DE2726188C2 - Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparats - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparats

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier

Description

55
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparates.
Es ist bekannt, Enzyme durch Bindung an organische oder anorganische Träger zu immobilisieren, d.h. eo wasserunlöslich zu machen, so daß diese wiederverwendbar sind und in kontinuierlich arbeitenden Verfahren eingesetzt werden können.
Organische Materialien (z. B. Zellulose, Nylon, Polyacrylamid) weisen als Träger erhebliche Nachteile auf, b5 da sie keine ausreichende mechanische Stabilität besitzen, vom Lösungsmittel angegriffen werden können, gegenüber wechselnden pH-Werten und Ionenstär ken empfindlich sind und teilweise zum Niikrobenbefall neigen, wodurch die Bindung zum Enyzm gelöst werden kann.
Deshalb wurden anorganische Substanzen als Träger vorgeschlagen, auf denen Enzyme adsorptiv oder kovalent gebunden werden. Die bevorzugte Art der Bindung hängt von der Art und den Einsatzbedingungen des Enzyms und der Beschaffenheit des Substrates ab. Liegt das Substrat beispielsweise in einer starken Salzkonzentration vor, ist die Adsorptionsmethode nicht anwendbar, da eine Desorption der adsorbierten Enzymmoleküle möglich ist Deshalb wird die kovalents Bindung des Enzyms an den Träger vorgezogen. Die Trägeroberfläche muß dann spezifische funktionelle Gruppen enthalten, die eine Bindung des Enzyms gewährleisten. Da der Träger diese funktioneilen Gruppen in den meisten Fällen nicht besitzt, ist eine Vorbehandlung der Oberfläche erforderlich. Bekannt ist beispielsweise die Belegung von anorganischem Material mit Silanen, wodurch die Oberfläche organisch funktionelle Gruppen (z. B. Alkylamin) erhält, die mit organischer Substanz eine kovalente Bindung eingehen. Weiterhin ist die Behandlung anorganischer Träger mit Sulfurylchlorid, Thionylchlorid oder Cyanurchlorid erprobt worden. Außerdem ist es möglich, die Trägeroberfläche mit einem wasserunlöslichen Polymer zu überziehen, das freie funktionelle Gruppen aufweist, wie z. B. Polyacrolein, das zwischen 10 und 70% freie Aldehydgruppen, bezogen auf die Anzahl der monomeren Moleküle, besitzt
Als Material für anorganische Träger wurden Aluminiumoxide, Nickeloxid, Eisenoxid, Titanoxid, Zirkonoxid, Hydroxylapatit, Silikate und poröses Glas vorgeschlagen, deren Porenstruktur die Zugänglichkeit des Enzyms und des Substrates zur inneren Oberfläche gewährleistet, über deren weitere wünschenswerte Eigenschaften, wie z. B. optimale Porenverteilung und Oberflächengröße jedoch sehr unterschiedliche Angaben vorliegen.
Mit keinem der genannten Träger gelang es, unabhängig von der angewandten Bindungsart, Enzyme so zu immobilisieren, daß ihre spezifische Aktivität der spezifischen Aktivität im freien Zustand nahekommt Nach Angaben von D. L Latigue (Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, London 1975, S. 127) liegen auch unter besten Immobilisierungsbedingungen nur maximal 80% des auf dem Träger aufgebrachten Enzyms in aktiver Form vor.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die bekannten Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher Enzympräparate, bei denen man einen anorganischen Träger mit funktioneilen Gruppen zur kovalenten Bindung mit einer Enzymlösung in Berührung bringt, so zu verbessern, daß bei minimalem Enzymaufwand ein maximal aktives Präparat erhalten wird.
Die Lösung dieser Aufgabe gelingt gemäß der Erfindung dadurch, daß man einen Träger mit einem solchen häufigsten Porendurchmesser auswählt, der ungeachtet der an ihn gebundenen Enzymmenge ein Präparat mit maximaler Aktivität ergibt, und daß man den so ausgewählten Träger mit einer Enzymlösung in Berührung bringt, die nur so viel Enzym enthält, daß die spezifische Aktivität des damit hergestellten Präparats die spezifische Aktivität des Enzyms in freiem Zustand erreicht oder ihr nahekommt.
