DE2717040C2 - Als Anthelmintica C-076 bezeichnete α-L-Oleandrosyl-α-L-oleandroside, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen durch Fermentation eines früher noch nicht beschriebenen Mikroorganismus Streptomyces avermitilis in einem Nährmedium. Die neuen Verbindungen können durch Lösungsmittelextraktions- und chromatographische Fraktionierverfahren isoliert werden. Die Verbindungen, die mit ihrem Genericnamen als C-076 bezeichnet werden, besitzen eine ausgeprägte parasitenvernichtende Aktivität. Die Verbindungen können in Form von Zubereitungen für die orale oder parenterale Verabreichung an Lebewesen für die Prophylaxe und Heilung parasitischer Infektionen verwendet werden.

b0 Mindestens acht individuelle, aber engverwandte, neue Verbindungen werden von Streptomyces avermitilis gebildet. Sie werden in der vorliegenden Anmeldung als C-076 AIa, Alb, A2a, A2b, Bin, BIb, B2a und B2b bezeichnet. Alle besitzen eine ausgeprägte antiparasitische Aktivität. Sie können durch Fermentation und

Isolierung in im wesentlichen reiner Form, wie im folgenden beschrieben, hergestellt werden.

Aufgrund taxonomischer Untersuchungen wurde festgestellt, daß die Mikroorganismen, die diese C-076-Verbindungen bilden können, eine neue Species des Genus Streptomyces sind, die als Streptomyces avermitilis bezeichnet wird. Eine solche Kultur, die aus Boden isoliert wurde, wird als MA-4680 in der Kultursammlung von Merck & Co., Inc. Rahway, New Jersey, bezeichnet. Eine C-076 liefernde Probe dieser Kultur wurde ebenfalls in der Kultursammlung der Fermentation Section of the Northern Utilization Research Branch, U.S. Department

of Agriculture at Peoria, Iilinois, hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer NRRL 8165 erhalten. Eine Probe
von NRRL 8165 wurde ebenfalls ohne Beschränkung hinsichtlich der Freigabe in der Kultursammlung von
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, RockvilSe, Maryland 20852, hinterlegt und mit der
Hinterlegungsnummer ATCC 31 267 bezeichnet.

Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Streptomyces avermitilis werden im folgenden 5 aufgeführt

Morphologie:
I Die Sporenträger bilden Spiralen als Seitenzweige auf Luftmyzelien. Die Spiralen sind kompakt, werden

aber beim Älterwerden der Kultur offener. Die Sporen liegen in Ketten von mehr als 15 Sporen vor und to sind im allgemeinen kugelförmig bis oval bei einer 970fachen Vergrößerung. Die Sporenbildung beobachtet
man auf Hafermehlagar, Glycerin-Asparaginagar, Agar aus Salzen und Stärke und Eialbuminagar. Die
Sporenoberfläche ist, betrachtet durch ein Elektronenmikroskop, glatt.

Hafermehlagar _I5

Vegetatives Wachstum: umgekehrt — sehr dunkelbraun Luftmyzelium: pulverartig, bräunlich-grau (4Ii)**), gemischt mit weiß lösliches Pigment: braun.

Czapek Dox Agar (Saccharosenitratagar) 20

Vegetatives Wachstum: schlecht, farblos Liiftmyzeiiiiir.: knapp, gräulich lösliches Pigment: hellgräulich-dunkel^slb.

Eialbuminagar 25

Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzeüum: mäßig, hellgräulich-gelbbraun (3ge)**), gemischt mit weiß lösliches Pigment: hellgelblich-dunkelgelb.

Glycerin-Asparaginagar 30

Vegetatives Wachstum: umgekehrt — gelblichbraun Luftmyzelium: pulverartig, bräunlichgrau (4Ii)**), vermischt mit weiß lösliches Pigment: hell, gelblichbraun.

Agar aus anorganischen Salzen und Stärken 35

Vegetatives Wachstum: umgekehrt — gräulich-gelblichbraun

Luftmyzelium: pulverartig, hellbräunlichgrau (4ig)**), gesäumt mit dunklerem bräunlichem Grau (4Ii)**)
lösliches Pigment: hellgelblichbraun.

Agar aus Hefeextrakt-Dextrose und Salzen ■ 40

Vegetatives Wachstum: umgekehrt — dunkelbraun Luftmyzelium: mäßig, bräunlichweiß lösliches Pigment: braun.

I Agar aus Hefeextrakt-Malzextrakt ₄₅

Vegetatives Wachstum: umgekehrt — dunkelbraun Luhmyzelium: mäßig, bräunlichweiß lösliches Pigment: braun.

I Agar aus Pepton-Eisen-Hefeextrakt ₅₀

Vegetatives Wachstum: dunkelbraun

Luftmyzelium: keins

« lösliches Pigment: dunkelbraun bis schwarz

f Melanin: positiv

\ H2S-Bildung: positiv. ₅₅

\ Nähragar

'. Vegetatives Wachstum: dunkelgelb

Luftmyzelium: spärlich, gräulich

lösliches Pigment: hellbraun. ₆₀

Nährstärkeagar

Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzelium: spärlich, gräulichweiß

lösliches Pigment: hellbraun ₆₅

Hydrolyse der Stärke: gut.

Kartoffelstempel Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzelium: bratin, gemischt mit gräulichweiß lösliches Pigment: gräulichbraun.

Loeffler's Blutserum Vegetatives Wachstum: gräulich-dunkelgelb Luftmyzelium: keines lösliches Pigment:geringes Braunwerdendes Mediums Schmelzen: keins.

Tyrosinnähragar Vegetatives Wachstum: umgekehrt — dunkelbraun bis schwarz Luftmyzelium: spärlich, gräulich lösliches Pigment: dunkelbraun Zersetzung von Tyrosin: nein.

Kohlenstoffverwendung

Pridham-Gottlieb-Grundmedium + 1% Kohlenstoffquelle; + = Wachstum; — = kein Wachstum, verglichen mi? negativer Kontrolle (keine Kohlenstoffnnelle) 20 Glucose +

Arabinose + Cellulose Fructose+ Inosit+ Lactose + Maltose + Mannit + Mannose-f-Raffinose + Rhamnose-f Saccharose + Xylose +

Gelatinenähragar Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzelium: spärlich, gräulichweiß lösliches Pigment: hellbraun

TCi nü55igüng VGn uciSimS: £>üi.

Gelatinestiche Vegetatives Wachstum: brauner Ring Luftmyzelium: keins lösliches Pigment: grünlichbraun Verflüssigung von Gelatine: vollständig.

Magermilchagar Vegetatives Wachstum: dunkelbraun Luftmyzelium: keins lösliches Pigment: dunkelbraun Hydrolyse von Casein: gut

Lackmusmilch Vegetatives Wachstum: dunkelbrauner Wachstumsring Luftmyzelium: keines Farbe: dunkelbraun Koagulation und/oder Peptonisierung: vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden (pH 8,1).

Magermilch

Vegetatives Wachstum: dunkelbrauner Wachstumsring Luftmyzelium: keines lösliches Pigment: dunkelbraun Koagulation und/oder Peptonisierung: vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden (pH 8,0).

Temperaturbereich (Agar aus Hefeexirakt-Destrose+Salzen): 28° C — gutes vegetatives Wachstum und Luftmyzelium 37° C — gutes vegetatives Wachstum und Luftmyzelium 50⁰C — kein Wachstum.

Sauerstoffbedarf (Stichkultur in Agar aus Hefeextrakt, Destrose und Salzen): aerob.

Alle Ablesungen erfolgten nach 3 Wochen bei 28°C, sofern nicht anders angegeben. Der pH-Wert aller Medien ist ungefähr neutral (6,8 bis 7,2).

Die Farbzahlbezeichnungen (**) wurden aus dem Color Harmony Manual, 1958,4. Edition Container Corporation of America, Chicago, Illinois, entnommen.

Ein sorgfältiger Vergleich der zuvor aufgeführten Ergebnisse mit den publizierten Beschreibungen einschließlieh Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Eighth Edition) bekannter Mikroorganismen zeigt wesentliche Unterschiede, was andeutet, daß der angemeldete Mikroorganismus als neue Species klassifiziert werden kann. Aufgrund dieser Annahme wurde er als Streptomyces avermitilis bezeichnet.

Di·; obige Beschreibung ist eine Erläuterung für einen Stamm von Streptomyces avermitilis, der bei der Herstellung der anmeldungsgemäßen C-076-Verbindungen verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin Mutanten des oben beschriebenen Mikroorganismus. Beispielsweise werden solche C-076 liefernde Mutanten, die durch natürliche Auswahl erhalten werden, oder solche, die durch Mutationsmittel einschließlich Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Stickstofflost oder ähnliche Behandlungen erhalten werden, von der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfaßt.

Ein Beispiel eines solchen Organismus ist ein Stamm von Streptomyces avermitilis MA 4848, der nach Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von Streptomyces avermitilis MA 4680 isoliert wurde. Ein lyophilisiertes Rohr und eine gefrorene Ampulle dieser Kultur wurden in der permanenten Kultursammlung der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 31 272 bzw. 31 271. Unter Verwendung dieses gefrorenen Stocks bzw. Materials als Inokulum werden etwas höhere Fermentationsausbeuten an C-Ö76 erhalten.

Die C-076-Verbindungen werden während der aeroben Fermentation geeigneter, wäßriger Nährmedien unter den im folgenden beschriebenen Bedingungen mit einem produzierenden Stamm von Streptomyces avermitilis hergestellt. Bei dem Verfahren zur Herstellung von C-076 können wäßrige Medien verwendet werden, wie sie normalerweise für die Herstellung vieler antibiotischer Substanzen eingesetzt werden.

Solche Nährmedien bzw. -boden enthalten Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, die von dem Mikroorganismus assimilierbar sind, und im allgemeinen niedrige Gehalte an anorganischen Salzen. Zusätzlich können die Fermentationsmedien Spuren an Metallen enthalten, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sind. Diese sind normalerweise in ausreichender Konzentration in den komplexen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen vorhanden, die als Nährquellen verwendet werden. Sie können natürlich auch gegebenenfalls getrennt zu dem Medium zugegeben werden.

Im allgemeinen sind Kohlenhydrate, wie Zucker, z. B. Dextrose, Saccharose, Maltose, Lactose, Dextran, Ctrelose u. ä., und Stärken geeignete Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff im Nährmedium. In dem Medium wird die genaue Menge der Kohlenstoffquelle, die verwendet wird, teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums abhängen. Es wurde jedoch im allgemeinen gefunden, daß eine Menge an Kohlenhydrat zwischen etwa 0,5 und 5 Gew.-°/o, bezogen auf das Medium, ausreichend ist. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden, oder mehrere solcher Kohlenstoffquellen können im gleichen Medium gemeinsam verwendet werden.

Verschiedene Stickstoffquelten, wie Hefehydrolysate, Hefeautoysate, Sojabohnenmehl. Caseinhydroiysate, Hefeextrakte, Maiseinweichflüssigkeiten, Schlempe bzw. lösliche Stoffe aus der Branntweinerzeugung, Baumwollsamenmehl. Fleischextrakt u. a., sind leicht von Streptomyces avermitilis bei der Herstellung von C-076-Ver- 40 | bindungen assimilierbar. Die verschiedenen Stickstoffquellen können allein oder im Gemisch in Mengen im |

Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.-°/o, bezogen auf das Medium, verwendet werden. |

Als anorganische Nährsalze können in den Kulturmedien die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Magnesi- /

um-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen ergeben, verwendet *

werden. Weiterhin können Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan oder Eisen, verwendet werden.

