DE2650920A1

DE2650920A1 - Verfahren zur durchfuehrung von enzymatischen reaktionen

Info

Publication number: DE2650920A1
Application number: DE19762650920
Authority: DE
Inventors: Harry P Dr Gregor
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-11-07
Filing date: 1976-11-06
Publication date: 1977-05-18
Also published as: CA1083057A; FR2330695B3; JPS5950317B2; US4033817A; IT1121686B; FR2330695A1; JPS5283995A; GB1519676A

Description

PATENTANWALT DR. HANS-GUNTHER EGGERT₁ DIPLOMCHEMIKER

5 KÖLN 51, OBERLÄNDER UFER 90

Köln, den 5. November 197 6 Nr. 189/Eg/Ax

Dr. Harry P. Gregor, 15o Lakeview Avenue, Leonia, New Jersey o76o5, USA

Verfahren zur Durchführung von enzymatischen Reaktionen

Die Erfindung umfaßt einen erheblich weiteren Bereich von Matrixmembranen, Kupplungsreaktionen und Enzymen,

die Gegenstand des Patents (Patentanmeldung

P vom gleichen Tage entsprechend der

US-Patentanmeldung 629 940) der Anmelderin sind. Die Erfindung ist auf die Herstellung einer großen Klasse von Membranfiltern gerichtet, an die Enzyme und andere Moleküle von ähnlicher katalytischer Aktivität durch chemische Bindungen gebunden sind, wobei das Verfahren zur Aktivierung der Porenoberflächen dieser Membranen zum Zwecke der anschließenden Kupplung (wo diese erforderlich ist) unter Druckbedingungen durchgeführt wird, und wobei das gekuppelte Enzymsystem unter ähnlichen Druckbedingungen, nämlich durch Pressen des zu behandelnden Substrats durch die Poren der Membran unter Druck eingesetzt wird.

Die üblichen Anwendungen von immobilisierten Enzymen sind aus der wissenschaftlichen und technischen Literatur und Patentliteratur allgemein bekannt. Demgemäß sind auch die Vorteile dieses allgemeinen Arbeitsverfahrens bekannt. Bei den bisher angewandten üblichen Verfahren werden kleine Teilchen von natürlichen oder synthetischen Polymerisaten oder anorganischen porösen Materia-

709820/0947

lien verwendet. Die Enzyme werden durch chemische Bindungen oder durch den Prozess der Bildung eines unlöslichen Gels in Gegenwart dieser Enzyme oder durch Einkapseln der Enzyme in kleinen Perlen oder in porösen Hohlfasern u.dgl. daran gebunden. Alle diese üblichen Verfahren haben ihre Vorteile und auch ihre Nachteile. Die Erfindung umfaßt ein neues Verfahren zur Herstellung der druckbetriebenen enzymgekuppelten Membranen, die ... ... .-... hierbei hergestellten Membranen und ihre Verwendung für die verschiedensten Zwecke. Hauptsächlich werden sie als Katalysator zur Durchführung von chemischen Reaktionen verwendet. In der hier beschriebenen Form weisen die Systeme eine hohe Kapazität im Sinne der darin enthaltenen Menge des Enzyms und eine hohe enzymatische Aktivität auf, so daß diese Systeme besonders

vorteilhaft für großtechnische Verfahren sind. Die in :. -. dieser Weise stabilisierten Enzyme haben außer den vorstehend genannten Vorteilen die üblichen naturgegebenen Vorteile von stabilisierten Enzymen hinsichtlich chemischer und thermischer Stabilität.

Gemäß der Erfindung wurde nun gefunden, daß hohe Kapazität und Stabilität für lange Zeiträume aufweisende Enzymreaktoren einer Art, die besonders für den großtechnischen Einsatz in der Industrie geeignet ist, in der nachstehend beschriebenen Weise hergestellt werden können. Zunächst werden Matrixmembranen mit ziemlich einheitlichen Poren hergestellt. Diese Matrixmembranen können aus Homopolymeren, Copolymeren oder Interpolymergemischen hergestellt werden. Bei Herstellung aus Homo— polymeren müssen sie ausreichende chemische und mechanische Stabilität haben, so daß sie für Zeiträume von Monaten in Gegenwart eines Lösungsmittels (gewöhnlich Wasser) eingesetzt werden können, ohne daß wesentliche Änderungen ihrer Porosität (Volumenanteil der Poren), des Porendurchmessers oder der Dimensionen eintreten.

709820/034?

DIe verwendeten Homopolymeren müssen daher unlöslich sein. Sie können im Lösungsmittel, z.B. Wasser, quellen, jedoch in einem begrenzten Maße. Es gibt eine begrenzte Zahl von Homopolymeren, die für die Zwecke der Erfindung geeignet sind. Cellulose ist' eines- dieser Homopolymeren und Polyvinylbenzylchlorid ein anderes. Das übliche Verfahren zur Herstellung von Membranen dieser Arten besteht darin, daß man sie als Folie aus einem geeigneten Lösungsmittel gießt und, nachdem ein Teil des Lösungsmittels zur Bildung einer gelartigen Folie verdampft ist, das System so koaguliert, daß eine Folie gebildet wird, deren Volumen zu wenigstens 50% aus Poren von geeigneten Molekülabmessungen besteht. Es gibt zahlreiche geeignete Verfahren zur Herstellung von Membranen dieser Arten, jedoch wird ein Verfahren bevorzugt, bei dem man eine solche Menge des Lösungsmittels abdampfen läßt, daß eine gelartige Struktur gebildet wird, worauf man über die Dampfphase ein zweites Lösungsmittel einführt, das Fällung oder Koagulierung des Polymerisats bewirkt. Die Einführung des zweiten Lösungsmittels in der Dampfphase trägt mit dazu bei, die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Koagulierung so zu regeln, daß sehr einheitliche Poren aufweisende Membranen mit den gewünschten Eigenschaften gebildet werden. Als Beispiele von Folien, die in dieser Weise hergestellt werden können, sind Folien aus Cellulose zu nennen, die in einem Gemisch von Dimethylsulfoxyd und Paraformaldehyd gelöst ist und gemäß den Formulierungen von D.C.Johnson und Mitarbeitern (Institute of Paper Chemistry Technical Paper Series Nr.5, April 1975, Appleton, Wisconsin) hergestellt ist. Die Fällung des Matrixpolymerisats wird in diesem Fall durch Verwendung von Wasser-oder Methanoldämpfen erreicht. Eine Folie mit den gewünschten Eigenschaften wird während der Regenerierung der Cellulose gebildet. Es ist auch tnög-