Bei der Lehre nach der Erfindung werden zunächst Träger mit unterschiedlichen häufigsten Porendurchmessern nach bekannten Methoden mit Kupplungsmit-
teln versehen, die sowohl ausreichend fest am Träger haften, insbesondere eine kovalente Bindung zum Träger eingehen, als auch zu einer kovalenten Bindung mit dem Enzym befähigt sind. Als gebräuchlichste Methode hat sich in der Vergangenheit für anorganische Träger die Silanisierung durchgesetzt, es sind aber, wie schon ausgeführt, auch andere Kupplungsmittel einsetzbar. Die Anzahl der Kupplungsglieder am Träger muß hinreichend groß sein und hängt weitgehend von der Oberfläche des Trägers ab.
Den so vorbehandelten Trägern werden dann unterschiedliche Enzymmengen angeboten, indem man sie mit Enzymlösungen unterschiedlicher Konzentration in Berührung bringt und nach bekannten Methoden eine kovalente Bindung des Enzyms zum Kupplungsglied und damit zum Träger herstellt Nach Bestimmung der Aktivität der so erhaltenen Präparate zeigt sich, daß die Aktivität der Präparate ungeachtet der an sie gebundenen Enzyminenge von dem häufigsten Porendurchmesser abhängt und ein Maximum durchläuft Es hat sich dabei außerdem gezeigt, daß die Korngröße des Trägers für die Lage des Maximums unerheblich ist und allenfalls dessen Absolutwert beeinflußt Die Korngröße des Trägers hat daher für die Lehre nach der Erfindung nur eine untergeordnete Bedeutung und richtet sich weitgehend nach dem vorgesehenen Einsatzzweck, beispielsweise der Viskosität des Substrats, der Verfahrensführung und dgl.
Dem auf diese Weise hinsichtlich des häufigsten Porendurchmessers ermittelten optimalen Träger werden dann wiederum unterschiedliche Mengen Enzym angeboten. Dabei zeigt sich, daß bei bestimmten Enzymkonzentrationen Präparate erhalten werden, deren spezifische Aktivität der spezifischen Aktivität des Enzyms im freien Zustand nahekommt oder diese erreicht, d.h. die relative Aktivität des Präparats erreicht einen Wert von 100%.
Bei Trägern, die aus einem SiCh-GeI hergestellt sind, läßt sich gemäß Weiterbildung der Erfindung der optimale Träger erhalten, wenn man das Gel nach Einstellung eines Alkaligehalts, berechnet als Na2O und bezogen auf Trockensubstanz, von 0,1 bis 0,5 Gew.-%, und Trocknung, 5 bis 10 Stunden in einem wasserdampf -haltigen Luftstrom bei 400° C bis 8500C, vorzugsweise 57O0C bis 750°C, glüht
Zweckmäßigerweise erfolgt die Trocknung in wasserdampf gesättigter Luft bei 180° C bis 200° C. Für das Glühen hat sich ein wasserdampfhaltiger Luftstrom mit einer relativen Feuchte von 40 bis 80% als vorteilhaft erwiesen.
Der so hergestellte Träger weist einen häufigsten Porendurchmesser von 175 bis 3000 A, vorzugsweise 250 bis 600 A, optimalerweise etwa 340 A, auf.
Das erfindungsgemäße Immobilisierungsverfahren ist für alle technisch und analytisch wichtigen Enzyme anwendbar, beispielsweise für Hydrolasen (z. B. Amylasen, Glycosidasen, Proteasen), Oxydoreductasen (GIucoseoxidase, Katalase), Isomerasen (Glucoseisomerase), Transferasen (Dextransucrase).