Die in der vorliegenden Anmeldung und in den Beispielen beschriebenen Medien sind nur Beispiele für die große Vielzahl von Medien, die verwendet werden können.

Im folgenden werden einige Beispiele von Medien aufgeführt, die zum Züchten der Stämme von Streptomyces avermitilis zur Herstellung der C-076-Verbindungen geeignet sind. „

50 ξ

Medium A	20,0 g
Maismehl	10,0 g
Schlempe bzw. lösliche Stoffe von der	15,0 g
Branntweinerzeugung Sojabohnenmehl	4,0 g
Natriumeitrat	0,5 g
CaCl2 - 2 H2O	2,5 ml
Polyglykol P2000	0,1g
MgSO4 · 7 H2O	0,01g
CoCl2 · 6 H2O	0,01g
FeSO4 - 7 H2O	1000 ml
destilliertes Wasser
DH6.5

Medium B

lösliche Stärke 20,0 g

Maiseinweichflüssigkeit 15,0 g

Cerelose 5,0 g

Sojabohnenmehl 4,0 g

(N Ht)₂SO₄ 4,0 g

Maismehl 1,0 g

Sojabohnenöl 2,5 ml

KH₂PO₄ 0,3 g

CaCO₃ 6,0 g

destilliertes Wasser 1000 ml
pH 6,7

Medium C

Tomatenpaste bzw.-mark 40,0 g

Hafermehl 15,0 g

destilliertes Wasser 1000 ml

pH 6,0

Hafermehl 20,0 g

Tomatenpaste bzw. -mark 20,0 g

destilliertes Wasser 1000 ml
pH 5.5

Medium E

Dextrose 10,0 g

Pepton 5,0 g

Hefeautolysat 3,0 g

NaCl 12,7 g

KCl 0,72 g

■™ FeSO₄(NH₄J₂SO₄ · 6 H₂O 0,035 g

¹I MgCl₂-OH₂O 5,32 g

^H CaCl₂ · 2 H₂O 0,73 g

destilliertes Wasser 1000 ml

pH 7,4

Die Fermentation bei der Verwendung von C-076 liefernden Mikroorganismen kann bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis etwa 40° C durchgeführt werden. Für optimale Ergebnisse ist es am zweckdienlichsten, diese Fermentationen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 24 bis etwa 30°C durchzuführen. Temperaturen von etwa 27 bis 28° C sind am meisten bevorzugt Der pH-Wert des Nährmediums, der für die Herstellung | der C-076-Verbindungen geeignet ist, kann von etwa 5,0 bis 9,0 variieren. Ein bevorzugter Bereich beträgt etwa 6,0 bis 7,5.

Fermentationen im kleinen Maßstab werden zweckdienlich durchgeführt, indem man geeignete Mengen an Nährmedium in einen Kolben unter Verwendung bekannter Sterilisationsverfahren gibt, den Kolben entweder mit Sporen oder vegetativem, cellulärem, gewachsenem Material eines C-076 erzeugenden Stamms von Streptomyces avermitilis inokuliert, die Kolbenhälse lose mit Baumwolle verschließt und die Fermentation in einem Raum mit konstanter Temperatur von etwa 28° C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung während etwa 3 bis 10 Tagen ablaufen läßt. Beim Arbeiten in größerem Maßstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einer Rührvorrichtung und Einrichtungen zum Belüften des Fermentationsmediums ausgerüstet sind. Das Nährmedium wird in dem Tank zubereitet und nach der Sterilisation mit einer geeigneten Quelle an vegetativem, zellulärem Wachstum von einem C-076 liefernden Stamm von Streptomyces avermitilis inokuliert Die Fermentation kann während 1 bis 8 Tagen unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums bei einer Temperatur im Bereich von etwa 24 bis 37° C ablaufen. Der Belüftungsgrad hängt von verschiedenen Faktoren, wie der Größe des Fermenters, der Rührgeschwindigkeit und ähnlichen Faktoren, ab.

Im allgemeinen werden größere Fermentationsansätze bei etwa 95 bis 150 min-' gerührt und mit etwa 56,6 bis |

565 l/min belüftet I

Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen, die schematisch in der vorliegenden Anmeldung als C-076 bezeichnet werden, werden hauptsächlich in dem Myzelium bei Beendigung der Streptomyces avermitilis-Fer-

mentation gefunden, und sie können, wie im folgenden beschrieben, isoliert und voneinander getrennt werden. ρ

Es wurden vier Hauptkomponenten und vier Nebenkomponenten von C-076, die durch Streptomyces avermitilis §

gebildet werden, isoliert Die acht unterschiedlichen Verbindungen werden in der vorliegenden Anmeldung als C-076 AIa, Alb, A2a, A2b, BIa, BIb, B2a und B2b identifiziert Den Hauptkomponenten wurde bei der Identifizierungsterminologie die Nachsilbe »a« verliehen und den Nebenkomponenten die Nachsilbe »b«. Man nimmt an, daß der Strukturunterschied zwischen den »a«- und »b«-Verbindungen bei allen vier Paaren gleich ist.

Wie zu erwarten war, werden selbst die Haupt-C-07G Verbindungen bei den anmeldungsgemäßen Fermentationen nicht in gleichen Mengen gebildetes wurde im allgemeinen gefunden, daß die Al -Verbindungen etwa 20 bis 30 Gew.-% des gesamten, gebildeten C-076-Komplexes, die A2-Verbindungen etwa 1 bis 20 Gew.-% und die

BI- und B2-Verbindungen je etwa 25 bis 35 Gew.-% ausmachen. Das Gewichtsverhältnis der Verbindungen der »a«-Reihen zu den »bw-ReiheW beträgt etwa 85 :15 bis 99 :1.

Die Trennung der C-076-Reihen der Verbindungen aus der gesamten Fermentationsbrühe und die Isolierung der einzelnen Komponenten erfolgt durch Lösungsmittelextraktion und chromatographische Fraktionierungen mit verschiedenen chromatographischen Verfahren und Lösungsmittelsystemen.

Die C-076-Verbindungen besitzen in Wasser eine geringe Löslichkeit, sind jedoch in organischen Lösuogsmitteln löslich. Diese Eigenschaft wird zweckdienlich bei ihrer Gewinnung aus der Fermentationsbrühe ausgenutzt. Bei dem Isolierungsverfahren wird die gesamte Fermentationsbrühe filtriert, und das wäßrige Filtrat wit'd verworfen. Der feuchte Myzeliumkuchen wird dann mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel extrahiert. Obgleich irgendein organisches Lösungsmittel verwendet werden kann, ist es bevorzugt, ein mit Wasser misch- ie bares Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol oder Äthanol, zu verwenden. Im allgemeinen sind verschiedene Extraktionen zur maximalen Isolierung erwünscht. Durch das Lösungsmittel werden die C-076 aktiven Komponenten wie auch andere Substanzen, denen die antiparasitische Aktivität von C-076 fehlt, entfernt. Ist das Lösungsmittel ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wird von den feuchten Myzelien ebenfalls Wasser entfernt. Die extrahierten Myzelien werden verworfen. Die Lösungsmittelextrakte werden zur Entfernung organischer Lösungsmittel eingedampft und mehrere Maie mit einem zweiten Lösungsmittel extrahiert. Wenn bei der ersten Extraktion ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel verwendet wird, wird bei der zweiten Extraktion bevorzugt ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel, wie Chloroform, Methylenchlorid, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylacetat, Methyläthylketon oder Methylisobutylketon, verwendet. Diese letzteren Extrakte werden nach an sich bekannten Verfahren getrocknet und konzentriert, und man erhält einen Rückstand, der aus C-076, vermischt mit anderen Materialien, besteht. Diese Fraktion wird dann zweckdienlich zur Abtrennung der aktiven C-076-Verbindungen aus anderen Materialien und ebenfalls zur Abtrennung und Isolierung der einzelnen C-076-Verbindungen Chromatographien. Die zur Reinigung der C-076-Verbindungen verwendbaren chromatographischen Verfahren sind dem Fachmann geläufig. Beispiele solcher Verfahren sind die Säulenchromatographie unter Verwendung solcher Medien, wie Kieselgel, Aluminiumoxid oder Dextrangel, und Eluierung solcher Säulen mit verschiedenen Lösungsmitteln und/oder Gemischen aus zwei oder mehr Lösungsmitteln in verschiedenen Verhältnissen. Die Flüssigkeitschromatographie wird zum Nachweis der C-076-Verbindungen verwendet, und die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie kann zur Isolierung gereinigter Fraktionen, die eine oder mehrere dieser Verbindungen enthalten, verwendet werden. Die Dünnschichtchromatographie kann zum Nachweis der Anwesenheit und Isolierung einzelner C-076-Verbindungen verwendet werden. Bei dem Einsatz der zuvor beschriebenen Verfahren wie auch bei anderen Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, wird man gereinigte Zusammensetzungen erhalten, die die C-076-Verbindungen wie auch einzelne C-076-Verbindungen selbst enthalten. Die Anwesenheit der aktiven C-076-Verbindungen wird festgestellt, indem man die verschiedenen chromatographischen Fraktionen auf ihre antiparasitische Aktivität analysiert und ebenfalls durch spektrale charakteristische Eigenschaften (wie Ultraviolett- und Infrarotspektrum) der Verbindungen, wie im folgenden näher erläutert wird.

Die spektralen und andere physikalisch-chemischen Eigenschaften der einzelnen C-076-Verbindungen sind in Tabellenform in Tabelle ! zusammengefaßt. Diese Verbindungen sind in den meisten organischen Lösungsmitteln gut löslich und in Wasser nur gering löslich.

Die spektralen Ultraviolettwerte der Tabelle I werden in Methanollösungen in T-cm-Quarzzellen erhalten. Die Konzentration der Verbindung beträgt etwa 25 μg/ml. Die ultraviolette Absorption ist. obgleich sie als die einer besonderen Verbindung der »a«-Reihen angegeben wird, tatsächlich die Absorption der Verbindung der »a«-Reihe, die eine geringe Menge an Verbindung der »b«-Reihen enthält. Die »a«- und »b«-Reihen unterscheiden sich nur durch einen —CH₂-Molekülteil im niedrig-Alkylsubstituenten, und dieser Unterschied steht η At im Zusammenhang mit einem Chromophor. Durch das Ultraviolett-Absorptionsspektrum wird hauptsächlich der Grad und die Art der ungesättigten Bindungen, die in einer besonderen Verbindung vorhanden sind, beschrieben. Die optischen Rotationen werden unter Verwendung von Standardverfahren mit einem Polarimeter bestimmt. Der Konzentrationsfaktor (c) wird als Prozent der Verbindung in dem angegebenen Lösungsmittel aufgeführt.

misiis^^iamBasi

Tabelle 1	Summenformel Ala	Alb	A2a	A2b	BIa	BIb	B2n '	B2b
	C49H74O14	Q8H72Oh	Q9H76O13	Q8H74O15	Q8H72Om	Q7H70Om	C18H74O1;	QtH7JOi5

Optische Drehung [a#'(CHCl₃)

+ 68,5° ±2° (C = 0,77)

Molekulargewicht	886
(bestimmt durch
M assenspektrometrie)
LJltraviolett-Absorptions-	237
spektrum	(28 700: 4,458)
/Zmax (Γημ)	243
	(31 275: 4,495)
(filogf)	252
	(20290: 4,307)

+48,8° ±2°
(C= 1,64)

904

237

(28 800; 4,459)

243

(31 740; 4,501)

252

(20425; 4,310)

890

+ 55,7° ±2° (C= 1,06)

872

237

(29 120; 4,464)

243

(31 850; 4,503)

252

(20510; 4,431)

+ 38,3" ±2° (C = 0,87)

890

237 (27 580; 4,441) 243 (30590; 4,486) 252 (20060:4,302)

876

Die Werte für die 13C kernmagnetischen Resonanzspektren für C-076 AIa, A2a, BIa und B2a werden in der folgenden Tabelle II angegeben. Die Spektren werden in deuterierter Chloroformlösung unter Verwendung von Tetramethylsilan als Innenstandard bestimmt. Das Lösungsvolumen und die Konzentration der Probe werden für jeden Fall angegeben, darauf folgen die chemischen Verschiebungen, bezogen auf Tetramethylsilan, für jede Verbindungen, angegeben in Teilen pro Million (ppm). Die chemischen Verschiebungen werden für ein einzelnes Kohlenstoffatom, sofern nicht nach der chemischen Verschiebung ein Klammerausdruck angegeben ist, aufgeführt.

