DE2717040A1 - Neue anthelminthika und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Patentanwälte

Dr.-lng. Waiter Abi« g 9717η/η

Dr. Dreier F. Morf 21 I /040

Dipl.-Phys. M. Gritschnedei 8 München 8b, Pienzenauerstr.28

18. APRIL 1977

15 874Y

MERCK & CO., INC. Rahway, New Jersey 07065, V.St.A.

Neue Anthelminthika und Verfahren zu ihrer Herstellung

709845/0794

15 874Y > 2717XMQ

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen durch Fermentation eines früher noch nicht beschriebenen Mikroorganismus Streptomyces avermitilis in einem Nährmedium. Die neuen Verbindungen können durch Lösungsmittelextraktions- und chromatographische Fraktionierverfahren isoliert werden. Die Verbindungen, die mit ihrem Genericnamen als C-076 bezeichnet werden, besitzen eine ausgeprägte, parasitenvernichtende Aktivität. Die Verbindungen können in Form von Zubereitungen für die orale oder parenterale Verabreichung an Lebewesen für die Prophylaxe und Heilung parasitischer Infektionen verwendet werden.

Die Erfindung betrifft neue chemische Verbindungen. Die Erfindung betrifft insbesondere neue chemische Verbindungen, die kollektiv als C-076 bezeichnet werden und die durch Fermentation in einem Nährmedium mit einem Stamm des Mikroorganismus Streptomyces avermitilis hergestellt werden. Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Verbindungen, die mit dem Gattungsnahmen C-076 bezeichnet werden, und ein Verfahren zur Herstellung dieser Produkte zur Verfügung zu stellen. Erfindungsgemäß sollen neue Verbindungen geschaffen werden. Weiterhin soll ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung solcher Verbindungen zur Verfügung gestellt werden. Diese Verbindungen besitzen ein ausgeprägtes und breites antiparasitisches Aktivitätsspektrum, und es ist somit ebenfalls Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue antiparasitische Zubereitungen, die eine oder mehrere der C-076-Verbindungen enthalten, zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäß wird eine Klasse von Verbindungen, die mit dem Gattungsnamen C-076 bezeichnet werden, durch Züchten von in der Vergangenheit noch nicht beschriebenen Stämmen von Mikroorganismen bei kontrollierten Bedingungen hergestellt. Mindestens acht individuelle, aber engverwandte, neue Verbindungen werden von Streptomyces avermitilis gebildet. Sie wer-

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den in der vorliegenden Anmeldung als C-076 A1a, AHd, AZa, A2b, B1a, B1b, B2a und B2b bezeichnet. Alle besitzen eine ausgeprägte antiparasitische Aktivität. Sie können durch Fermentation und Isolierung in im wesentlichen reiner Form, wie im folgenden beschrieben, hergestellt werden.

Aufgrund taxonomischer Untersuchungen wurde festgestellt, daß die Mikroorganismen, die diese C-076-Verbindungen bilden können ein neuesSpecies des Genus Streptomyces sind, das als Streptomyces avermitilis bezeichnet wird. Eine solche Kultur, die aus Boden isoliert wurde, wird als MA-4680 in der Kultursammlung von Merck & Co., Inc. Rahway, New Jersey, bezeichnet. Eine C-076 liefernde Probe dieser Kultur wurde ebenfalls in der Kultursammlung der Fermentation Section of the Northern Utilization Research Branch, U.S. Department of Agriculture at Peoria, Illinois, hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer NRRL 8165 erhalten. Eine Probe von NRRL 8165 wurde ebenfalls ohne Beschränkung hinsichtlich der Freigabe in der Kultursammlung von American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, hinterlegt und mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31 267 bezeichnet.

Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Streptomyces avermitilis werden im folgenden aufgeführt.

Morphologie:

Die Sporenträger bilden Spiralen als Seitenzweige auf Luftmyzelien. Die Spiralen sind kompakt, werden aber beim Älterwerden der Kultur offener. Die Sporen liegen in Ketten von mehr als 15 Sporen vor und sind im allgemeinen kugelförmig bis oval bei einer 970fachen Vergrößerung. Die Sporenbildung beobachtet man auf Hafermehlagar, Glycerin-Asparaginagar, Agar aus Salzen und Stärke und Eialbuminagar. Die Sporenoberfläche ist, betrachtet durch ein Elektronenmikroskop, glatt.

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Hafermehlagar

Vegetatives Wachstum: umgekehrt - sehr dunkelbraun Luftmyzelium: pulverartig, bräunlich-grau^li)**, gemischt

mit weiß lösliches Pigment: braun. '

Czapek Dox Agar (Saccharosen!tratagar) Vegetatives Wachstum: schlecht, farblos

Luftmyzelium: knapp, gräulich

lösliches Pigment: hellgräulich-dunkelgelb.

Eialbuminagar

Vegetatives Wachstum: dunkelgelb

Luftmyzelium: mäßig, hellgräulich-gelb-braun Oge)**, gemischt mit weiß
lösliches Pigment: hellgelblich-dunkelgelb.

Glycerin-Asparaginagar

Vegetatives Wachstum: umgekehrt - gelblichbraun Luftmyzelium: pulverartig, bräunlichgrau (4Ii)³⁰S vermischt

mit weiß lösliches Pigment: hell, gelblichbraun.

Agar aus anorganischen Salzen und Stärken

Vegetatives Wachstum: umgekehrt - gräulich-gelblichbraun Luftmyzelium: pulverartig, hellbräunlichgrau (4Ig)³⁰S gesäumt

mit dunklerem bräunlichem Grau lösliches Pigment: hellgelblichbraun.

Agar aus Hefeextrakt-Dextrose und Salzen

Vegetatives Wachstum: umgekehrt - dunkelbraun Luftmyzelium: mäßig, bräunlichweiß lösliches Pigment: braun.

Agar aus Hefeextrakt-Malzextrakt Vegetatives Wachstum: umgekehrt - dunkelbraun

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Luftmyzelium: mäßig, bräunlichweiß lösliches Pigment: braun.

Agar aus Pepton-Eisen-Hefeextrakt

Vegetatives Wachstum: dunkelbraun Luftmyzelium: keins

lösliches Pigment: dunkelbraun bis schwarz Melanin: positiv

HgS-Bildung: positiv. Nähragar

Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzelium: spärlich, gräulich lösliches Pigment: hellbraun.

Nährstärkeagar

Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzelium: spärlich, gräulichweiß lösliches Pigment: hellbraun Hydrolyse der Stärke: gut.

Kartoffelstempel

Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzelium: braun, gemischt mit gräulichweiß lösliches Pigment: gräulichbraun.

Loeffler's Blutserum

Vegetatives Wachstum: gräulich-dunkelgelb Luftmyzelium: keines lösliches Pigment: geringes Braunwerden des Mediums Schmelzen: keins.

Tyrosinnähragar

Vegetatives Wachstum: umgekehrt - dunkelbraun bis schwarz Luftmyzelium: spärlich, gräulich lösliches Pigment: dunkelbraun Zersetzung von Tyrosin: nein.

_ 4 _ 709845/0794

Kohlensto ffverwendung

Pridham-Gottlieb-Grundmedium + Λ% Kohlenstoffquelle; + = Wachstum; kein Wachstum, verglichen mit negativer Kontrolle (keine Kohlenstoffquelle)

Glucose	+
Arabinose	+
Cellulose	-
Fructose	+
Inosit	+
Lactose	+
Maltose	+
Mannit	+
Mannose	+
Raffinose	+
Rhamnose	+
Saccharose	+
Xylose	+ .

Gelatinenähragar

Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzelium: spärlich, gräulichweiß lösliches Pigment: hellbraun Verflüssigung von Gelatine: gut.

Gelatinestiche

Vegetatives Wachstum: brauner Ring Luftmyzelium: keins
lösliches Pigment: grünlichbraun Verflüssigung von Gelatine: vollständig.

Magermilchagar

Vegetatives Wachstum: dunkelbraun Luftmyzelium: keins
lösliches Pigment: dunkelbraun Hydrolyse von Casein: gut.

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Vegetatives Wachstum: dunkelbrauner Wachstumsring Luftmyzelium: keines Farbe: dunkelbraun

Koagulation und/oder Peptonisierung: vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden (pH 8,1).

Magermilch

Vegetatives Wachstum: dunkelbrauner Wachstumsring Luftmyzelium: keines lösliches Pigment: dunkelbraun

Koagulation und/oder Peptonisierung: vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden (pH 8,0).

Temperaturbereich: (Agar aus Hefeextrakt-Destrose + Salzen) 28°C - gutes vegetatives Wachstum und Luftmyzelium 37°C - gutes vegetatives Wachstum und Luftmyzelium 50⁰C - kein Wachstum.

Sauerstoffbedarf: (Stichkultur in Agar aus Hefeextrakt,

Destrose und Salzen) aerob.

Alle Ablesungen erfolgten nach 3 Wochen bei 28°C, sofern nicht anders angegeben. Der pH-Wert aller Medien ist ungefähr neutral (6,8 bis 7,2).

Die Farbzahlbezeichnungen (xx) wurden aus dem Color Harmony Manual, 1958, 4.Edition Container Corporation of America, Chicago, Illinois, entnommen.

Ein sorgfältiger Vergleich der zuvor aufgeführten Ergebnisse mit den publizierten Beschreibungen einschließlich Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Eighth Edition) bekannter Mikroorganismen zeigt wesentliche Unterschiede, was andeutet, daß der angemeldete Mikroorganismus als neue Species

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klassifiziert werden kann. Aufgrund dieser Annahme wurde er als Streptomyces avennitilis bezeichnet.

Die obige Beschreibung ist eine Erläuterung für einen Stamm von Streptomyces avermitiliä, der bei der Herstellung der anmeldungsgemäßen C-076-Verbindungen verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin Mutanten des oben beschriebenen Mikroorganismus. Beispielsweise werden solche C-076 liefernde Mutanten, die durch natürliche Auswahl erhalten werden, oder solche, die durch Mutationsmittel einschließlich Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Stickstoff-Iost oder ähnliche Behandlungen erhalten werden, von der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfaßt.

Ein Beispiel eines solchen Organismus ist ein Stamm von Streptomyces avermitilis MA 4848, der nach Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von Streptomyces avermitilis MA 4680 isoliert wurde. Ein lyophilisiertes Rohr und eine gefrorene Ampulle dieser Kultur wurdaain der permanenten Kultursammlung der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 31272 bzw. 31271. Unter Verwendung dieses gefrorenen Stocks bzw. Materials als Inokulum werden etwas höhere Fermentationsausbeuten an C-076 erhalten.

Die C-076-Verbindungen werden während der aeroben Fermentation geeigneter, wäßriger Nährmedien unter den im folgenden beschriebenen Bedingungen mit einem produzierenden Stamm von Streptomyces avermitilis hergestellt. Bei dem Verfahren zur Herstellung von C-076 können wäßrige Medien verwendet werden, wie sie normalerweise für die Herstellung vieler antibiotischer Substanzen eingesetzt werden.

Solche Nährmedien bzw. -boden enthalten Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, die von dem Mikroorganismus assimilierbar sind,und im allgemeinen niedrige Gehalte an anorganischen

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Salzen. Zusätzlich können die Fermentationsmedien Spuren an Metallen enthalten, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sind. Diese sind normalerweise in ausreichender Konzentration in den komplexen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen vorhanden, die als Nährquellen verwendet werden. Sie können natürlich auch gegebenenfalls getrennt zu dem Medium zugegeben werden.

Im allgemeinen sind Kohlenhydrate, wie Zucker, z.B. Dextrose, Saccharose, Maltose, Lactose, Dextran, Cerelose u.a., und Stärken geeignete Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff im Nährmedium. In dem Medium wird die genaue Menge der Kohlenstoff quelle, die verwendet wird, teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums abhängen. Es wurde Jedoch im allgemeinen gefunden, daß eine Menge an Kohlenhydrat zwischen etwa 0,5 und 5 Gew.%, bezogen auf das Medium, ausreichend ist. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden oder mehrere solcher Kohlenstoffquellen können im gleichen Medium gemeinsam verwendet werden.