Für den Fall, daß das Enzym Amyloglucosidase ist, welche im freien Zustand eine spezifische Aktivität von 10 bis 15 Einheiten/mg aufweist, wird das optimale Präparat dann erhalten, wenn man den optimalen Träger mit einer Lösung in Berührung bringt, die 25 bis 75 mg, vorzugsweise 50 mg, Amyloglucosidase pro Gramm Träger enthält
Wird als Enzym Glucoseisomerase eingesetzt, die im freien Zustand eine spezifische Aktivität von 50—70 Einheiten/mg aufweist, erhält man das optimale Präparat wenn der optimale Träger mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die 20—50 mg, vorzugsweise 25 mg Glucoseisomerase pro Gramm Träger enthält Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1 Zur Herstellung des Trägers 1 wurde ein aus
ίο Natriumsilikatlösung mit Schwefelsäure gefälltes SiOrGeI mit einem Na2O-GeImIt von 03 Gew.-% bei 180° C in wasserdampf gesättigter Luft drei Stunden getrocknet 1 kg dieses Materials wurde sechs Stunden bei 730° C in einem Luftstrom von 2 l/min, der einen relativen Feuchtigkeitsgehalt von 80% aufwies, geglüht Nach dieser Behandlung hatte das SiO2 einen häufigsten Porendurcbmesser von 1400 A. Der Träger 1 wurde durch Siebung in Fraktionen getrennt Die weitere Präparation erfolgte mit der Fraktion 0,25 bis 0,5 mm.
150 g dieser Trägerfraktion wurde 8 Stunden mit 4 1 einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Benzol am Rückfluß gekocht und nach Abkühlung mit je 1000 ml Benzol und mit je 1000 ml Aceton dreimal gewaschen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels bei Raumtemperatur im Vakuum wurde der Träger zweimal mit 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) und dreimal mit bidest Wasser gewaschen. Die Trocknung erfolgte über P2O5 im Vakuum. Berechnet auf Basic des Mittelwertes der C- und N-Bestimmung enthielt der
Träger 10,13 m Aq Silan/g.
10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert Die Aktivität der Amyloglucosidase betrug 11,75 U/mg, wobei als Aktivitätsmaß Lf die Bildung von
is 1 μ Mol Glucose/min bei 25° C benutzt wurde. Die Suspension wurde 20 Minuten unter Vakuum gehalten, wieder belüftet und nach zwei Stunden nochmals für 20 Minuten evakuiert Nach vier Stunden erfolgte die Trennung von Träger und Lösung durch Filtration, anschließend dreimaliger Waschung mit bidest Wasser und schließlich eine dreimalige Waschung mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH 5). Die fertige Probe 1.1 wurde in Phosphatpuffer (pH 5) bei 40C aufbewahrt Die C-N-Analyse ergab einen Proteingehalt von 16,5 mg/g.
Zur Herstellung der Probe 1.2 wurden 10 g des silanisierten Trägers 1 in 20 ml von 0,5 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation der Probe 1.1. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 1.2 ergab einen Proteingehalt von 9,0 mg/g.
Beispiel 2
Zur Herstellung des Trägers 2 wurde ein aus Natriumsilikatlösung mit Schwefelsäure gefälltes SiO2-Gel mit einem Na2O-GeIIaIt von 03 Gew.-%, wie im Beispiel 1 beschrieben, getrocknet. 1 kg dieses Materials wurde sechs Stunden bei 680° C in einem Luftstrom von 2 l/min, der einen relativen Feuchtigkeitsgehalt von 80% aufwies, geglüht Nach dieser
bo Behandlung hatte das SiO2 einen häufigsten Porendurchmesser von 340 A. Der Träger 2 wurde durch Siebung in Fraktionen getrennt Die weitere Präparation erfolgte mit der Fraktion 0,25 bis 0,5 mm. 150 g dieser Trägerfraktion wurde acht Stunden mit 4 1 einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Benzol entsprechend dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren behandelt. Der Träger 2 enthielt, berechnet auf Basis des
Mittelwertes der C- und N-Bestimmung, 0,19 mÄq Silan/g.
10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidese in 0,05 m PhosphiUpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispie!. 1 beschrieben, präpariert Die fertige Probe 2.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 30,8 mg/g auf.
Weitere 10 g des silanisierten Trägers 2 wurden in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel 1 (Probe 1.2) beschrieben, behandelt
Die C-N-Analyse der fertigen Probe 22 ergab einen Proteingehalt von 17,4 mg/g.