Tabelle II

12,0,13,0,15,1,16,4,17,7,18,4,193,203,27,5,30,6,343 (3C), 35,2,36,6,39,7,40,5,45,7,56,4 (2C), 57,7, 673,68,2 (2C), 68,4 (2C), 743,76,1,77,0,77 3, 783,79,4,80,6 (2C), 82,0,95,0,95,8,98,5,118,4 (2C), 119,7,124,9,127,8,135,2, 136,0,136,1,137,6.139,9,173,8.

A2 (0,6 ml 16%)

11,8,12,4,13,8,15.1,17,7,18,4,193,203,273,343 (3C), 35,2,35,8,36,5,39,8,40,8,41A 45,7,56,4 (2C), 57,7 Ö73, 67,7,682 (3C), 69,9,70,8,76,1,77,0,77,6,78,3,79,4,80,6 (2C), 81,8,94,9,98,6,99,7,117,7,118,4,119,7,124,9,135,7, 136,1,137,6,140,0.173,7.

Bl (03 ml 16%)

12,0, 12,9,15,1,16,4,17,7,18,4,19,9,20,2,273, 30,6,343 (3C), 35Ä 36,6,39,8,403,45,7,56,4 (2C), 673,67,8,68,2 (2C), 68,4 (2C), 75,0, 76,1, 783, 79,4 (2C), 80,5 (2C), 82,0, 95,0, 95,8, 983, 118,1, 118,4, 120,4,124,8.127,9, 135,2, 136A 1373(2C), 139,7,173,6.

B2 (0.6 ml 16%)

11,8, 12,4,13,8,15,1,17,7,18,4,193,2OA 273,34,4 (3C), 35A 35,8,36,5,39,8,40,8,41A 45,8,56,4 (2C), 673,67,7 (2C). 683 (3C), 69.9,703,76.1,783,79,4 (2C), 80,5 (2C), 81,8,94,9,98,6,99,7,117,7,118,0,120,4,124,8,135,7,138,0 (2C). 139,8,1733.

Die charakteristischen Massenspektrenpeaks der acht C-076-Verbindungen werden in Tabelle III angegeben. Die erste Zeile in Tabelle III bedeutet das Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/e) des Molekülions jeder betreffenden Verbindung, und die restlichen Zahlen bedeuten das Masse-zu-Ladung-Verhältnis der Hauptfragmente jeder Verbindung. Die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse, die in der gleichen horizontalen Reihe aufgeführt sind, weisen auf analoge Fragmente in jeder Verbindung hin. Die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse werden als ganze Zahlen aufgeführt. Die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse, die bis zur vierten Dezimale aufgeführt sind, werden auf einem High Resolution Massenspektrometer gemessen.

Die Fig. 1 bis 8 sind genaue Reproduktionen der Infrarotspektren und der kernmagnetischen Protonenresonanzspektren von vier der C-076-Verbindungen. Die F i g. 1 bis 4 sind Infrarotspektren für C-076 Ala, A2a, BIa und B2a. Die Fig.5 bis 8 sind kernmagnetische Protonenspektren für C-076 AIa, A2a, B1a und B2a. Die lnfrarotspeklren werden in Chloroformlösung aufgenommen. Die kernmagnetischen Protonenresonanzspekiren werden in deuterierter Chioroformiösung aufgenommen, und die in den Spektren aufgeführten chemischen

Tabelle III	Alb	Massenspeklrum	A2b	BIa	BIb	B2a	B2b	» t I
	872	A2a	890	872	858	890	876	40 I
Charakteristische Peaks im	728	904	746	728	714	746	732	J
AIa	5663265	760	584	566	552	584	570	S
886.5072	534	598	552	548.3131	534	566	552	45 W
742.4229	442	566	442	456	442	455	442	I
5803406	291.1962	456	309.2070	305	291	323	309	\
5483136		323.2225	291			305	291	ö
456.2886	275	305	275	261.1139	261	261	261	I
305.2120	257	275	257	257	257	257	257	10 i
	207	257	225	221	207	239	225	I }
275.1292	179.1429	239.1637	197.1542	193	179	211	197	55 I
257.1382	199	211.1691	199	199	199	199	199	jj
221.1527	155	199	179	169	155	179	179	I
193.1587	145	179.1076	145	145	145	145	145	I
199.1101	137	145	137	137	137	137	137
169.1226	127	137	127	127	127	127	127	60 ί
145.0867	113	127	113	113	113	113	113	1
137.0954	95	113	95	95	95	95	95	S
127.0754	87	95	87	87	87	87	87
113.0604		87
95.0496
87.0444

Verschiebungen werden in Teilen pro Million (ppm), bezogen auf Tetramethylsilan als Innenstandard, angegeben.

Aufgrund von Versuchsergebnissen einschließlich der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Untersuchungen und Messungen wird angenommen, daß die C-076-Verbindungen die folgende planare Strukturformel besitzen

CH₃

CH₃

HO

CH₃O

CH₃

in der

die gestrichelte Linie eine Einfach- oder eine Doppelbindung anzeigt,
Ri eine Hydroxygruppe bedeutet und nur dann vorhanden ist, wenn die gestrichelte Linie eine Einfachbindung

darstellt,

R? i-Propyl oder sek.- B^ityl bed -;utet und R₃ Methoxy oder Hydroxy bedeutet.

Die einzelnen Verbindungen, die unter die zuvor beschriebene Strukturformel fallen, werden in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle	IV	R2	R3
	Ri	sek.-ButyI	-OCH3
AIa	Doppelbindung	i-Propyl	-OCH3
Alb	Doppelbindung	sek.-Butyl	-OCH3
A2a	-OH	i-Propyl	-OCH3
A2b	-OH	sek.-Butyl	-OH
BIa	Doppelbindung	i-Propyl	-OH
BIb	Doppelbindung	sek.-Butyl	-OH
B2a	-OH	i Propyl	-OH
B2b	-OH

Wie zu erwarten war, verhalten sich die erfindungsgemäßen Verbindungen, worin R2 sek.-Butyl bedeutet (die »a«-Reihen der Verbindungen), und die entsprechenden Verbindungen, worin R2 i-Propyl bedeutet (die »b«-Reihen) in den meisten Isolierungsverfahren, wie solchen, bei denen eine Extraktion mit Lösungsmitteln verwendet wird, ähnlich. Bei jedem Paar von »a«- und »b«-Verbindungen wurde die »a«-Verbindung in größerer Menge festgestellt und macht im· allgemeinen etwa 85 bis 99% in dem Gemisch der »a«- und »b«-Verbindungen aus. Die Anwesenheit der i-Propylverbindungen wird durch das Massenspektrum der Verbindungen sichergestellt, worin die Massenpeaks, die die Fragmente darstellen, die eine sek.-Butylgruppe enthalten, begleitende Peaks mit 14 Masseneinheiten (oder eine —CH2-Gruppe) weniger aufweisen. Weiterhin wurde die Hochdruckflüssigkeitschromatographie zur Abtrennung der Alb-Komponente von der Ala-Komponente verwendet, und das Massenspektrum einer solchen Alb-Komponente wurde durch Hochresolutionsmassenspektrometrie verifiziert (vgl.Tabelle III).

Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen eine ausgeprägte parasitenvernichtende Aktivität als Anthelminthika, Insektizide und Acarizide für die menschliche und tierische Gesundheit und in der Landwirtschaft.

Die Krankheit oder Gruppe von Krankheiten, die allgemein als Helminthose bezeichnet wird, beruht auf der Infektion eines lebenden Wirts mit parasitischen Würmern, die als Helminthen bekannt sind. Die Helminthose ist ein schwerwiegendes und ernstes wirtschaftliches Problem bei domestizierten Tieren, wie Schweinen, Schafen, Pferden, Kühen bzw. Kälbern, Ziegen, Hunden, Katzen und Geflügel. Unter den Helminthen verursacht die

Gruppe von Würmern, die als Nematoden bezeichnet werden, eine weitverbreitete und oft ernste Infektion bei verschiedenen Tierspecies. Die wichtigsten Arten der Nematoden, die die obenerwähnten Tiere infizieren, sind Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum. Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma. Uncinaria, Toxascaris und Parascaris.

Bestimmte Nematoden, wie Nematodirus, Cooperia und Oesophagostomum, greifen hauptsächlich den intestinalen Trakt an, während andere, wie Maemonchus und Ostertagia, im Magen überwiegen, während noch andere, wie Dictyocauius, in den Lungen gefunden werden. Noch andere Parasiten können in anderen Geweben und Organen Jes Körpers, wie in Herz- und Blutgefäßen oder den subkutanen und lymphatischen Geweben bzw. Gefäße, auftreten. Die parasitischen Infektionen, die als Helminthose bekannt sind, führer, zu Anämie, Unterernährung, Schwachheit, Gewichtsverlust starken Schaden an den Wänden des intestinalen Trakts und anderen Geweben und Organen und können, sofern sie nicht behandelt werden, den Tod des infizierten Wirts hervorrufen. Die erfindungsgemäßen C-076-Verbindungen besitzen eine überraschend hohe Aktivität gegenüber diesen Parasiten, und zusätzlich sind sie gegenüber Dirofilaria bei Hunden, Nematospiroiden, Syphacia und Aspiculuris bei Nagetieren, arthropoden Ectoparasiten bei Tieren und Vögeln, wie Zecken, Milben, Läusen, Flöhen, Schmeißfliegen und Fliegen, bei Schafen Lucilia sp., beißenden insekten und wandernden, zu den Dipteren gehörenden Larven, wie Hypoderma sp, bei Rindern, Gastrophilus bei Pferden und Cuterebra sp. bei Nagetieren aktiv.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind weiterhin gegen Parasiten, die Menschen infizieren, wirksam. Die häufigsten Arten von Parasiten des gastro-intestinalen Trakts von Menschen sind Anylostoma,' tcator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capiliaria, Trichuris und Enterobius.

Andere, medizinisch wichtige Arten von htrasiten, die im Blut und anderen Geweben und Organen außerhalb des gastro-intestinalen Trakts auftreten, sind die Filialwürmer (filiarial worms), wie Wuchereria, Brugia, Onchocerca und Loa, Dracunculus und extra intestinale Stufen der intestinalen Würmer Strongyloides und Trichinella. Die Verbindungen sind ebenfalls von Wert gegenüber Arthropod'.n, die Menschen bzw. Lebewesen als Parasiten befallen, beißenden Insekten und anderen, zu den Dipteren gehörenden Schädlingen, die Menschen bzw. Lebewesen belästigen.