709820/09*7

265092Q

lieh, ein Homopolymeres oder Copolymeres von Vinylbenzylchlorid, in diesem Fall Polyvinylbenzylchlorid, oder ein Copolymerisat von ^vinylbenzylchlorid mit Styrol zu verwenden. Diese Polymerisate werden in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. Methylenchlorid, gelöst. Die Folie wird aus der Lösung gegossen, worauf durch Koagulierung in der Dampfphase unter Verwendung von Methanol eine Membran mit den gewünschten Eigenschaften entsteht.

Bei einem anderen Verfahren, das im allgemeinen zur Herstellung von Matrixmembranen bevorzugt wird, wird die in der US-PS 3 808 305 beschriebene allgemeine ^: Arbeitsweise angewandt, bei der Membranen aus Interpolymergemischen gegossen werden. Als typisches Beispiel ist ein Verfahren zu nennen, bei dem 2 Teile Polyacrylsäure in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. Dimethylformamid, mit 1 Teil eines filmbildenden Matrixpolymeren, z.B. Polyvinylidenfluorid ("Kynar", Pennwalt Co.) zusammen mit einem geeigneten Epoxyd als Vernetzungsmittel gelöst werden, wie in der US-PS 3 808 305 beschrieben. Die Lösung wird dann in üblicher Weise gegossen. Um diese Membranen mit geeigneter Porosität herzustellen, wird die teilweise trockene gegossene Membran anschließend durch Einführung von Dämpfen koaguliert, die eine teilweise Koagulierung bewirken, wobei jedoch keine Dämpfe verwendet werden, die die Struktur der Membran schädigen. Als Lösungsmittel eignet sich in diesem Fall Wasser oder eine andere Substanz, die das ionogene Polymere in ein ionisches Polymeres umwandelt, z.B. Ammoniak oder Triäthylamin, worauf durch abschließendes Trocknen und Härten der Folie durch Vernetzung eine Membran erhalten wird, die Poren mit geeigneten Abmessungen aufweist, während sie noch Carboxylgruppen, an denen die Kupplungsreaktionen stattfinden können, in hoher Konzentration

709820/0947

enthält. Ebenso können Amine, z.B. Polyvinylimidazol oder Poly-N-methyläthylenimin, in diesem Ansatz verwendet werden. Polymergemische, die Polystyrolsulfonsäure enthalten, ergeben eine stark polare negative - Ladung in der Membran und können zusammen mit einer ^r Gruppe, z.B. Polyacrylsäure, die zur Kupplung fähig ist, verwendet werden. Es ist somit offensichtlich, daß es durch geeignete Wahl von Matrixpolymeren und Polymeren, an denen die Kupplung stattfinden kann, möglich ist, einen weiten Bereich von geeigneten Matrixmembranen herzustellen. Beispielsweise können die verschiedensten Matrixpolymeren, die in einem weiten Bereich hydrophil oder hydrophob sind und von solchen mit eingearbeiteter Polystyrolsulfonsäure als stark hydrophiles Polymeres bis zu Polymeren reichen, die PoIyvinylbenzylchlorid als stark hydrophobes Polymeres enthalten, hergestellt werden.

Ebenso ist ein weiter Bereich von chemischen Kupplungsprozessen verfügbar. In gewissen Fällen ist eine Akti- vierung erforderlich. Als Beispiele sind die Behandlung von Cellulose mit Cyanbromid und die Behandlung einer Membran, die Polyvinylalkohol enthält, mit Cyanurchlorid zu nennen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt und werden in der Literatur, insbesondere in dem Buch von O.R.Zaborsky ("Immobilized Enzymes", C.R.C.Press, Cleveland, Ohio 1974), beschrieben. Es ist nicht die Aufgabe der Erfindung, neue chemische Reaktionen für diese Aktivierungsreaktionen oder für die folgenden Kupplungsreaktionen zu lehren, sondern vielmehr die außergewöhnliche Kombination der . hier beschriebenen Materialien und Verfahren herauszustellen, daß nämlich die Kupplungs- und Aktivierungsverfahren an einer geeigneten Membranmatrix unter Druck durchgeführt werden können.

Die Größe der zu kuppelnden Enzymmoleküle und die Größe

709820/094?

der Membranporen sind wichtige Punkte, die im Rahmen der Erfindung zu berücksichtigen sind. Die Größe der Enzymmoleküle kann nach zahlreichen Methoden bestimmt werden. Berechnungen auf der Grundlage ihrer Diffusionsgeschwindigkeiten stellen nur eine dieser Methoden dar. Die Porengröße der Membran wird gewöhnlich durch Messen der relativen Diffusions- oder Filtrationsgeschwindigkeiten von Molekülen von verschiedener Größe durch die Membranporen und anschließende Anwendung hydrodynamischer Gleichungen zur Berechnung der effektiven Porendurch— messer bestimmt. Die Methoden, die von Kawabe und Mitarbeitern (J.Colloid Interface Sei. 21 (1966) 79) beschrieben werden, sind zu diesem Zweck geeignet. Es wurde gefunden, daß Berechnungen unter Anwendung des Parallelplatten-Porenmodells an Stelle des zylindrischen Porenmodells für die Zwecke der Erfindung gültiger sind. Beispielsweise wurde festgestellt, daß, wenn der Durchmesser der zu kuppelnden Enzyme ein Drittel des Durchmessers der Membranporen beträgt und Antriebsdrücke angewendet werden, die nicht so hoch sind, daß Denaturierung des Proteins durch Belastung erfolgt, die enzymatsiche Kupplung in einem so hohen Maße bewirkt werden kann, daß ein erheblicher Anteil (wenigstens 30% der gesamten Porenoberfläche) durch das Enzym besetzt wird.

