DE2649749A1

DE2649749A1 - Verfahren und reagens zur bestimmung von gesamtcholesterin oder gebundenem cholesterin

Info

Publication number: DE2649749A1
Application number: DE19762649749
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr Phil Gruber; Detlef Von Dr Ph Hoerschelmann; Gunter Lang; Michael D Nelboeck-Hochstetter; Peter Dr Rer Nat Roeschlau; Hans Dr Rer Nat Seidel
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1976-10-29
Filing date: 1976-10-29
Publication date: 1978-05-11
Also published as: DE2649749C2; US4181575A; CH611712A5; NL7709576A; JPS5356090A; FR2369564A2; IT1114912B; GB1516820A; FR2369564B2

Description

Dipl.-Ing. F. A/Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN

„_,„ POSTFACH 860 820

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MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

int. Nr. 2073

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH, MANNHEIM Sandhofer Straße 112 - 132

Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Gesamteholesterin oder gebundenem Cholesterin

Aus der Deutschen Patentschrift (Patentanmeldung

P 25 06 712) ist ein Verfahren zur Bestimmung von Gesamteholesterin oder gebundenem Cholesterin durch Freisetzung des gebundenen Cholesterins mit Cholesterinesterase und Bestimmung des freien Cholesterins mit einem Cholesterin umsetzenden Enzym bekannt. Als Cholesterin umsetzendes Enzym wird dort Cholesterinoxydase genannt, welche in Anwesenheit von Luftsauerstoff Cholesterin unter Bildung von H₃O₇ in Cholestenon überführt.

Der besondere Vorteil des oben beschriebenen Verfahrens ist darin zu sehen, daß es eine vollenzymatische Bestimmung des Cholesterins in biologischem Material ermöglicht, wo Cholesterin gewöhnlich sowohl in freier als auch in gebundener Form als Ester vorliegt. Durch diese vollenzymatische Bestimmung wird die früher übliche, mindestens zweistufige Bestimmung,bei der die Verseifung des Esters

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in einer gesonderten Stufe durchgeführt werden mußte, wesentlich vereinfacht.

Bei analytischen und klinischen Bestimmungen wird sehr häufig von Methoden Gebrauch gemacht, die in gekoppelten Reaktionen schließlich zur Reduktion von NAD oder NADP unter Bildung von NADH bzw. NADPH führen, da sich letztere Umsetzung besonders einfach in üblichen und weit verbreiteten Photometern verfolgen läßt. Die oben beschriebene, vollenzymatische Cholesterinesterbestimmung läßt sich jedoch nur auf recht komplizierte und umständliche Weise so mit nachgeschalteten enzymatischen Reaktionen koppeln, daß schließlich NADH bzw. NADPH gemessen werden kann. Nunmehr wurde gefunden, daß es möglich ist, diese Schwierigkeit zu beseitigen und eine vollenzymatische Bestimmung für Cholesterinester oder Gemische von Cholesterinester und freiem Cholesterin zu schaffen, welches sowohl die direkte Messung der NADH- bzw.NADPH Konzentration ohne zwischengeschaltete Reaktionen und damit zusätzlichen Aufwand und zusätzliche Fehlermöglichkeiten, als auch die beim bisher bekannten vollenzymatischen Verfahren gegebene Möglichkeit der Bestimmung von gebildetem Cholestenon ermöglicht.

Erreicht wird dies erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin oder gebundenem Cholesterin durch Freisetzung des gebundenen Cholesterins mit einer Cholesterinesterase und gleichzeitige oder anschließende Bestimmung des freigesetzten Cholesterins mit einem Cholesterin umsetzenden Enzym, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Cholesterin umsetzendes Enzym eine NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterinder hydrogenase aus einem anaeroben Mikroorganismus oder aus Warmblüterleber verwendet wird.