Die Verbindungen sind weiterhin gegenüber Haushaltsschädlingen, wie Schaben bzw. Küchenschaben, Blatel-Ia sp., Kleidermotten, Tineola sp. Teppich- bzw. Tapetenkäfer und Hausfliegen Musca domestica, aktiv.

Die Verbindungen sind weiterhin gegenüber Insektenschädlingen von gelagertem Getreide, wie Tribolium sp., Tenebrio sp., und von landwirtschaftlichen Pflanzen, wie Spnvnmilben (Tetranychus sp.), Aphiden (Acyrthiosiphon sp.); gegenüber wandernden Geradflüglern, wie Heuschrecken, und unentwickelten Stufen von Insekten, die auf Pflanzengewebe leben. Die Verbindungen sind wertvolle Nematozide für die Kontrolle von Bodennematoden und Pflanzenparasiten, wie Meloidogyne spp, die in der Landwirtschaft Bedeutung haben können.

Diese Verbindungen können oral in Dosiseinheitsformen, wie Kapseln, großen Pillen oder Tabletten, oder in Form eines flüssigen Arzneitranks, wenn sie bei Säugetieren als Anthclminthika verwendet werden, verabreicht werden.

Der Arzneimitteltrank ist normalerweise eine Lösung, Suspension oder Dispersion des aktiven Bestandteils, normalerweise in Wasser, zusammen mit einem Suspensionsmittel, wie Bentonit, und einem Benetzungsmittel oder einem ähnlichen Verdünnungsmittel.

Im allgemeinen enthält der Arzneimitteltrank ebenfalls ein Antischaummittel.

Arzneimitteltrankzubereitungen enthalten im allgemeinen etwa 0,001 bis 0,5 Gew.-% an aktiver Verbindung. Bevorzugte Arzneimitteltrankzubereitungen können 0,01 bis 0,1 Gew.-°/o enthalten. Die Kapseln und großen Pillen enthalten den aktiven Bestandteil vermischt mit einem Träger, wie Stärke, Talk, Magnesiuirstearat oder Dicalciumphosphat.

Wenn die C-076-Verbindungen in trockener, fester Einheitsdosisform verabreicht werden sollen, werden normalerweise Kapseln, große Pillen oder Tabletten, die die gewünschte Menge an aktiver Verbindung enthalten, verwendet. Diese Dosisformen werden durch inniges und einheitliches Vermischen des aktiven Bestandteils mit geeigneten, feinverteilten Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, Desintegrationsmitteln und/oder Bindemitteln, wie Stärke, Lactose, Talk, Magnesiumstearat, pflanzlichen Gummis u. ä., hergestellt.

Solche Dosiseinheitszubereitungen können stark variieren und werden abhängig von dem Gesamtgewicht und dem Gehalt an antiparasitischem Mittel und abhängig von solchen Faktoren, wie der Art des zu behandelnden Wirttiers, der Stärke und der Art der Infektion und dem Gev, iciit des Wirts ausgewählt.

Wenn die aktive Verbindung über das Tierfutter verabreicht werden soll, wird sie gut in dem Tierfutter dispergiert, oder sie wird als Zubereitung auf dem Tierfutter oder in Form von Pellets verwendet, die dann zu dem fertigen Futter zugegeben werden können oder gegebenenfalls getrennt verfüttert werden können.

Alternativ können die erfindungsgemäßen antiparasitischen Verbindungen Tieren parenteral, z. B. durch intraruminale. intramuskuläre, intratracheale oder subkutane Injektion, verabreicht werden, wobei in diesem Fall der aktive Bestandteil in einem flüssigen Trägerstoff gelöst oder dispergiert ist.

Für die parenteral Verabreichung wird das aktive Material geeigneterweise mit einem annehmbaren Träger, bevorzugt einem Pflanzenöl, wie Erdnußöl oder Baumwollsamenöl, vermischt. Andere parenteral Trägfcr für organische Zubereitungen wie Solketal, Glyzerin, Formal und wäßrige parenterale Zubereitungen werden ebenfalls verwendet. Die aktive C-076-Verbindung oder die aktiven C-076-Verbindungen werden in der parenteralen Zubereitung für die Verabreichung gelöst oder suspendiert. Solche Zube-eitungen enthalten im allgemeinen 0,005 bis 5 Gev,.-% an aktiver Verbindung.

Obgleich die erfindungsgemäßen antiparasitischen Mittel ihre primäre Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von Helminthose finden, sind sie ebenfalls für die Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten nützlich, die durch andere Parasiten verursacht werden, z. B. ArthronodenDarasiten. wie Zecken.

Läuse, Flöhe, Milben, und andere beißende Insekten bei domestizierten Tieren und Geflügel. Sie sind ebenfalls zur Behandlung von parasitischen Krankheiten, die bei anderen Tieren einschließlich Menschen auftreten, wirksam. Die für die besten Ergebnisse verwendete optimale Menge wird natürlich von der besonderen verwendeten Verbindung, der zu behandelnden Art der Tiere, der Art und der Stärke der parasitischen Infektion oder dem Befall abhängen. Im allgemeinen werden gute Ergebnisse mit den neuen erfindungsgemäßen Verbindungen bei einer oralen Verabreichung von etwa 0,001 bis 10 mg/kg Tierkörpergewicht erhalten. Diese Gesamtdosis kann einmal oder unterteilt in verschiedene Dosen während einer relativ kurzen Zeit, wie während 1 bis 5 Tagen, verabreicht werden. Mit den bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen wird eine ausgezeichnete Kontrolle der Parasiten bei Tieren bei Verabreichung von etwa 0,025 bis 0,5 mg/kg Tierkörpergewicht als Einzeldosis erhalten. Wiederholte Behandlungen werden, sofern erforderlich, zur Bekämpfung von Wieder-Infektionen durchgeführt und hängen von der Art der Parasiten und den verwendeten Paarungseigenschaften ab. Verfahren zur Verabreichung dieser Materialien an Tiere sind dem Fachmann auf dem Veterinärgebiei bekannt.

Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen als Komponente des Futters den Tieren oder gelöst oder suspendiert in dem Trinkwasser verabreicht werden, werden Zubereitungen geschaffen, in denen die aktive Verbindung oder Verbindungen gut in einem inerten Träger oder Verdünnungsmittel dispergiert sind.

Unter »inerter Träger« wird eine Verbindung verstanden, die mit dem antiparasitischen Mittel nicht reagiert und die Tieren sicher verabreicht werden kann. Bevorzugt wird als Träger für die Verabreichung als Futtermittel ein Material verwendet, das ein Bestandteil der Tierfutterration ist.
Geeignete Zusammensetzungen umfassen Vormischungen (Futterprämix) oder Ergänzungen, in denen der aktive Bestandteil in relativ großen Mengen vorhanden ist und die für die direkte Verfütterung an Tiere oder für die Zugabe zu Futter entweder direkt oder nach einer Zwischenverdünnung oder Mischstufe geeignet sind.

Typische Träger oder Verdünnungsmittel, die für solche Zusammensetzungen geeignet sind, sind z. B. getrocknetes Getreide bzw. getrocknete Körner von der Branntweinherstellung, Maismehl, Citrusmehl, Fermentationsrückstände, gemahlene Austernschalen, Weizenrückstände, Melassenschlempe bzw. lösliche Melassenrückstän-

25 de. genießbares Futter aus Maismehl. Bohnenmehl, Sojagrieß oder zerkleinertes Kalkgestein.

Die aktiven C-076-Verbindungen v/erden intensiv in dem Träger durch Zerstoßen, Rühren, Vermählen oder Trommeln dispergiert. Zubereitungen, die etwa 0,005 bis 2,0 Gew.-% an aktiver Verbindung enthalten, sind als Futterprämix besonders geeignet. Futterergänzungen, die direkt an die Tiere verfüttert werden, enthalten etwa 0,0002 bis 03 Gew.-% an aktiven Verbindungen.

Solche Ergänzungen werden zu dem Tierfutter in einer Menge zugegeben, daß das fertige Futter die für die Behandlung und Kontrolle parasitischer Krankheiten erforderliche Konzentration an aktiver Verbindung enthält.

Obgleich die gewünschte Konzentration an aktiver Verbindung in Abhängigkeit von den zuvor beschriebenen Faktoren abhängen wird, wie auch von der besonderen, verwendeten C-076-Verbindung, werden die erfindungsgemäßen Verbindungen normalerweise in Konzentrationen zwischen 0,00001 und 0,002% in dem Futter verfüttert, damit man die gewünschten antiparasitischen Ergebnisse erhält.

Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen können die verschiedenen C-076-Koinponenien isoliert und gereinigt werden und in dieser Form verwendet werden. Alternativ können Gemische aus zwei oder mehreren der einzelnen C-076-Komponenten verwendet werden. Es ist nicht erforderlich, die verschiedenen C-076-Verbindungen, die man bei der Reinigung der Fermentationsbrühe erhält, vollständig zu trennen. Im allgemeinen erhält man ein Gemisch, das zwei oder mehr der C-076-Verbindungen enthält und aus dem andere, nichtverwandte Verbindungen entfernt sind. Ein solches Gemisch kann für die Verhinderung und Behandlung parasitischer Krankheiten, wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben, verwendet werden. Ein solches Gemisch wird im allgemeinen ungleichmäßige Anteile an C-076-Verbindungen enthalten, jedoch besitzen alle Verbindungen wesentliche Aktivität, und die antiparasitische Aktivität des Gemisches kann genau bestimmt werden. Insbesondere wird es nicht erforderlich sein, die »b«-Komponenten von den verwandten »a«-Komponenten zu trennen. Diese Verbindungen unterscheiden sich nur in C-25 in der Länge der Seitenkette. Die Abtrennung der engverwandten Verbindungen wird im allgemeinen nicht praktiziert da die »b«-Verbindung nur in einer geringen Menge, ausgedrückt als Gew.-%, vorhanden ist

Zusätzlich ist es, wenn die C-076-Verbindungen zu Tierfutter zugegeben werden, möglich, den getrockne*en Myzelienkuchen aus der Fermentationsbrühe zu verwenden. Die Myzelien enthalten das Übergewicht an Aktiviiät und da der Aktivriäisgeivait der Myzeiien bestimmt werden kann, können sie direkt zu dem Tierfutter zugegeben werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen ein breites Aktivitätsspektrum gegenüber vielen Parasiten bei niedrigen Dosisgehalten und bei verschiedenen Tieren. Bei Gehalten von etwa 2,5 mg/kg Tierkörpergewicht sind konzentrierte Gemische der C-076-Verbindungen vollständig aktiv bei Schafen gegenüber Haemonchus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostrongylus axei, Trichostrongylus colubriformis, Cooperia spp. und Oesophagostomum columbianum. Ähnlich sind bei Rindern bzw. Kühen C-076-B2-Verbindungen in so niedrigen Dosismengen wie 0,043 mg/kg vollständig aktiv gegenüber Ostertagia ostertagi, Trichostrongylus axei, Trichost-

60 rongylus colubriformis, Oesophagostomum radiatum und Dictyocaulus viviparus.

