DE2655084A1

DE2655084A1 - Verfahren zur kopplung biologischer substanzen durch covalente bindungen

Info

Publication number: DE2655084A1
Application number: DE19762655084
Authority: DE
Inventors: Stratis Avrameas; Therese Ternynck
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1975-12-05
Filing date: 1976-12-04
Publication date: 1977-06-16
Also published as: US4925921A; FR2334107B1; FR2334107A1; SE7909965L; US4193982A; DE2655084C2; SE7613498L; US4592998A; SE440830B; SE440149B; BE848943A

Description

Dr. Hans-Heinrich Willrath t

Dr. Dieter Weber Dipl.-Phys. Klaus Seiffert

PATENTANWÄLTE

D - 62 WIESBADEN 2. Dez. 1976 PostfadiHB 6145 V/pf

Gusuv-Freytig-Stnie 15

'S (061X1) 3727X0

Telef ramu*dreue: W1LLPATENT

Telex: 4-186 247

2832-3695

INSTITUT PASTEUR

28, rue du Docteur Roux, 75015 Paris Frankreich

VERFAHREN ZUR KOPPLUNG BIOLOGISCHER SUBSTANZEN DURCH COVALENTE BINDUNGEN

Priorität vom 5· Dezember 1975 iⁿ Frankreich aufgrund der Anmeldung Nr.7537»392

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Kopplung biologischer Substanzen, wie z.B. Proteine, Glycoproteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren, roten Blutkörperchen und anderer biologischer Substanzen, die fähig sind, sich untereinander durch covalente Bindungen zu befestigen. Spezieller ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zum Koppeln von Macromolekülen aneinander oder an rote Blutkörperchen durch covalente Bindungen.

AG. WH*·*·. tmm-Ht. i7»MT

Man hat schon die Kopplung von zwei Proteinen verwirklicht, wie z.B. einen Antikörper und ein Enzym, mit einem Kopplungsmittel, vorzugsweise einem bifunktionellen, wie z.B. Glutaraldehyd. Man kann auch schon eine covalente Bindung verwirklichen zwischen einem Hormon, wie z.B. dem Progesteron, und einem Enzym, z.B. der ß-D-Galactosidase unter Verwendung des Carbodiimids.

Solche Reaktionen sind schon insbesondere in den französischen Patentschriften Nr. 74.19.100 und Nr. 7^.3^.519 beschrieben worden. Andere einschlägige bibliografische VeröffentlMiungen werden nachfolgend beschrieben:

Die Wahl des Kopplungsmittels ist wichtig, denn es bedingt einerseits die Ausbeute der Reaktion und andererseits die Aktivität biologischer Substanzen, insbesondere Proteine, wenn diese z.B. Enzyme, Antikörper usw. sind.

Es wäre deshalb wünschenswert, über ein Kopplungsmittel zu verfugen, welches erlaubt, gleichzeitig höhere Kopplungsausbeuten zu erreichen, indem jedoch ein wichtiger Anteil an biologischer Aktivität der Macromoleküle beibehalten wird.

Man hat jetzt ein neues Verfahren zum Koppeln mindestens zweier biologischer Substanzen untereinander durch covalente Bindungen mittels eines Verbrückungsmittels gefunden,

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wobei dieses Verbrückungsmittel das Benzochinon ist.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist durch folgende Schritte gekennzeichnet:

a) Behandlung der ersten Substanz mit einem großen Überschuß an Benzodinon, wobei diese Aktivierung genannte Reaktion in homogenem flüssigem Milieu erfolgt;

b) Entfernen von Produkten der Reaktion der Stufe (a) und des Überschusses an Benzochinon und Gewinnung der aktivierten Substanz;

c) In-Lerührung-bringen der aktivierten Substanz mit der zweiten, zu koppelnden Substanz,

Gemäß einem Grundmerkmal des neuen Verfahrens wird die Behandlung der Aktivierung der Stufe a) in Lösung verwirklicht. So ist es im besonderen, wenn es sich darum handelt, ein "aktiviertes" Protein mit einem anderen Protein oder mit einer speziellen Substanz, z.B. roten Blutkörperchen, zu koppeln.

Die Stufe a) des Verfahrens erfolgt unter Inberührungbringen der ersten Substanz, wie z.B. eines Proteins, die in einem geeigneten Milieu gelöst ist, und zwar mit dem Benzochinon in Lösung.

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Als Lösungsmittel kann man irgendein Lösungsmittel oder
Gemisch von organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser
mischbar sind und in denen das Benzochinon löslich ist,
benutzen. Man verwendet mit Wasser gepufferte Medien,
in welchen die erste Substanz, wie z.B. ein Protein, löslich ist. Diese Medien oder Milieus sind bekannt. Erfindungsgemäß wählt man solche Medien aus, deren pH-Wert
zwischen etwa 5»5 und etwa °- liegt, wobei der optimale pH-Wert zwischen 6 und 6,2 liegt.

Ein zweckmäßiges Lösungsmittel für das Benzochinon ist ein niederer aliphatischer Alkohol, wie z.B. Äthanol.

Im allgemeinen sieht die Erfindung vor·, Substanzen zu koppeln, von denen einige unter ihnen in der Lage sind, in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser mischbar ist, in Lösung zu gehen, wodurch die Aktivierung der Stufe a) in
Lösung möglich wird. Im Falle von Proteinen ist es also vorteilhaft, sie mit Benzochinon in Lösung zu behandeln, um das irreversible Unlöslichwerden des Proteins zu verhindern.