Bevorzugt wird dieses Verfahren gemäß Patent

(Deutsche Patentanmeldung P 25 06 712) unter Verwendung einer Cholesterinesterase aus Mikroorganismen durchgeführt. Das Verfahren kann jedoch auch mittels Cholesterinesterase aus Pankreas oder Leber durchgeführt werden. Die Verwendung des letzteren Enzyms

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zu diesem Zweck ist bereits bekannt aus der DT-AS 22 24 132.

Die Erfindung beruht auf der Auffindung einer NAD- bzw. NADP-abhängigen Cholesterindehydrogenase in anaeroben Mikroorganismen. Dieses Enzym läßt sich generell in solchen Anaerobiern finden, welche ein in ihrem Nährmedium vorhandenes, eine 3-&-0H-Gruppe aufweisendes Steroid zum entsprechenden Enon zu dehydrieren vermögen. Als besonders geeignet für die Gewinnung dieses Enzyms erwies sich Eubacterium sp. ATCC 21408.

Anstelle des beschriebenen mikrobMellen Enzyms ist es auch möglich, eine aus Warmblüterieber gewonnene Cholesterindehydrogenase zu verwenden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Cholesterinesterase und NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase der zur bestimmenden Probe gleichzeitig, zweckmäßig als Mischung der Enzyme, zugesetzt. Es ist aber natürlich auch möglich, die Enzyme nacheinander zuzusetzen und beispielsweise erst die Verseifung des Cholesterinesters durch die Cholesterinesterase aus Mikroorganismen vollständig ablaufen zu lassen, ehe die erfindungsgemäß verwendete Cholesterindehydrogenase zugegeben wird. Bei einer derartigen Arbeitsweise ist eine Cholesterinesterase aus Mikroorganismen zu verwenden, um eine vollständige Esterspaltung auch in Abwesenheit des Cholesterin weiter umsetzenden Enzyms zu ,gewährleisten.

Die erfindungsgemäß verwendete NAD- oder NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase dehydriert Cholesterin unter Bildung von Cholestenon und überträgt den abgespaltenen Wasserstoff dabei auf NAD bzw. NADP unter Bildung von NADH bzw. NADPH, die, wie oben erwähnt, im Photometer direkt gemessen werden können. Auf diese Weise ergibt sich eine besonders einfache Bestimmungsmethade, die keiner nachgeschalteten Meßreaktion bedarf. Die photometrische Bestimmung von NADH bzw. NADPH ist dem Fachmann geläufig und braucht hier

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nicht weiter beschrieben zu werden.

Wahlweise ist es beim erfindungsgemäßen Verfahren aber auch möglich, gebildetes Cholestenon zu bestimmen. Die Cholestenonbestimmung*erfolgt dabei zweckmäßig durch Zugabe eines Hydrazinderivates, welches mit der Ketogruppe des Cholestenons unter Hydrazonbildung zu reagieren vermag. Bevorzugt wird hierzu 2,4-Dinitrophenylhydrazin verwendet, da dieses mit dem Cholestenon ein Hydrazon bildet, welches im Photometer bei 405 nm leicht gemessen werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei pH-Werten zwischen 4,5 und 8,5 durchgeführt werden. Der bevorzugte pH-Bereich liegt zwischen 5 und 8. Die Pufferlösungskonzentration ist nicht kritisch, gute Ergebnisse werden zwischen 0,05 und 0,8 M erzielt. Bevorzugt wird der Bereich zwischen 0,1 und 0,6 M.

Wahlweise kann beim erfindungsgemäßen Verfahren außer dem Puffer auch ein Stabilisierungsmittel und/oder zur Verhinderung des Auftretens von Trübungen bzw. Aktivierungen ein oberflächenaktives Mittel zugesetzt werden. Als Stabilisierungsmittel kommen die üblichen für Enzyme bzw. NAD oder NADP verwendeten Stabilisierungsmittel in Betracht. Notwendig sind sie nicht. Desgleichen kann auch ohne Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels gearbeitet werden, insbesondere wenn feststeht, daß die Cholesterinkonzentration in der zu untersuchenden Probe nicht so hoch ist, daß ein Auftreten von Trübungen, die den optischen Test stören könnten, zu befürchten ist.