Verschiedene Stickstoffquellen, wie Hefehydrolysate, Hefeautoysate, Sojabohnenmehl, Caseinhydrolysate, Hefeextrakte, Maiseinweichflüssigkeiten, Schlempe bzw. lösliche Stoffe aus der Branntweinerzeugung, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt u.a., sind leicht von Streptomyces avermitilis bei der Herstellung von C-076-Verbindungen assimilierbar. Die verschiedenen Stickstoffquellen können allein oder im Gemisch in Mengen im Bereich von etwa 0,2 bis 6 Gew.%, bezogen auf das Medium, verwendet werden.

Als anorganische Nährsalze können in den Kulturmedien die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen ergeben, verwendet werden. Weiterhin können Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan, Eisen u.a., verwendet werden.

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Die in der vorliegenden Anmeldung und in den Beispielen beschriebenen Medien sind nur Beispiele für die große Vielzahl von Medien, die verwendet werden können.

Im folgenden werden einige Beispiele von Medien aufgeführt, die zum Züchten der Stämme von Streptomyces avermitilis zur Herstellung der C-076-Verbindungen geeignet sind.

Medium A

Maismehl	Medium B	20,0 g
Schlempe bzw. lösliche Stoffe	lösliche Stärke	in η σ
von der Branntweinerzeugung	Maiseinweichflüssigkeit
So j abohnenmehl	Cerelose	15,0 g
Natriumeitrat	So jabohnenmehl	4,0 g
CaCl22H20	(NH4)2S04	0,5 g
Polyglykol P2O0O	Maismehl	2,5 ml
MgSO4.7H2O	Sojabohnenöl	0,1 g
CoCl2.6H2O	KH2PO4	0,01 g
FeSO4.7H2O	CaCO3	0,01 g
destilliertes Wasser	destilliertes Wasser	1000 ml
pH 6,5	pH 6,7
20,0 g
15,0 g
5,0 g
4,0 g
4,0 g
1,0 g
2,5 ml
0,3 g
6,0 g
1000 ml

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15 874Y Medium C	Medium D	bzw. -mark	Λ	40	,0	g	2717040
Tomatenpaste				15	,0	g
Hafermehl	Wasser		1000	ml
destilliertes	6,0
PH

Hafermehl

Tomatenpaste bzw. -mark destilliertes Wasser pH 5,5

Medium £

20,0 g 20,0 g 1000 ml

Dextrose	10,0 g	12,7 g
Pepton (erhältlich von Difco Laboratories, Detroit, Michigan)	5,0 g	0,72 g
Hefeautolysat (erhältlich als Ardamine pH von Yeast Products Ine., Paterson, New Jersey) 3,0 g	0,035 g
NaCl	5,32 g
KCl	0,73 g
FeS04(NH4)2S04.6H20	1000 ml
MgCl2.6H2O
CaCl2.2H2O
destilliertes Wasser
pH 7,4

Die Fermentation bei der Verwendung von C-076 liefernden Mikroorganismen kann bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis etwa 40⁰C durchgeführt werden. Für optimale Ergebnisse ist es am zweckdienlichsten, diese Fermentationen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 24 bis etwa 30°C durchzuführen. Temperaturen von etwa 27 bis 28⁰C sind am meisten bevorzugt. Der pH-Wert des Nährmediums, der für die Herstellung der C-076-Verbindungen geeignet ist, kann von etwa 5,0 bis 9,0

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variieren. Ein bevorzugter Bereich beträgt etwa 6,0 bis 7,5.

Fermentationen im kleinen Maßstab werden zweckdienlich durchgeführt, indem man geeignete Mengen an Nährmedium In einen Kolben unter Verwendung bekannter Sterilisationsverfahren gibt, den Kolben entweder mit Sporen oder vegetativem, cellulärem, gewachsenem Material eines C-076 erzeugenden Stamms von Streptomyces avermitilis inokuliert, die Kolbenhälse lose mit Baumwolle verschließt und die Fermentation in einem Raum mit konstanter Temperatur von etwa 28°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung während etwa 3 bis 10 Tagen ablaufen läßt. Beim Arbeiten in größerem Maßstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einer Rührvorrichtung und Einrichtungen zum Belüften des Fermentationsmediums ausgerüstet sind. Das Nährmedium wird in dem Tank zubereitet und nach der Sterilisation mit einer geeigneten Quelle an vegetativem, zellulärem Wachstum von einem C-076 liefernden Stamm von Streptomyces avermitilis inokuliert. Die Fermentation kann während 1 bis 8 Tagen unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums bei einer Temperatur im Bereich von etwa 24 bis 37°C ablaufen. Der Belüftungsgrad hängt von verschiedenen Faktoren, wie der Größe des Fermenters, der Ruhrgeschwindigkeit und ähnlichen Faktoren, ab. Im allgemeinen werden größere Fermentationsansätze bei etwa 95 bis 150 U/min gerührt und mit etwa 56,6 bis 566 1 (2-20 cft.)/min belüftet.

Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen, die schematisch in der vorliegenden Anmeldung als C-076 bezeichnet werden, werden hauptsächlich in dem Myzelium bei Beendigung der Streptomyces avermitilis-Fermentation gefunden, und sie können, wie im folgenden beschrieben, isoliert und voneinander getrennt werden. Es wurden vier Hauptkomponenten und vier Nebenkomponenten von C-076, die durch Streptomyces avermitilis gebildet werden, isoliert. Die acht unterschiedlichen Verbindungen wer-

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den in der vorliegenden Anmeldung als C-076 A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a und B2b identifiziert. Den Hauptkomponenten wurde bei der Identifizierungsterminologie die Nachsilbe "a" verliehen und den Nebenkomponenten die Nachsilbe "b". Han nimmt an, daß der Strukturunterschied zwischen den ⁿaⁿ- und "b"-Verbindungen bei allen vier Paaren gleich ist.

Wie zu erwarten war, werden selbst die Haupt-C-076-Verbindungen bei den anmeldungsgemäßen Fermentationen nicht in gleichen Mengen gebildet. Es wurde im allgemeinen gefunden, daß die A1-Verbindungen etwa 20 bis 30 Gew.% des gesamten, gebildeten C-076-Komplexes, die A2-Verbindungen etwa 1 bis 20 Gew.96 und die B1- und B2-Verbindungen je etwa 25 bis 35 Gew.% ausmachen. Das Gewichtsverhältnis der Verbindungen der ^waⁿ-Reihen zu den "b"-Reihen beträgt etwa 85:15 bis 99:1.

Die Trennung der C-076-Reihen der Verbindungen aus der gesamten Fermentationsbrühe und die Isolierung der einzelnen Komponenten erfolgt durch Lösungsmittelextraktion und chromatographische Fraktionierungen mit verschiedenen chromatographischen Verfahren und Lösungsmittelsystemen.

Die C-076-Verbindungen besitzen in Wasser eine geringe Löslichkeit, sind jedoch in organischen Lösungsmitteln löslich. Diese Eigenschaft wird zweckdienlich bei ihrer Gewinnung aus der Fermentationsbrühe ausgenutzt. Bei dem Isolierungsverfahren wird die gesamte Fermentationsbrühe filtriert und das wäßrige Filtrat wird verworfen. Der feuchte Myzeliumkuchen wird dann mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel extrahiert. Obgleich irgendein organisches Lösungsmittel verwendet werden kann, ist es bevorzugt, ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol, Äthanol u.a., zu verwenden. Im allgemeinen sind verschiedene Extraktionen zur maximalen Isolierung erwünscht. Durch das Lösungsmittel werden die C-076 aktiven Komponenten wie auch andere Substan-

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zen, denen die antiparasitische Aktivität von C-076 fehlt, entfernt. Ist das Lösungsmittel ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wird von den feuchten Myzelien ebenfalls Wasser entfernt. Die extrahierten Myzelien werden verworfen. Die Lösungsmittelextrakte werden zur Entfernung organischer Lösungsmittel eingedampft und mehrere Male mit einem zweiten Lösungsmittel extrahiert. Wenn bei der ersten Extraktion ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel verwendet wird, wird bei der zweiten Extraktion bevorzugt ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel, wie Chloroform, Methylenchlorid, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylacetat, Methyläthylketon, Methylisobutylketon u.a., verwendet. Diese letzteren Extrakte werden nach an sich bekannten Verfahren getrocknet und konzentriert, und man erhält einen Rückstand, der aus C-076, vermischt mit anderen Materialien, besteht. Diese Fraktion wird dann zweckdienlich zur Abtrennung der aktiven C-076-Verbindungen aus anderen Materialien und ebenfalls zur Abtrennung und Isolierung der einzelnen C-076-Verbindungen chromatographiert. Die zur Reinigung der C-076-Verbindungen verwendbaren chromatographischen Verfahren sind dem Fachmann geläufig. Beispiele solcher Verfahren sind die Säulenchromatographie unter Verwendung solcher Medien, wie Silikagel, Aluminiumoxid, Dextrangel u.a., und Eluierung solcher Säulen mit verschiedenen Lösungsmitteln und/oder Gemischen aus zwei oder mehr Lösungsmitteln in verschiedenen Verhältnissen. Die Flüssig- keitschromatographie wird zum Nachweis der "C-076-Verbindungen verwendet, und die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie kann zur Isolierung gereinigter Fraktionen, die eine oder mehrere dieser Verbindungen enthalten, verwendet Werden. Die Dünnschichtchromatographie kann zum Nachweis der Anwesenheit und Isolierung einzelner C-076-Verbindungen verwendet werden. Bei dem Einsatz der zuvor beschriebenen Verfahren wie auch bei anderen Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, wird man gereinigte Zusammensetzungen erhalten, die die C-076-Verbindungen wie auch einzelne C-076-Verbin-

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düngen selbst enthalten. Die Anwesenheit der aktiven C-076-Verbindungen wird festgestellt, indem man die verschiedenen chromatographischen Fraktionen auf ihre antiparasitische Aktivität analysiert und ebenfalls durch spektrale charakteristische Eigenschaften (wie Ultraviolett- und Infrarotspektrum) der Verbindungen, wie im folgenden näher erläutert wird.

Die spektralen und andere physikalisch-chemischen Eigenschaften der einzelnen C-076-Verbindungen sind in Tabellenform in Tabelle I zusammengefaßt. Diese Verbindungen sind in den meisten organischen Lösungsmitteln gut löslich und in Wasser nur gering löslich.

Die spektralen Ultraviolettwerte der Tabelle I werden auf einem Cary Modell 15 Ultraviolett-Spektrometer in Methanollösungen in 1 cm Quarzzellen erhalten. Die Konzentration der Verbindung beträgt etwa 25 /Ug/ml. Die ultraviolette Absorption ist, obgleich sie als die einer besonderen Verbindung der "a"-Reihen angegeben wird, tatsächlich die Absorption der Verbindung der "a"-Reihe, die eine geringe Menge an Verbindung der "b"-Reihen enthält. Die "a"- und '^"-Reihen unterscheiden sich nur durch einen -CHg-Molekülteil im niedrig-Alkylsubstituenten, und dieser Unterschied steht nicht im Zusammenhang mit einem Chromophor. Durch das Ultraviolett-Absorptionsspektrum wird hauptsächlich der Grad und die Art der Unsättigung, die in einer besonderen Verbindung vorhanden ist, beschrieben. Die optischen Rotationen werden unter Verwendung von Standardverfahren mit einem Carl Zeiss-Polarimeter bestimmt. Der Konzentrationsfaktor (c) wird als Prozent der Verbindung in dem angegebenen Lösungsmittel aufgeführt.

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A1a

A2a

Tabelle I A2b

B1a

Bib

B2a

B2b

Summenformel

^C48^H72°14 ^C49^H76°15 ^C48^H74°15 ^C48^H72°14

^C48^H74°15 ^C47^H72°15

optische Drehung +68, [a]*7 (CHCl3) <C=	5°+2° 0,77)	872	+48,8° (C=1	+2° ,64)	890	+55 (C	,7° =1,	+2° 06)	858	+38,3°+22 (C=O,87
Molekulargewicht (bestimmt durch Massenspektrometrie)	886	904			872		890 876

oUltraviolett-Ab- 237 co Sorptionsspektrum (28 700: oo 4,458)

A. max (m

; log£.)