Die Umsetzung mit dem Benzochinon erfolgt bei einer Temperatur, die vorzugsweise nicht +22 C übersteigt, bis das Kopplungsmittel an der zu aktivierenden Substanz, wie z.B. dem Protein, fixiert ist, z.B. während einer Dauer von einigen Minuten bis zu 24 Stunden, insbesondere in der Größenordnung von einer halben Stunde.

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Im Verlaufe der Aktivierungsreaktion mit dem Benzochinon ist es zweckmäßig, einen großen Kopplungsmittelüberschuß über der zu aktivierenden Substanz, wie z.B. dem Protein, zu verwenden. Der Benzocfaüraüberschuß ist der Unterschied der Zahl der Moleküle des Reaktionspartners (Benzochinon) gegenüber der Zahl der Moleküle der zu aktivierenden Substanz.

Die Größe des Benzochinonüberschusses ist ein kritisches bzw. entscheidendes Merkmal für die vorliegende Erfindung. Bei zu geringen Werten erfolgt die Aktivierung nicht oder praktisch nicht; sie ist dann unzureichend, um die Kopplung zu ermöglichen. Es ist somit vorteilhaft, einen sehr starken Benzochinonüberschuß zu verwenden, der die Aktivierungsreaktion begünstigt. Ausgedrückt in Molen sind die ¥erte des Benzochinonüberschusses gegenüber der zu aktivierenden Substanz, beispielsweise einem Protein, mindestens gleich 200, z.B. darüber oder gleich 1000. Ein praktischer zweckmäßiger Wert ist 2,5 x 10³.

Das Entfernen der Produkte der Reaktion und des Benzochinonüberschusses kann z.B. durch Durchführung durch eine Kolonne für Molekularfiltration (Molekularsieb) erfolgen, wie z.B. eine unter der Handelsbezeichnung "Sephadex" erhältliche Kolonne.

Erfindungsgemäß kann die "aktivierte" Substanz nach der Umsetzung mit dem Benzochinon mit einer anderen biologischen Sub-

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stanz gekoppelt werden, um eine Kopplung zweier Substanzen durch covalente Bindungen zu verwirklichen.

Die Betriebsbedingungen dieser Kopplung sind relativ kritisch. Man arbeitet bei einer Temperatur unterhalb 22 C oder oberhalb 4°C, wobei die ausreichende Zeit 2k Std. bei 22°C und k8 Std. bei h C beträgt. Die Kopplung erfolgt in vorteilhafter Weise in einem Lösungsmittel für Substanzen, wenn diese löslich sind, wie im Falle der Proteine, und zwar in einem Puffermilieu. Die Kopplung erfordert einen leicht alkalischen pH-Wert zwischen 8 und 9» und die Gegenwart von Carbonationen ist bevorzugt. Man arbeitet im allgemeinen mit einem Überschuß an markierter Substanz mit Rücksicht auf di e andere Substanz. Es ist möglich, eine Kopplurg mit äquimolaren Mengenverhältnissen von zu koppelnden Substanzen zu erhalten.

Indessen kann man je nach den Fällen einen Überschuß an mit Benzochinon behandelter Substanz gegenüber der zu koppelndenSubstanz oder einen Überschuß an Substanz verwenden, die nicht behandelt ist und mit der durch das Benzochinon behandelten Substanz zu koppeln ist. Somit liegen je nach den Fällen die Mengen-variationen in der Größenordnung zwischen 1 und k (ausgedrückt als Mole).

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist insbesonder e in dem Falle geeignet, wenn eines der Proteine ein Antikörper und das andere Protein ein Enzym ist.

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Wenn die Benzochinonderivate gewöhnlich in den ortho- und para-Formen existieren, kann man das eine oder das andere ihrer Isomere oder ein Gemisch von beiden benutzen. Indessen ist bevorzugt, das para-Benzochinon reagieren zu lassen.

Man hat gefunden, daß die ursprüngliche Verwendung dieses Chinons es erlaubt, erhöhte Kopplungsausbeuten zu erhalten, die über 30 % liegen und 65 tf° oder mehr je nach den verwendeten Proteinen erreichen können.

Wie schon erwähnt, kann das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, um die Antikörper mit den Enzymen zu koppeln, damit diese Kopplungen verwendet werden können, um Antikörper und Antigene aufzufinden und zu dosieren.

Der Vorteil dieses Mittels besteht in der Möglichkeit, seine Reaktion mit den Makomolekülen zu steuern. Bei einem pH-Wert von 6 befestigt sich das Benzochinon auf den Proteinmolekülen unter Bildung von monosubstituierten Derivaten, und man benötigt einen alkalischen pH-Wert, um die zweite Reaktion zu ermöglichen, entweder mit einem anderen Molekül desselben Proteins unter Polymerbildung oder mit einem anderen Molekül eines anderen Proteins unter Bildung von Conjugaten. Dadurch kann das Benzochinon in Kopplungsreaktionen verwendet werden, die in zwei Schritten erfolgen und auf diese Weise vollkommen kontrollierbar sind.

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Dieses Verfahren kann gleichermaßen die Kopplung von Makromolekülen - roten Blutkörperchen verwirklichen, denn die Verwendung von Benzochinon als Verbrückungsmit fcel erlaubt Reaktionen, deren Empfindlichkeit erheblich über/Üerjenigen liegt, die zuvor mit anderen Bindungsmitteln erhalten ist, z.B. mit dem Glutaraldehyd.