Für die Gewinnung des erfindungsgemäß zu verwendenden NAD- bzw. NADP-abhängigen Enzyms ist es erforderlich, die Mikroorganismen unter streng anaeroben Bedingungen zu züchten. Der Luftausschluß wird dabei zweckmäßig durch Zugabe eines Sauerstoff entfernenden Mittels wie Methylenblau und Aufrechterhaltung einer Inertgasatmösphäre erzielt. Als Inertgas können beispielsweise Stick-

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stoff, Wasserstoff, Edelgase oder Mischungen davon verwendet werden. Insbesondere hat sich ein Gemisch von Stickstoff und Wasserstoff als günstig erwiesen.

Ein geeignetes Nährmedium für die Züchtung derartiger streng anaerober Mikroorganismen weist beispielsweise folgende Zusammensetzung, bezogen auf 1 1 Medium aufs

20 bis 80 g homogenisiertes, frisches Hirn 5 bis 25 g Hefeextrakt

5. bis 25 g Kasaminosäuren '

1 bis 5 g NaCl

1 bis 3 g Alkalithioglycolat

0,5 bis 5 g Cholesterin oder ein anderes 3~ß-0H-Steroid 0,5 bis 1,5g NaHCO₃

0,2 bis 1 g L-Cystein

5 bis 10 ml 0,05%ige Methylenblaulösung.

Der pH-Wert des Mediums sollte annähernd neutral sein. Vor der Beimpfung mit den Mikroorganismen muß das Medium durch Erhitzen sauerstofffrei gemacht werden. Alle Manipulationen einschließlich der Aufreinigung müssen in Inertatmosphäre durchgeführt werden.

Die Züchtungsdauer ist je nach verwendetem Mikroorganismus verschieden. Für das oben angegebene Eubacterium spec. ATCC 21408 erwies sich eine 30- bis 40-stündige Bebrütung bei 37 bis 40 C als gut geeignet. Am Ende dieser Züchtungsperiode nimmt das Medium eine gallertartige Beschaffenheit an. Durch Zentrifugieren und Resuspenslon in Puffer, zweckmäßig Phosphatpuffer pH 6 bis 8, wird die Biomasse auf etwa 20% konzentriert.

Der anschließende Aufschluß erfolgt vorzugsweise mechanisch und nicht durch chemische Mittel. Gut geeignet erwies sich der Ultra-

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schallaufschluß oder das Zerreiben mit feinen Glasperlen oder dergleichen. Diese und andere geeignete mechanische Aufschlußmethoden sind dem Fachmann bekannt und brauchen hier nicht näher beschrieben zu werden. Vorzugsweise wird bei diesem Aufschluß in Abwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels gearbeitet.

Unlösliche Bestandteile werden aus dem gewonnenen Aufschlußmaterial abzentrifugiert. Der so erhaltene Rohextrakt kann zwar bereits direkt für das erfindungsgeroäße Verfahren eingesetzt werden, vorzugsweise wird das Enzym jedoch konzentriert durch Ausfällung mit einem der üblichen Fällungsmittel wie Ammonsulfat. Bei Verwendung von Ammonsulfat wird letzteres vorzugsweise bis zu einer Konzentration von 3,1 M zugesetzt. Der gewonnene Niederschlag kann dann direkt für die Bestimmung eingesetzt oder weiter gereinigt werden. Eine Weiterreinigung ist beispielsweise durch Säulenchromatographie, Molekularsiebchromatographie oder andere bekannte biochemische Reinigungsmethoden, die hier nicht im einzelnen beschrieben werden sollen, möglich.