Demgemäß wurde festgestellt, daß ein einfaches mechanisches Modell als Anhaltspunkt für diese präparativen Maßnahmen genügt. Wenn die Porenwände mit Enzymen belegt werden, indem Enzymlösungen von einer Seite der Membran zur anderen gepumpt werden, wird der Porenein— tritt verlegt, falls der Porendurchmesser nicht wenigstens das Dreifache des Durchmessers des Enzymmoleküls selbst beträgt. Die Anwendung dieser Regel ist nicht starr, weil Enzymmoleküle deformierbar sind und aus diesem Grunde die Poren wenigstens den zweifachen Durchmesser, vorzugsweise etwa den 3-fachen bis 5-fachen

709820/034?

Durchmesser des daran zu bindenden Enzymmoleküls haben sollten.

Eine weitere in Betracht zu ziehende Größe ist die Größe des Substratmoleküls. Wenn beispielsweise ein großes Substratmolekül, z.B. ein Protein, durch eine an die Poren der Membran gekuppelte Protease gespalten werden soll, ist es wichtig, daß das große Enzym nicht zu Denaturierung der gekuppelten Enzyme durch Scherwirkung führt, während es durch die Pore getrieben wird.

Um von dem Konzept der druckgetriebenen, enzymgekuppelten Membran zweckdienlichen Gebrauch zu machen, ist es wichtig, daß die Matrixmembran gewisse Eigenschaften aufweist. Zunächst müssen ihre Poren Molekülabmessungen aufweisen und wenigstens die zweifache Größe der daran zu bindenden Enzyme, vorzugsweise den 3- bis 10-fachen Durchmesser der Enzymmoleküle, jedoch weniger als das 20-fache dieser Durchmesser aufweisen, so daß die Membranen eine große innere Oberfläche für die Kupplung haben können. Membranen mit makroskopischen Poren mit Abmessungen im u-Bereich sind für die Zwecke der Erfindung unbrauchbar, weil ihre innere Porenoberfläche erheblich kleiner ist. Die Matrixmembranen müssen dem Druckgradienten von einer Seite zur anderen widerstehen können, ohne zusammenzufallen. Selbst bei den verhältnismäßig niedrigen Druckdifferenzen, die in diesem System herrschen, nämlich von durchschnittlich 0,7 bis 10,5 atü, fallen sehr weiche gelartige Strukturen zusammen, so daß die Vorteile des Verfahrens verlorengehen. Es ist nicht notwendig, daß die Membran dem Druck ungestützt widersteht, weil die verfügbare Membrantechnik die Abstützung dünner und empfindlicher Membranen mit den verschiedensten Stützmaterialien ermöglicht. Es ist jedoch eine wesentliche Voraussetzung,daß die Größe der Poren der Membran unter den Einsatzbedingungen

709820/0947

im wesentlichen konstant bleibt. Ein zusätzliches Erfordernis ist, daß ein wesentlicher Teil der inneren Porenoberfläche für die Kupplung von Enzymmolekülen verfügbar ist. Eine große Zahl von sehr feinen Poren, die für Wasser, aber nicht für das Enzymmolekül durchlässig sind, ist nicht erwünscht.

Die Zahl der Homopolymeren, die für diese Zwecke verwendet werden können, ist begrenzt. Beispielsweise sind das homopolymere Polyvinylidenfluorid ("Kynar", Pennwalt) und auch das Copolymerisat von Acrylnitril und Vinylchlorid ("Dynel", Union Carbide) beide ausgezeichnete Filmbildner und weisen viele der erforder liehen Eigenschaften auf. Sie enthalten jedoch von sich aus keine Gruppen, die die leichte Kupplung von Enzymen ermöglichen, und sind auf Grund ihrer hohen chemischen Beständigkeit schwierig zu aktivieren. Andererseits ist Cellulosenitrat ein ausgezeichneter Filmbildner und wird üblicherweise zur Herstellung von Matrixmembranen der für dieses Verfahren erwünschten Art verwendet, jedoch hat dieses Polymerisat als solches keine genügende chemische Stabilität für diese Verwendung. Die homopolymere Cellulose hat die erforderliche chemische Beständigkeit, kann zu Membranen mit geeigneten Eigenschaften entweder durch Regenerierung aus Cellulose— acetat verarbeitet oder direkt durch Auflösen von Cellulose im Dimethylsulfoxyd-Paraformaldehyd-Lösungsmittelsystem gebildet werden. Cellulose kann auch mit einer Anzahl verschiedener Mittel für die enzymatische Kupplung aktiviert werden und wird in großem Umfange in ihren verschiedenen Formen für diesen Zweck verwendet. Cellulose hat jedoch eine begrenzte chemische Beständigkeit. Außerdem scheint sie auf Grund ihrer Natur zu einer begrenzten Reaktion oder Kupplung mit Carbohydrasen und ähnlichen Enzymen fähig zu sein, so daß sie nicht unbedingt das bevorzugte Matrixpolymere

709820/0947

für Enzymreaktoren ist, in denen diese Enzyme verwendet werden. Ferner unterliegt Cellulose selbst der Zersetzung durch Cellulasen und ist aus diesem Grunde für bestimmte spezielle Anwendungen unzweckmäßig.

Dagegen weist das Interpolymersystem die chemische Beständigkeit eines unlöslichen und chemisch beständigen, filmbildenden Polymerisats auf, wenn es mit einem zweiten Polymerisat, das mit Enzymen chemisch kupplungsfähig ist, kombiniert wird. Falls erforderlich, können auch Vernetzungsmittel verwendet werden, um ein Material mit den erforderlichen Eigenschaften zu bilden. Diese Interpolymertechnik ist bereits von Gregor (US-PS 3 808 305) hoch entwickelt worden.