243

(31 275ϊ 4,495)

252

(20 290: 4,307)

237

(28 800: 4,459)

243

(31 740: 4,501)

252

(20 425; 4,310)

237

(29 120:
4,464)

243

(31 850:
4,503)

252

(20 510:
4,431)

237

(27 580: 4,441)

,243
(30 590: 4,486)

252

(20 060: 4,302)

-^ O

Die Werte für die 13C kernmagnetischen Resonanzspektren für C-076 A1a, A2a, B1a und B2a werden in der folgenden Tabelle II angegeben. Die Spektren werden auf einem Varian Nuclear Magnetic Spectrometer Modell CFT-20 in deuterierter Chloroformlösung unter Verwendung, von Tetramethylsilan als Innenstandard bestimmt. Das Lösungsvolumen und die Konzentration der Probe werden für jeden Fall angegeben, darauf folgen die chemischen Verschiebungen, bezogen auf Tetramethylsilan, für jede Verbindungen, angegeben in Teilen pro Million (ppm). Die chemischen Verschiebungen werden für ein einzelnes Kohlenstoffatom, sofern nicht nach der chemischen Verschiebung ein Klammerausdruck angegeben ist, aufgeführt.

Tabelle II A1 (0,6 ml

12,0, 13,0, 15,1, 16,4, 17,7, 18,4, 19,9, 20,3, 27,5, 30,6, 34,3 (3C), 35,2, 36,6, 39,7, 40,5, 45,7, 56,4 (2C), 57,7,

67.3, 68,2 (2C), 68,4 (2C), 74,9, 76,1, 77,0, 77,5, 78,3,

79.4, 80,6 (2C), 82,0, 95,0, 95,8, 98,5, 118,4 (2C), 119,7, 124,9, 127,8, 135,2, 136,0, 136,1, 137,6, 139,9, 173,8.

A2 (0,6 ml 16%)

11,8, 12,4, 13,8, 15,1, 17,7, 18,4, 19,9, 20,3, 27,3, 34,3 (3C),

35.2, 35,8, 36,5, 39,8, 40,8, 41,2, 45,7, 56,4 (2C), 57,7,

67.3, 67,7, 68,2 (3C), 69,9, 70,8, 76,1, 77,0, 77,6, 78,3,

79.4, 80,6 (2C), 81,8, 94,9, 98,6, 99,7, 117,7, 118,4, 119,7, 124,9, 135,7, 136,1, 137,6, 140,0, 173,7.

B1 (0.3 ml 16%)

12,0, 12,9, 15,1, 16,4, 17,7, 18,4, 19,9, 20,2, 27,5, 30,6, 34,3 (3C), 35,2, 36,6, 39,8, 40,5, 45,7, 56,4 (2C), 67,3, 67,8, 68,2 (2C), 68,4 (2C), 75,0, 76,1, 78,3, 79,4 (2C), 80,5 (2C), 82,0, 95,0, 95,8, 98,5, 118,1, 118,4, 120,4, 124,8, 127,9, 135,2, 136,2, 137,9 (2C), 139,7, 173,6.

- 16 -

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B2 (0.6 ml 1690

11,8, 12,4, 13,8, 15,1, 17,7, 18,4, 19,9, 20,2, 27,3, 34,4(3C), 35,2, 35,8, 36,5, 39,8, 40,8, 41,2, 45,8, 56,4 (2C), 67,3, 67,7 (2C), 68,3 (3C), 69,9, 70,9, 76,1, 78,3, 79Λ (2C), 80,5 (2C), 81,8, 94,9, 98,6, 99,7, 117,7, 118,0, 120,4, 124,8, 135,7, 138,0 (2C), 139,8, 173,5.

Die charakteristischen Massenspektrenpeaks der acht C-076-Verbindungen werden in Tabelle III angegeben. Die erste Zeile in Tabelle III bedeutet das Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/e) des Molekülions jeder betreffenden Verbindung, und die restlichen Zahlen bedeuten das Masse-zu-Ladung-Verhältnis der Hauptfragmente jeder Verbindung. Die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse, die in der gleichen horizontalen Reihe aufgeführt sind, weisen auf analoge Fragmente in jeder Verbindung hin. Die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse, die als ganze Zahlen aufgeführt sind, werden an einem LKB Massenspektrometer Modell LKB-9000 erhalten. Die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse, die bis zur vierten Dezimale aufgeführt sind, werden auf einem High Resolution Varian Massenspektrometer Modell MAT-731 gemessen.

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874Y

CM ff

CM ff

CM

CM

VO CM

N io s n co o- in in

O CM CM CTtT-

ιη -4" ο er»

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CMCVJCM

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Die beigefügten Fig. 1 bis 8 sind genaue Reproduktionen der Infrarotspektren und der kernmagnetischen Protonenresonanzspektren von vier der C-076-Verbindungen. Die Fig. 1 bis 4 sind Infrarotspektren für C-076 A1a, A2a, B1a und B2a. Die Fig. 5 bis 8 sind kernmagnetische Protonenspektren für C-076 A1a, A2a, B1a und B2a. Die Infrarotspektren werden auf einem Perkin-Elmer Infrarotspektrometer Modell 421 in Chloroformlösung aufgenommen. Die kernmagnetischen Protonenresonanzspektren werden in deuterierter Chloroformlösung auf einem Varian kernmagnetischen Resonanzspektrometer Modell HA-1OO aufgenommen, und die in den Spektren aufgeführten chemischen Verschiebungen werden in Teilen pro Million (ppm), bezogen auf Tetramethylsilan als Innenstandard, angegeben.

Aufgrund von Versuchsergebnissen einschließlich der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Untersuchungen und Messungen wird angenommen, daß die C-076-Verbindungen die folgende planare Strukturformel besitzen

CH

R-O

CH,

CH-

in der

R das ÖL -L-Oleandrosyl- oC-L-oleandrosid der Strukturfο rmel

- 19 -

709845/0794

15 874Y

717040

bedeutet,

die gestrichelte Linie eine Einfach- oder eine Doppelbindung anzeigt,

R₁ eine Hydroxygruppe bedeutet und nur dann vorhanden ist, wenn die gestrichelte Linie eine Einfachbindung darstellt, R₂ Propyl oder Butyl bedeutet und R, Methoxy oder Hydroxy bedeutet.

Die einzelnen Verbindungen, die unter die zuvor beschriebene Strukturformel fallen, werden in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV

^R1^R2

A1a Doppelbindung Butyl -OCH₃

A1b Doppelbindung Propyl -OCH,

A2a -OH Butyl -OCH₃

A2b -OH Propyl -OCH₃

B1a Doppelbindung Butyl -OH

Bib Doppelbindung Propyl -OH

B2a -OH Butyl -OH

B2b -OH Propyl -OH

Wie zu erwarten war, verhalten sich die erfindungsgemäßen Verbindungen, worin R₂ Butyl bedeutet (die ⁿaⁿ-Reihen der Verbindungen) ,und die entsprechenden Verbindungen, worin R₂ Propyl bedeutet (die "b"-Reihen) in den meisten Isolierungsverfahren, wie solchen, bei denen eine Extraktion mit Lösungsmitteln verwendet wird, ähnlich. Bei jedem Paar von ⁿa^w- und ⁿb^M-Verbindungen wurde die "aⁿ-Verbindung in größerer Menge festge stellt und macht im allgemeinen etwa 85 bis 9996 in dem Gemisch der "a"- und ⁿb"-Verbindungen aus. Die Anwesenheit der

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Propylverbindungen wird durch das Massenspektrum der Verbindungen sichergestellt, worin die Massenpeaks, die die Fragmente darstellen, die eine Butylgruppe enthalten, begleitende Peaks mit 14 Masseneinheiten (oder eine -CH₂" Gruppe) weniger aufweisen. Weiterhin wurde die Hochdruckflüssigkeitschromatographie zur Abtrennung der Alb-Komponente von der A1a-Komponente verwendet, und das Massenspektrum einer solchen A1b-Komponente wurde durch Hochresolutionsmassenspektrometrie verifiziert (vergl. Tabelle III).

Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen eine ausgeprägte parasitenvernichtende Aktivität als Anthelminthika, Insektizide und Acarizide für die menschliche und tierische Gesundheit und in der Landwirtschaft.

Die Krankheit oder Gruppe von Krankheiten, die allgemein als Helminthose bezeichnet wird, beruht auf der Infektion eines lebenden Wirts mit parasitischen Würmern, die als Helminthen bekannt sind. Die Helminthose ist ein schwerwiegendes und ernstes wirtschaftliches Problem bei domestizierten Tieren, wie Schweinen, Schafen, Pferden, Kühen bzw.. Kälbern, Ziegen, Hunden, Katzen und Geflügel. Unter den Helminthen verursacht die Gruppe von Würmern, die als Nematoden bezeichnet werden, eine weitverbreitete und oft ernste Infektion bei verschiedenen Tierspecies. Die wichtigsten Arten der oben erwähnten Nematoden, die Tiere infizieren, sind Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris und Parascaris.

- 21 -

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Bestimmte Nematoden, wie Nematodirus, Cooperia und Oesophagostomum, greifen hauptsächlich den intestinalen Trakt an, während andere, wie Maemonchus und Ostertagia, im Magen überwiegen, während noch andere, wie Dictyocaulus, in den Lungen gefunden werden. Noch andere Parasiten können in anderen Geweben und Organen des Körpers, wie in Herz- und Blutgefäßen, den subkutanen und lymphatischen Geweben bzw. Gefäße u.a., auftreten. Die parasitischen Infektionen, die als Helminthose bekannt sind, führen zu Anämie, Unterernährung, Schwachheit, Gewichtsverlust, starken Schäden an den Wänden des intestinalen Trakts und anderen Geweben und Organen und können, sofern sie nicht behandelt werden, den Tod des infizierten Wirts hervorrufen. Die erfindungsgemäßen C-076-Verbindungen besitzen eine überraschend hohe Aktivität gegenüber diesen Parasiten, und zusätzlich sind sie gegenüber Dirofilaria bei Hunden, Nematospiroiden, Syphacia und Aspiculuris bei Nagetieren, arthropoden Ectoparasiten bei Tieren und Vögeln, wie Zecken, Milben, Läusen, Flöhen, Schmeißfliegen und Fliegen, bei Schafen Lucilia sp., beißenden Insekten und wandernden, zu den Dipteren gehörenden Larven, wie Hypoderma sp., bei Rindern, Gastrophilus bei Pferden und Cuterebra sp. bei Nagetieren aktiv.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind weiterhin gegen Parasiten, die Menschen infizieren, wirksam. Die häufigsten Arten von Parasiten des gastro-intestinalen Trakts von Menschen sind Anylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris und Enterobius.

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Ändere, medizinisch wichtige Arten von Parasiten, die im Blut und anderen Geweben und Organen außerhalb des gastro-intestinalen Trakts auftreten, sind die Filialwürmer (filiarial worms), wie Wuchereria, Brugia, Onchocerca und Loa, Dracunculus und extra intestinale Stufen der intestinalen Würmer Strongyloides und Trichinella. Die Verbindungen sind ebenfalls von Wert gegenüber Arthropoden, die Menschen bzw. Lebewesen als Parasiten befallen, beißenden Insekten und anderen,zu den Dipteren gehörenden Schädlingen, die Menschen bzw. Lebewesen belästigen.

Die Verbindungen sind weiterhin gegenüber Haushaltsschädlingen, wie Schaben bzw. Küchenschaben, Blatella sp., Kleidermotten, Tineola sp., Teppich- bzw. Tapetenkäfer und Hausfliegen Musca domestica, aktiv.

Die Verbindungen sind weiterhin gegenüber Insektenschädlingen von gelagertem Getreide, wie Tribolium sp., Tenebrio sp., und von landwirtschaftlichen Pflanzen, wie Spinnenmilden (Tetranychus sp.), Aphiden (Acyrthiosiphon sp.); gegenüber wandernden Geradflüglern, wie Heusehrecken,und unentwickelten Stufen von Insekten, die auf Pflanzengewebe leben. Die Verbindungen sind wertvolle Nematozide für die Kontrolle von Bodennematoden und Pflanzenparasiten, wie Meloidogyne spp., die in der Landwirtschaft Bedeutung haben können.