Beispiel 3
Zur Herstellung des Trägers 3 wurde ein aus Natriumsilikatlösung mit Schwefelsäure gefälltes SiO2-GeI mit einem Na2O-Gehalt von 03 Gew.-%, wie im Beispiel 1 beschrieben, getrocknet 1 kg dieses Materials wurde sechs Stunden bei 640° C in einem Luftstrom von 2 l/min, der einen relativen Feuchtigkeitsgehalt von 60% aufwies, geglüht Nach dieser Behandlung hatte das SiO2 einen häufigsten Porendurchmesser von 180 A. Der Träger 3 wurde durch Siebung in Fraktionen getrennt Die weitere Präparation erfolgte mit der Fraktion 0,25 bis 0,50 mm.
150 g dieser Trägerfraktion wurde acht Stunden mit 41 einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Benzol entsprechend dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren behandelt
Der Träger 3 enthielt, berechnet auf Basii des Mittelwertes der C- und N-Bestimmung 0,51 m Äq Silan/g.
10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiet 1 beschrieben, präpariert
Die fertige Probe 3.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 262 mg/g auf.
Weitere 10 g des silanisierten Trägers 3 wurden in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel 1 (Probe 1.2) beschrieben, behandelt.
Die C-N-Analyse der fertigen Probe 3.2 ergab einen Proteingehalt von 12,7 mg/g.
Beispiel 4
Um den Nachweis zu führen, daß das Kupplungsmittel auf die Aktivität des Präparates keinen Einfluß hat, wurde von dem Träger 2 (häufigster Porendurchmesser 340 A) die Fraktion 0,25—0,5 mm ausgesiebt und davon 50 g in 500 ml 12,5%iger wäßriger Glutardialdehydlösung 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt Anschließend erfolgte ein Zusatz von 500 ml gesättigter NH4C1-Lösung. Nach vierstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Probe mit Wasser bis zur Chloridfreiheit gewaschen und über P2O5 im Vakuum getrocknet
10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und wie im Beispiel 1 beschrieben, präpariert.
Die fertige Probe 4.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 29,8 mg/g auf.
Weitere 10 g des Trägers 2 wurden in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und wie im Beispiel 1 (Probe 1.2) beschrieben, behandelt Die C-N-Analyse der fertigen Probe 42 ergab einen Proteingehalt von 17,9 mg.
Beispiel 5
10 g des Trägers 1 (häufigster Porendurchmesssr 1430 A) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase (Y. T a k a s a -ki, Agr. BioL Chem. 33, Nr. 11, 1527-1534 [1969]) enthielt, suspendiert
ίο Die Reaktionszeit betrug bei Raumtemperatur 30 Minuten. Nach jeweils 10 Minuten wurde das Reaktionsgefäß evakuiert und nach Beendigung der Reaktion die Restlösung abgesaugt Dann erfolgten 3 Waschungen mit Wasser und 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7).
Die fertige Probe 5.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 4,8 mg/g auf.
Zur Herstellung der Probe 52 wurden weitere 10 g des Trägers 1 in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation 5.1.
Die C-N-Analyse der fertigen Probe 5.2 ergab einen Proteingehalt von 2,0 mg/g.
Beispiel 6
10 g des Trägers 2 (häufigster Porendurchmesser 340 A) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert.
Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die fertige Probe 6.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 22,0 mg/g auf.
Zur Herstellung der Probe 6.2 wurden weitere 10 g des Trägers 2 in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlö sung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 62 ergab einen Proteingehalt von 10,2 mg/g.
Beispiel 7
10 g des Trägers 3 (häufigster Porendurchmesser 180 A) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert.
Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die fertige Probe 7.1 wies nach der C-N-Analyse einen Prctcingchait von 11,2 mg/g auf.
Zur Herstellung der Probe 72 wurden weitere 10 g
des Trägers 3 in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlö sung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert Die weitere Verfahrensweise entsprach der
Präparation 5.1.
Die C-N-Analyse der fertigen Probe 72 ergab einen Proteingehalt von 5,1 mg/g.