Zu den reaktionsfähigen Polymerisaten, die Teil eines Interpolymergemisches bilden können, gehören Cellulose, Polyvinylbenzylchlorid und seine Copolymerisate, PoIyp-aminostyrol und seine Copolymerisate, Copolymerisate von Methacrylsäure mit dem Addukt von Fluoranilid und Methacrylsäure, Polythiolstyrol, Polyacrylsäure und ihre Copolymerisate, die Homopolymeren und Copolymeren von Maleinsäureanhydrid, Poly-N-vinylimidazol, PoIy-N-methyläthylenimin und lineares Polyäthylenimin. Außerdem können im Interpolymergemisch auch Polymerisate verwendet werden, die die Umgebung innerhalb der Membranporen, die sog. Mikroumgebung des gekuppelten Enzyms, beeinflussen und regulieren. Hierzu können beispielsweise die stark saure Polystyrolsulfonsäure und das stark basische Poly-N-methylimidazoliumchlorid verwendet werden. Die Verwendung von schwach basischen . und schwach sauren Polymerisaten wurde vorstehend bereits erwähnt. Wenn schließlich die Mikroumgebung stärker hydrophob gemacht werden soll, stellt der Zusatz von acylsubstituiertem Polystyrol oder seinen Copolymerisaten ein ausgezeichnetes Mittel dar, dies zu erreichen, wo die Länge der Kohlenstoffkette nach Belieben geregelt werden kann.

709820/0947

Die Kupplung von unlöslichen Polymerisaten an Enzyme kann über die Aminogruppe des Enzyms, über ihre Carboxylgruppen, über ihre Tyrosinreste oder über ihre Mercaptogruppen vonstatten gehen. Nach der gebräuchlichsten Methode wird die Kupplung über die Aminogruppe des Enzyms erreicht, und hierfür sind die Kupplungsverfahren unter Verwendung von Cyanbromid, Anhydrid, Cyanurchlorid und Glutaraldehyd allgemein bekannt. Das Diazonium-Kupplungsverfahren wird zur Kupplung über die Tyrosinreste angewendet, und die Isocyanid- oder Ugi-Reaktion kuppelt über die Carboxylgruppen. Thiolgruppen kuppeln über die Mercaptoreste des Enzyms. Dagegen kann bei Verwendung von Woodward¹ Reagens K entweder mit der Aminogruppe oder der Carboxylgruppe des Enzyms gekuppelt werden. Ferner können Carboxylgruppen an der Matrix mit Carbodiimid behandelt werden, um ein Enzym entweder über die Aminogruppe oder die Carboxylgruppe zu kuppeln.

^Eines der hauptsächlichen Anwendungsgebiete dieser druckgetriebenen, enzymgekuppelten Membransysteme liegt in der Zuckerrohr- und Zuckerrübenindustrie und in der Maisverarbeitungsindustrie, wobei ihre Verwendung in der druckgetriebenen, enzymgekuppelten Form besonders vorteilhaft ist. Gewisse Enzyme dieser Klasse lassen sich gewöhnlich durch Verwendung eines anschließend nitrierten Copolymerisats von Methacrylsäure—3—fluor— anilid kupplungsfähig machen, wie von G.Manecke (Pure & Applied Chemistry 4 (1962) 507) beschrieben. Dieses Polymere kann zusammen mit Polyvinylidenfluorid ("Kynar", Pennwalt) in einem Lösungsmittel gelöst werden. Aus der Lösung kann eine Folie gegossen, teilweise getrocknet und dann zur Bildung der gewünschten Folie mit einheitlichen Poren koaguliert werden. Diese Membran läßt sich leicht so aktivieren, daß die direkte Kupplung von

Enzymen in diesem Fall über die Aminogruppe erfolgt·

709820/0947

Oder man stellt ein Copolymerisat von Methacrylsäure und Methacrylsäure-3-fluoranilid her, kombiniert mit dem gleichen Matrixpolymeren und bildet eine Folie von geeigneter Porosität, worauf die Folie nitriert und die Fluoranilidgruppen aktiviert und anschließend gekuppelt werden. Zu den Enzymen, die diesem Kupplungsprozess besonders zugänglich sind, gehören Dextranase, Invertase, Cellulase, Dextransaccharase, oc-Galactosidase, α-Amyläse und Glucoseoxydase.

Bei Verfahren, bei denen die Verwendung von druckbetriebenen, enzymgekuppelten Systemen, bei denen die Kupplung über die Diazoniumbindung erfolgt, besonders vorteilhaft ist, können Interpolymergemische von Polyvinylidenfluorid (Kynar) und Polyaminostyrol verwendet werden. Bei Interpolymerfolien, die Cellulose enthalten, kann Cyanbromid zur Reaktion mit dem Celluloseteil der Matrixfolie verwendet werden. Eine Behandlung mit p-Phenylendiamin oder Benzidin mit anschließender Behandlung zur Bildung des Diazoniumsalzes ermöglich die direkte Kupplung. Zu den Enzymen, die der Diazonium— kupplung besonders zugänglich sind, gehören Invertase, a-Amylase, ß-Amylase, Glucoseisomerase, Amyloglucosidase und ß-Galactosidase. Die Reaktion von Cellulose mit Titantetrachlorid kann angewendet werden, um Invertase, α—Amylase, Amyloglucosidase und Glucoseoxidase zu kuppeln. Schließlich können Polyamine enthaltende Membranen aus Interpolymeren mit Glutaraldehyd behandelt werden, um ß-Galactosidase und Glucoseoxidase zu kuppeln« Demgemäß erfolgt die Kupplung dieser Carbohydrasen und verwandten Enzyme direkt. Sie ist besonders einfach und leicht, wenn die druckbetriebenen, enzymgekuppelten Membransysteme verwendet werden.