Diese Verbindungen können oral in Dosiseinheitsformen, wie Kapseln, großen Pillen oder Tabletten, oder in Form eines flüssigen Arzneitranks, wenn sie bei Säugetieren als Ant-¹ helminthika verwendet werden, verabreicht werden.

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Der Arzneimitteltrank ist normalerweise eine Lösung, Suspension oder Dispersion des aktiven Bestandteils, normalerweise in Wasser, zusammen mit einem Suspensionsmittel, wie Bentonit, und einem Benetzungsmittel oder einem ähnlichen Verdünnungsmittel.

Im allgemeinen enthält der Arzneimitteltrank ebenfalls ein Antischaummittel.

Arzneimitteltrankzubereitungen enthalten im allgemeinen etwa 0,001 bis 0,5 Gew.% an aktiver Verbindung. Bevorzugte Arzneimitteltrankzubereitungen können 0,01 bis 0,1 Gew.% enthalten. Die Kapseln und großen Pillen enthalten den aktiven Bestandteil vermischt mit einem Träger, wie Stärke, Talk, Magnesiumstearat oder Dicalciumpho sphat.

Wenn die C-076-Verbindungen in trockener, fester Einheitsdosisform verabreicht werden sollen, werden normalerweise Kapseln, große Pillen oder Tabletten, die die gewünschte Menge an aktiver Verbindung enthalten, verwendet. Diese Dosisformen werden durch inniges und einheitliches Vermischen des aktiven Bestandteils mit geeigneten, feinverteilten Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, Desintegrationsmitteln und/oder Bindemitteln, wie Stärke, Lactose, Talk, Magnesiumstearat, pflanzlichen Gummis u.a., hergestellt.

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Solche Dosiseinheitszubereitungen können stark variieren und werden abhängig von dem Gesamtgewicht und dem Gehalt an antiparasitischem Mittel und abhängig von solchen Faktoren, wie der Art des zu behandelnden Wirttiers, der Stärke und der Art der Infektion und den Gewicht des Wirts ausgewählt.

Wenn die aktive Verbindung über das Tierfutter verabreicht werden soll, wird sie gut in dem Tierfutter dispergiert, oder sie wird als Zubereitung auf dem Tierfutter oder in Form von Pellets verwendet, die dann zu dem fertigen Futter zugegeben werden können oder gegebenenfalls getrennt verfüttert werden können.

Alternativ können die erfindungsgemäßen antiparasitischen Verbindungen Tieren parenteral, z.B. durch intraruminale, intramuskuläre, intratracheale oder subkutane Injektion, verabreichet werden, wobei in diesem Fall der aktive Bestandteil in einem flüssigen Trägerstoff gelöst oder dispergiert ist.

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Für die parenterale Verabreichung wird das aktive Material geeigneterweise mit einem annehmbaren Träger, bevorzugt einem Pflanzenöl, wie Erdnußöl, Baumwollsamenöl u.a., vermischt. Andere parenterale Träger für organische Zubereitungen wie Solketal, Glyzerin, Formal und wäßrige •parenterale Zubereitungen werden ebenfalls verwendet. Die aktive C-076-Verbindung oder die aktiven C-076-Verbindungen werden in der parenteralen Zubereitung für die Verabreichung gelöst oder suspendiert. Solche Zubereitungen enthalten im allgemeinen 0,005 bis 5 Gew.% an aktiver Verbindung.

Obgleich die erfindungsgemäßen antiparasitischen Mittel ihre primäre Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von Helminthose finden, sind sie ebenfalls für die Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten nützlich, die durch andere Parasiten verursacht werden, z.B. Arthropodenparasiten, wie Zecken;: Läuse, Flöhe, Milben, und andere· beißende Insekten bei domestizierten Tieren und Geflügel. Sie sind ebenfalls zur Behandlung von parasitischen Krankheiten, die bei anderen Tieren einschließlich Menschen auftreten, wirksam. Die für die besten Ergebnisse verwendete, optimale Menge wird natürlich von der besonderen verwendeten Verbindung, der zu behandelnden Art der Tiere, der Art und der Stärke der parasitischen Infektion oder dem Befall abhängen. Im allgemeinen werden gute Ergebnisse mit den neuen erfindungsgemäßen Verbindungen bei einer oralen Verabreichung von etwa 0,001 bis 10 mg/kg Tierkörpergewicht erhalten. Diese Gesamtdosis kann einmal oder unterteilt in verschiedene Dosen während einer relativ kurzen Zeit, wie während 1 bis 5 Tagen, verabreicht werden. Mit den bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen wird eine ausgezeichnete Kontrolle der Parasiten bei Tieren bei Verabreichung von etwa 0,025 bis 0,5 mg/kg Tierkörpergewicht als Einzeldosis erhalten. Wiederholte Behandlungen werden, sofern erforderlich,

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zur Bekämpfung von Wieder-Infektionen durchgeführt und hängen von der Art der Parasiten und den verwendeten Paarungseigenschaften ab. Verfahren zur Verabreichung dieser Materialien an Tiere sind dem Fachmann auf dem Veterinärgebiet bekannt. '

Venn die erfindungsgemäßen Verbindungen als Komponente des Futters den Tieren oder gelöst oder suspendiert in dem Trinkwasser verabreicht werden, werden Zubereitungen geschaffen, in denen die aktive Verbindung oder Verbindungen gut in einem inerten Träger oder Verdünnungsmittel dispergiert sind.

Unter "inerter Träger" wird eine Verbindung verstanden, die mit dem antiparasitischen Mittel nicht reagiert und die Tieren sicher verabreicht werden kann. Bevorzugt wird als Träger für die Verabreichung als Futtermittel ein Material verwendet, das ein Bestandteil der Tierfutterration ist.

Geeignete Zusammensetzungen umfassen Vormischungen (Futterprämix) oder Ergänzungen, in denen der aktive Bestandteil in relativ großen Mengen vorhanden ist und die für die direkte Verfütterung an Tiere oder für die Zugabe zu Futter entweder direkt oder nach einer Zwischenverdünnung oder Mischstufe geeignet sind.

Typische Träger oder Verdünnungsmittel, die für solche Zusammensetzungen geeignet sind, sind z.B. getrocknetes Ge-

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treide bzw. getrocknete Körner von der Branntweinherstellung, Maismehl, Citrusmehl, Fermentationsrückstände, gemahlene Austernschalen, Weizenrückstände, Melassenschlempe bzw. lösliche Melassenrückstände, Cops (Stücke) aus Maismehl, genießbares Futter aus Bohnenmehl, Sojagrieß, zerkleinertes Kalkgestein u.a.

Die aktiven C-076-Verbindungen werden intensiv in dem Träger durch Zerstoßen, Rühren, Vermählen oder Trommeln dispergiert. Zubereitungen, die etwa 0,005 bis 2,0 Gew.% an aktiver Verbindung enthalten, sind als Futterprämix besonders geeignet. Futterergänzungen, die direkt an die Tiere verfüttert werden, enthalten etwa 0,0002 bis 0,3 Gew.% an aktiven Verbindungen.

Solche Ergänzungen werden zu dem Tierfutter in einer Menge zugegeben, daß das fertige Futter die für die Behandlung und Kontrolle parasitischer Krankheiten erforderliche Konzentration an aktiver Verbindung enthält.

Obgleich die gewünschte Konzentration an aktiver Verbindung in Abhängigkeit von den zuvor beschriebenen Faktoren abhängen wird, wie auch von der besonderen, verwendeten C-076-Verbindung, werden die erfindungsgemäßen Verbindungen normalerweise in Konzentrationen zwischen 0,00001 und 0,002% in dem Futter verfüttert, damit man die gewünschten antiparasitischen Ergebnisse erhält.

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Bei der Verwendung der erf indungsgemäßen Verbindungen können die verschiedenen C-076-Komponenten isoliert und gereinigt werden und in dieser Form verwendet werden. Alternativ können Gemische aus zwei oder mehreren der einzelnen C-076-Komponenten verwendet werden. Es ist nicht erforderlich, die verschiedenen C-076-Verbindungen, die man bei der Reinigung der Fermentationsbrühe erhält, vollständig zu trennen. Im allgemeinen erhält man ein Gemisch, das zwei oder mehr der C-076-Verbindungen enthält und aus dem andere, nichtverwandte Verbindungen entfernt sind. Ein solches Gemisch kann für die Verhinderung und Behandlung parasitischer Krankheiten, wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben, verwendet werden. Ein solches Gemisch wird im allgemeinen ungleichmäßige Anteile an C-076-Verbindungen enthalten, jedoch besitzen alle Verbindungen wesentliche Aktivität, und die antiparasitische Aktivität des Gemisches kann genau bestimmt werden. Insbesondere wird es nicht erforderlich sein, die "b"-Komponenten von den verwandten "a"-Komponenten zu trennen. Diese Verbindungen unterscheiden sich nur in der Länge der 25 Seitenkette. Die Abtrennung der engverwandten Verbindungen wird im allgemeinen nicht praktiziert, da die "b"-Verbindung nur in einer geringen Menge, ausgedrückt als Gew.%, vorhanden ist.

Zusätzlich ist es, wenn die C-076-Verbindungen zu Tierfutter zugegeben werden, möglich, den getrockneten Myzelienkuchen aus der Fermentationsbrühe zu verwenden. Die Myzelien enthalten das Übergewicht an Aktivität, und da der Aktivitätsgehalt der Myzelien bestimmt werden kann, können sie direkt zu dem Tierfutter zugegeben werden.

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15 874Y 27170A0

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen ein breites Aktivitätsspektrum gegenüber vielen Parasiten bei niedrigen Dosisgehalten und bei verschiedenen Tieren. Bei Gehalten von etwa 2,5 mg/kg Tierkörpergewicht sind konzentrierte Gemische der C-076-Verbindungen vollständig aktiv bei Schafen gegenüber Haemonchus contortus, Ostertagia circumcincta, Trichostrongylus axei, Trichostrongylus colubriformis, Cooperia spp. und Oesophagostomum columbianum. Ähnlich sind bei Rindern bzw. Kühen C-076 B2-Verbindungen in so niedrigen Dosismengen wie 0,043 mg/kg vollständig aktiv gegenüber Ostertagia ostertagi, Trichostrongylus axei, Trichostrongylus colubriformis, Oesophagostomum radiatum und Dictyocaulus viviparus.

Weiterhin wurde ein mit Dassellarven (Gastrophilus intestinalis und Gastrophilus haemorrhoidalis), großen und kleinen Strongylen und Oxyuris infiziertes Pferd mit Erfolg mit 10 mg/kg (etwa 1 Gew.% an aktiven Verbindungen) eines gemischten Konzentrats von C-076-Verbindungen behandelt.

Ein mit der mikrofilarialen Stufe des Herzwurms (Dirofilaria immitis) infizierter Hund wurde erfolgreich mit einer einzigen oralen Dosis von 10 mg/kg (etwa 1 Gew.% an aktiven Verbindungen) eines gemischten Konzentrats von C-076-Verbindungen behandelt. Bei Nagern, wie Mäusen, wurden Infektionen von Syphacia, Nematospiroides und Aspiculuris erfolgreich durch orale Verabreichung von C-076-Verbindungen oder von Konzentraten, die bei der Extraktion der Myzelien erhalten wurden, behandelt.

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^717040

15 874Y 3 t

Die erfindungsgemäßen C-076-Verbindungen werden ebenfalls zur Bekämpfung landwirtschaftlicher Schädlinge, die eine Beschädigung der Nutzpflanzen während des Wachstums oder während der Lagerung verursachen, verwendet. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden unter Verwendung an sich bekannter Verfahren als Sprays, Bestäubungsmittel, Emulsionen u.a. auf die wachsenden oder gelagerten Nutzpflanzen angewendet, damit man gegenüber diesen landwirtschaftlichen Schädlingen einen Schutz erhält.