Wird statt des mikrobiellen Enzyms ein solches aus Warmblüterleber verwendet, so läßt sich ein analoges Reinigungsverfahren anwenden. Hierbei wird zweckmäßig die zwischen 30 und 50% Ammonsulfatsättigung ausfallende Fraktion für die Bestimmung verwendet.

Bei der Züchtung eines anaeroben Mikroorganismus wird dem Nährmedium als eine 3-/^- OH-Gruppe enthaltendes Steroid zweckmäßig eine der in der DT-OS 24 56 586 aufgeführten Substanzen oder eine Mischung davon zugesetzt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens, welches in einer ersten Ausführungsform Cholesterinesterase, NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase, NAD oder NADP, Puffer und gegebenenfalls Stabilisierungsmittel oder/und ein oberflächenaktives Mittel enthält oder daraus besteht.

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Gemäß einer weiteren Ausfuhrungsform besteht ein derartiges Reagens aus Cholesterinesterase, NAD- bzw. NADP-abhängiger Cholesterindehydrogenase, einem System zur Bestimmung von Cholestenon, Puffer und gegebenenfalls Stabilisierungsmittel oder/und einem oberflächenaktiven Mittel. Als System zur Bestimmung von Cholestenon wird vorzugsweise ein mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierendes Hydrazinderivat verwendet. Besonders bevorzugt wird 2,4-Dinitrophenylhydrazin als System zur Bestimmung von Cholestenon.

Die quantitative Zusammensetzung eines derartigen Reagens beträgt zweckmäßig 0,04 bis 4 U Cholesterinesterase, 0,04 bis 50 U NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase und 10 bis 100 mM NAD bzw. NADP oder 0,5 bis 10 mM Hydrazinderivat, bezogen auf 2 ml Reagens. Falls das Reagens ein oberflächenaktives Mittel wie Hydroxypolyäthoxydodecan enthält, so liegt dessen Konzentration zweckmäßig zwischen 0,1 und 1 %, entsprechend 0,002 bis 0,02 ml, bezogen auf 2 ml Reagens (die in einem Testansatz üblicherweise eingesetzte Menge).

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Reagens läßt sich eine sehr rasche und vollständige Bestimmung von gebundenem und freiem Cholesterin, insbesondere auch in biologischen Proben wie Serum, Blut und dergleichen durchführen. Ein besonderer Vorteil liegt darin, daß keine zusätzlichen Meßreaktionen angekoppelt werden müssen und die Bestimmung direkt mit den weitverbreiteten einfachen Photometern durchgeführt werden kann.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1

Eubacterium spec. ATCC 21408, ein streng anaerober Mikroorganismus, wird auf ein Medium folgender Zusammensetzung überimpft:

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pro Liter 50 g frisches Kalbshirn (homogenisiert)

15 g Hefeextrakt (DIFCO) 15 g Casamino acids 2,5 g NaCl

2,0 g Natriumthioglycolat 2,0 g Cholesterin
1,0 g NaHCO₃
0,5 g L-Cystin

7,5 g 0,05%ige Methylenblaulösung (pH-Wert 6,9 - 7,1; die Medien werden unmittelbar vor Beimpfung durch Erhitzen sauerstofffrei gemacht; alle Manipulationen - einschließlich Aufreinigen - erfolgen im Isolator in N₂/H₂ Atmosphäre).

Nach 30 bis 40 Stunden Bebrütung bei 37 bis 40°C hat sich das Medium gallertartig verändert. Durch Zentrifugation und Resuspension in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,5 wird die Biomasse 1:5 konzentriert und dann in der Sorvallmühle (+ 0 0,25 mm-Glasperlen 1:1, 3 min.,Schalterstellung 4) aufgeschlossen.

Zum zentrifugierten Rohextrakt wird Ammonsulfat bis zu einer Konzentration von 3,1 M gegeben; die Fällung wird in 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,5 aufgenommen und auf eine Säule, die mit Molekularsiebmaterial auf Basis von vernetztem Dextran gefüllt ist, gegeben. Die Elution erfolgt wieder mit 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,5; die aktiven Fraktionen werden vereinigt und eingefroren.