Für den Durchschnittsfachmann versteht es sich, daß das Verfahren gemäß der Erfindung auch zum Koppeln von zwei oder mehreren Makromolekülen oder Makromolekülgemischen verwendet werden kann.

Ohne eine Bindung an eine besondere Theorie zu beabsichtigen, wird angenommen, daß die durdi das Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen beachtlichen Resultate auf der Tatsache beruhen, daß das Benzochinon mit anderen Gruppierungen reagiert als Aminogruppierungen, für welche schon zahlreiche Reagentien benutzt werden: Das Glutaraldehyd, die Carbodiimide, die Isocyanate, das bis-diazotierte Benzidin usw. Dieses Chinon reagiert mit den osidiken Gruppierungen, ohne die antigenen Determinanten dieser Moleküle zu verändern.

Der Artikel von Martin Morrison et al ^Archives of Biochemistry and Biophysics 134, 515-523 (196^)J/ mit dem Titel "The reaction of benzoquinone with amines and proteins" zeigt, daß das Benzochinon unter sehr langsamen Bedingungen mit den Aminosäuren reagiert. Das Benzochinon kann also zu zusätzlichen

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Produkten mit den Proteinen unter Bildung von covalenten Bindungen hoher Energie führen. Die Autoren dieses Artikels haben z.B. die Befestigung des Benzochinone auf dem Cytochrom c studiert und gezeigt, daß die sich aus der Reaktion ergebenden Produkte in der Lage sind, die Oxydation von Ascorbaten zu katalysieren, was beim Studium biologischer Systeme interessant sein kann.

Zunächst einmal sollte festgestellt werden, daß dieser Artikel keineswegs die Kopplung verschiedener Proteine durch das Benzochinon vorschlägt. Die Lehre des Artikels ist auf eine zusätzliche Reaktion des Benzochinon mit einem Protein beschränkt, und aufgrund dieser Tatsache sind die in dem Artikel von Martin Morrison et al beschriebenen Reaktionsbedingungen derart, daß sie eine einfache Addition des Benzochinon mit dem Protein (Cytochrom c) erlauben; insbesondere beträgt der molare Überschuß des Benzochinon in bezug auf das Protein maximal 10 : 1. Also bilden sich während der Reaktion des Benzochinone mit dem Glycin in einem molaren Bezugsbereich Glycin/Benzochinon, der von 1 bis 10 geht, mono- und disubstituierte Glycinchinonderivate. Diese Reaktionsbedingungen gestatten es nicht, nach dem Inberührungbringen des Probeins und des Benzochinons aktiviertes Protein zu erhalten, welches in der Lage ist, seinerseits mit einer anderen biologischen Substanz zu reagieren. Insbesondere lehrt der Artikel von Martin Morrison nicht, daß ein sehr starker molarer Überschuß an Benzochinon in bezug auf das Protein für den Erhalt eines aktivierten Proteins kritisch

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ist; außerdem arbeiten diese Autoren nur bei einem pH-Wert von 8 und erwähnen nicht die Möglichkeit, die Zusatzreaktionen zu steuern.

Der Artikel von Johny Brandt et al ^Biochimica et Biophysica Acta 386 (1975) 196-2027 mit dem Titel "Covalent attachment of proteins to polysaccharide carriers by means of benzoquinone" beschreibt die Befestigung von Proteinen auf festen Polysaccharxd trägern durch covalente Bindungen dank der Verwendung von Benzochinon als Kopplungsmittel. Die Autoren benutzen Agarose und Dextrangele, die mit dem Benzochinon in heterogener Phase reagieren, wobei die Gele sich in einem Puffermilieu in festem Zustand befinden und mit einer Benzochinonlösung in Berührung gebracht wurden. Ebenso werden die aktivierten Gele in einem Puffermxlieu im Hinblick auf die Kopplungsreaktion in Suspension gebracht, wonach das Protein am Gel covalent befestigt wird. Außerdem schlagen J. Brandt et al einen Kopplungsreaktionsmechanismus vor.

Zunächst stellt man fest, daß der Artikel von Brandt et al ein Verfahren zur Verwendung eines unlöslichen Trägers betrifft. Das Protein wird auf dem Gel, z.B. Dextran, befestigt, wobei das Verfahren speziell vorgesehen ist, um mithin das Protein unlöslich zu machen. Xm Gegensatz hierzu erfolgen erfindungsgemäß die Aktxvxerungsreaktxonen in flüssiger Phase unter gesteuerten Bedingungen, um dann qua-

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litative und/oder quantitative Maßnahmen und Dosierungen in flüssiger Phase zu ermöglichen. Zum Beispiel macht man sich für das Titrieren von Antikörpern oder Antigenen durch Hämolyse den Vorteil der Eigenschaft roter Blutkörperchen zunutze, sich einer Hämolyse zu unterziehen und sich durch eine Färbung des flüssigen Titriermilieus zu zeigen. Diese Titriertechnik wurde dank der Tatsache ermöglicht, daß die Produkte gemäß der Erfindung in der Lage sind, in flüssiger Phase verwendetyzu werden. Die festen Polysaccharidträger, Träger der Proteine, wie z.B. durch J. Brandt et al definiert, passen absolut nicht für eine solche Titrierung.