Die anthelminthische Aktivität von C-076 kann durch orale Verabreichung über das Futter, einer Probe einer einzelnen C-076-Verbindung, eines Gemisches aus C-O76-Verbindungen, eines konzentrierten Extraktes u.a. an eine Maus, die 3 Tage zuvor mit Nematospiroides dubius infiziert wurde, bestimmt werden. An dem 11., 12. und 13. Tag nach der Initiierung der Medikation werden die Exkremente der Maus auf N.dubius-Eier geprüft, und am nächsten Tag wird die Maus getötet und die Anzahl der in dem proximalen Teil des Dünndarms vorhandenen Würmer wird bestimmt. Eine aktive Verbindung stellt man fest, wenn eine wesentliche Verminderung in den Ei - und Wurmzählungen beobachtet wird, verglichen mit den infizierten Kontrolltieren, denen kein Medikament verabreicht wurde.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1 ^4/ "^vny

Der Inhalt eines lyophilisierten Rohrs von Streptomyces avermitilis MA-4680 wird aseptisch in einen 50 ml Medium enthaltenden 250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben. Der inokulierte Kolben wird 3 Tage bei 28° auf einer Rotationsschüttelmaschine bei einer Geschwindigkeit von 220 U/min in einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm (2 in.) geschüttelt.

Gegen Ende dieser Zeit wird ein 50 ml Medium 2 enthaltender 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit einer 2 ml Probe aus dem ersten Kolben inokuliert. Dieser Kolben wird dann 3 Tage bei 28°C auf einer Rotations schUttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 U/min in einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm geschüttelt.

50 ml der entstehenden, C-076 enthaltenden Fermentationsbrühe sind gegenüber N.dubius-Infektion bei Mäusen wirksam.

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15 874Y

Medium 1

Dextrose Pepton Fleischextrakt primäre Hefe NaCl

CaCO₅ (nach der pH-Einstellung) destilliertes Wasser pH 7,0

Zusammensetzung der Medien 2717040

20 g 5 g 5 g 3 g 5 g 3 g 1000 ml

Medium 2

Tomatenpaste bzw. -mark modifizierte Stärke (CPC) primäre Hefe CoCl₂ 6H₂O destilliertes Wasser

pH 7,2 bis 7,A

20 g 20 g 10 g

0,005 g 1000 ml

Beispiel 2

Ein lyophilisiertes Rohr von Streptomyces avermitilis MA-4680 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in 50 ml Medium 1 in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Urlenkorganen suspendiert. Dieser Kolben wird 3 Tage bei 28°C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 220 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm (2 in.) geschüttelt. Ein 0,2 ml Teil dieses Impfmediums wird zur Inokulierung einer Schrägkultur von Medium 3 verwendet. Das inokulierte Schrägkulturmedium wird 10 Tabe bei 28°C inkubiert und bei 4°C gelagert, bis es zur Inokulation von vier weiteren Schrägkulturen von Medium 3 verwendet wird. Diese Schrägkulturen werden 8 Tage in der Dunkelheit inkubiert. Eine dieser Schrägkulturen wird zur Inokulation von drei 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen, die 50 ml Nr.4

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Impf medium enthalten, verwendet. Die Impfkolben werden 2 Tage bei 27 bis 28°C auf einer RotationsschUttelmaschine bei 220 U/min in einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5»08 cm geschüttelt. Die Inhalte dieser Kolben werden vereinigt und zur Inokulation (5# Inokulum)von 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen, die AO ml verschiedener Produktionsmedien enthalten, verwendet. Die Kolben, die die Medien 2, 5 und 6 enthalten, werden 4 Tage bei 28⁰C auf einer RotationsschUttelmaschine bei 220 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm inkubiert. Die entstehende, C-076 enthaltende Brühe wird dann entnommen und auf ihre anthelminthische Aktivität geprüft. In allen Fällen sind 6,2 ml der gesamten Brühe und die Feststoffe, die man beim Zentrifugieren von 25 ml der gesamten Brühe erhält, voll aktiv gegenüber N.dubius-Wurminfektionen bei Mäusen.

Medium 3 (Schrägkultur)

Dextrose 10,Og

Bacto Asparagin 0,5 g

K₂HPO₄ 0,5 g

Bacto Agar 15,0 g

destilliertes Wasser 1000 ml
pH 7,0

Medium 4 (Impfmedium)

Lösliche Stärke 10,0 g

Ardamine pH 5,0 g

NZ AmIn E ' 5,0 g

Rinderextrakt 3,0 g

MgSO₄ 7H₂O 0,5 g

Cerelose . . „.. 1,0 g

Na₂HPO₄ 0,190 g

KH₂PO₄ 0_f182 g

CaCOj 0_f5 g

destilliertes Wasser 1000 ml
pH 7,0 bis 7,2

709845/*0³794

15 874Y Medium 5 Tomatenpaste bzw. -mark Hafermehl Cerelose

Maiseinweichflüssigkeit Spurenelementmischling destilliertes Wasser pH 6,8.

271704Q AO,0 g 10,0 g 10,0 g 5,0 g 10,0 ml ml

Spurenelementmischung FeSO^.7H₂O

CuCl₂.2H₂O

CaCl₂

H₂BO₃

ZnSO^.7H₂O

destilliertes Wasser PH

mg mg 25,0 mg

100,0 mg 56,0 mg 10,0 mg

200,0 mg ml

Medium 6 CPC industrielle Stärke, modifiziert (erhältlich von CPC Corp.)

lösliche Stoffe aus der Branntweinherstellung

autolyslerte Hefe (Ardamine pH, erhältlich von
Yeast Products Inc.)

CoCl₂.6H₂O destilliertes Wasser pH 7,3.

40,0	g
7,0	g
5,0	g
50,0	mg
1000 ml

Beispiel

Eine 0,5 x 1,0 cm Schlinge von einer der vier Schrägkulturen von Medium 3, hergestellt wie In Beispiel 2 beschrieben, wird zum Inokulieren eines 50 ml Impfmedium 4 enthaltenden 250 ml Erlenmeyer-Kolbens mit Umlenkorganen verwendet. Der Impfkolben wird 1 Tag bei 27 bis 28°C auf einer Rotations-

- 35 -709845/0794

Schüttelmaschine bei 220 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm geschüttelt. Der Impfkolben wird dann stationär bei 4°C bis zu seiner Verwendung gelagert. Der Inhalt dieses Kolbens wird dann zur Inokulierung (5% Inokulum) von zwanzig 250 ml Erlenmeyer-Kolben ohne Umlenkorgane, die 40 ml Medium 2 enthalten, verwendet. Nach 4 Tagen Inkubation bei 28°C auf einer Rotations-Schüttelmaschine bei 220 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm wird aus neunzehn Kolben der Inhalt gewonnen und vereinigt. Die vereinigten, C-076 enthaltenden Fermentationsbrühen werden filtriert; man erhält 500 ml Filtrat und 86 g Myzelien. 78 g Myzelium werden mit 150 ml Aceton während einer halben Stunde unter Rühren extrahiert und das Gemisch wird filtriert. Der Filterkuchen wird mit 50 ml Aceton gewaschen, und das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt und auf 46,5 ml konzentriert. Der pH-Wert von 30 ml Konzentrat wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 4 eingestellt. Das Konzentrat wird dreimal mit 30 ml-Teilen Chloroform extrahiert. Die Extrakte werden durch Filtern durch trockene Infusorienerde (Super-Cel) getrocknet, vereinigt und zur Trockene im Vakuum konzentriert. Der ölige Rückstand von C-076 wiegt 91,4 mg; er wird in ausreichend Chloroform gelöst, so daß man 3 ml Lösung erhält, was einem 1%igen Brühenvolumen entspricht.

Das bei diesem Isolierungsverfahren gewonnene C-076 ist gegenüber N-dubius-Infektionen bei Mäusen voll aktiv. Zusätzlich ergibt die Chloroformextraktion eine 70fache Reinigung von C-076 aus der gesamten Brühe.

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Eine Impfkultur wird hergestellt, indem man 50 ml Medium k in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Ablenkorganen mit einer 0,5 χ 1,0 cm Öse aus einer der vier Schrägkulturen aus Medium 3, hergestellt gemäß Beispiel 2, inokuliert.

Der Kolben wird bei 28°C auf einer Rotationsschüttelmaschine mit 220 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5ι08 cm während 2 Tagen inkubiert.

Die Impfkultur wird zum Inokulieren eines 250 ml Medium 2 enthaltenden 2 1 Erlenmeyer-Produktionskolbens verwendet. Das Volumen zum Inokulieren beträgt 5,0 ml (296). Der Produktionskolben wird bei 28°C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 220 U/min 4 Tage inkubiert.

Gegen Ende dieser Zeit wird die gesamte, C-076 enthaltende Brühe gesammelt. 6 ml dieser Gesamtbrühe sind beim Prüfen bei einer Maus, die mit N-dubius infiziert ist, voll aktiv.

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Beispiel 5 Stufe A

Ein 50 ml Medium 7 enthaltender 250 ml Erlenmeyerkolben mit Ablenkorganen wird mit einer gefrorenen Ampulle von Streptomyces avermitilis MA-4680 inokuliert. Der Kolben wird bei 28°C auf einer RotationsSchüttelmaschine bei 160 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5_f08 cm während 24 h inkubiert.

Medium 7

Dextrose 1 g

CPC industrielle Stärke, modifiziert 10 g

Fleischextrakt 3 g

NZ Amin E 5 g

autolysierte Hefe (Ardamine pH) 5g

MgS0₄.7H₂0 0,05 g

0,19 g 0,182 g 0,5 g 1000 ml

Na4HPO4 KH2PO4 CaCO	Stufe B	Wasser
destilliertes		7,0 bis 7,2
pH

Zwei 2 1 Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen, die je 500 ml Medium 7 enthalten, werden mit 10 ml des Kolbeninhalts der Stufe A inokuliert. Die Medien werden bei 28°C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 160 U/min auf einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm 24 h inkubiert.

Stufe C

In einen 756 1 rostfreien Stahlfermenter, der 467 1 Medium enthält, gibt man 1 1 des gesamten Fermentationsmediums von Stufe B. Der Fermenter wird 96 h bei 28⁰C und 130 U/min ge-

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15 874Y Y^ 27170AO

rührt und mit einer Luftströmung von 283 1 (10 cft.)/min belüftet.

Medium 8

Tomatenpaste bzw. -mark 20 g/l

primäre Hefe N.F. 10 g/l

Stärke, modifizierte, CPC 20 g/l CoCl₂.6H₂O 5 mg/1

Polyglykol 2000 0,321 ml/1

destilliertes Wasser q.s. pH 7,2 bis 7,4.

Gegen Ende dieser Zeit werden 15,5 1 der Gesamtbrühe filtriert und die C-076 enthaltenden Myzelien werden mit Wasser gewaschen. Die feuchten Myzelien (2 268 g) werden mit 3 1 Aceton unter Rühren extrahiert. Das Gemisch wird filtriert und das Filtrat wird auf 1550 ml konzentriert und mit verdünnter HCl wird der pH-Wert auf 4,0 eingestellt. Diese Lösung wird dreimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden durch FiI rieren durch trockene Infusorienerde (Super-Cel) getrocknet, sie werden vereinigt und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Das zurückbleibende öl von C-076 wiegt 5,12 g. 3,3 mg sind gegenüber N-dubius bei Mäusen vollständig aktiv.

