbeispiel 4
In den gleichen Kolben wie in Beispiel 1 wurden 20 g Acrylnitril, 180 g 56%iges Divinylbenzol, 2 g 2,2f-Azobisisobutyronitril und 2 g 2,2'-Azobisi2,4-dimethylvaleronitril) und 1000 g reines Wasser gegeben, in dem 5 g des gleichen teilweise verseiften Polyvinylacetats wie in Beispiel 1 gelöst waren. Dem Ansatz wurden 15 g Natriunchlorid zugesetzt. Während das Gemisch bei 350 UpM gerührt wurde, wurde die Polymerisation nach dem glei- ι chen Temperaturprogramm wie in Beispiel. 1 durchgeführt.
Ebenso wurde die Aufarbeitung auf die in Beispiel 1 j beschriebene Weise durchgeführt. Die Ausbeute an Copoly- j merisat betrug 98% und das Schüttgewicht des erhaltenen ι Copolymerisats 0,59 g/cm . Die Messungen mit dem Porosi- | meter ergaben, daß das Copolymerisat keine Poren ent- |
hielt. Dieses Copolymerisat wird nachstehend als "C-4" bezeichnet. ;
Verqleichsbeispiel 5
In den gleichen Kolben wie in Beispiel 1 wurden eine homogene Lösung von 100 g 56%igem Divinylbenzol, 80 g Tetralin, 120 g Cyclohexanol und 1 g Benzoylperoxyd gegeben. Dieser Lösung wurden 1500 g reines Wasser zugesetzt, das 9 g Methylcellulöse" (mit einer· viskosität von 100 cPs, gemessen bei 200C an einer 2#igen wäßrigen Lösung gelöst enthielt. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 60°C, 3 Stunden bei 70°C und 4 Stunden bei 80°C gerührt, wobei ein Copolymerisat mit einem Korndurchmesser von 60 bis 200 η und einem Schüttgewicht von 0,23 g/cm erhalten wurde. Die Messungen mit einem Porosimeter ergaben daß der mittlere Porendurchmesser 1300 A, das gesamte Porenvolumen 1,63 ml/g und das Volumen der Poren mit einem Durchmesser von 650 bis 2600 8 0,53 cm /g betrug. Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als "C-5" bezeichnet.
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Beispiel 19 und Verqleichsbeispiel 6
Auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden die Mengen des an den porösen Copolymerisaten R-15, R-16, C-4 und C-5 adsorbierten Proteins bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 genannt.
Im vorliegenden Fall wurden Serumalbumin, ot-Chymotrypsin und Lipase als zu untersuchende Proteine verwendet.
Tabelle 7
Protein 10
Protein Adsorbierte Menge des
Proteins		 Beispiel 20 C-5
30
mg/g des trockenen Copoly
merisate		 20
Serumalbumin R-15 R-16 C-4 30
a-Chymotrypsin 120 150 10
Lipase 90 90 5
130 190 10
Ein Gemisch von 80 g a-Chloracrylnitril, 20 g Trimethyl<»lpropantrimethacrylat, 300 g Toluol und 1 g Benzoylperoxyd wurde der Suspensionspolymerisation in einer wässrigen Lösung aus 2000 g reinem Wasser, 20 g Carboxymethylcellulose mit einer Viskosität von 300 cPs (gemessen bei 20°C an einer 2%igen wässrigen Lösung) und 40 g Natriumchlorid unterworfen. Das Temperaturprogramm der Polymerisation und die Aufarbeitung waren die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das erhaltene Copolymerisat hatte die folgenden Porencharakteristiken:
Mittlerer Porendurchmesser: 5000 8
Gesamtporenvolumen: 2,42 cm /g
30 Volumen der Poren mit einem
Durchmesser im Bereich von -
2500 bis 10.000 8: 1,36 cnT/g
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- 94 -
Beispiel 21