Es wird ebenfalls bemerkt, daß die Verwendung von Benzochinon als Kopplungsmittel sehr viel anpassungsfähigere und weitere Anwendungen erlaubt als die bekannten Kupplungsmittel, wie z.B. der Glutaraldehyd. Der Fachmann weiß, daß es bei der Benutzung von Glutaraldehyd für die Kopplung unterschiedlicher Proteine untereinander notwendig ist, die Reaktion sehr sorgfältig zu steuern, was schwierig ist, manchmal sogar unmöglich. Man muß insbesondere die Reaktionsdauer, den pH-Wert, die Konzentration des Glutaraldehyds, die molaren Verhältnisse Glutaraldehyd/Protein usw. auswählen, damit die Aktivierungsreaktion niht über bestimmte Grenzen hinausgeht, anderenfalls das Protein polymerisiert und im Extremfall unlöslich wird. Es ist also notwendig,

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die Arbeitsbedingungen der Aktivierung mit dem Glutar aldehyd auf jede Art von Fall anzupassen. Jedem Protein entsprechen besondere Bedingungen. Wenn man ein neues Protein verwendet, muß man zahlreiche vorangehende Versuche machen, bevor man befriedigende Reaktionsbedingungen findet

Andererseits erlaubt das Gl-utaraldehyd nicht, biologische Substanzen zu aktivieren, wie z.B. Polysaccharide und Nucleinsäuren. Seine Verwendung ist auf freie Aminosäuren oder auf Trägersubstanzen von Amino säure gruppen beschränkt. Das GIutaraldehyd ist also in seinen Anwendungen begrenzt.

Im Gegensatz hierzu ist das Benzochinon ein Kopplungsmittel, welches unter steuerbaren Bedingungen wirkt, und welches man allgemein anwenden kann. Beispielsweise kann die Aktivierung eine Stunde lang bei einem pH-¥ert von 6 geführt werden, entweder von Proteinen, Glycoproteinen oder Polysacchariden, und zwar ohne das Risiko der Bildung eines Po^mers, Außer der Behandlung von Proteinen erfolgt z.B. die Aktivierurg immer leicht, seitdem man die durch die Erfindung bestimmten Aktivierungsbedingungen betrachtet, nämlich ohne das Risiko, unerwünschte Polymere zu erhalten. Darüberhinaus ist das Benzochinon ein Kopplungsmittel allgemeiner Anwendung.

Die Erfindung gestattet das Erhalten von Ergebnissen, die bis jetzt nicht erreicht werden konnten, insbesondere mit dem GIutaraldehyd.

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Zum Beispiel kann man direkt einen Antikörper oder ein Fragment Fab des Antikörpers mit dem Benzochinon aktiviei en und dann durch. Kopplung eine andere Substanz befestigen oder fixieren, die zum Markieren und als Titrierreagens dient.

Eine andere ursprüngliche Anwendung der Erfindung besteht in der Befestigung von Antikörpern an natürlichen roten Blutkörperchen (d.h. nicht chemisch behandelte), welche die Eigenschaft, lysiert zu sein, beibehalten und dann in der Lage sind, die entsprechenden Antigene nachzuweisen, die z.B. in-einer flüssigen, zu prüfenden Probe zugegen sind. Nach Kenntnis des Anmelders sind diese Anwendungen im Stand der Technik niemals verwirklicht worden.

Die Erfindung findet eine spezifische, sehr interessante Anwendung bei der Dosierung von Antitetanusantikörpern und Anti-DNA- Antikörpern in menschlichem Serum.

Eine andere Anwendung im Hinblick auf die Dosierung durch HämaggLutination oder Hämolyse schließt den Versuch mit einem Behältnis zur Dosierung eines in einer biologischen

ein

Flüssigkeit vorhandenen Antikörpers und weist die folgende Kombination auf:

- Die sensibilisierten roten Blutkörperchen gegenüber Antigen 1, durch Benzochinon aktiviert, dienen der Durch-

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führung eines MeßbereiclB mit dem Antigenstandard und dienen der Reaktion mit in der zu prüfenden Probe vorhandenen Antikörpern 1;

der Antigen-1 Standard;

- ein Lösungsmittel, wie z.B. physiologisches Serum und eine Dosiermikroplatte,

wobei der Hämolysetest einfach dadurch ausgeführt wird, daß man der oben definierten Kombination einen Flacon oder Kolben, der einen Ergänzungsstoff enthält, zufügt.

Das so definierte Behältnis gehört ebenfalls in dem Rahmen der Erfindung.

Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der Erfindung vorgesehen, ohne den Schutzumfang zu beschränken.

- Kopplung von Proteinen oder Glycoproteinen mit Makromolekülen

Beispiel 1

Kopplung von Antikörpern eines Hammels an Xg von Mäusen oder ihres Fragmentes Fab an Enzyme , wie z.B. die Peroxydase, die Glucoseoxydase und die alkalische Phosphatase, die Lactoperoxidase, die ß-Galactosidase.

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IA^Λ. - Aktivierung des Proteins . ■ · . :

Beispiel 1A1

5 mg Peroxydase (oder andere Proteine) werden in 0,8 mg 0,1 M Phosphatpuffer von pH 8 aufgelöst. Das Benzochinon wird in der Form einer Lösung von

6 mg in 0,2 mg Äthanol zugegeben. Die Reaktion wird bei 22 C 20 Minuten lang bei Dunkelheit durchgeführt. Der Chinonüberschuß und die Produkte der ReakLion werden von der aktivierten Peroxydase auf einer Sephadex-G-25-fein-Bblonne (θ,9 x 5 cm) abgetrennt, die mit 0,1 M Natriumbicarbonat äquilibriert ist.