^Eine weitere besonders vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung ist der Fall, in dem mehrere Enzyme an die gleiche Membran oder eine Reihe von Membranen gekuppelt

709820/0347

sind, die eine nach der anderen verwendet werden, um eine spezielle Umwandlung vorzunehmen. Beispielsweise wurden vier enzymgekuppelte Membranen, nämlich eine mit Trypsin, eine zweite mit Chymotrypsin, eine dritte mit Aminopepsidase M und eine vierte mit Prolydase hergestellt. Alle diese Membranen wurden mit Aktivierung durch Cyanbromid und anschließender Kupplung hergestellt, Durch laufende Umwälzung von Lösungen von Polypeptiden oder Proteinen durch diese Reihe von Membranen ergab sich eine vollständige Aminosäurehydrolyse. Da die Enzyme vollständig immobilisiert waren, sie einander nicht angreifen konnten und nicht aus den Membranen ausgelaugt wurden, wurde eine vollständige Digestion ohne Verunreinigung erreicht. Diese Form einer enzymatischen Hydrolyse ist besonders vorteilhaft für Analysenzwecke, weil die Aminosäuren, die gewöhnlich vor ihrer Bestimmung vollständig oder teilweise durch die übliche saure Hydrolyse zerstört werden, nämlich Tryptophan, Tyrosin, Serin, Asparagin und Glutamin, bei dieser Methode nicht zerstört werden. Bei späteren Versuchen wurden Gemische dieser vier Enzyme gleichzeitig gekuppelt, und bei weiteren Versuchen wurden verdünnte Lösungen jedes der Enzyme nacheinander an die gleiche Membran gekuppelt. Da bei den Verfahren gemäß der Erfindung eine schnelle Kupplung an eine starre Matrix stattfindet, die die Enzyme isoliert und Autodigestion und gegenseitige Digestion verhindert, ist ein besonders vorteilhaftes und kompaktes Polypeptid- und Proteinspaltungssystem die Folge.

Es gibt zahlreiche Anwendungen dieses Multienzymsystems. Beispielsweise wurde festgestellt, daß zahlreiche Substanzen, die zu Allergien führen und somit antigen sind, diese Wirkungen aufweisen, weil sie mit kleinen Spuren von Fremdproteinen verunreinigt sind. Beispielsweise sind Penicillin und verwandte Antibiotika häufig mit

709820/094?

/sr

einer geringen Menge Protein verunreinigt, das entweder aus der ursprünglichen enzymatisehen Methode zur Herstellung oder zur Umwandlung von Penicillin in verwandte Verbindungen herrührt. Mit Hilfe dieser Mehrfach-Enzym-Reaktoren können somit Penicillinlösungen einer Behandlung, durch die alle Spuren von Proteinen entfernt werden, unterworfen werden. Ebenso sind viele andere Substanzen, die kleine Mengen von Protein enthalten, das nach üblichen Methoden schwierig zu entfernen ist, der Behandlung nach dieser Methode zugänglich. Sie können verwendet werden, um in handelsüblichen Präparaten von Alginaten vorhandene Eiweißspuren zu zersetzen, um Verbindungen zu bilden, die nicht die Wirkung von Protein-Antigenen haben.

Die druckgetriebenen, enzymgekuppelten Membranen gemäß der Erfindung eignen sich auch für eine Anzahl wichtiger großtechnischer Verfahren in der pharmazeutischen Industrie und Fermentationsindustrie. Ein wichtiges An-r wendungsgebiet ist die Verwendung dieser gekuppelten Enzyme zur Herstellung wertvoller Derivate aus den verschiedensten synthetischen und natürlichen Produkten. Ein spezielles Beispiel ist die Verwendung von Membranen, an die ein Acylase-Enzym gebunden ist, das Penicillin in 6-Aminopenicillansäure, auch als 6-AMP oder 6-APA bezeichnet, umzuwandeln vermag. Dieses wertvolle Derivat wird aus Penicillin hergestellt, das durch Fermentation unter Anwendung üblicher Fermentationsverfahren erzeugt wird. Druckgetriebene, enzymgekuppelte Reaktoren sind hier wegen ihrer hohen Kapazität, Reaktionsfähigkeit und Stabilität und der hohen Reinheit der hierbei hergestellten Produkte wichtig.

Die in den Beispielen beschriebenen Versuche wurden im Laboratoriumsmäßstab durchgeführt. Sie sind repräsentativ für das, was auch unter den Bedingungen des Betriebs von Versuchsanlagen oder halbtechnischen Anlagen und

709820/0947

/b

großtechnischen Anlagen erreichbar ist. Da das Verfahren im wesentlichen darin besteht, daß eine Lösung, die ein gegebenes Substrat enthält, durch die Membran, an die das Enzym gebunden ist, gepumpt wird, findet der gleiche Prozess im großtechnischen Maßstab wie im kleintechnischen Maßstab statt. Demgemäß bietet die Überführung dieser Verfahren in den großtechnischen Maßstab kein Problem, ein weiterer Vorteil dieser Verfahren. Beispielsweise ist bei der üblichen Fermentation die Voraussage der Parameter eines großtechnischen Fermentationsverfahrens aus den in kleinen Laboratoriumfermentern ermittelten Parametern gefährlich.

Zahlreiche mechanische Anordnungen und Ausführungsformen sind für die Verwendung im Rahmen der Erfindung verfüg— bar. Verwendet werden die Vorrichtungen, die allgemein bei üblichen Verfahren der Ultrafiltration und umgekehrten Osmose eingesetzt werden. Hierzu gehören die üblichen Vorrichtungen mit gerahmten Platten, die Vorrichtungen mit spiralförmig gewundenen Membranen, die Vorrichtungen, in denen Hohlfasern als Membranen verwendet werden, Vorrichtungen mit schlauchförmigen Membranen und die mit Röhrchen arbeitenden Vorrichtungen, die sämtlich aus der Fachliteratur und Patentliteratur bekannt sind. Da man bei jedem großtechnischen Fermenter bestrebt ist, die höchste Kapazität im Sinne von katalytischer Aktivität mit geringsten Kosten zu erzielen, und da die Kosten des Enzyms von anderen Erwägungen abhängig sind, ist es offensichtlich vorteilhaft, die Kosten der übrigen Apparaturen so niedrig wie möglich zu halten. Die enzymgekuppelten, druckgetriebenen Ultrafiltrationsmembranen, auf die die Erfindung gerichtet ist, sind insofern einmalig und außergewöhnlich, als Vorrichtungen erstellt werden können, bei denen die Kosten der Membranen, die Kosten der Kupplung und die Kosten der mechanischen Apparaturen schätzungsweise

709820/0947

erheblich niedriger sind als die Kosten für das Enzym selbst, es sei denn, daß ein besonders billiges Enzym verwendet wird. Da in solchen Systemen große Membranflachen und -volumina in einer verhältnismäßig kleinen und einfachen Vorrichtung untergebracht werden können, hat das druckbetriebene System zahlreiche offensichtliche Vorteile gegenüber allen anderen Anordnungen und Ausführungsformen.