4,69 g dieses Öls werden in 142 ml Chloroform gelöst und auf einer 90 g Silikagel enthaltenden, mit Chloroform gepackten Säule chromatographiert. Die Säule wird mit 1400 ml Chloroform entwickelt. Die Säule wird dann mit Chloroform/Äthanol (49:1) eluiert, wobei 145 Fraktionen von je 5 ml gesammelt werden. Danach wird die Säule mit Chloroform/Äthanol (19:1) eluiert, wobei die Fraktionen 146 bis 226 von je 5 ml gesammelt werden. Die Fraktionen 49 bis 72 werden vereinigt und zur Trockene eingedampft; man erhält 200 mg eines Öls (A). Die Fraktionen 79 bis 184 werden ähnlich vereinigt und

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eingedampft; man erhält 291 mg eines Öls (B). 400/Ug Jeder Fraktion sind gegenüber N-dubius bei Mäusen vollständig aktiv. Diese beiden Fraktionen (A und B) werden getrennt chromatographisch an Silikageldünnschichtplatten (Quanta/ Gram QIF-Platten, erhältlich von Quanta/Gram Inc., Fairfield, New Jersey) analysiert. Die Platten werden mit Chloroform/Methanol (19:1) entwickelt. Die Flecken werden auf ihre Ultraviolettaktivität analysiert und ein Flecken Jeder Fraktion hat die charakteristische UV-Absorption für die C-076-Verbindungen (vergl. Tabelle i). Bei der Fraktion A besitzt der Flecken mit einem Rf-Wert von 0,83 diese Absorption, und bei der Fraktion B besitzt der Flecken mit einem Rf-Wert von 0,57 diese Absorption. Diese Flecken stellen die C-076 Α-Verbindungen bzw. die C-076 B-Verbindungen dar.

198 mg des obigen Öls (A) werden an 80 g Silikagel, das mit Chloroform gepackt wurde, chromatographiert. Man eluiert mit Chloroform/Methanol (199:1), bis 5^0 ml gesammelt sind, und anschließend mit Chloroform/Methanol (99:1), wobei jeweils 10 ml-Fraktionen gesammelt werden. Die Fraktion von 630 bis 720 ml ergibt 30,4 mg; die Fraktion von 730 bis 950 ml er gibt 78,4 mg; und die Fraktion von 950 bis 1040 ml ergibt 20 mg eines öligen Materials. Die C-076 Α-Komponenten enthaltenden Fraktionen 1 und 2 sind bei der Prüfung bei Mäusen,, gegenüber N.dubius bei Gehalten von 1,0, 0,5 und 0,25 mg vollständig aktiv.

Beispiel 6

Stufe A

Ein 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Ablenkorganen, der 50 ml Medium 8 enthält, wird mit einer gefrorenen Ampulle von Streptomyces avermitills inokuliert. Der Kolben wird bei 28°C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 160 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm 24 h inkubiert·

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15 874Y 2717OAO

Stufe B "'

Ein 500 ml Medium 8 enthaltender 2 1 Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen wird mit 10 ml des Kolbeninhalts der Stufe A inokuliert. Das Medium wird bei 28°C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 160 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm 24 h inkubiert.

Stufe C

In einen 189 1 rostfreien Stahlferment er, der 160 1 Medium enthält, gibt man 500 ml Inokulum von Stufe B. Der Fermenter wird bei 28°C unter Rühren bei 150 U/min 24 h und Belüften in einer Rate von 84,9 1(3 cft.)/min inkubiert.

Medium 9

Dextrose 1 g/l

Maisstärke 10 g/l

Fleischextrakt 3 g/l

autolysierte Hefe (Ardamine pH) 5 g/l

MgSO₄.7H₂O 0,05 g/l

Na₂HPO₄ 0,10 g/l

KH₂PO₄ 0,182 g/l

CaCO₃ 0,5 g/l

destilliertes Wasser q.s. pH 7,0 bis 7,2.

Stufe D

In einen 467 1 Medium 6 enthaltenden 756 1 rostfreien Stahlfermenter gibt man 43 1 Inokulum von Stufe C. Der Fermenter wird bei 28⁰C unter Rühren bei 130 U/min während 144 h und Belüften mit einer Luftströmungsrate von 283,1 1 (10 cft.)/ min inkubiert.

Stufe E

Gegen Ende dieser Zeit wird die Gesamtbrühe filtriert und der C-076 enthaltende Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen.

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Der Filtericuchen wird 30 min in 120 1 Aceton auf geschlämmt, filtriert und die Feststoffe werden mit 30 1 Aceton gewaschen. Die Acetonwaschlösungen werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf ein Volumen von 40 1 eingedampft. Mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure wird der pH-Wert des Konzentrats auf 4,0 eingestellt. Das Konzentrat wird dreimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden getrocknet, indem man sie durch eine Schicht aus trockener Infusorienerde (Super-Cel) filtriert. Die Extrakte werden durch Super-Cel geleitet und dann vereinigt. Die vereinigten Extrakte werden bei vermindertem Druck auf ein Volumen von 4 1 konzentriert. Das Chloroformkonzentrat wird filtriert und durch eine Säule von 2,4 kg Silikagel in Chloroform geleitet. Die Säule wird mit Chloroform eluiert, wobei man acht 3,5 1 Fraktionen sammelt. Die Säule wird dann mit Chloroform/Methanol (49:1) eluiert, wobei man acht weitere 3,5 1 Fraktionen (Fraktionen 9 bis 16) sammelt. Die Fraktion Nr. 3 wird zur Trockene eingedampft; man erhält 76 g eines öligen Materials, das die Hauptmenge der C-076-Materialien enthält.

97% dieses Materials werden in 685 ml Methylenchlorid gelöst und durch 800 g Kieselsäure (Mallinckrodt Chemical Co., 0,149 mm = 100 inesh die durch ein Sieb mit 0,177 mm öffnungen - 80 mesh gesiebt wurde, chromatographiert. Die Säule (Durchmesser 7,62 cm, Länge 36 cm) wird mit etwa 7,5 1 Methylenchlorid/Benzol (7:3) und anschließend mit 2,25 1 5%igem Isopropanol in Methylenchlorid/Benzol (7:3) entwickelt. Die Fraktion, die mit dem 5#igen Isopropanol in Methylenchlorid/ Benzol eluiert wird, enthält eine stark gefärbte Bande und enthält im wesentlichen das gesamte C-076-Material, bestimmt durch DUnnschichtchromatographie (wie in Beispiel 5 beschrie ben). Diese Fraktion (500 ml) wird eingedampft und an 105 g Kieselsäure (Säule mit 3,7 cm Durchmesser und 18 cm Länge)

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15 874Y Ο 27170A0

in Methylenchlorid erneut chromatographiert. Die Säule wird mit 100 ml-Teilen Methylenchlorid, die 5, 10 und 2096 Äther enthalten, entwickelt. Weitere Eluierung mit 20# Äther in Methylenchlorid ergibt zwei gefärbte Banden. Die Fraktionen zwischen den beiden Banden enthalten im wesentlichen das gesamte C-076-Material, bestimmt durch DünnschichtChromatographie.

Die C-076 enthaltende Fraktion wird an 59 g Kieselsäure (Säule mit 3,7 cm Durchmesser und 11 cm Länge) in Methylenchlorid Chromatograph!ert. Die Säule wird mit 10% Äther in Methylenchlorid entwickelt. Nachdem das erste Material zu eluieren beginnt, wird eine Fraktion von 70 ml entnommen und anschließend werden 26 Fraktionen von je 5 bis 6 ml entnommen. Die Fraktionen 3 bis 26 werden vereinigt; man erhält 1,35 g Material. Dieses wird dünnschichtchromatographisch analysiert (Silikagelplatten-Analtech GF 254, entwickelt mit 5#igem Isopropanol in Methylenchlorid). Das Material mit einem Rf-Wert von 0,28 ist in diesem System C-076 A1.

Die Säule wird dann mit 2096 Äther in 200 ml Methylenchlorid und anschließend mit 50% Äther in 800 ml Methylenchlorid eluiert. Eine geringe Menge des C-076 A1/A2-Gemisches wird eluiert und anschließend wird das gesamte C-076 A2 eluiert. Der Gesamtrückstand der C-076 A2-Fraktion beträgt 800 mg.

Weitere Elution mit 596igem Isopropanol in Methylenchlorid ergibt C-076 B1 (135 mg). Die Trennung erfolgt, indem man die Ultraviolettabsorption des elulerten Materials beobachtet. C-076 B1 und A2 besitzen sehr ähnliche Rf-Werte an dUnnschichtchromatographischen Silikagelplatten (Analtech GF 254) in 5%igem Isopropanol In Methylenchlorid. Die beiden Komponenten unterscheiden sich Jedoch eindeutig bei den gleichen Platten, die mit 15%igem Isopropanol in Hexan entwickelt werden.

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Die gesamte C-O76 Al-Fraktion wird auf 14 Silikagelplatten (Analtech HF 254, 20 χ 20 cm,500 /U dick) aufgebracht. Die Platten werden mit 10%igem Isopropanol in Hexan entwickelt. Die das C-076 A1 enthaltende Bande wird aus den Platten entfernt, mit Äther extrahiert, eingedampft und erneut auf 6 weitere Platten angewendet und fünfmal mit 5%igem Isopropanol in Hexan entwickelt. Das C-076 A1 wird von den Platten entfernt und erneut Chromatograph!ert und mitreinem Äther entwickelt; man erhält 270 mg im wesentlichen reines C-076 A1« Die Infrarot- und kernmagnetischen Resonanzspektren für diese Probe sind in den Fig. 1 und 5 und in Tabelle II dargestellt.

Die C-076 A2-Fraktion wird an 10 Silikagel(Analtech HF 254)-Platten chromatographiert und fünfmal mit 15%igem Isopropanol in Hexan entwickelt; man erhält 265 mg im wesentliches reines C-076 A2. Die Infrarot- und kernmagnetischen Resonanzspektren für diese Probe sind in den Fig. 2 bzw. 6 und in Tabelle II dargestellt.

Die C-076 B1-Fraktion wird an 2 Platten (wie oben) in 15#igem Isopropanol in Hexan chromatographiert; man erhält 55 mg im wesentlichen reines C-076 B1. Das kernmagnetische Resonanzspektrum dieser Probe ist in Fig. 7 und in Tabelle II dargestellt.

B eispiel 7

Die in Beispiel 6 beschriebene Fermentation wird zweimal wiederholt und die gesamten Brühen werden vereinigt. Die Fermentationsbrühe wird, wie in Beispiel 6 beschrieben, aufgearbeitet; man erhält 3»3 1 eines ersten Chloroformextraktes, der 60 mg/ml Gesamtfeststoffe enthält und nach Schätzung anhand der dünnschichtchromatographischen Analyse 0,596 C-076 enthält.

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3 1 dieser Chloroformlösung werden an 2400 g Silikagel (Davidson Grade 62), gepackt in Chloroform, chromatographiert, Die Säule (9,5 χ 122 cm) wird mit acht 3800 ml-Teilen Chloroform (Fraktionen 1 bis 8) und dann mit acht 3800 ml-Teilen Chloroform/Methanol (49:1, Fraktionen 9 bis 16) entwickelt. Die einzelnen Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch (Silikagelplatten, Quanta/Gram QIF) analysiert und mit Chloroform/Methanol (19:1) entwickelt. Die Fraktionen 9 bis 11, 12 bis 13 und 14 werden jeweils zur Trockene eingedampft; man erhält 6,63 g Feststoffe, die die C-076 Α-Komponenten in den Fraktionen 9 bis 11 enthalten, 24,91 g Feststoffe, die die C-076 B-Komponenten in den Fraktionen 12 bis 13 enthalten, und 4,71 g Feststoffe, die auch die C-076 B-Komponenten in der Fraktion 14 enthalten.

Das Material aus den Fraktionen 12 bis 14 wird vereinigt (29,62 g), in 100 ml Methylenchlorid gelöst und an 400 g Silikagel (Davidson Grade 62) in Methylenchlorid chromatographiert. Die Säule wird mit 1500 ml Methylenchlorid/2-Propanol (99:1); 1500 ml Methylenchlorid/2-Propanol (49:1); 2000 ml Methylenchlorid/2-Propanol (19:1); und 100OmI Methylenchlorid/2-Propanol (9:1) eluiert. Die eluierten Volumina zwischen 5500 bis 6000 ml (2,56 g) und 6000 bis 6500 ml (5,03 g) werden in 25 ml Methylenchlorid vereinigt und an 60 g Silikagel in Hexan chromatographiert. Ein Vorlauf von 70 ml Hexan und 100 ml Hexan/Diäthylather (4:1) wird entnommen und die Säule wird dann mit 600 ml Hexan/Diäthyläther (1:4) entwickelt, wobei 200 ml Fraktionen aufgefangen werden. Sie wird schließlich mit 700 ml Äther eluiert, wobei 100 ml-Fraktionen entnommen werden. EluierungsVolumina der Säule von 400 bis 600 ml ergeben 2,035 g Feststoffe, die die C-076 B1-Komponenten enthalten; die Volumina 600 bis 1100 ergeben 0,881 g Feststoffe,, die gemischte C-076 B1/B2-Komponenten enthalten; und die Volumina 1100 bis 1500 ml ergeben Feststoffe, die die C-076 B2-Komponenten enthalten.