Beispiel 1A2

Man löst 5 mg Peroxydase oder andere Proteine in 0,8 mg 0,1 M Phosphatpuffer von pE 5. Das Benzochinon wird in der Form einer Lösung von 6 mg/0,2 ml Äthanol zugegeben. Die Reaktion erfolgt bei 22 C während einer Stunde in der Dunkelheit. Der Chinonüberschuß und die Produkte der Reale Lion werden von der aktivierten Peroxydase auf einer Sephadex-G 25 feln4£>lonne (0,9 x 5 cm) abgetrennt, die mit 0,1 M Natriumbicarbonat äquilibriert ist.

IB. - Kopplung von Proteinen untereinander

Beispiel IB-1

Per-5 mg "aktivierte" oxydase gemäß Beispiel IA2 in 1 ml

0,1 M Natriumbicarbonat werden mit 5 mg Fab (oder 20 mg

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Antikörper) in einer Lösung von 5 mg/ml in 0,1 M Natriumbicarbonat gekoppelt. Die Kopplung erfolgt während 24 Std. bei einer Temperatur unterhalb 22 C oder während 48 Std. bei 4°C.

Die Kopplungsausbeuten haben gezeigt, daß ungefähr 30 fo Fab mit 30 /° Peroxydase gekoppelt waren, als die Proteine in einem Molverhältnis von 1 : 1 zum Reagieren gebracht wurden, daß aber der Prozentsatz bis auf 65 $ steigt, wenn ein Molekül Fab mit 4 Molekülen "aktivierter" Peroxydase zum Reagieren gebracht wurde. Unter letzteren Bedingungen wären nur 35 f° Fab mit der Peroxydase gekoppelt, wenn diese mit Glutaraldehyd aktiviert wäre .

Beispiel 1B-2

phatase

5 mg alkalische Phos-, die gemäß Beispiel IA2 "aktiviert" ist, wird mit 2,5 mg Fab (oder 10 mg Antikörper) unter denselben Bedingungen wie bei Beispiel IB-1 zur Kopplung gebracht.

Beispid. 1B-3

5 mg Glucoseoxydase, die gemäß Beispiel IA2 "aktiviert" ist, wird mit 1,25 ^mS Fab (oder 5 mg Antikörper) unter denselben Bedingungen zur Kopplung gebracht.

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Man erhält identische Resultate, wenn man als Variante zunächst die Aktivierung von Antikörpern, dann die Kopplung mit dem Enzym durchführt.

Beispiel lß-4

Man koppelt 5 mg Antikörper oder 1,25 mg Fab Antikörper, mit 5 ^mS Enzym "aktiviert", welches die Peroxydase war. Die erhaltene Ausbeute, d.h. der Prozentsatz aktiviertes Fab, welches auf dem Enzym befestigt bzw. fixiert war, betrug praktisch 75 f°> wenn man nach der Technik gemäß Beispiel IB-1 arbeitet.

Andere Versuche sind unter den gleichen Bedingungen mit Glucoseoxydase und der alkalischen Phosphatase, der ß-Galactosidase und der Lactoperoxydase durchgeführt worden. Man hat ähnliche Resultate zu denen der Peroxydase erhalten, wenn man in jedem Falle ungefähr 4 Moleküle Enzym für 1 Molekül aktiviertes Fab verwendet.

Beispiel 1B-5

1,25 mg "aktiviertes" Fab gemäß Beispiel IB2 sind mit 5 tng Fab-Antiperoxydase gekoppelt worden. In diesem Falle kann die Fab-Antiperoxydase als Markierer dienen, wenn man es mit der Peroxydase nach der Kopplungsreaktion Fab-Fab Anti-PO mit dem Antigen in Berührung bringt.

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Die Enzyme und die mit dem Benzochinon behandelten Antikörper behielten mehr als 65 ^ϋβ> ihrer Aktivität.

Die verschiedenen bei Beispiel 1 erhaltenen Zusammensetzungen werden mit Erfolg verwendet, um die durch die Lymphzellen iamttni eiert er Tiere abgesonderten Immunoglobuline -nachzuweisen, Die verwendete Technik war folgende:

Die von der Ratte oder von den Lymphdrüsen der Maus stammenden Zellen haben einige Tage vorher eine Antigeninjektion bekommen und wurden dann auf dem Objektträger eines Mikroskops ausgebreitet, dann befestigt und dann mit dem Fragment Fab Antilg der Maus, welches mit dem Enzym gekoppelt ist, inkubiert Nach der Yäsche ist das Enzym durch seine spezifische cytochemische Reaktion offenbart worden. Die erhaltene Färbung gestattet die Lokalisierung der Reaktionsstelle des Fab im Mikroskop. Durch ein Verfahren mit sukzessiver Auflösung des Fab, welches mit dem Enzym gekoppelt ist, konnte man die Aktivität dieser Kopplungen im Hinblick auf jene vergleichen, die mittels G-lutaraldehyd erzeugt war. Die Empfindlichkeit dieser zwei Reagentien auf gleiche Antikörperkonzentrationen war identisch. Im Hinblick auf den Prozentsatz erhaltener Kopplung sieht man, daß das erfindungsgemäße Verfahren dem bekannten Verfahren mit der Verwendung von Glutaraldehyd überlegen ist.

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II. - Kopplung von Polysacchariden in homogenem flüssigen Milieu mit Makromolekülen

Beispiele 2 und 3

Kopplung von Polysaccharid T von Salmonella typhi mit Enzymen.