Einer der offensichtlichen Nachteile - falls überhaupt des druckbetriebenen Ultrafiltrationsverfahrens unter Verwendung von gekuppelten Enzymen besteht darin, daß Lösungen, die feinteilige Stoffe, Schwebstoffe u.dgl. enthalten, die einen größeren Durchmesser als die Porenöffnungen haben, nicht verarbeitet werden können. Es ist ."" demzufolge notwendig, daß ein Prozess verfügbar ist, bei dem diese rohen Prozeßströme behandlungsfähig gemacht werden. Für diesen Zweck ermöglichen die Ultrafiitrationsmembranen mit feststehender Belastung (fixed-charge ultrafiltration membranes), die in der US-PS 3 808 305 beschrieben werden, eine ideale Vorbehandlung, und diese Membranen werden für diese Zwecke verwendet.

Die Erfindung hat den weiteren Vorteil, aß eine hohe katalytische Kapazität pro Reaktorvolumeneinheit erreicht werden kann. Es wurden Membranen hergestellt, bei denen wenigstens 20% bis zu 60% des Trockengewichts der fertigen Membran durch das Gewicht des Enzyms selbst bedingt sind. Diese hohe Kapazität ergibt sich aus der sehr großen inneren Porenfläche der Membran und der druckbetriebenen Kupplungsmethode. Die üblichen mikroporösen Filter, bei denen die Poren im Mikrongrößenbe— reich liegen, haben nicht diese hohe Kapazität, so daß Systeme, die unter ihrer Verwendung erstellt werden, nicht mit den Systemen der Erfindung vergleichbar sind.

709820/0947

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Eine Membran wurde aus einem 1:!-Gemisch von Polyvinylidenfluorid (Kynar) und Cellulose in MSO-Paraformaldehyd-Lösung hergestellt, 2 Minuten der Trocknung an der Luft überlassen, abgedeckt und eine Stunde der Gleichgewichtseinstellung in den Lösungsmitteldämpfen überlassen und dann mit Wasserdampf koaguliert und gewaschen. Die Membran hatte eine Dicke von 20 u₃ einen Wassergehalt von 90% und eine hydraulische Permeabilität von 4,5 1/Std,

2 bei einem Druck von 3,5 atü für eine Fläche von 11,3 cm Die Membran wurde 25 Minuten bei 3,5 atü mit Cyanbromid (40 mg CNBr in Wasser von pH 11) aktiviert. Sie wurde eine Minute in einem 0,1-molaren Phosphatpuffer bei pH 7,5 gewaschen, worauf eine Lösung von 50 ml des Enzyms Pferdeleber-Alkohol-Dehydrogenase (horse liver alcohol dehydrogenass) in 100 ml des gleichen Puffers bei 3,5 atü durchgeleitet wurden, die Membran wurde dann in diesem Ablauf 24 Stunden bei 4°C gehalten und dann mit Wasser gewaschen. Ihr Proteingehalt betrug 18% des Trockengewichts der Membran.

Die Aktvität dieses Enzyms wurde unter Verwendung der Standardmethoden bestimmt, die in Worthington Biochemical C_orp_Oration Manual (Freehold, New Jersey 1972) beschrieben werden. Die Aktivität dieser Pferdeleber-Alkohol-Dehydrogenase als freie Lösung wurde bei pH 7,5 im Phosphatpuffer unter Verwendung von NAD als Coenzym und von Äthanol als Substrat bestimmt. Die Aktivität dieses Enzyms als freie Lösung (free solution activity) dieses Enzyms betrug 0,31 Einheiten/mg. Bei einem Substratdruck von 7 atü hatte das gekuppelte Enzym eine Aktivität von 0,19 Einheiten/mg.

709820/0 947

Beispiel 2

Jackbohnenurease (Worthington Biochemical) wurde an eine auf die in Beispiel 1 hergestellte und mit Cyanbromid unter einem Druck von 3,5 atü aktivierte Polyvinylidenfluorid-Cellulose-Membran gekuppelt. Die Membran hatte eine hydraulische Permeabilität, die einem mittleren Porendurchmesser von 300 & entsprach. Das Enzym hat ein Molekulargewicht von 483.000 und ist empfindlich gegenüber vorhandenen Metallspuren, so daß alle Versuche in Gegenwart von 0,001 Mol EDTA durchgeführt wurden. Nachdem die Membran nach der Aktivierung eine Minute mit kaltem Wasser gewaschen worden war, wurde eine Lösung von 50 mg Urease in 100 ml 0,02-molarem Phosphatpuffer bei pH 7,0 unter einem Druck von 1,75 atü durchgeleitet. Die Membran wurde dann über Nacht bei 4°C im Ablauf aus der Kupplungsreaktion gehalten und dann mit dem Puffer gut gewaschen. Ihr Proteingehalt seigte, daß die trockene Membran zu 55 Gew.-% aus Protein bestand«, Ihre Aktivität wurde durch Titration für das als Folge der Zersetzung von Harnstoff gebildete Ammoniak nach der im Worthington Biochemical Corporation Catalogue (Freehold_s New Jersey 1972) beschriebenen Methode bestimmt. Dieser Test ergab, daß die Urease im gekuppelten Zustand 60% der Aktivität des freien Enzyms hatte.