Ein Gemisch von 50 g ot-Phenylacrylnitril, 50 g 80%igem Divinylbenzol, 200 g γ-Butyrolacton und 2 g 2,2'-Azobisisobutyronitril wurde der Suspensionspolymerisation in einer wässrigen Suspension von 80 g BaSO4 und 10 g der in Beispiel 6 genannten Methylcellulose in 2000 g reinem V/asser unterworfen. Das Temperaturprogramm der Polymerisation und die Aufarbeitung waren die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben· Das erhaltene Copolymerisat hatte die folgenden Porencharakteristiken:
Mittlerer Porendurchmesser 800 8
Gesamtporenvolumen 2,03 ml/g
Volumen der Poren mit einem Durch- ,
messer im Bereich von 400 bis 1600 A 1,01 cm /g
15 Beispiel 22
Zu 100 ml einer 0,1-molaren Phosphatpufferlösung (pH 7,0), in der 50 mg Urease (760 Einheiten/mg) gelöst waren, die aus der Jackbrotbaumfrucht extrahiert worden war, wurden 10 g des nassen porösen Copolymerisats R-16 [
gegeben. Die erhaltene Suspension wurde 4 Std. bei 25°C gerührt. Das erhaltene Verbundrnaterial aus Copolymerem und Urease wurde in eine Kolonne gefüllt (Innendurchmesser 1,5 cm, Höhe 10 cm), die mit Mantel und Glasfilter versehen war. Durch die Kolonne wurden 50 ml 0,1-molare Phosphatpufferlösung (250C, pH 7,0) von oben nach unten geleitet. Anschließend wurde eine 0,1-molare wäßrige Harnstofflösung (pH 7,0) bei 37°C mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 200 ml/Std durch die Kolonne geleitet. Die Bestimmung des erhaltenen Ammoniaks ergab, daß die Zersetzung des
30 Harnstoffs 95$ betrug.
Die enzymatische Aktivität der Urease wurde nach der folgenden Methode bestimmt: Die enzymatische Reaktion des Harnstoffs wurde bei einem pH-Wert von 7,0 bei 37°C durchgeführt. Das erhaltene Ammoniak wurde mit Hilfe der
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Nesslerschen kolorimetrischen Analyse bestimmt. Die enzymatische Aktivität der Urease, die für die Bildung von Iu Mol Ammoniak/Std. erforderlich ist, wird als 1 Einheit bewertet.
5 Beispiel 23
Jeweils 1 g der in Tabelle 8 genannten trockenen porösen Copolymerisate wurden zu 10 ml Rinderserum gegeben, das 120 mg Proteine enthielt. Die erhaltenen Suspensionen wurden 2 Stunden bei 35°C geschüttelt. Die Proteine im Überstand und die am porösen Copolymerisat adsorbierte Proteinmenge wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in j Tabelle 8 genannt. ;
Die Proteine wurden durch Messung der optischen Dichte (278 mu) bestimmt. \
15 Tabelle 8
Copolymerisat Menge der adsorbierten Proteine, I mq/g des trockenen Copolymerisats
R-I 78
R-16 63
20 R-17 61
R-18 58
Verqleichsbeisplel 7
Ein Gemisch von 90 g 56%igem Divinylbenzol, 10 g Styrol, 50 g Toluol, 100 g sek.-Butanol und 1 g Benzoylperoxyd wurde der Suspensionspolymerisation im wesentlichen aaf die in Beispiel 1 beschriebene Weise unterworfen. Das erhaltene Copolymerisat hatte die folgenden Porencharakteristiken:
Mittlerer Porendurchmesser 200 8
Gesamtporenvolumen 0,78 ml/g
Dieses Copolymerisat wird als "C-7" bezeichnet.
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Verqleichsbeispiel 8
In die gleiche Kolonne wie in Beispiel 22 wurde 1 g des trockenen Copolymerisats C-I gefüllt. Durch die Kolonne wurden Methanol und dann 200 ml Wasser geleitet, wobei das nasse Copolymerisat erhalten wurde. Unter Verwendung dieses nassen Copolymerisats wurden im wesentlichen die gleichen Versuche, die in Beispiel 22 beschrieben wurden, wiederholt. Eine Adsorption von Urease wurde nicht festgestellt.