Beispiel 2

Kopplung durch das Aktivierungsverfahren von Polysaccharid

2A. - Aktivierung von Polysaccharid

1 mg Polysaccharid T wird in 0,8 ml M 0, 1 Phosphatpuf fer von pH 6 gelöst. Das Benzochinon wurde in der Form von 6 mg in 0,2 ml Äthanol zugegeben. Die Reaktion erfolgte bei 22 C während einer Std. in der Dunkelheit. Der Chinonüberschuß und die Produkte der Reaktion sind vom "aktivierten" Polysaccharid abgetrennt worden durch Filtration über Sephadex wie im Beispiel IA2.

2B. - Kopplung von Polysaccharid T mit dem Enzym

1 mg "aktiviertes" Polysaccharid T in 1 ml 0,1 M-Natriumbicarbonat wird mit 2 mg alkalischer Phosphatase (oder einem anderen Enzym) in 0,2 ml 0,1 M-Natriumbicarbonat gekoppelt. Die Kopplung erfolgte während 24 Std. bei Labortemperatür.

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Beispiel_3

Die Kopplung des Enzyms durch das Aktivierungsverfahren.

3A. Aktivierung des Enzyms

Man arbeitet auf die gleiche Weise wie bei Beispiel IA2
unter Verwendung eines Enzyms, welches aus der Peroxydase,
der alkalischen Phosphatase und Glucoseoxydase ausgewählt ist,

3B. Kopplung des Enzyms mit Polysaccharid

1 mg "aktiviertes" Enzym gemäß Beispiel 3A in 0,2 ml 0,1 M
Natriumbicarbonat wird mit 0,1 mg Polysaccharid in 0,1 ml
0,1 M Natriumbicarbonat zur Kopplung gebracht. Die Kopplung erfolgt während 2k Std. bei Labortemperatur,

III. Kopplung von Nucleinsäuren mit Makromolekülen
Beispiele K und 5
Kopplung des ADN mit einem Enzym

Beispiel h

Kopplung des ADN durch das Aktivierungsverfahren

4a. Aktivierung von ADN

1 mg ADN wird in 0,7 ml 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 6 gelöst. Das Benzochinon wird in Form von 6 mg in 0,2 ml Äthanol zugegeben. Die Reaktion erfolgt bei 22 C während einer Stunde in der Dunkelheit. Das Gemisch wird auf Sephadex filtriert, wie in Beispiel 1A.

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4B. - Kopplung von "aktiviertem" ADN mit der Peroxydase

1 mg "aktiviertes" ADN in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer mit pH -8 wird mit 1 mg Peroxydase in 0,1 ml 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 8 zur Kopplung gebracht. Die Kopplung erfolgt während 2k Std. bei Labortemperatur.

Beispiel 5

Die Kopplung des Enzyms durch das Aktivierungsverfahren.

5A. - Aktivierung des Enzyms

Man arbeitet in derselben Weise wie bei Beispiel 1A2 unter Verwendung eines Enzyms, welches aus der Peroxydase, der alkalischen Phosphatase und der Glucoseoxydase ausgewählt ist. . .

5B. - Kopplung von Enzym mit ADN

1 mg "aktiviertes" Enzym gemäß Beispiel 5^A in °»2 ml 0,1 M Phosphat wild mit 1 mg ADN in Lösung in 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 8 zur Kopplung gebracht.

IV. - Kopplung von Makromolekülen mit roten Blutkörperchen Beispiel 6

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird bei der Kopplung· von Proteinen, Glycoproteinen und "aktivierten" Polysacchariden mit roten Blutkörperchen mit dem Ziel ange-

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wendet, Ilämagö-ut!nations- oder Hämolysereaktionen zu praktizieren.

6a. Aktivierung von Proteinen oder des Polysaccharids

Diese Aktivierung wie auch die Filtration auf Sephadex erfolgen wie zuvor in Beispiel IA1 beschrieben.

OB. Kopplung von Makromolekülen mit roten Blutkörperchen

1 mg Proteine oder Polysaccharide, die gemäß Beispiel 6a "aktiviert" sind, in 1 ml 0,1 M Natriumbicarbonat wird von 0,25 ^ml Bodensatz gewaschener roter Blutkörperchen zugegeben. Nach 2 Stunden Rühren bei Labortemperatur sind die roten Blutkörperchen dreimal in dem Milieu gewaschen, welches der Hämagg_utations- oder Hämolysereaktion dienen wird.

Die unterschiedlichen Vorbereitungen werden getroffen, um einerseits die Gegenwart von Antikörpern oder. Antigenen in biologischen Flüssigkeiten und andererseits die Sekretion der Zellen durch geeignete Verfahren nachzuweisen.

a) Titrierung von Antikörpern durch Hämag^utination oder Hämolyse

Beispiel:

Dosierung von Antitetanus—Antikörpern im menschlichen Serum.

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Zu filtrierendes Antiserum wird sukzessive Volumen auf Volumen (0,05 ml) in einem Puffer gelöst, der Mg und Ca notwendig für die Hämolysereaktion enthält. Die mit dem Tetanusgift durch das Benzochinon sensibilisierten roten Blutkörperchen werden (0,01 ml einer Lösung bei 5 Ί°) zugegeben, und die Cuvetten werden gerührt, um die roten Blutkörperchen gut freizulegen. Nach 45 Minuten bei 37 C ist die HämaggLutinationsreaktion sehr sichtbar. Wenn man dann Ergänzungsstoff zugibt, findet die Hämolyse der roten Blutkörperchen 45 bis 6O Minuten später bei 37 C statt. Allgemein sah man die Lyse der roten Blutkörperchen mindestens zwei Lösungen weiter als die Agglutination.

b) Titrieren eines Antigens durch Häma^-utation oder Hämolyse

Beispiel:

Dosierung von IgG in Mäuseserum.