Beispiel 3

Glucoseoxidase von A. niger (Worthington) wurde an die gemäß Beispiel 1 hergestellte Cellulose-Polyvinylidenfluorid-Membran gekuppelt. Nach Aktivierung mit Cyanbromid und Waschen mit kaltem Wasser für eine Minute wurden 40 mg Glucoseoxidase in 100 ml destilliertem Wasser bei 4,9 atü durchgeleitet. Die Membran wurde dann 24 Stunden bei 4°C in diesem Ablauf gehalten und anschließend gut gewaschen. Ihr Proteingehalt, bestimmt gemäß Lowry, betrug 4,4 mg oder 42 Gew.-% der trockenen Membran. Ihre Aktivität wurde nach der Worthington-Me-

70982G/0947

thode, jedoch in Abwesenheit von Meerrettichperoxidase bestimmt, weil das gebildete Wasserstoffperoxyd nicht das Enzym inhibieren, sondern unter den angewendeten Druckbedingungen entfernt werden würde. Demgemäß wurde unter Verwendung der 18%ige Standardlösung von Glucose als Substrat und unter Verwendung von reinem Sauerstoff als Druckmedium, so daß der Sauerstoffgehalt nicht geschwindigkeitsbegrenzend wirken würde, die Bildungsgeschwindigkeit des Peroxyds gemessen und mit 80% derjenigen des nativen Enzyms ermittelt.

Beispiel 4

Bei einer weiteren Modifikation der Erfindung wurde eine Penicillinacylase an eine Membran, die Maleinsäureanhydridgruppen enthielt, unter Druckbedingungen gekuppelt.

Eine Folie wurde aus 2 Teilen eines Copolymerisats von Vinylmethyläther und Maleinsäureanhydrid in gleichen molaren Mengen in Kombination mit 1 Teil Polyvinylidenfluorid (Kynar), das in einem Gemisch von Hexamethylenphosphoramid und DMF zusammen mit einem Epoxyd als Ver— netzungsmittel gelöst war, hergestellt. Die daraus gegossene Membran wurde teilweise getrocknet. Nach Trocknung für 10 Minuten in trockener Luft bei 6O⁰C wurde auf die Membran fein zerstäubtes Toluol gesprüht, wodurch die Folie teilweise koagulierte. ^Durch anschließenfes Nachtrocknen wurde die Membran endgültig vernetzt, wobei eine stark poröse Folie erhalten wurde. Die Kupplung von Penicillinacylase wurde vorgenommen, indem 1 g dieses Enzyms mit einer spezifischen Aktivität von 15 Einheiten/mg in 100 ml eines Puffers von pH 6 gelöst, die Membran mit diesem Puffer benetzt und hierdurch gequollen wurde und die Enzymlösung dann bei 4°C 2 Stunden bei 2,8 atü durch die Membran umgewälzt wurde. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von verdünnter Base konstant gehalten. Nach einigen Augenblicken war die Membran genügend gequollen, um die Enzymlösung leicht durch die

709820/09A7

Membran pumpen zu können. Die Membran quoll weiter, wo_ ihre hydraulische Permeabilität stieg. Die endgültige Membran hatte einen Proteingehalt von 30% und 45% der enzymatischen Aktivität der gleichen Menge an nativem Enzym. Für die Herstellung von 6-AMP aus Penicillin G wurden 100 g des Substrats in 1 1 Wasser bei konstantem pH-Wert von 7,8 2 Stunden bei 4,9 atü und 38°C durch die Membran geleitet. Eine Produktausbeute von 88% der Theorie wurde gefunden.

Beispiel 5

Eine von E. coli stammende Penicillin-Acylase wurde an die gemäß Beispiel 1 hergestellte Membran aus Cellulose und Polyvinylidenfluorid gekuppelt. Diese Membran wurde durch Behandlung mit Cyanbromid (40 mg in 100 ml bei einem durch Zusatz einer Base konstant bei 11 gehaltenen pH-Wert) bei 4,9 atü aktiviert, worauf die Membran eine Minute gewaschen und dann mit einer Lösung des Enzyms im Phosphatpuffer bei pH 5,5, der 5 g Enzym in 200 ml Lösung enthielt, behandelt. Nachdem diese Lösung unter einem Druck von 4,9 atü durch die Membran gepumpt und die Membran über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und gewaschen worden war, enthielt die erhaltene Folie 31% Enzymprotein, bezogen auf ihr Trockengewicht. Bei einer typischen Verwendung dieses Membran wurde 1 g des Natriumsalzes von 7-(2-Thienyl)-acetamidocephalosporansäure bei pH 7,5 und 37°C mit dieser enzymgekuppelten Membran bei 3,5 atü behandelt, wobei 7-ASP nach einer Reaktionszeit von 10 Minuten in einer Ausbeute von 98% erhalten wurde. Bei diesem Versuch betrug die effektive

2
Fläche der Membran 11 cm , die gebundene Enzymmenge 3,5 mg und die Aktivität der Membran 60% der Aktivität des nativen Enzyms bei dieser Reaktion.

709820/0947

Beispiel 6

Eine Carboxylgruppen enthaltende Membran wurde wie folgt hergestellt: 2 Teile Polymethacrylsäure und 1 Teil Polyvinylidenfluorid ("Kynar", Pennwalt) wurden zusammen mit 0,1 Teilen eines Epoxyds als Vernetzungsmittel in einer lO%igen Lösung von Hexamethylenphosphoramid und Dimethylformamid gelöst. Die Membran wurde gegossen, der teilweisen Trocknung bei 60°C überlassen und dann mit Wasserdampf koaguliert, um ihre Porosität zu steigern, und abschließend bei 120⁰C vernetzt, nachdem sie bei 60°C fertig getrocknet war. Wenn sie mit Wasser benetzt wurde, hatte die Membran einen Wassergehalt von 80% und eine hydraulische Permeabilität, die einem Porendurchmesser von 180 ά entsprach. Zur Herstellung der enzymgekuppelten Membran wurden 5 Raumteile einer 25%-igen wässrigen Lösung von Glutaraldehyd und 5 Raumteile Diaminopentan zu 50 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wurde auf 100 ml aufgefüllt und der pH-Wert auf 6 eingestellt. Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur und 4,9 atü 2 Stunden durch die Membran gepumpt. Die Membran wurde dann mit reinem Puffer von pH 6 gewaschen, worauf eine 0,5%ige Lösung eines Acylasepräparats, das von E.coli erhalten worden war, in 1 1 Puffer, der einen pH-Wert von 5 hatte, 3 Stunden bei Raumtemperatur und 4,2 atü durch die Membran geleitet wurde. Die Membran wurde dann mit Wasser gewaschen, worauf festgestellt wurde, daß ihr Proteingehalt 20 Gew.-% der trockenen Membran ausmachte. Die Aktivität der Membran entsprach einem Umsatz von 200 liMol einer 5%igen Lösung von K-Benzylpenicillin pro Minute und Gramm der trockenen Membran bei pH 7,8, 37°C und 2,1 atü, wobei der Umsatz über 95% lag.