10 Vergleichsbeispiel 9
Ein Gemisch von 55 g Acrylnitril, 45 g 56%igem Divinylbenzol, 30 g Decalin, 1 g 2,2'-Azobisisobutyronitril und 1 g 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril) wurde im wesentlichen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise der Suspensionspolymerisation in einer wässrigen Lösung unterworfen, die aus 650 g reinem Wasser, 3 g teilweise verseiftem Polyvinylacetat, wie es in Beispiel 1 verwendet wurde, und 6 g Natriumchlorid bestand. Das erhaltene Copolymerisat hatte die folgenden Porencharakte-
20 ristiken:
Mittlerer Porendurchmesser 600 8
Gesamtporenvolumen 0,20 ml/g
Die am erhaltenen Copolymerisat adsorbierte Proteinmenge wurde nach der in Beispiel 8 beschriebenen Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 genannt.
Tabelle 9
Protein Menge des adsorbierten Proteins mq/q des trockenen Copolymerisats
Katalase 10
30 Hämoglobin 15
Trypsin 10
Bacitracin 25
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- 54--
Beispiel 24
Die Mengen des an den porösen Copolymerisaten R-5, R-6, R-20 und R-21 adsorbierten Proteins wurden nach der folgenden Methode bestimmt: In eine Glaskolonne (Innendurchmesser 1,5 cm, Höhe 10 cm) mit Mantel und Glasfilter wurden 2 g des jeweiligen porösen Copolymerisats gefüllt. Durch die Säule wurden 50 ml Methanol und dann 200 ml Wasser geleitet. Anschließend wurden 100 ml Wasser, das jeweils 100 mg der in Tabelle 10 genannten Proteine enthielt, von oben nach unten .bei 30°C und einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 4 Std. und anschließend 10 ml Wasser durchgeleitet. Die durchgeleitete Flüssigkeit wurde eingedampft, worauf die restlichen Proteine gewogen wurden. Die erhaltenen Ergeb-
15 nisse sind in Tabelle 10 genannt.
Tabelle 10
Protein Menge des adsorbierten Proteins, R-20 R-21
mg/q des trockenen Copolymerisats 21 26
R-5 R-6 31 33
γ-Globulin 32 36 26 32
Hämoglobin 28 35 - -
Urease 41 35 - -
Vasopressin 29 31
Fibrinogen 38 19
Beispiel 25
In eine Kolonne (Innendurchmesser 1 cm, Höhe 10 cm), die mit einem Glasfilter versehen war, wurden 5 g des nassen Copolymerisats R-19 gefüllt. Zu 10 ml Rinderblut wurden 1 mg des Natriumsalzes von Heparin und 90 ml Wasser gegeben. Die erhaltene Lösung wurde bei 30°C und einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 15 Std. durch die Kolonne geleitet. Hierbei wurden 98% des in der Lösung enthaltenen Hämoglobins am Copolymerisat adsorbiert. Das Hämoglobin wurde durch Adsorption bei 555 um und 430 um im sichtbaren Spektrum bestimmt.
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Beispiel 26
Im wesentlichen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise , wurde ein Gemisch von 50 g Acrylnitril, 30 g Styrol, 20 g Athylenglykoldimethacrylat, 100 g Toluol, 10 g Polystyrol mit einem Molekulargewicht von 40.000 und 2 g 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril) der Suspensionspolymerisation in einer wässrigen Lösung von 1000 g ] reinem Wasser, 5 g teilverseiftem Polyvinylacetat > wie es in Beispiel 1 verwendet wurde, und 10 g Natriumchlorid unterworfen. Das erhaltene Copolymerisat hatte die
folgenden Porencharakteristiken: |
ο i
Mittlerer Porendurchmesser 2000 X
Gesamtporenvolumen 0,82 cm /g
Volumen der Poren mit einem ^ I
Durchmesser im Bereich von 1000-4000 A: 0,54 cm /g
Die am erhaltenen porösen Copolymerisat adsorbierte j Menge des Proteins wurde nach der in Beispiel 8 be- ! schriebenen Methode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 11 genannt.