Weiterhin wurde ein mit Dassellarven (Gastrophilus intestinalis und Gastrophilus haemorrhoidalis), großen und kleinen Strongylen und Oxyuris infiziertes Pferd mit Erfolg mit 10 mg/kg (etwa 1 Gew.-°/o an aktiven Verbindungen) eines gemischten Konzentrats von C-076-Verbindungen behandelt

Ein mit der mikrofilarialen Stufe des Herzwurms (Dirofilaria immitis) infizierter Hund wurde erfolgreich mit

b5 einer einzigen oralen Dosis von 10 mg/kg (etwa i Gew.-% an aktiven Verbindungen) eines gemischten Konzentrats von C-076-Verbindungen behandelt Bei Nagern, wie Mäusen, wurden Infektionen von Syphacia, Nematospiroides und Aspiculuris erfolgreich durch orale Verabreichung von C-076-Verbindungen oder von Konzentraten, die bei der Extraktion der Myzelien erhalten wurden, behandelt

12

Die erfindungsgemäßen C-076-Verbindungen werden ebenfalls zur Bekämpfung landwirtschaftlicher Schädlinge, die eine Beschädigung der Nutzpflanzen während des Wachstums oder während der Lagerung verursachen, verwendet. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden unter Verwendung an sich bekannter Verfahren als Sprays, Bestäubungsmittel oder Emulsionen auf die wachsenden oder gelagerten Nutzpflanzen angewendet, damit man gegenüber diesen landwirtschaftlichen Schädlingen einen Schutz erhält.

Die anthelminthischc Aktivität von C-076 kann durch orale Verabreichung über das Futter, einer Probe einer einzelnen C-076-Verbindung, eines Gemisches aus C-07ö-Vcrbindungcn oder eines konzentrierten Extraktes an eine Maus, die 3 Tage zuvor mit Nematospiroides dubius infiziert wurde, bestimmt werden. An dem 11., 12. und 13. Tag nach der Initiierung der Medikation werden die Exkremente der Maus auf N.dubius-Eier geprüft, und am nächsten Tag wird die Maus getötet, und die Anzahl der in dem proximalen Teil des Dünndarms vorhandenen Würmer wird bestimmt. Eine aktive Verbindung stellt man fest, wenn eine wesentliche Verminderung in den Ei- und Wurmzählungen beobachtet wird, verglichen mit den infizierten Kontrolltieren, denen kein Medikament verabreicht wurde.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Der Inhalt eines lyophilisierten Rohrs von Streptomyces avermitilis MA-4680 wird aseptisch in einen 50 ml Medium 1 enthaltenden 250-ml-ErIenmeyer-Kolben gegeben. Der inokulierte Kolben wird 3 Tage bei 28° auf einer Rotationsschüttelmaschine bei einer Geschwindigkeit von 220 min-' in einer kreisförmigen Bahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm geschüttelt. |

Gegen Ende dieser Zeit wird ein 50 ml Medium 2 enthaltender 250-ml-Erlenmeyer-Kolben mit einer 2-ml-Probe aus dem ersten Kolben inokuliert. Dieser Kolben wird dann 3 Tage bei 28°C auf einer Rotationsschüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 min-' in einer kreisförmigen Bahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm geschüttelt.

50 ml der entstehenden, C-076 enthaltenden Fermentationsbrühe sind gegenüber N.dubius-Infektion bei Mäusen wirksam.

Zusammensetzung der Medien

35 40 45 50

Ein lyophilisiertes Rohr von Streptomyces avermitilis MA-4580 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in 50 ml Medium 1 in einem 250-ml-Erlenrneyer-Kolben mit Umlenkorganen suspendiert. Dieser Kolben wird 3 Tage bei 28° C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 220 min-' mit einer kreisförmigen Bahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm geschüttelt Ein 0,2-ml-Teil dieses Impfmediums wird zur Inokulierung einer Schrägkultur von Medium 3 verwendet Das inokulierte Schrägkulturmedium wird 10 Tage bei 28° C inkubiert und bei 4° C gelagert, bis es zur Inokulation von vier weiteren Schrägkulturen von Medium 3 verwendet wird Diese Schrägkulturen werden 8 Tage in der Dunkelheit inkubiert Eine dieser Schrägkulturen wird zur Inokulation von drei 250-ml-Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen, die 50 ml Nr. 4 Impfmedium enthalten, verwendet. Die Impfkolben werden 2 Tage bei 27 bis 28°C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 220 min-' in einer kreisförmigen Bahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm geschüttelt. Die Inhalte dieser Kolben werden vereinigt und zur Inokulation (5% Inokulum) von 250-ml-Erlennieyer-Kolben mit Umlenkorganen, die 40 ml verschiedener Produktionsmedien enthalten, verwendet Die Kolben, die die Medien 2, 5 und 6 enthalten, werden 4 Tage bei 28°C auf einer Rotationsschütielmaschme bei 220 min-' mit einer kreisförmigen Bahn mit einem Durchmesser von 5.08 cm inkubiert Die entstehende, C-076 enthaltende Brühe wird dann entnommen und auf ihre anthelminthische Aktivität geprüft In allen Fällen sind 6,2 ml der gesamten Brühe und die Feststoffe, die man beim Zentrifugieren von 25 ml der gesamten Brühe erhält voll aktiv gegenüber N.dubius-Wurminfektionen bei Mäusen.

Medium I	20 g
Dextrose	5g
Pepton	5g
Fleischextrakt	3g
primäre Hefe	5g
NaCl	3g
CaCC/3 (nach der pH-Einsteiiung)	1000 ml
destilliertes Wasser
pH 7,0
Medium 2	20 g
Tomatenpaste bzw. -mark	20 g
modifizierte Stärke (CPC®)	10g
primäre Hefe	0,005 g
CoCI2 · 6 H2O	1000 ml
destilliertes Wasser
pH 7,2 bis 7,4	Beispiel 2

Medium 3 (Schrägkultur)

Dextrose 10,0 g Bacto® Asparagin 0,5 g

K₂HPO₄ 0,5 g

Bacto® Agar 15,Og

destilliertes Wasser 1000 m! pH 7,0

Medium 4 (Impfmedium)

Lösliche Stärke 10,0 g

Ardamine® pH 5,0 g NZ Amin E® 5,0 g

Rinderextrakt 3,0 g MgSO₄ · 7 H₂O 0,5 g

Cerelose 1,0 g

Na₂HPO₄ 0,190 g KH₂PO₄ 0,182 g

CaCO₃ 0,5 g

destilliertes Wasser 1000 mi pH 7,0 bis 7,2

Medium 5

Tomatenpaste bzw. -mark 40,0 g

Hafermehl 10,0 g

Cerelose 10,0 g Maiseinweichflüssigkeit 5,0 g

Spurenelementmischung 10,0 ml

destilliertes Wasser 1000 ml pH 6,8

Spurenelementmischung

FeSO₄-7 H₂O 1000 mg

MnSO₄-4 H₂O 1000 mg

CuCl₂ · 2 H₂O 25,0 mg

CaCl₂ 100,0 mg

H₂BO₃ 56,0 mg

(N H₄J₂MoO₄ ■ 4 H₂O 10,0 mg

ZnSO₄ · 7 H₂O 200,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml pH

Medium 6

CPC® industrielle Stärke, modifiziert 40,0 g

lösliche Stoffe aus der

Branntweinherstellung 7,0 g

autolysierte Hefe (Ardamine® pH) 5,0 g

CoCl₂ · 6 H₂O 50,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

pH 73

Beispiel 3 - -

Eine O.Sxl.O-cm-Schlinge von einer der vier Schrägkulturen von Medium 3, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wird zum Inokulieren eines 50 ml Impfmedium 4 enthaltenden 250-ml-ErIenmeyer-KoIbens mit Umienkorganen verwendet Der Impfkolben wird 1 Tag bei 27 bis 28° C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 220 min-' mit einer kreisförmigen Bahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm geschüttelt. Der Impfkolben wird dann stationär bei 4° C bis zu seiner Verwendung gelagert. Der Inhalt dieses Kolbens wird dann zur Inokulierung (5% Inokulum) von zwanzig 250-ml-Erlenmeyer-Kolben ohne Umlenkorgane, die 40 ml Medium 2 enthalten, verwendet. Nach 4 Tagen Inkubation bei 28°C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 220 min-' mit einer kreisförmigen Bahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm wird aus neunzehn Kolben der Inhalt gewonnen und vereinigt. Die vereinigten. C-076 enthaltenden Fermentationsbrühen werden filtriert: man erhält 500 ml Filtrat und 84 g Myzelien. 78 g Myzelium werden mit 150 m! Aceton während einer halben Stunde unter Rühren extrahiert, und das Gemisch wird filtriert. Der Filterkuchen wird mit 50 ml Aceton gewaschen, und das Filtral und die Waschlösungen werden vereinigt und auf 46,5 ml konzentriert. Der pH-Wert von 30 ml Konzentrat wird mit verdünnter Chlor.vasserstoffsäure auf 4 eingestellt. Das Konzentrat wird dreimal mit 30 ml Chloroform extrahiert Die Extrakte werden durch Filtern durch trockene Infusorienerde (Super-Cel®) getrocknet, vereinigt und zur Trockene im Vakuum konzentriert Der ölige Rückstand von C-076 wiegt 91,4 mg; er wird in ausreichend Chloroform gelöst, so daß man 3 ml Lösung erhält was einem 1 %igen Brühenvolumen entspricht

14

Das bei diesem Isolierungsverfahren gewonnene C-076 ist gegenüber N-dubius-Infektionen bei Mäusen voll aktiv. Zusä'zlich ergibt die Chloroformextraktion eine 70fache Reinigung von C-076 aus der gesamten Brühe.

Beispiel 4

Eine Impfkultur wird hergestellt, indem man 50 ml Medium 4 in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben mit Ablenkorganen mit einer 0,5 χ 1,0-cm-Öse aus einer der vier Schrägkulturen aus Medium 3, hergestellt gemäß Beispiel 2, inokuliert.

Der Kolben wird bei 28°C auf einer Rotationsschüttelmaschine mit 220 min-' mit einer kreisförmigen Bahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm während 2 Tagen inkubiert.

Die Impfkultur wird zum Inokulieren eines 250 ml Medium 2 enthaltenden 2-1-Erlenmeyer-Produktionskolbens verwendet. Das Volumen zum Inokulieren beträgt 5,0 ml (2%). Der Produktionskolben wird bei 28° C auf einer Rotationsschüttelmasehir.e bei 220 min-' 4 Tage inkubiert.

Gegen Ende dieser Zeit wird die gesamte, C-076 enthaltende Brühe gesammelt. 6 ml dieser Gesarntbrühe sind beim Prüfen bei einer Maus, die mit N-dubius infiziert ist, voll aktiv.

Beispiel 5 Stufe A

Ein 50 ml Medium 7 enthaltender 250-ml-Erlenmeyer-K.olben mit Ablenkorganen wird mit einer gefrorenen Ampulle von Streptomyces avermiiilis MA-4680 inokuliert. Der Kolben wird bei 28° C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 160 min-' mit einer kreisförmigen Bahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm während 24 h inkubiert.

30 35

Stufe B

Zwei 2-1-Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen, die je 500 ml Medium 7 enthalten, werden mil 10 ml des Kolbeninhalts der Stufe A inokuliert. Die Medien werden bei 28° C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 160 min-' auf einer kreisförmigen Bahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm 24 h inkubiert.

Stufe C

In einen 756 1 rostfreien Stahlfermenter, der 467 1 Medium 8 enthält, gibt man 11 des gesamten Fermentationsmediums von Stufe B. Der Fermenter wird 96 h bei 28°C und 130 min-' gerührt und mit einer Luftströmung von 283 l/min belüftet.