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15 874Y Si 27170A0

Die gemischten C-076 B1/B2-Komponenten werden dann in 4,2 ml Methylalkohol/Wasser (4:1) gelöst und an C18 Porasil (Bondapak-37-75 Mikron Größe) in dem gleichen Lösungsmittel chromatographiert. Die Uinkehrphasenhochdrucksäule (die stärker polaren Komponenten werden zuerst eluiert) mißt 1,2 mx 16 mm und wird in einer Rate von 800 ml/h eluiert, wobei .21,3 ml-Fraktionen entnommen werden. Die Anwesenheit der C-076-Komponenten wird verfolgt, indem man die Ultraviolettabsorption der Fraktionen mißt. C-076 B2 wird in den Fraktionen 24 bis 37 gewonnen und C-076 B1 wird in den Fraktionen 51 bis 70 gewonnen; man isoliert 195,4 mg C-076 B2 und 137 mg C-076 B1.

Jede Probe wird dann getrennt an 4 g Säulen aus Silikagel (Davidson Grade 62) in Methylenchlorid chromatographiert. Die Säulen werden mit 35 ml Methylenchlorid/Methanol (9:1) eluiert. Die letzten 20 ml des Eluats von jeder Säule werden gesammelt und zur Trockene eingedampft; man erhält 155,3 mg C-076 B2 und 90 mg C-076 B1.

Dann werden 50 mg C-076 B1 und 100 mg C-076 B2 an präparativen Dünnschichtgelplatten (Analtech HF 254) chromatographiert, mit 12%igem Isopropanol in Hexan und anschließend mit Äther entwickelt. Man gewinnt C-076 B1 und C-076 B2, die im wesentlichen rein sind. Die Infrarotabsorptionspektren der so gewonnen C-076 B1 und B2 sind in den Fig. 3 bzw. 4 dargestellt. Das kernmagnetische Resonanzspektrum des so gewonnenen C-076 B2 ist in Fig. 8 dargestellt.

Beispiel 8

Ein 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen, der 50 ml des folgenden Mediums enthält,

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15 874Y

Si	Lactose	2717040
lösliche Stoffe von der Branntwein	2,0%
herstellung bzw. Schlempe
autolysierte Hefe, Ardamine pH	2,596
pH - vor der Sterilisation	0,556
7,0

wird mit dem Inhalt von einer gefrorenen Ampulle von Streptomyces avermitilis MA 4848 inokuliert und auf einer Rotationsschüttelmaschine 24 h bei 28⁰C und 150 U/min inkubiert.

10 ml der obigen Fermentationsmedien werden zur Inokulation von 500 ml des gleichen Mediums wie oben in einem 2 1 Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen verwendet. Die Fermentationsmedien werden bei 150 U/min auf einer Rotationsschüttelmaschine 24 h bei 28°C inkubiert.

Das gesamte, zuvor beschriebene Medium zur Inokulation von 467 1 des folgenden Mediums in einem 756 1 rostfreien Stahlfermenter verwendet:

Lactose 2,096

lösliche Stoffe von der Branntweinherstellung bzw. Schlempe 1,5%

autolysierte Hefe, Ardamine pH 0,596 Polyglykol 2000 0,32 ml/1

pH - vor der Sterilisation 7,0.

Das Fermentationsmedium wird 40 h bei 28°C mit einer Luftströmung von 283 1 (10 cft.)/min und einer Rührrate von 130 U/min inkubiert.

230 1 des obigen Mediums werden zur Inokulation von 4310 1 des folgenden Mediums in einem 5670 1 rostfreien Stahlfermenter verwendet.

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Dextrose 4,5#

peptonisierte Milch 2,4j6

autolysierte Hefe, Ardamine pH 0,25%

Polyglykol 2000 2,5 ml/1

pH - vor der Sterilisation 7,0

Die Fermentation wird 144 h bei 26°C mit einer Luftströmung von 1537 1 (54,3 eft.)/min und einer Rührrate von 120 U/min weitergeführt.

Das Fermentationsmedium wird filtriert und der Myzeliumfilterkuchen wird mit etwa 550 1 Wasser gewaschen, das Filtrat und die Waschlösungen werden verworfen. Der Filterkuchen wird mit etwa 1500 1 Aceton während etwa 1 h gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wird in einem Gemisch von etwa 150 1 Aceton und 40 1 entionisiertem Wasser gewaschen; man erhält etwa 2000 1 Extrakt.

Die zuvor beschriebene Fermentation und Extraktion wird in gleichem Maßstab wiederholt; man erhält weitere 2000 1 Acetonextrakt, der mit dem ersten Extrakt vereinigt wird und auf ein Volumen von etwa 800 1 eingedampft wird. Der pH-Wert des Konzentrats wird mit konz. Chlorwasserstoff säure auf etwa 4,7 eingestellt und mit etwa 800 1 Methylenchlorid vereinigt· Die vereinigten Lösungsmittel werden etwa 4 h gerührt und getrennt. Die wäßrige Schicht wird mit weiteren 800 1 Methylenchlorid vereinigt und weitere 4 h gerührt. Die Schichten werden getrennt und jeder Methylenchloridextrakt wird getrennt mit etwa 10 kg Super-Cel behandelt und filtriert. Beide Extrakte werden auf ein gemeinsames Volumen von etwa 60 1 eingedampft.

Bei spiel 9

Die 60 1 Lösung von C-076 in Methylenchlorid des vorherigen Beispiels werden zur Trockene im Vakuum eingedampft und der

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15 874T « ²⁷¹⁷⁰⁴°

Rückstand wird dreimal mit 60 1 Teilen Methanol vereinigt und dann wird zur Trockene eingedampft, um restliches Methylenchlorid zu entfernen. Das letzte Volumen des Methanolkonzentrats beträgt etwa 36 1. Die Methanollösung wird über Nacht gelagert und filtriert. Der Filterkuchen wird mit 40 1 frischem Methanol gewaschen, und die Methanolfiltrate und Waschlösungen werden vereinigt. Die Methanollösung wird mit 95 1 Äthylenglykol und 130 1 Heptan vermischt. Die Lösung aus zwei Schichten wird 5 min gerührt und dann wird die untere Schicht (Äthylenglykol und Methanol) abgetrennt. Die Heptanlösung wird mit einem Gemisch aus 20 1 Äthylen· glykol und 6,3 1 Methanol gewaschen. Nachdem man 5 min gerührt hat, wird die untere Schicht abgetrennt und mit dem ersten Äthylenglykol Al ethanol-Extrakt vereinigt. Ein gleiches Volumen Wasser (etwa 150 1), das 79 g Salz/l enthält, wird zu den Äthylenglykol/Methanol-Extrakten zugegeben. Diese Lösung wird mit 150 1 Äthyläther unter Rühren während 5 min extrahiert. Die Ätherschicht wird mit 75 1 Wasser (1/2 Vol.) gewaschen und 5 min gerührt; dann werden die Schichten getrennt. Dieses Verfahren wird weiter zweimal wiederholt (das letzte Wasser enthält 20 g Salz/l); man erhält ein Volumen aus der letzten Ätherschicht von 110 1. Die Ätherschicht wird im Vakuum auf ein minimales Volumen konzentriert, wobei man die Temperatur unter 25°C hält.40 ml Methylenchlorid werden zu dem Rückstand zugegeben und die Lösung wird zur Trockene eingedampft. Dieses Verfahren wird wiederholt, und der letzte Rückstand wird im Vakuum bei 50⁰C zur Trockene eingedampft.

Beispiel 10

Eine Säule mit einem Durchmesser von 30 cm wird mit einer Schicht aus 34 kg aktiviertem Aluminiumoxid und einer Schicht aus 34 kg aktiviertem Kohlenstoff in einer Lösung aus Methylenchlorid hergestellt. Der Rückstand aus dem vorherigen Bei-

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spiel wird in Methylenchlorid bis zu einem Volumen von 34 1 gelöst und auf die Säule aufgebracht. Man eluiert mit 34 1 Methylenchlorid, wobei diese Fraktionen verworfen werden. Eine 3%ige Lösung von Isopropanol und Methylenchlorid (20,8 Isopropanol und 660 1 Methylenchlorid) wird auf die Säule aufgebracht und in etwa 200 1 Fraktionen eluiert. Die vereinigten Isopropanol- und Methylenchloridfraktionen werden im Vakuum bei einer Badtemperatur von etwa 60⁰C auf ein Volumen von etwa 20 1 eingedampft. Die Badtemperatur wird auf etwa 45°C vermindert und der Extrakt wird im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 10 Teilen Methylenchlorid, 10 Teilen Hexan und 1 Teil Methanol so gelöst, daß man ein Endvolumen von 15 1 erhält. Die Lösung wird direkt auf eine Sephadex LH-20-Säule des nächsten Beispiels aufgebracht.

Beispiel 11

Eine Säule mit einem Durchmesser von 30 cm in Methanol mit 36 kg Sephadex LH-20 (erhältlich von Pharmacia Fine Chemicals, 800 Centennial Avenue, Piscataway, New Jersey 08854) wird hergestellt und mit einem Lösungsmittel gewaschen, das 10 Teile Methylenchlorid, 10 Teile Hexan und 1 Teil Methanol enthält. 1/4 der C-076 Lösung des Beispiels 10 wird auf die Säule aufgebracht und die Säule wird mit einer Rate von 250 ml/min eluiert. Zwei 20 1 Vorfraktionen werden gesammelt und verworfen. Anschließend werden zwanzig 2 1 reiche Fraktionen (die als Fraktionen 1 bis 20 bezeichnet werden) und dann eine einzige 20 1 Endfraktion gesammelt, die verworfen wird. Man stellt fest, daß die Fraktionen 1 bis 8 die C-076 A-Verbindungen und die Fraktionen 9 bis 20 die C-076 B-Verbindungen enthalten.

Beispiel 12

Das Verfahren von Beispiel 11 wird im gleichen Maßstab drei weitere Male wiederholt und alle Fraktionen₇die die C-076 B

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Komponenten (Fraktionen 9 bis 20) enthalten, werden vereinigt und zur Trockene eingedampft; man erhält 818 g einer rohen Mischung der C-076 B-Komponenten. Man stellt fest, daß die Probe 5596 C-076 B1 und 3996 C-076 B2 enthält. 680 g dieser Probe werden in 2 1 Methylenehlorid gelöst und in einen 22 Dreihalsrundkolben gegeben. Anschließend werden 13,6 1 Methanol zugegeben. Das Methylenehlorid wird durch Destillation entfernt. 13,6 1 Äthylenglykol werden zugegeben, so, wie das Methanol bei vermindertem Druck entfernt wird. Die Destillationsrate wird so eingestellt, daß die Temperatur der Lösung nicht unter 65°C fällt. Nach Beendigung der Äthylenglykolzugabe kann die Lösung 16 h bei 5°C abkühlen. Die Kristalle werden abfiltriert und mit 1 1 kaltem Äthylenglykol gewaschen. Die Kristalle werden dann erneut in 2 1 Methylenchlorid gelöst und die Lösung wird in einen 22 1 Dreihalsrundkolben gegeben. Das beschriebene Verfahren wird zweimal wiederholt. Das erste Mal werden je 12,5 i Methanol und Äthylenglykol verwendet, und das zweite Mal werden je 13,6 Methanol und Äthylenglykol verwendet. Die Endkristalle werden mit 1 1 kaltem Äthylenglykol und 1 1 Wasser gewaschen. Die Kristalle werden in 4 1 Wasser gelöst und durch Filtrieren durch Natriumsulfat getrocknet. Die Benzollösung wird auf ein Volumen von 2 1 konzentriert und lyophilisiert; man erhält 241,2 g eines weißen Pulvers, das 98% C-076 B1 und 1# C-076 B2 enthält.