Das Mäuseserum wird wie das Antiserum in Beispiel a) aufgelöst. Die mit den Antikörpern oder dem FragmentFab an Antikörpern sensibilisierten roten Blutkörperchen werden wie in Beispiel a) zugegeben. Nach 25 Minuten bei 37 C wird die Agglutinationsreaktion sichtbar. Man konnte mit der Hämolyse durch Zugabe von Ergänzungsstoff wie in Beispiel a) fortfahren.

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c) Nachweis der Sekretion von Proteinen durch die Zellen durch die lokale Hämolysetechnik

Beispiel:

Nachweis der Sekretion von Antikörper durch die Immunocyten.

Die lokale Hämolysereaktion erfolgt gemäß den klassischen Hämolysetechniken, entweder in Gel oder in flüssiger Phase, und zwar mit den Zellen, die von der Ratte stammen oder von den Lymphdrüsen des immunisierten Tieres, und mit den roten Blutkörperchen, die entweder mit den Proteinen, den G-lycoproteinen oder den Polysacchariden sensibilisiert sind.

ITm die Bedeutung der Konzentration an Benzochinon im Verlaufe der Aktivierungsreaktion klarzustellen, hat man Versuche durchgeführt, indem man die Peroxydase durch das Benzochinonuiter im übrigen identischen Bedingungen, aber mit verschiedenen Benzochinonquantitäten für jeden Fall aktiviert. Man hat die erreichten Resultate dadurch herausgestellt, daß man die aktivierte Peroxydase auf den roten Blutkörperchen befestigt und die Hämol^yse durchführt. Die Hämolyse ist ein bequemes Mittel, um die Ausbeute der Reaktion klarzustellen. Die Abwesenheit der Hämolyse zeigt an, daß die Befestigung oder Fixierung nicht stattgefunden hat. Der Hämolysegrad gestattet, qualitativ die Ausbeute der Reaktion auszuwerten.

Die Reaktionsbedingungen waren die gleichen wie die in Bei-

in
spiel IA1. Die Reaktion gebrachte Menge Peroxydase betrug

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5 mg» Die veränderlichen Benzochinonmengen wurden jedesmal in 0,2 ml Äthanol gelöst. Die Resultate wurden in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

TABELLE

Peroxydase 5 mg 5 mg 5 mg

(Menge)

Benzochinon 6 mg 0,6 mg 0,06 mg

(Menge)

Hämolyse 100 $ 25 $ keine

Hämolyse

Die obigen Ergebnisse zeigen den entscheidenden Einfluß der Benzochinonkonzentration auf die Ausbeute der Reaktion.

Die Erfindung ist keineswegs auf die zuvor zwecks Darstellung gezeigten Anwendungsbereiche beschränkt. Sie betrifft ein allgemeines Kopplungsmittel biologischer Substanzen unter Verwendung von Benzochinon.

V. Markierung von Zellenbestandteilen in sifa unter Verwendung von Fab-Paaren mit dem Benzochinon

Das Prinzip is-^folgendes: Man läßt das Fab-Paar so mit dem Benzochinon auf einen Träger wirken, der das Antigen unter den Antigen-Antikörper -Bedingungen bei einem pH 6,5

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enthält. Nach dem Abnehmen des Fab-ÜberSchusses erhöht sich der pH-Wert auf 8, wodurch die freie Chinongruppxerung aktiv wird. Wenn die aminierten Gruppierungen des Trägers blokkiert sind, reagiert das Benzochinon mit jenen Gruppierungen der zugegebenen Markierungssubstanz in alkalischem Milieu·

Beispiel 7
7A. Aktivierung des Fab

Diese Aktivierung erfolgt ebenso wie die Filtration auf Sephadex, wie zuvor in Beispiel 1A beschrieben.

7B. Markierung in situ

Die in Formol fixierten Zellen werden während einer Std. in eine Fab-Lösung (0,5-1 mg/ml in 0,15 M NaCl) gegeben. Nach dem Waschen in dem 0,15 M NaCl werden die Zellen mit einer Peroxydaselösung (oder einer anderen Markierungssubstanz) während mindestens 6 Stunden in 0,1 M Natriumbicarbonat inkubiert.

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Claims

Patentansprüche

* Verfahren zum Koppeln mindestens zweier biologischer Substanzen miteinander durch covalente" Bindungen mittels eines Verbrückungsmittels, welches das Benzochinon ist, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die erste Substanz durch einen großen Benzochinonüberschuß behandelt wird und diese Aktivierung genannte Reaktion in homogenem flüssigem Milieu erfolgt;

b) die Produkte der· Reaktion der Stufe a) und der Benzochinonüberschuß entfernt werden und die aktivierte Substa.iz gewonnen wird; und

c) die aktivierte Substanz der zweiten zu koppelnden Substanz in Berührung gebracht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologischen Substanzen Proteine , Glycoproteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren oder rote Blutkörperchen oder andere biologische Substanzen, die in der Lage sind, sich untereinander durch covalente Bindungen zu fixieren oder zu befestigen, sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierungsbehandlung nach Stufe a) durch In-

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ORIGINAL INSPECTED

kontaktbringen der ersten Substanz, wie z.B. eines Proteins, welches in einem Lösungsmittel gelöst ist, mit dem Benzochinon in Lösung erfolgt und daß das Lösungsmittel irgendein Lösungsmittel oder ein Gemisch von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln sein kann, in welche« das Benzochinon

-riges Medium,

löslicher ist, z.B. eingepuffertes wäss/und daß das Benzochinon vorzugsweise in Form einer Lösung in niederem aliphatischen! Alkohol, wie z.B. Äthanol, verwendet, wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß der pH ¥ert des wässrigen Mediiims der Reaktion zxirischen etwa 5t5 und etwa 9 liegt.