50

Medium 8

Tomatenpaste bzw. -mark 20 g/l

primäre Hefe N.F. 10 g/l

Stärke, modifizierte, CPC® 20 g/l

CoCl₂ · 6 H₂O 5 mg/1

Polygiykol 2000 0321 ml/1

destilliertes Wasser q.s. pH 7,2 bis 7,4

Gegen Ende dieser Zeit werden 15,51 der Gesamtbrühe filtriert, und die C-076 enthaltenden Myzelien werden mit Wasser gewaschen. Die feuchten Myzelien (2268 g) werden mit 31 Aceton unter Rühren extrahiert. Das Gemisch wird filtriert, und das Filtrat wird auf 1550 ml konzentriert, und mit verdünnter HCl wird der pH-Wert auf 4,0 eingestellt. Diese Lösung wird dreimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert Die Chloroformextrakte werden durch Filtrieren durch trockene Infusorienerde (Super-Cel®) getrocknet, sie werden vereinigt und im Vakuum zur l rockene eingedampft Das zurückbleibende Öl von C-076 wiegt 5,12 g. 33 mg sind gegenüber &s N-dubius bei Mäusen vollständig aktiv.

4.69 g dieses Öls werden in 142 ml Chloroform gelöst und auf einer 90 g Kieselgel enthaltenden, mit Chloroform gepackten Säule Chromatographien. Die Säule wird mit 1400 ml Chloroform entwickelt. Die Säule wird

15

Medium 7	ig
Dextrose	10g
CPC® industrielle Stärke, modifiziert	3g
Fleischextrakt	5g
NZAminE®	5g
autolysierte Hefe (Ardamine pH®)	0,05 g
MgSO4 · 7 H2O	0,19 g
Na4HPO4	0,182 g
KH2PO4	0,5 g
CaCO	1000 ml
destilliertes Wasser
pH 7,0 bis 7,2

dann mit Chloroform/Äthanol (49 :1) eluiert. wobei 145 Fraktionen von je 5 ml gesammelt werden. Danach wird die Säule mit Chloroform/Äthanol (19 :1) eluiert, wobei die Fraktionen 146 bis 226 von je 5 ml gesammelt werden. Die Fraktionen 49 bis 72 werden vereinigt und zur Trockene eingedampft; man erhält 200 mg eines Öls (A). Die Fraktionen 79 bis 184 werden ähnlich vereinigt und eingedampft; man erhält 291 mg eines Öls (B). 400 .ug

jeder Fraktion sind gegenüber N-dubius bei Mäusen vollständig aktiv. Diese beiden Fraktionen (A und B) werden getrennt chromatographisch an Kieselgeldünnschichtplatten (Qaanta/Gram®-Q1F-Platten) analysiert. Die Platten werden mit Chloroform/Methanol (19 :1) entwickelt Die Flecken werden auf ihre Ultraviolettaktivität analysiert, und ein Flecken jeder Fraktion hat die charakteristische UV-Absorption für die C-076-Verbindungen (vgL Tabelle I). Bei der Fraktion A besitzt der Flecken mit einem Rf-Wert von 0,83 diese Absorption, und bei der Fraktion B besitzt der Flecken mit einem Rf-Wert von 0,57 diese Absorption. Diese Flecken stellen die C-076 A-Verbindungen bzw. die C-076 B-verbindungen dar.

198 mg des obigen Öls (A) werden an 80 g Kieselgel, das mit Chloroform gepackt wurde, Chromatographien. Man eluiert mit Chloroform/Methanol (199 :1), bis 520 ml gesammelt sind, und anschließend mit Chloroform/ Methanol (99 :1), wobei jeweils 10-ml-Fraktionen gesammelt werden. Die Fraktion von 630 bis 720 ml ergibt 30.4 mg; die Fraktion von 730 bis 950 ml ergibt 78,4 mg; und die Fraktion von 950 bis 1040 ml ergibt 20 mg eines öligen Materials. Die C-076 Α-Komponenten enthaltenden Fraktionen 1 und 2 sind bei der Prüfung bei Mäusen gegenüber N.dubius bei Gehalten von 1,0,05 und 0,25 mg vollständig aktiv.

Beispiel 6

Stufe A

Ein 250-ml-Erlenmeyer-KoIben mit Ablenkorganen, der 50 ml Medium 8 enthält, wird mit einer gefrorenen Ampulle von Streptomyces avermitilis MA 4680 inokuliert Der Kolben wird bei 28° C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 160 min-' mit einer kreisförmigen Bahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm 24 h inkubiert.

Stufe B

Ein 500 ml Medium 8 enthaltender 2-1-Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen wird mit 10 ml des Kolbeninhalts der Stufe A inokuliert. Das Medium wird bei 28°C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 160 min-' mit einer kreisförmigen Bahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm 24 h inkubiert

Stufe C

In einen 189 1 rostfreien Stahifermenter, der 1601 Medium 9 enthält, gibt man 500 ml Inokulum von Stufe B. Der Fermenter wird bei 28°C unter Rühren bei 150 min-' 24 h und Belüften in einer Rate von 84,9 l/min inkubiert.

Medium 9
.«0 Dextrose 1 g/l

Maisstärke 10 g/l

Fleischextrakt 3 g/l

autolysierte Hefe (Ardamine pH) 5 g/l

MgSO₄ · 7 H₂O 0.05 g/l

45- Na₂HPO₄ 0,10 g/l

KH₂PO₄ 0,182 g/l

CaCO₃ 0,5 g/l

destilliertes Wasser q.s.
pH 7,0 bis 7.2

Stufe D

In einen 467 1 Medium 6 enthaltenden 756 1 rostfreien Stahifermenter gibt man 43 1 Inokulum von Stufe C. Der Fermenter wird bei 28°C unter Rühren bei 130 min-' während 144 h und Belüften mit einer Luftströmungsrate von 283,1 l/min inkubiert.

Stufe E

Gegen Ende dieser Zeit wird die Gesamtbrühe filtriert, und der C-076 enthaltende Filterkuchen wird mit |

Wasser gewaschen. Der Filterkuchen wird 30 min in 1201 Aceton aufgeschlämmt, filtriert, und die Feststoffe |

werden mit 301 Aceton gewaschen. Die Acetonwaschlösungen werden vereinigt und bei vermindertem Druck |

auf ein Volumen von 401 eingedampft. Mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure wird der pH-Wert des Konzcn- g

trats auf 4,0 eingestellt. Das Konzentrat wird dreimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden getrocknet, indem man sie durch eine Schicht aus trockener Infusorienerde (Super-Cel®) filtriert. Die Extrakte werden durch Super-Cel® geleitet und dann vereinigt. Die vereinigten Extrakte werden bei

vermindertem Druck auf ein Volumen von 4 1 konzentriert. Das Chloroformkonzentrat wird filtriert und durch ,,

eine Säule von 2,4 kg Kieselgel in Chloroform geleitet. Die Säule wird mit Chloroform eluiert, wobei man acht 3,5-1-Fraktionen sammelt. Die Säule wird dann mit Chloroform/Methanol (49 :1) eluiert, wobei man acht weitere

16

3,5-1-Fraktionen (Fraktionen 9 bis 16) sammelt Die Fraktion Nr. 3 wird zur Trockene eingedampft, man erhält 76 g eines öligen Materials, das die Hauptmenge der C-076-Materialien enthält

97% dieses Materials werden in 685 ml Methylenchlorid gelöst und durch 800 g Kieselgel 0,149 mm (das durch ein Sieb mit 0,177 mm Öffnungen gesiebt wurde) chromatographiert Die Säule (Durchmesser 7,62 cm, Länge 36 cm) wird mit etwa 7,51 Methylenchlorid/Benzol (7 :3) und anschließend mit 2,251 5%igem Isopropanol in Methylenchlorid/Benzol (7 :3) entwickelt Die Fraktion, die mit dem 5°/oigen Isopropanol in Methylenchlorid/ Benzol eluiert wird, enthält eine stark gefärbte Bande und enthält im wesentlichen das gesamte C-076-Material. bestimmt durch Dünnschichtchromatographie (wie in Beispiel 5 beschrieben). Diese Fraktion (500 ml) wird eingedampft und an 105 g Kieselgei (Säule mit 3,7 cm Durchmesser und 18 cm Länge) in Methylenchlorid emeut chromatographiert Die Säule wird mit 100-ml-Teilen Methylenchlorid, die 5, 10 und 20% Äther enthalten, entwickelt Weitere Eiuiening mit 20% Äther in Methylenchlorid ergibt zwei gefärbte Banden. Die Fraktionen zwischen den beiden Banden enthalten im wesentlichen das gesamte C-076-Material, bestimmt durch Dünnschächtchromatographie.

Die C-076 enthaltende Fraktion wird an 59 g Kieselgel (Säule mit 3,7 cm Durchmesser und 11 cm Länge) in Methylenchlorid chromatographiert Die Säule wird mit 10% Äther in Methylenchlcrid entwickelt Nachdem das erste Material zu eiuieren beginnt, wird eine Fraktion von 70 ml entnommen, und anschließend werden 26 Fraktionen von je 5 bis 6 ml entnommen. Die Fraktionen 3 bis 26 werden vereinigt; man erhält 1,35 g MaV-rfal. Dieses wird dünnschichtchromatographisch analysiert (Kieselgelplatten-Analtech® GF 254, entwickelt mit 5%igem Isopropanol in Methylenchlorid). Das Material mit einem Rf-Wert von 0,28 ist in diesem System C-076 Al.

Die Säule wird dann mit 20% Äther in 200 ml Methylenchlorid und anschließend mit 50% Äther in 800 ml Methylenchlorid eluiert. Eine geringe Menge des C-076 Al/A2-Gemisches wird eluiert, und anschließend wird das gesamte C-076 A2 eluiert. Der Gesamtrückstand der C-076 A2-Fraktion beträgt 800 mg.

Weitere Elution mit 5%igem Isopropanol in Methylenchlorid ergibt C-076 Bl (135 mg). Die Trennung erfolgt, indem man die Ultraviolettabsorption des eluierten Materials beobachtet C-076 Bl und A2 besitzen sehr ähnliche Rf-Werte an dünnschichtchromatographischen Kieselgelplatten (Analtech® GF 254) in 5%igem Isopropanol in Methylenchlorid. Die beiden Komponenten unterscheiden sich jedoch eindeutig bei den gleichen Platten, die mit 15%igem Isopropanol in Hexan entwickelt werden.

Die gesamte C-076 Al-Fraktion wird auf 14 Kieselgelplatten (Analtech® HF 254, 20 χ 20 cm, 500 μ dick) aufgebracht Die Platten werden mit 10%igem Isopropanol in Hexan entwickelt Die das C-076 Al enthaltende Bande wird aus den Platten entfernt, mit Äther extrahiert, eingedampft und erneut auf 6 weitere Platten angewendet und fünfmal mit 5%igem Isopropanol in Hexan entwickelt. Das C-076 Al wird von den Platten entfernt und erneut chromatographiert und mit reinem Äther entwickelt; man erhält 270 mg im wesentlichen reines C-076 Al. Die Infrarot- und kernmagnetischen Resonanzspektren für diese Probe sind in den F i g. 1 und 5 und in Tabelle II dargestellt 35 |

Die C-076 A2-Fraktion wird an 10 Kieselgel (Analtech® KF 254)-Piatten Chromatographien und fQnfma! mit -

15%igem Isopropanol in Hexan entwickelt; man erhält 265 mg im wesentliches reines C-076 A2. Die Infrarot- und kernmagnetischen Resonanzspektren für diese Probe sind in den F i g. 2 bzw. 6 und in Tabelle II dargestellt. |

Die C-076 Bl-Fraktion wird an 2 Platten (wie oben) in 15%igem Isopropanol in Hexan chromatographiert; |

man erhält 55 mg im wesentlichen reines C-076 Bl. Das kernmagnetische Resonanzspektrum dieser Probe ist in 40 *

F i g. 7 und in Tabelle 11 dargestellt.