Die Mutterlaugen (22 1) von den ersten beiden Kristallisationen wie oben werden vereinigt und mit 22 1 Wasser verdünnt. Die wäßrige Lösung wird mit 60 1 Toluol und erneut mit 15 Toluol extrahiert. Der Toluolextrakt wird dann mit 48 1 Wasser gewaschen. Die organische Phase wird durch Super-Cel zur Entfernung von restlichem Wasser filtriert und eingedampft; man erhält 336 g festes Material, das aus 7996 C-076 B2-und 16# C-076 B1-Verbindungen besteht.

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Beispiel 13

Von den vier Sephadex LH-20-Säulen des Verfahrens von Beispiel 11 enthalten die Fraktionen 1 bis 8 die C-076 A-Verbindungen und werden vereinigt· Durch HPLC-Analyse stellt man fest, daß das Gemisch 252 g C-076 A2a, 16 g A2b, 94 g A1a und 24 g A1b enthält. Das Material wird in einem Lösungsmittelsystem gelöst, das aus Hexan/Toluol/Methanol in einem Verhältnis von 6:1:1 besteht, und auf eine Sephadex LH-20-Säule der gleichen Dimensionen wie die, die in Beispiel 11 verwendet wurde, in dem obigen Lösungsmittel aufgebracht. Die Fraktionen werden in einer Rate von 250 ml/min gesammelt und ein 20 1 Vorlauf wird gesammelt und verworfen. Weitere Elution ergibt zwei weitere 20 1 Vorläufe, die ebenfalls verworfen werden, und fünfzig 4 1 reiche Fraktionen, die die C-076 Α-Verbindungen enthalten. Die Fraktionen 3 bis 8 enthalten hauptsächlich C-076 A1-Komponenten (40,2 g A1a und 6,7 g A1b), und die Fraktionen 29 bis 36 enthalten C-076 A2-Verbindungen (117,2 g A2a und 7,35 g A2b). Die Fraktionen 9 bis 28 enthalten ein Gemisch aus C-076 A1- und A2-Verbindungen.

Beispiel 14

Eine Probe aus 150 g C-076 B1 von Beispiel 12 wird in 3 1 einer Lösungsmittelmischung aus Hexan/Toluol/toethanol in einem Verhältnis von 3:1:1 gelöst. Die Lösung wird durch eine Sephadex LH-20-Säule (mit den gleichen Abmessungen wie die in Beispiel 11 verwendete) in dem obigen Lösungsmittel geleitet, wobei man Fraktionen in einer Rate von 250 ml/min entnimmt. Zwei 20 1 Teile des Lösungsmittelgemisches werden gesammelt und verworfen und dann wird ein Vorlauf von 10 1 entnommen und verworfen. Dann werden dreißig reiche Fraktionen von Je 2 1 genommen. Die Fraktionen 1 bis 13 und 25 bis 30 werden verworfen. Die Fraktionen 14 bis 16 werden vereinigt und enthalten 80 g hauptsächlich C-076 B1a. Die Fraktio-

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nen 22 bis 24 werden vereinigt und sie enthalten 6,7 g hauptsächlich C-076 B1b. Die Fraktionen 17 Ms 21 enthalten ein Gemisch von C-076 B1a und B1b.

Die obigen Fraktionen 17 bis 21 werden vereinigt und konzentriert und durch eine Sephadex LH-20-Säule mit dem gleichen Lösungsmittelsystem wie oben geleitet. Drei 20 1 Vorläufe werden entnommen und verworfen. Die reichen Fraktionen werden dann folgendermaßen genommen: 5 Fraktionen von je 2 1 (Fraktionen 1 bis 5); 20 Fraktionen von je 1 1 (Fraktionen 6 bis 25) und 10 Fraktionen von je 2 1 (Fraktionen 26 bis 35). Die Fraktionen 1 bis 15 werden verworfen; die Fraktionen 16 bis 21 enthalten 13,5 g C-076 B1a und 0,4 g C-076 B1b; die Fraktionen 22 bis 26 enthalten 44 g C-076 B1a und 0,13 g C-076 B1b; die Fraktionen 27 bis 30 enthalten 10,2 g C-076 B1a und 0,8 g C-076 B1b.

Beispiel 15

Ein Gemisch aus allen acht C-076-Komponenten wird an einer Hochdruckflüssigkeitschromatographiesäule 4 mm χ 30 cm, die mit 10 Mikronyu Bondapack C₁₈ Silikagel (erhältlich von Waters Associates Inc., Maple Street, Milford, Massachusetts 01757) gepackt ist, chromatographiert und mit 85:15 (Vol/Vol) Methanol/Wasser bei konstant 40⁰C eluiert. Bei einer Strömungsrate von 1,2 ml/min werden alle acht Verbindungen getrennt und die Elutionsvolumina, die unter den zuvor beschriebenen konstanten Bedingungen für die einzelnen Verbindungen charakteristisch sind, sind die folgenden.

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Elutionsvolumen (Ve) . ml

C-076 B2b 5,90

C-076 B2a 6,52

C-076 A2b 7,12

C-076 A2a 7,88

C-076 Bib 8,36

C-076 B1a 9,60

C-076 A1b 10,24

C-076 A1a 11,88.

Die Trennung der C-076 "b"-Komponenten von den entsprechenden "a"-Komponenten erfolgt unter Verwendung solcher Verfahren, wie der Hochdruckflüssigkeitschromatographie. Eine absolute Methanollösung von 30 /ul eines Gemisches aus C-076 A1a und A1b, das geschätzt 30/Ug C-076 A1b enthält, wird auf eine 3 χ 250 mm Hochdruckflüssigkeitschromatographiesäule gegeben, die Spherisorb 5 micron ODS (erhältlich von Spectra Physics) als Packung enthält. Die Säule wird mit 85:15 Methanol/V/asser in einer Rate von 0,15 ml/min eluiert. Die Elution der Produkte wird verfolgt, indem man die Ultraviolettabsorption des eluierten Materials beobachtet und die einzelnen Komponenten am Ausgang des UV-Meßgeräts sammelt. 30/Ug C-076 A1b werden gewonnen und in einem Massenspektrometer analysiert. Das Massenspektrum dieser Probe ist in der zweiten Spalte von Tabelle III aufgeführt.

Ende der Beschreibung.

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Leerseite

Claims (1)

1. Merck & Co., Inc. 15 874Y

   Patentansprüche οτηη/η

   1. Verfahren zur Herstellung von C-O76, dadurch gekennzeichnet, daß man einen C-076 erzeugenden Stamm von Streptomyces avermitilis in einem wäßrigen, eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, eine assimilierbare Stickstoffquelle und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen fermentiert und C-076 aus der Fermentationsbrühe gewinnt.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als C-076 erzeugenden Stamm Streptomyces avermitilis (NRRL 8165; ATCC 31267) verwendet.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,0 durchgeführt wird.

   4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur etwa 24 bis 30°C beträgt und der pH-Wert etwa 6,0 bis 7,5 beträgt.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium etwa 0,5 bis 5 Gew.Si Kohlenstoffquellen und etwa 0,2 bis 6 Gew.% Stickstoffquellen enthält.

   6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation während etwa 1 bis 8 Tagen durchgeführt wird.

   709845/0794

   ORIGINAL INSPECTED

   7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als C-076 erzeugenden Stamm Streptomyces avermitilis

   (MRRL 8165; ATCC 32167) verwendet.

   8. Verfahren zur Herstellung von C-076, dadurch gekennzeichnet, daß man einen C-076 erzeugenden Stamm von Streptomyces avermitilis in einem wäßrigen, eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen fermentiert und das C-076 durch Filtration des Fermentationsmediums, Extraktion des Myzeliums mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, Verdampfen des organischen Lösungsmittels und Extraktion des Rückstands mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel gewinnt.

   9. Verfahren zur Herstellung von C-076, dadurch gekennzeichnet, daß man einen C-076 erzeugenden Stamm von Streptomyces avermitilis in einem wäßrigen, eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen fermentiert und das Fermentationsmedium filtriert.

   -Z-

   709345/0794

   15 874Y

   Verbindung der Formel

   2717Q4Q

   CH

   in der

   R-O

   CH₃ CH

   R HO -/"Λ—ο

   CH₃O CH₃O

   bedeutet,

   die gestrichelte Linie eine Einfach- oder Doppelbindung bedeutet,

   R₁ Hydroxy bedeutet und nur vorhanden ist, wenn die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet, R₂ Propyl oder Butyl bedeutet und R, Methoxy oder Hydroxy bedeutet.

   11. Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die gestrichelte Linie eine Doppelbindung bedeutet, R₂ Propyl und R, Methoxy bedeuten.

   12. Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die gestrichelte Linie eine Doppelbindung bedeutet, Propyl und R, Hydroxy bedeuten.

   - 3 -709845/0794

   15 874Y V 27170A0

   13. Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die gestrichelte Linie eine Doppelbindung bedeutet, R₂ Butyl und R, Methoxy bedeuten.

   14. Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die gestrichelte Linie eine Doppelbindung bedeutet, Rp Butyl und R, Hydroxy bedeuten.

   15. Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet, R^ Hydroxy, R₂ Propyl und R, Methoxy bedeuten.

   16. Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet, R^ Hydroxy, R₂ Propyl und R, Hydroxy bedeuten.

   17. Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet, R^ Hydroxy, R₂ Butyl und R, Methoxy bedeuten.

   18. Verbindung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet, R₁ Hydroxy, R₂ Butyl und R^ Hydroxy bedeuten.

   19. C-076.

   20. Verbindung der Klasse C-076 A1a, A2a, B1a und B2a, wobei

   C-076 A1a die empirische Formel C^oHy^O«^, ein Molekulargewicht von 886, das in Fig. 1 dargestellte Infrarotabsorptionsspektrum besitzt, ein Ultraviolettabsorptionsmaximum bei 237, 243 und 252 nyu aufweist, das in Fig.5 dargestellte kernmagnetische Resonanzspektrum besitzt und die Hauptpeaks im Massenspektrum auftreten bei m/e 87, 95,

   - 4 709845/0794

   113, 127, 137, 145, 169, 199, 193, 221, 257, 275, 305, 456, 548, 580, 742 und 886;

   C-076 A2a die empirische Formel ^gHygO^, ^ei*i Molekulargewicht von 904, das in Fig. 2 dargestellteInfrarotabsorptionsspektrum besitzt, ein Ultraviolettabsorptionamaximum bei 237, 243 und 252 m/a aufweist, das in Fig. 6 gezeigte kernmagnetische Resonanzspektrum besitzt und die Hauptpeaks im Massenspektrum auftreten bei m/e 87, 95 , 113, 127, 137, 145, 179, 199, 211, 239, 257, 275, 305, 323, 456, 566, 598, 760 und 904;

   C-076 B1a die empirische Formel CAgHy^O^r, ein Molekulargewicht von 872, das in Fig. 3 dargestellte Infrarotabsorptionsspektrum besitzt, ein Ultraviolettabsorptionsmaximum bei 237, 243 und 252 m/u aufweist, das in Fig. 7 dargestellte kernmagnetische Resonanzspektrum besitzt und die Hauptpeaks im Massenspektrum auftreten bei m/e 87, 95, 113, 127, 137, 145, 169, 199, 193, 221, 257, 261, 305, 456, 548, 566, 728 und 872;

   C-076 B2a die empirische Formel 649^76⁰I5» ein Molekulargewicht von 890, das in Fig. 4 dargestellte Infrarotabsorptionsspektrum besitzt, ein Ultraviolettabsorptionsmaximum bei 237, 243 und 252 m/u aufweist, das in Fig. 8 dargestellte kernmagnetische Resonanzspektrum besitzt und die Hauptpeaks im Massenspektrum auftreten bei m/e 87, 95, 113, 127, 137, 145, 179, 199, 211, 239, 257, 261, 305, 323, 456, 566, 584, 746 und 89O.

   21. Zubereitung für die Prophylaxe und Behandlung von parasitischen Krankheiten, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen inerten Träger und eine oder mehrere C-076-Verbindungen darin eingearbeitet enthält.

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