20 Tabelle 11
Protein Menge des adsorbierten Proteins>
mq/q des trockenen Copolymerisats
Trypsin 30
Ovalbumin 18
25 Serumalbumin 42
Verqleichsbeispiel 10
Im wesentlichen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurde die Suspensionspolymerisation durchgeführt, wobei als Monomere 12 g 56%iges Divinylbenzol und 48 g Acrylnitril, als organische Flüssigkeit 260 g Toluol und 40 g Cyclohexanol und als Initiator 0,4 g 2,2'-Azobisisobutyronitril und 0,4 g 2,2'-Azobis(dimethylvaleronitril) verwendet wurden. Das erhaltene Copolymerisat war so spröde, daß es beim Klassierungsvorgang leicht
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- 98 -
zusammenfiel. Das Reaktionsgemisch wurde daher in ein Decherglas gegeben. Dem Gemisch wurde warmes Wasser von 50°C in der 10-fachen Menge der für die Polymerisationsreaktion verwendeten wässrigen Lösung zugesetzt. Das hierbei erhaltene Gemisch wurde sachte gerührt und dann stehen gelassen. Der erhaltene Überstand wurde entfernt. Diese Reihe von Maßnahmen wurde zweimal wiederholt. Anschließend wurden die gleichen Maßnahmen zweimal unter Verwendung von Aceton in einer Menge, die dem. 10-fachen scheinbaren Volumen des Copolymerisats entsprach, und anschließend zweimal unter Verwendung von Wasser wiederholt. Das erhaltene Copolymerisat hatte die folgenden Porencharakteristiken:
Mittlerer Porendurchmesser 1500 8
Gesamtporenvolumen 5,12 ml/g
In eine Kolonne mit einem Innendurchmesser von 1 cm und einer Höhe von 10 cm wurden 5 g des nassen Copolymerisats gefüllt. Eine wässrige Lösung von Ovalbumin wurde durch die Kolonne geleitet. Das Filter wurde durch das Pulver des Copolymerisats verstopft und der Durchlauf der Flüssigkeit im Laufe des Adsorptionsvorgangs verhindert.
Die am Copolymerisat adsorbierte Menge des Proteins wurde nach der in Beispiel 8 beschriebenen Chargenmethode bestimmt. Sie betrug 110 mg/g, jedoch betrug das Schüttgewicht nur 0,05. Daher war die pro Volumeneinheit adsorbierte Proteinmenge gering, und starke Pulverisierung des Copolymerisats wurde selbst während der chargenweise durchgeführten Adsorption festgestellt.
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Claims (32)

Patentansprüche
1) Adsorptionsmittel für Proteine, das im wesentlichen aus einem porösen Polymerisat besteht, das hergestellt worden ist durch Copolymerisation eines Monomerengemisches aus 2 bis 98 Gew.-% wenigstens eines Cyangruppen enthaltenden Monomeren der allgemeinen Formel \
CN j
CH0=C (A) ;
in der R ein Wasserstoffatom, ein Alkylrest mit 1 bis '
10 C-Atomen, ein Halogenatom, eine Cyangruppe, ein ! Methoxyrest, eine Acetoxygruppe oder ein unsubstituierter oder substituierter Phenylrest der Formel _/r~\ I
ist (worin R1 ein Wasserstoffatom, ein Alkylrest mit 1 ! bis 10 C-Atomen, ein Halogenatom, eine Cyangruppe, ' ein Methoxyrest oder Acetoxyrest ist), und 2 bis 98 Gew.-% wenigstens eines vernetzbaren Monomeren, wobei das Copolymerisat einen mittleren Porendurchmesser (d)von 40 bis 9000 8 und ein Gesamtporenvolumen von 0,05 */)T ml bis 1,5 VX ml/g Copolymerisat im trockenen Zustand hat, worin X der Gewichtsanteil des vernetzbaren Monomeren in Gewichtsprozent, bezogen auf j die Gesamtmonomeren, bezeichnet.
2) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an Cyangruppen enthaltendem Monomeren!