Beispiel 7

Die in Beispiel 6 beschriebene Fermentation wird zweimal wiederholt, und die gesamten Brühen werden vereinigt. Die Fermentationsbrühe wird, wie in Beispiel 6 beschrieben, aufgearbeitet; man erhält 3,3 1 eines ersten Chloroformextraktes, der 60 mg/ml Gesamtfeststoffe enthält und nach Schätzung anhand der dünnschichtchromatographischen Analyse 0,5% C-076 enthält.

3 1 dieser Chloroformlösung werden an 2400 g Kieselgel (Davidson® Grade 62), gepackt in Chloroform, chromatographiert. Die Säule (9,5 χ 122 cm) wird mit acht 3800-ml-Teilen Chloroform (Fraktionen 1 bis 8) und dann mit acht 3800-ml-Teilen Chloroform/Methanol (49 :1, Fraktionen 9 bis 16) entwickelt. Die einzelnen Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch (Kieselgelplatten, Quants/Gram® QlF) analysiert und mit Chlorofurm/Methanol (19 :1) entwickelt. Die Fraktionen 9 bis 11,12 bis 13 und 14 werden jeweils zur Trockene eingedampft; man erhält 6.63 g Feststoffe, die die C-076 Α-Komponenten in den Fraktionen 9 bis 11 enthalten, 24,91 g Feststoffe, die die C-076 B-Kornponenten in den Fraktionen 12 bis 13 enthalten, und 4,71 g Feststoffe, die auch die C-076 B-Komponenten in der Fraktion 14 enthalten.

Das Material aus den Fraktionen 12 bis 14 wird vereinigt (29,62 g), in 100 ml Methylenchlorid gelöst und an 400 g Kieselgel (Davidson® Grade 62) in Methylenchlorid chromatographiert. Die Säule wird mit 1500 ml Methylenchlorid/2-Propanol (99:1), 1500 ml Methylenchlorid/2-Propanol (49:1), 2000 ml Methylenchlorid/ 2-Propanol (19 :1) und 1000 ml Methylenchlorid/2-Propanol (9 :1) eluiert. Die eluierten Volumina zwischen 60 i 5500 bis 6000 ml (2,56 g) und 6000 bis 6500 ml (5,03 g) werden in 25 ml Methylenchlorid vereinigt und an 60 g Kieselgel in Hexan chromatographiert. Ein Vorlauf von 70 ml Hexan und 100 ml Hexan/Diäthyläther(4 : l)wird entnommen, und die Säule wird dann mit 600 ml Hexan/Diäthyläther (1:4) entwickelt, wobei 200-ml-Fraktionen aufgefangen werden. Sie wird schließlich mit 700 ml Äther eluiert, wobei 100-ml-Fraktionen entnommen wer- S,

den. Eluierungsvolumina der Säule von 400 bis 600 ml ergeben 2,035 g Feststoffe, die die C-076 Bl-Komponenten enthalten; die Volumina 600 bis 1100 ergeben 0,881 g Feststoffe, die gemischte C-076 Bl/B2-Komponenten enthalten, und die Volumina 1100 bis 1500 ml ergeben 0,381 g Feststoffe, die die C-076 B2-Komponenten enthalten.

Die gemischten C-076 Bl/B2-Komponenten werden dann in 4,2 ml Methylalkohol/Wasser (4 :1) gelöst und an C18 Porasil® (Bondapak®-37-75 Mikron Größe) in dem gleichen Lösungsmittel Chromatographien. Die Umkehrphasenhochdrucksäule (die stärker polaren Komponenten werden zuerst eluiert) mißt 1,2 m χ 16 mm und wird in einer Rate von 800 ml/h elu'ert, wobei 21,3-ml-Fraktionen entnommen werden. Die Anwesenheit der C-076-Komponenten wird verfolgt, indem man die Ultraviolettabsorption der Fraktionen mißt C-076 B2 wird in den Fraktionen 24 bis 37 gewonnen, und C-076 Bl wird in den Fraktionen 51 bis 70 gewonnen; man isoliert 195,4 mg C-076 B2 und 137 mg C-076 Bl.

Jede Probe wird dann getrennt an 4 g Säulen aus Kieselgel (Davidson® Grade 62) in M ethylene!-Ό rid Chromatographien Die Säulen werden mit 35 ml Methylenchlorid/Methanol (9 :1) eluiert. Die letzten 20 ml des ίο Eluats von jeder Säule werden gesammelt und zur Trockene eingedampft; man erhält 1553 mg C-076 B2 und 90 mg C-076 Bl.

Dann werden 50 mg C-076 Bl und 100 mg C-076 B2 an präparativen Dünnschichtgelplatten (Analtech®

HF 254) Chromatographien, mit 12°/oigem Isopropanol in Hexan und anschließend mit Äther entwickelt Man gewinnt C-076 Bl und C-076 B2, die im wesentlichen rein srnd. Die Infrarotabsorptionsspektren der so gewonnenen C-076 Bl und B2 sind in den Fig.3 bzw. 4 dargestellt Das kernmagnetische Resonanzspektrum des so

gewonnenen C-076 B2 ist in F i g. 8 dargestellt

Beispiel 8 20 Ein 250-mi-Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen, der 50 ml des folgenden Mediums enthält.

Lactose 2,0%

lösliche Stoffe von der Branntweinherstellung bzw. Schlempe 1,5%

autolysierte Hefe, Ardamine® pH 0,5%

25 pH — vor der Sterilisation 7,0

wird mit dem Inhalt von einer gefrorenen Ampulle von Streptomyces avermitilis MA 4848 inokuliert und auf einer Rotationsschüttelmaschine 24 h bei 28° C und 150 min-¹ inkubiert

10 ml der obigen Fermentationsmedien werden zur Inokulation von 500 ml des gleichen Mediums wie oben in einem 2-1-Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen verwendet. Die Fermentationsmedien werden bei 150 min-' auf einer Rotationsschüttelmaschine 24 h bei 28° C inkubiert

Das gesamte, zuvor boschriei* jne Medium zur Inokulation von 467 I des folgenden Mediums in einem 756 1 rostfreien Stahlfermenter verwendet:

35 Lactose 2,0%

lösliche Stoffe von der Branntweinhersteiiung bzw. Schlempe 1,5%

autolysierte Hefe, Ardamine® pH 0,5%

Polyglykol 2000 0,32 mi/1

pH — vor der Sterilisation 7,0

Das Fermentationsmedium wird 40 h bei 28°C mit einer Luftströmung von 283 l/min und einer Rührrate von 130 min-' inkubiert.

2301 des obigen Mediums werden zur Inokulation von 4310 1 des folgenden Mediums in einem 56701 rostfreien Stahlfermenter verwendet.

Dextrose 4,5%

peptonisierte Milch 2,4%

autolysierte Hefe, Ardamine® pH 0,25%

Polyglykol 2000 2,5 ml/1

so pH — vor der Sterilisation 7,0

Die Fermentation wird 144 h bei 26°C mit einer Luftströmung von 1537 I/min und einer Rührrate von 120 min-' weitergeführt.

Das Fermentationsmedium wird filtriert, und der Myzeliumfilterkuchen wird mit etwa 5501 Wasser gewasehen, das Filtrat und die Waschlösungen werden verworfen. Der Filterkuchen wird mit etwa 15001 Aceton während etwa 1 h gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wird in einem Gemisch von etwa 150 I Aceton und 40 1 entionisiertem Wasser gewaschen; man erhält etwa 2000 1 Extrakt.

Die zuvor beschriebene Fermentation und Extraktion wird in gleichem Maßstab wiederholt; man erhält weitere 2000 1 Acetonextrakt, der mit dem ersten Extrakt vereinigt wird und auf ein Volumen von etwa 8001 eingedampft wird. Der pH-Wert des Konzentrats wird mit konz. Chlorwasserstoffsäure auf etwa 4,7 eingestellt und mit etwa 8001 Methylenchlorid vereinigt. Die vereinigten Lösungsmittel werden etwa 4 h gerührt und getrennt Die wäßrige Schicht wird mit weiteren 8001 Methylenchlorid vereinigt und weitere 4 h gerührt. Die Schichten werden getrennt, und jeder Methylenchloridextrakt wird getrennt mit etwa 10 kg Super-Cel® behandelt und filtriert. Beide Extrakte werden auf ein gemeinsames Volumen von etwa 601 eingedampft.

Beispiel 9
Die 60-l-Lösung von C-076 in Methylenchlorid des vorherigen Beispiels werden zur Trockene im Vakuum

18

eingedampft, und der Rückstand wird dreimal mit 60-1-TeiIen Methanol vereinigt, und dann wird zur Trockene eingedampft, um restliches Methylenchlorid zu entfernen. Das letzte Volumen des Methanolkonzentrats beträgt etwa 36 1. Die Methanollösung wird über Nacht gelagert und filtriert Der Filterkuchen wird mit 40 1 frischem Methanol gewaschen, und die Methanolfiltrate und Waschlösungen werden vereinigt. Die Methanollösung wird mit 951 Äthylenglykol und 1301 Heptan vermischt Die Lösung aus zwei Schichten wird 5 min gerührt, und dann wird die untere Schicht (Äthylenglykol und Methanol) abgetrennt. Die Heptanlösung wird mit einem Gemisch aus 20 1 Äthylenglykol und 63 1 Methanol gewaschen. Nachdem man 5 min gerührt hat, wird die untere Schicht abgetrennt und mit dem ersten Äthylenglykol/Methanol-Extrakt vereinigt Ein gleiches Volumen Wasser (etwa 1501), das 79 g Salz/1 enthält, wird zu den Äthylenglykol/Methanol-Extrakten zugegeben. Diese Lösung wird mit 1501 Äthyläther unter Rühren während 5 min extrahiert Die Ätherschicht wird mit 75 1 Wasser (V₂ VoL) gewaschen und 5 min gerührt; dann werden die Schichten getrennt Dieses Verfahren wird weiter zweimal wiederholt (das letzte Wasser enthält 20 g Salz/1); man erhält ein Volumen aus der letzten Ätherschicht von 1101. Die Ätherschicht wird ira Vakuum auf ein minimales Volumen konzentriert, wobei man die Temperatur unter 25" C hält 40 1 Methylenchlorid werden zu dem Rückstand zugegeben, und die Lösung wird zur Trockene eingedampft Dieses Verfahren wird wiederholt, und der letzte Rückstand wird im Vakuum bei 50⁰C zur Trockene eingedampft