Beispiel 8
10 g des im Beispiel 4 genannten Trägeis (häufigster Porendurchmesser 340A, behandelt mit wäßriger
to Glutardialdehydlösung) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferiösung (pH 7), die 0,5 g Giucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die fertige Probe 8.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 21,3 mg/g auf.
Zur Herstellung der Probe 82 wurden weitere 10 g des gleichen Trägers in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der
Präparation 5.1. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 8.2 ergab einen Proteingehalt von 9,8 mg/g.
Beispiel 9
Die Aktivität der in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Präparate 1.1, 1.2; 2.1, 2.2; 3.1, 3.2; 4.1,4.2 sowie die des zur Fixierung eingesetzten Enzyms (Amy!og:ucosidase) wurde nach der Dinilrosalizylsäuremethode (vergl. Rick, W., Stegbauer, H. P. in: B e r g in e y e r, H. U. »Meth. d. Enzymatischen Analyse«, Verlag Chemie 1970 S. 848 ff) bestimmt. Eine Aktivitätseinheit (U) entspricht der Enzymmenge, die unter Inkubationsbedingungen 1 μ Äquivalent reduzierende Gruppen (berechnet als Glucose) pro Minute freisetzt.
gungen in einem 40 ml Reaktor bei einer Rührgeschwin digkeit von 600 min-' (Produktbildungsrate unabhängig von Rührgeschwindigkeit) suspendiert.
Der Proteingehalt der Präparate wurde auf Basis dei Mittelwerte der C-N-Bestimmung ermittelt. Der häufig ste Porendurchmesser der Träger wurde aus dei Porenverteilung (gemessen mit Hochdruckporosimeter bestimmt.
In der folgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse dei Proben 1—4 zusammengestellt. Die verwendeter Kenngrößen werden wie folgt definiert:
inkubationsbedingungen
2%ige Substratlösung (Zulkowsky-Stärke) in 0,1 m Acetatpuffer pH 5,0,30 Minuten, 25° C.
Trägerfixierte Präparate wurden unter o. a. Bedin-
Tabelle 1
(Fixierte Amyloglucosidase)
Häufigster D (A)
Porendurchmesser Ce (mg Enzym/g Träger)
Enzymaufnahme U (Units/g Probe)
Aktivität Us iy/Cf(Units/mg Enzym)
Spez. Aktivität
Sipez. Aktivität Usf (Units/mg Enzym)
i. freien Zustand Urel= 100.-^(0/0)
Relative Aktivität
Probe
Häufigster
Porendurchm.
Enzymaufnahme
Aktivität
Usf
1.1
1.2
1400 16,5
9,0
98,4
100,5
5,96
11,16
51
95
2.1
2.2
340 30,8
17,4
208,8
203,9
6,77
11,71
58
100
3.1
3.2
180 26,2
12,7
150,0
149,5
5,72
11,77
49
100
4.1
4.2
340 29,8
17,9
199,7
209,4
6,70
11,70
57
100
11,75
Beispiel 10
Die Aktivität der in den Beispielen 5—8 beschriebenen Präparate 5.1, 52; 6.1, 6.2; 7.1, 72; 8.1, 8.2 sowie die der zur Fixierung eingesetzten Glucoseisomerase wurde nach der Takasaki-Methode (vgl. Y. Takasaki: Agr. Biol. Chem. Vol. 30, Nr. 12,1247-1253,1966 und Z. Dische und E Borenfreund : J. Biol. Chem. 192, 583, 1951) bestimmt Eine Aktivitätseinheit (U) ist definiert als die Enzymmenge, die unter Inkubationsbedingungen 1 mg Fructose bildet
Inkubationsbedingungen
Temperatur 65° C
Reaktionszeit 1 h
Tabelle 2
(Fixierte Glucoseisomerase)
Substrat 0,1 m Glucose xH2O (Merck 8342) in
0,05 m Phosphatpuffer, pH 8,0 mit
0,0004 m MgSO4
Die trägerfixierten Präparate wurden wie im Beispiel 9 beschrieben unter Standardbedingungen im Rührreaktor suspendiert
Der Proteingehalt der Präparate wurde auf Basis der Mittelwerte der C-N-Bestimmung ermittelt
In der folgenden Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Proben 5—8 zusammengestellt
Die Definition der verwendeten Kenngrößen ist im Beispiel 9 angegeben.