5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierungsreaktion in dem Benzochinon bei einer Temperatur erfolgt, die vorzugsweise 22 nicht übersteigt, bis das Kupplungsmittel an der zu aktivierenden Substanz, wie z.B. dem Protein, befestigt ist, und zwar z.B. während einer Zeitdauer von einigen Minuten bis 2k Stunden, insbesondere in der Größenordnung einer Stunde.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,, daß im Verlauf der Aktivierungsreaktion mit dem Benzochinon ein großer Kopplungsmittelüberschuß in bezug auf die zu aktivierende Substanz verwendet wird, wie z.B. das Protein, wobei insbesondere das Molverhältnis Benzochinon/Substanz mindestens gleich 200 und vorzugsweise mehr als 1000 ist,

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3 z.B. in der Gi'ößenordnung von 2,5 x 10 ·

2^55084

7· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (b) zum Entfernen der Pi*odukte der Reaktion und des Benzochinonüberschusses durch den Durchgang auf einem Austauscherharz erfolgt, wie z.B. einer Molekularsiebkolonne, die unter der Bezeichnung "Sephadex" erhältlich ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß im Verlaufe der Stufe c) der Kopplung zwischen der Substanz, die nach der Reaktion mit dem Benzochinon aktiviert ist und der anderen biologischen Substanz bei Normaltemperatur bis zum Erhalt einer ausreichenden·Kopplung gearbeitet wird, z.B. während einer Dauer von 1 bis 48 Stunden, insbesondere 24 Stunden, und zwar in einem Lösungsmittel für Substanzen, insbesondere in einem xtfässrigen Puffermilieu, wenn es sich um Proteine handelt und vorzugswei se mit einem Überschuß an aktivierter'Substanz im Verhältnis zu der anderen Substanz.

9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß im Verlauf der Kopplungsreaktion ein Überschuß an einer der Reaktionssubstanzen im Verhältnis zu der anderen verwendet wird (aktivierte Substanz im Überschuß gegenüber der nichtaktivierten Substanz oder nichtaktivierte im Überschuß gegenüber der aktivierten Substanz),

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insbesondere in einer Größenordnung von 1 bis 8 Molen, zum Beispiel von vier mal mehr Molen gegenüber der anderen Substanz.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis °» dadurch gekennzeichnet, daß als Aktivierungsreagens para-Benzöchinon verwendet wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die erste biologische Substanz ein Protein ist, vorzugsweise ein Enzym, wie z.B. die Peroxydase, die alkalische Phosphatase oder die Glucoseoxydase.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite biologische Substanz durch ein Pro- j

tein gebildet ist, wie z.B. einen Antikörper oder ein Antigen, J oder durch rote Blutkörperchen, Nucleinsäuren oder Polysaccharide.'

13· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn-

biozeichnet, daß die erste logische Substanz aus den Antikörpern,

den Antigenen, den roten Blutkörperchen, den Nucleinsäuren . oder den Polysacchariden ausgewählt wird.

ik-. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und 13t dadurch gekennzeichnet, daß die zweite biologische Substanz ein Enzym ist, wie z.B. die Peroxydase, die alkalische Phosphataso oder

·«
die Glycoseoxydase, die ß-Galactosidase, die Lactoperoxydase,

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ein Antikörper oder Fab-Antienzym oder Antivirus oder Antirote Blutkörperchen oder eine andere mit Elektronen dicht besetzte Substanz.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 4 zum Titrieren von Antikörpern und Antigenen in biologischen Flüsigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörper direkt mit dem Benzochinon aktiviert wird, dann mit einer anderen Substanz gekoppelt wird, die als Markierer und Titrierreagens dient, oder der Antikörper auf den roten- Blutkörperchen befestigt wird, die dann in der Lage sind, die entsprechenden Antigene nachzuweisen bzw. zu erfassen, z.B. mit Hilfe bekannter Titrier· techniken von Antikörpern oder Antigenen durch Hämagglutination oder Hämolyse.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis l4, dadurch gekennzeichnet, daß man Antitetanusantikörper oiler Anti-DNA-Antikörper im menschlichen Serum dosiert.

17· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis lh zur Dosierung dux'ch HämaggLutation oder Hämolyse mit Hilfe eines kleinen Behälters zur Dosierung von in einer biologischen Flüssigkeit vorhandenen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man kombiniert:

- die mit dem Antigen sensibilisierten roten Blutkörperchen, die mit Benzochinon aktiviert sind, welches dazu dient, einen Meßbereich vorzusehen mit dem Antigenstan-

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dard und die Reaktion mit den Antikörpern 1, die in der zu prüfenden Probe zugegen sind, bewirkt wird;

den Antigen—1-Standard;

ein Lösungsmittel, z.B. physiologisches Serum und eine Dosierungsmikroplatte, wobei der Hämolysetest in einfacher Weise dadurch erfolgt, daß man der vorgenannten KombinationeinenErgänzungsstoff aufweisenden kleinen Behälter zugibt.

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