Beispiel 10

Eine Säule mit einem Durchmesser von 30 cm wird mit einer Schicht aus 34 kg aktivierten. Aluminiumoxid und einer Schicht aus 34 kg aktiviertem Kohlenstoff in einer Lösung aus Methylenchlorid hergestellt Der Rückstand aus dem vorherigen Beispiel wird in Methylenchlorid bis zu einem Volumen von 34 1 gelöst und auf die Säule aufgebracht Man eluiert mit 341 Methylenchlorid, wobei diese Fraktionen verworfen werden. Eine 3%ige Lösung von Isopropanol und Methylenchlorid (20,81 Isopropanol und 6601 Methylenchlorid) wird auf die Säule aufgebracht und in etwa 200-I-Fraktionen eluiert Die vereinigten Isopropanol- und Methylenchloridfraktionen werden im Vakuum bei einer Badtemperatur von etwa. 6O⁰C auf ein Volumen von etwa 201 eingedampft Die Badtemperatur wird auf etwa 45°C vermindert, und der Extrakt wird im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 10 Teilen Methylenchlorid, 10 Teilen Hexan und 1 Teil Methanol so gelöst, daß man ein Endvolumen von 15 1 erhält Die Lösung wird direkt auf eine Sephadex® LH-20-Säule des nächsten Beispiels aufgebracht

Beispiel 11

Eine Säule mit einem Durchmesser von 30 cm in Methanol mit 36 kg Sephadex® LH-20 wird hergestellt und mit einem Lösungsmittel gewaschen, das 10 Teile Methylenchlorid, 10 Teile Hexan und 1 Teil Methanol enthält. ''Ia der C-076 Lösung des Beispiels iö wird auf die Säuie aufgebracht, und die Säuie wird mit einer Rate von 250 ml/min eluiert Zwei 20-1-Vorfraktionen werden gesammelt und verworfen. Anschließend werden zwanzig 2-1-Fraktionen (die als Fraktionen 1 bis 20 bezeichnet werden) und dann eine einzige 20-1-Endfraktion gesammelt, die verworfen wird. Man stellt fest, daß die Fraktionen 1 bis 8 die C-076 Α-Verbindungen und die Fraktionen 9 bis 20 die C-076 B-Verbindungen enthalten.

Beispiel 12

Das Verfahren von Beispiel 11 wird im gleichen Maßstab drei weitere Male wiederholt und aile Fraktionen, die die C-076 B-K.omponenten (Frg'ctionen 9 bis 20) enthalten, werden vereinigt und zur Trockene eingedampft; man erhält 818 g einer rohen Mischung der C-076 B-Komponenten. Man stellt fest, daß die Probe 55% C-076 Bl und 39% C-076 B2 enthält. 680 g dieser Probe werden in 2 1 Methylenchlorid gelöst und in einen 22-1-Dreihalsrundkolben gegeben. Anschließend werden 13,6 1 Methanol zugegeben. Das Methylenchlorid wird durch Destillation entfernt. 13,6 1 Ä^hylenglykol werden zugegeben, so, wie das Methanol bei vermindertem Druck entfernt wird. Die Destillationsrate wird so eingestellt, daß die Temperatur der Lösung nicht unter 65° C fällt. Nach Beendigung der Äthylenglykolzugabe kann die Lösung 16 h bei 5°C abkühlen. Die Kristalle werden abfiltriert und mit 1 I kaltem Äthylenglykol gewaschen. Die Kristalle werden dann erneut in 2 i Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wird in einen 22-1-Dreihalsrundkolben gegeben. Das beschriebene Verfahren wird zweimal wiederholt. Das erste Mal werden je 12,5 I Methanol und Äthylenglykol verwendet, und das zweite Mal werden je 13,6 1 Methanol und Äthylenglykol verwendet. Die Endkristalle werden mit 1 1 kaltem Äthylenglykol und 1 1 Wasser gewaschen. Die Kristalle werden in 41 Wasser gelöst und durch Filtrieren durch Natriumsulfat getrocknet. Die Benzollösung wird auf ein Volumen von 21 konzentriert und lyophilisiert; man erhält 241,2 g eines weißen Pulvers, das 98% C-076 Bl und 1 % C-076 B2 enthält.

Die Mutterlaugen (22 1) von den ersten beiden Kristallisationen wie oben werden vereinigt und mit 22 I Wasser verdünnt. Die wäßrige Lösung wird mit 601 Toluol und erneut mit 151 Toluol extrahiert. Der Toluolex- eo trakt wird dann, mit 48 I Wasser gewaschen. Die organische Phase wird durch Super-Cel zur Entfernung von restlichem Wasser filtriert und eingedampft; man erhält 336 g festes Material, das aus 79% C-076 B2- und 16% C-076 Bl-Verbindungen besteht.

Beispiel 13

Von den vier Sephadex® LH-20-Säulen des Verfahrens von Beispiel 11 enthalten die Fraktionen 1 bis 8 die C-076 A-Verbindungen und werden vereinigt. Durch H PLC-Analyse stellt man fest, daß das Gemisch 252 g

C-076 A2a, 16 g A2b.94 g Ala und 24 g Alb enthält. Das Material wird in einem Lösungsmittelsystem gelöst, das aus Hexan/Toluol/Methanol in einem Verhältnis von 6 :1 :1 besteht, und auf eine Sephadex® LH-20-Säuie der gleichen Dimensionen wie die, die in Beispiel 11 verwendet wurde, in dem obigen Lösungsmittel aufgebracht. Die Fraktionen werden in einer Rate von 250 ml/min gesammelt und ein 20-1-Vorlauf wird gesammelt und

verworfen. Weitere Elution ergibt zwei weitere 20-1-Vorläufe, die ebenfalls verworfen werden, und fünfzig 4 1 reiche Fraktionen, die die C-076 Α-Verbindungen enthalten. Die Fraktionen 3 bis 8 enthalten hauptsächlich C-076 Al-Komponenten (40,2 g Ala und 6,7 g Al b), und die Fraktionen 29 bis 36 enthalten C-076 A2-Verbindungen (117,2 g A2a und 735 g A2b). Die Fraktionen 9 bis 28 enthalten ein Gemisch aus C-076 Al- und A2-Verbindungen.

10

Beispiel 14

Eine Probe aus 150 g C-076 Bl von Beispiel 12 wird in 3 1 einer Lösungsmittelmischung aus Hexan/Toluol/Methanoi in einem Verhältnis von 3:1:1 gelöst. Die Lösung wird durch eine Sephadex® LH-20-Säule (mit den

gleichen Abmessungen wie die in Beispiel 11 verwendete) in dem obigen Lösungsmittel geleitet, wobei man Fraktionen in einer Rate von 250 ml/min entnimmt. Zwei 20-I-TeiIe des Lösungsmittelgemisches werden gesammelt und verworfen, und dann wird ein Vorlauf von 101 entnommen und verworfen. Dann werden dreißig Fraktionen von je 21 genommen. Die Fraktionen 1 bis 13 und 25 bis 30 werden verworfen. Die Fraktionen 14 bis 16 werden vereinigt und enthalten 80 g hauptsächlich C-076 BIa. Die Fraktionen 22 bis 24 werden vereinigt, und sie enthalten 6,7 g hauptsächlich C-076 BIb. Die Fraktionen 17 bis 21 enthalten ein Gemisch von C-076 BIa und BIb.

Die obigen Fraktionen 17 bis 21 werden vereinigt und konzentriert und durch eine Sephadex® LH-20-Säule

, mit dem gleichen Lösungsmittelsystem wie oben geleitet Drei 20-1-Vorläufe werden entnommen und verworfen.

Die reichen Fraktionen werden dann folgendermaßen genommen: 5 Fraktionen von je 2 I (Fraktionen 1 bis 5); 20 Fraktionen von je 1 1 (Fraktionen 6 bis 25) und 10 Fraktionen von je 2 1 (Fraktionen 26 bis 35). Die Fraktionen 1 bis 15 werden verworfen; die Fraktionen 16 bis 21 enthalten 13,5g C-076 BIa und 0,4 g C-076 BIb: die Fraktionen 22 bis 26 enthalten 44 g C-076 BIa und 0,13 g C-076 Bib; die Fraktionen 27 bis 30 enthalten 10,2 g C-076 B1 a und 0,8 g C-076 B1 b.

30 Beispiel 15

Ein Gemisch aus ailen acht C-076-Komponenten wird an einer Hochdruckflüssigkeitschromatographiesäule 4 mm χ 30 cm, die mit 10 Mikron μ-Bondapack® Cie Kieselgel (Waters® Associates Ine) gepackt ist, Chromatographien und mit 85 :15 (Vol/Vol) Methanol/Wasser bei konstant 40⁰C eluiert. Bei einer StrömungsraSe von 1,2 ml/min werden alle acht Verbindungen getrennt, und die Elutionsvolumina, die unter den zuvor beschriebenen konstanten Bedingungen für die einzelnen Verbindungen charakteristisch sind, sind die folgenden.

40 45

Die Trennung der C-076 »b«-Komponenten von den entsprechenden »a«-Komponenten erfolgt unter Verwendung solcher Verfahren, wie der Hochdruckflüssigkeitschromatographie. Eine absolute Methanollösung von 30 μΐ eines Gemaches aus C-076 AIa und Alb, das geschätzt 30 μg C-076 Alb enthält, wird auf eine 3 χ 250-r.;m-Hochdruckflüssigkeitschromatographiesäule gegeben, die Spherisorb® 5 micron ODS (Spectra Physics®) als Packung enthält Die Säuie wird mit S5:15 Methanol/Wasser in einer Rate von 0,15 ml/min eluiert Die Elution der Produkte wird verfolgt, indem man die Ultraviolettabsorption des eluierten Materials beobachtet und die einzelnen Komponenten am Ausgang des UV-Meßgeräts sammelt 30 μg C-076 Alb werden gewonnen und in einem Massenspektrometer analysiert Das Massenspektrum dieser Probe ist in der zweiten Spalte von Tabelle III aufgeführt

	Elutionsvolumen (Vc), ml
C-076 B2b	5,90
C-076 B2a	632
C-076 A2b	7,12
C-076 A2a	7,88
C-076 BIb	8,36
C-076 BIa	9,60
C-076 Alb	103
C-076 AIa	11,88

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

60

65

20

Claims (7)

1. Patentansprüche: 1. Als C-076 bezeichnete «-L-Oleandrosyl-ar-L-oIeandroside der allgemeinen Formel

   CH₃

   in der

   die gestrichelte Linie eine Einfach- oder Doppelbindung bedeutet,

   Ri Hydroxy bedeutet und nur vorhanden ist, wenn die gestrichelte Linie eine Einfachbindung ist,

   R₂ i-Propyl oder sek.-Butyl bedeutet und

   R3 Methoxy oder Hydroxy bedeutet
2. 2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

   die gestrichelte Linie eine Doppelbindung bedeutet und R2 sek.-ButyI und R3 Methoxy bedeuten;
   die gestrichelte Lini«; eine Doppelbindung bedeutet und R2 sek.-Butyl und R3 Hydroxy bedeuten;
   die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet und Ri Hydroxy, R2 sek.-Butyl und R3 Methoxy bedeuten; oder
   die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet und Ri Hydroxy, R₂ sek.-Butyl und R₃ Hydroxy bedeuten.
3. 3. Verfahren zur Herstellung dsr Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dsß man einen C-076 erzeugenden Stamm von Streptomyces avermitilis in einem wäßrigen, eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, eine assimilierbare Stickstoffquelle und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen fermentiert und C-076 aus der Fermentationsbrühe gewinnt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als C-076 erzeugenden Stamm Streptomyces avermitilis (NRRL 8165; ATCC 31 267) verwendet.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,0 durchgeführt wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5. dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur etwa 24 bis 3O⁰C und der pH-Wert etwa 6.0 bis 7,5 beträgt.
7. 7. Pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1 und übliche Träger und/oder Verdünnungsmittel.