Beispiel 7

Eine Membran wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt, jedoch mit einem Verhältnis von

709820/0947

Polyvinylidenfluorid zu Cellulose von 2:1. Eine Folie mit einem Porendurchmesser von 180 R wurde erhalten. Nach Aktivierung mit Cyanbromid bei 4,9 atü und Waschen mit Wasser für eine Minute ebenfalls bei 4,9 atü wurde die Membran mit einer Lösung von p-Phenylendiamin (100 mg in 100 ml) 10 Minuten bei pH 8,9 ebenfalls bei 4,9 atü behandelt und dann über Nacht inkubiert. Alle Maßnahmen wurden bei Raumtemperatur und die letzte Behandlung im Dunkeln durchgeführt. Nach einer Wäsche mit Wasser und l—molarem Natriumchlorid und dann erneut mit Wasser wurde die Membran durch Behandlung mit 2n-Salzsäure bei O⁰C für 30 Minuten diazotiert. Dann wurde 14%iges Natriumnitrit langsam der sauren Lösung zugesetzt. Die Membran wurde eine Stunde in dieser Lösung gehalten und dann mit 0,3%iger SuIfaminsäure bei 0⁰C gewaschen. Sie wurde dann mit einer Lösung von Glucoseisomerase (40 mg in 100 ml Puffer von pH 8,5) bei O⁰C und 2,1 atü behandelt, wobei sie eine Stunde umgewälzt wurde, und anschließend über Nacht bei 4°C inkubiert.

Nach einer Wäsche mit destilliertem Wasser bei 3,5 atü - wurde die enzymgekuppelte Membran mit 0,5%iger Natriumchloridlösung behandelt. Im Gebrauch wurde durch die Membran eine 0,5-molare Glucoselösung bei pH 8,0, 60°C und 2,1 atü durch die Membran geleitet, um einen Ablauf, der Fructose enthielt, zu bilden. Die ursprüngliche Aktivität dieses Enzyms betrug 15 Einheiten/mg und die des gekuppelten Enzyms 13 Einheiten/mg. Die Beladung mit Enzym betrug 18 Gew.-% der trockenen Membran.

Bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren gemäß der Erfindung kann mit beliebigem Druck gearbeitet werden, . um den Durchgang der aktivierenden Flüssigkeit und/oder des Enzyms durch die Membran zu beschleunigen, jedoch werden mit einem Druck von wenigstens etwa 0,7 atü, insbesondere etwa 2,1 bis 8,4 atü, besonders gute Ergebnisse erhalten. Für die auf die enzymgekuppelten Mem-

709820/0947

bran einwirkende Materiallösung ist ein Druck von wenigstens etwa 0,35 atü zweckmäßig. Dieser Druck oder dieses Potential kann anstatt pneumatisch oder hydraulisch auch von elektrischer Natur sein, wie es bei der bekannten Erscheinung der Elektroosmose und/oder Elektrophorese der Fall ist, wo ein elektrisches Potential an eine Membran oder ein Filter gelegt wird, und Kombinationen der Aktivierung und Kupplung einerseits und der Anwendungen können in dieser Weise verwirklicht werden. Beispielsweise wird nach der Kupplung von Chymotrypsin an die Membran mit anschließender Aktivierung mit Cyanbromid durch einen Strom, der einen Lösungsstrom durch die Membran erzeugt, der einem Druckgradienten von 4,9 atü entspricht, ein System ausgebildet, dessen enzymatische Aktivität nahezu die gleiche ist wie die Aktivität eines unter einem Druck von 4,9 atü ausgebildeten Systems.

709820/0947

Claims

Paten tansprüche

1) Verfahren zur Durchführung von enzymatischen Reaktionen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung eines Enzyms unter einem Druck von wenigstens etwa 7 atü durch eine aktivierte poröse Ultrafiltrationsmembran preßt, deren aktivierte Stellen mit dem Enzym reaktionsfähig sind,und hierdurch das Enzym an die Membran bindet und eine Substratlösung, die ein Material enthält, das durch das Enzym umgewandelt werden kann, unter einem Druck von wenigstens etwa 0,35 atü durch die Membran preßt, wodurch die Membran mit dem daran gebundenen Enzym die enzymatische Umwandlung des Materials bewirkt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die aktivierte Membran bildet, indem man ein Aktivierungsmittel unter einem Druck von wenigstens etwa 2,1 atü durch die Membran preßt.

3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Membranen verwendet, deren Poren eine durchschnittliche Größe haben, die ungefähr dem 3- bis 5-fachen Durchmesser des Enzyms entspricht.

4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die aktivierte Membran bildet, indem man ein Aktivierungsmittel unter einem Druck von etwa 4,9 bis 8,4 atü durch die Membran preßt und das Enzym unter einem Druck von etwa 4,9 bis 8,4 durch die Membran preßt.

5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Enzymlösung, die mehrere Proteasen enthält, und eine Lösung eines Materials verwendet, das mit wenigstens einem Protein oder Polypeptid verunreinigt ist, und hierdurch die Verunreinigung enzymatisch umwandelt.

709820/09A7

6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym eine Amylase und als Material in der Substratlösung lösliche Stärke verwendet und hierdurch die Stärke enzymatisch in Glucose umwandelt.

7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Glucoseisomerase und als Material in der Substratlösung Glucose verwendet und hierdurch die Glucose teilweise enzymatisch in Fructose umwandelt.

8) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Glucoselösung herstellt, indem man lösliche
Stärke durch eine Membran leitet, an die Amylase gebunden ist.

9) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym eine Penicillinacylase und als Material in der Substratlösung Penicillin verwendet und
hierdurch das Penicillin in Penicillansäure umwandelt.

709820/0947