Probe
Häufigster
Porendurchm.
Enzymaufnahme
Ce U
Aktivität Urcl
Usf
5.1
5.2
1400 4,8
2,0
115,4
117,3
24,0
58,7
41
99
6.1
6.2
340 22,0
10,2
558,5
556,1
25,4
54,5
43
93
7.1
7.2
180 11,2
5.1
291,0
292,3
26,0
57,3 '
44
97
8.1
8.2
340 21,3
9,8
543,2
544,0
25,5
55,5
43
94
58,9
Die Ergebnisse zeigen:
1. Die Aktivität U der untersuchten Proben verläuft über ein Maximum, das vom häufigsten Porendurchmesser des Trägers abhängig ist.
2. Die spezifische Aktivität U5 hängt von der Enzymaufnahme ab und erreicht bei einer bestimmten Enzymkonzentration et den Wert der Aktivität des Enzyms im freien Zustand Usn so daß Urci = 100 wird. Wird diese Enzymmenge überschritten, sinkt die spezifische Aktivität ab, wobei das Produkt aus £/sund Ce konstant bleibt.
3. Die vom Träger aufgenommene Enzymmenge ist eine Funktion des häufigsten Porendurchmessers.
Das System Enzym/Träger weist maximale Aktivität bei kleinstmögtichem Enzymeinsatz auf, wenn
der optimale Träger 2 (häufigster Porendurchmesser 340 A) 17,4 mg Amyloglucosidase/g bzw. 10,2 mg Glucoseisomerase/g aufgenommen hat (Proben 2.2 bzw. 6.2).
4. Enzymaufnahme und Aktivität der untersuchten Proben sind vom Kupplungsmittel unabhängig.
Da die Enzymkosten beträchtlich sind und mit dem geforderten Reinheitsgrad sehr stark ansteigen, für den
ίο wirtschaftlichen Einsatz also eine erhebliche Rolle spielen, ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmals die Möglichkeit geschaffen worden, auch teure Enzyme technisch anzuwenden, da es das Verfahren gestattet, bei Einsatz des erfindungsgemäßen Trägers, die für maximale Aktivität benötigte Enzymmenge zu optimieren.

Claims (8)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparates, bei dem man einen anorga- nischen Träger mit funktioneilen Gruppen zur kovalenten Bindung mit einer Lösung eines Enzyms
in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger mit einem solchen häufigsten Porendurchmesser auswählt, der ungeachtet der an ihn gebundenen Enzymmenge ein Präparat mit maximaler Aktivität ergibt, und daß man den so ausgewählten Träger mit einer Enzymlösung in Berührung bringt, die nur so viel Enzym enthält, daß die spezifische Aktivität des damit hergestellten Präparats die spezifische Aktivität des Enzyms in freiem Zustand erreicht oder ihr nahekommt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger aus einem SiO2-GeI auswählt, das nach Einstellung eines Alkaligehalts, berechnet als Na2O, auf 0,1 bis 0,5 Gew.-% und Trocknung 5—10 Stunden in einem wasserdampfhaltigen Luftstrom bei 4000C bis 8500C, vorzugsweise 570° C bis 750° C, geglüht ist
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trocknung in wasserdampfgesättigter Luft bsi 180° C bis 200° C erfolgt
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Glühen in einem jo wasserdampfhaltigen Luftstrom mit einer relativen Feuchte von 40 bis 80% erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym Amyloglucosidase verwendet wird. js
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung einer Amyloglucosidase mit einer spezifischen Aktivität im freien Zustand von etwa 10 bis 15 Einheiten/mg der Träger mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die 25 bis 75 mg, vorzugsweise 50 mg, Amyloglurosidase pro Gramm Träger enthält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym Glucoseisomerase verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet daß bei Verwendung einer Glucoseisomerase mit einer spezifischen Aktivität im freien Zustand von etwa 50 bis 70 Einheiten/mg der Träger mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die 20 bis 50 mg, vorzugsweise 25 mg, Glucoseisomerase pro Gramm Träger enthält.
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