4 bis 95 Gew.-%, vorzugsweise 6 bis 90 Gew.-% beträgt.
3) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Cyangruppen enthaltende Monomere Acrylnitril, Methacrylnitril oder ein Gemisch von Acrylnitril und Methacrylnitril ist.
4) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das vernetzbare Monomere ein Monomeres mit
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CH 2 C - C - ο — R2 CH_ - O 1 O
II C Rl \ CH Il -fCH - 2 η C - 0 Rl
" 2" 274627b
2 bis 4 Vinylgruppen ist.
5) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das vernetzbare Monomere Divinylbenzol ist.
6) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekenn-
j zeichnet, daß das vernetzbare Monomere ein Monomeres
der allgemeinen Formel J
(B)
ist, worin R^ und R- Wasserstoffatome oder Methylreste sind und η eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist.
7) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gewichtsanteil des vernetzbaren Monomeren 8 bis 80 Gew.-% beträgt.
8) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der mittlere Porendurchmesser (d) im Bereich von 50 bis 5000 S liegt.
9) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen der Poren mit einem Durchmesser von 0,5 d bis 2 d nicht größer als 60 % des gesamten Porenvolumens ist.
10) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das gesamte Porenvolumen im Bereich von 0,2 VX ml bis 1,3 ν/Χ ml pro Gramm des Copolymerisats im trockenen Zustand beträgt.
11) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Molekulargewicht von 1000 bis 1000 000 hat.
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12) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Albumin von menschlichem Serum ist.
13) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein a-Chymotrypsin ist.
14) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Lipase ist.
15) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Enzym ist.
16) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 11 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Trypsin ist.
17) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 11 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Chymotrypsin ist.
18) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekenn-|
zeichnet, daß das Protein ein Antigen ist. j
19) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Antikörper ist.
20) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das poröse Copolymerisat Kugelform aufweist.
21) Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das poröse Copolymerisat ein Produkt ist, das hergestellt worden ist durch Suspensionspolymerisation in einer wässrigen Lösung in Gegenwart eines freie Radikale bildenden Initiators.
22) Verwendung von Adsorptionsmitteln nach Anspruch 1 bis für die Adsorption von Proteinen aus Lösungen oder Dispersionen des Proteins, wobei man die Lösung oder Dispersion des Proteins mit dem Adsorptionsmittel in Berührung bringt, das in einer Menge von 0,02 bis 300 g/l
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Lösung oder Dispersion verwendet wird.
23) Verwendung nach Anspruch 22, wobei man die Behandlung der Lösung oder Dispersion mit dem porösen Copolymerisat chargenweise vornimmt.
24) Verwendung nach Anspruch 22, wobei man die Behandlung der Lösung oder Dispersion mit dem porösen Copolymerisat ' kontinuierlich vornimmt.
25) Verwendung nach Anspruch 22, wobei man die Behandlung der Lösung oder Dispersion mit dem porösen Copolymerisat bei einer Temperatur im Bereich von 2° bis 95°C vornimmt.
26) Verwendung nach Anspruch 2.5. wobei man die Behandlung während einer Zeit im Bereich von 10 Sekunden bis ι 500 Stunden Vornimmt.
27) Verwendung nach Anspruch 24, wobei man die Lösung oder j Dispersion bei einer Raumströmungsgeschwindigkeit im Bereich von 0,01 bis 1000 Std. zuführt.
28) Verwendung nach Anspruch 22, wobei die Lösung oder Dispersion einen pH-Wert von 1 bis 11 hat.
29) Verbundmaterial, bestehend aus einem porösen Copolymerisat nach Anspruch 1 bis 10 und einem Protein in einer solchen Menge, daß das am Copolymerisat adsorbierte Protein Aktivität ausübt.
30) Verbundmaterial nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des Proteins wenigstens 10 mg/g Copolymerisat im trockenen Zustand beträgt.
31) Verbundmaterial nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des Proteins wenigstens 20 mg/g Copolymerisat im trockenen Zustand betragt.
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32) Verbundmaterial nach Anspruch 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß es als Protein ein Enzym enthält.
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