Bei s ρ i e 1 2

0,02 ml Serum werden zu 1,0 ml 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer pH 7,5 der 0,4% Hydroxypolyäthoxydodecan enthält, gegeben. Nach Zugabe von 0,02 ml (= 2 U) Cholesterinesterase-Lösung sowie 0,05 ml

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Cholesterindehydrogenase-Lösung von Beispiel 1 und Inkubation für 30 Min bei 25 C werden 2 ml 1 mM 2,4-Dinitrophenylhydrazin-10%ige Salzsäure-Lösung zum Reaktionsgemisch pipettiert. Nach einer weiteren 30 minütigen Inkubation bei 25 C werden 3,0 ml Wasser zur Reaktionslösung gegeben und anschließend gegen einen Reagentien-Leerwert (anstatt Serum wird Wasser eingesetzt) bei 405 nm in einem geeigneten Photometer gemessen.

Die Auswertung erfolgt über einen mitgeführten Cholesterin-Standard. Die Messung einer typischen Probe ergab 147 mg Cholesterin/100 ml Serum. Die Vergleichsbestimmung mit einem handelsüblichen Reagens auf Basis von Cholesterinoxydase ergab 149 mg Cholesterin/100 ml Serum.

Beispiel 3

1,89 ml Phosphatpuffer, pH 7,5 (0,5M), der 0,4% Hydroxypoly-

wer.de^n . und 0.Ό2 ml Serum

äthoxydodecan enthält, ■w-Mra-mit 0,1 ml NADP-Lösung (13 mM)/gemischt und in eine Küvette gegeben. In einem geeigneten Photometer wird bei 365 nm die Extinktion E₁ abgelesen. Nach Zugabe von 0,02 ml (= 2 U) Cholesterinesterase-Lösung und 0,05 ml Cholesterindehydrogenase-Lösung nach Beispiel 1 wird bei 25 C im Wasserbad inkubiert.

Nach 30 min wird die Extinktion E₂ abgelesen. Die Extinktionsdifferenz E₂-E₁ = E geht in die Berechnung ein.

Die Berechnung erfolgt nach dem Lambert-Behr¹sehen Gesetz. Die Messung einer typischen Probe ergab 150 mg Cholesterin/100 ml Serum. Eine Vergleichsbestimmung mit einem handelsüblichen Reagens auf Basis von Cholesterinoxydase ergab 149 mg Cholesterin/100 ml Serum.

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- γι-4%

Bei s pie 14

Gewinnung einer Cholesterindehydrogenase aus Rattenleber.

Ti

Rattenleber wird mit der 3-fachen Menge 0,25 M Saccharose homogenisiert und bei 80.000 G zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird bei pH 7,0 mit Ammonsulfat auf 30% Sättigung gebracht und der Niederschlag abzentrifugiert. Der Überstand wird mit einem gleichen Volumen gesättigter Ammonsulfat-Lösung versetzt und der erhaltene Niederschlag abzentrifugiert und gegen destilliertes Wasser dialysiert.

Das Dialysat wird mit 1 M Phosphat-Puffer auf 0,2 M Phosphatgehalt und pH 6,0 eingestellt und mit 0,1 Vol. Aiuminiumoxydgel versetzt. Die Suspension wird dann zentrifugiert, der Niederschlag verworfen und der Überstand mit Ammonsulfat bis 2,7 M versetzt. Der hierbei auftretende Niederschlag wird abzentrifugiert und auf c = 10 ml aufgelöst. Die erhaltene Enzymlösung enthält ca. 0,005 U/ml.

1 ml dieser Lösung gibt nach dem in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen Verfahren anstelle des dort verwendeten Dehydrogenasepräparates praktisch gleiche Resultate.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin oder gebundenem -Cholesterin durch Freisetzung des gebundenen Cholesterins mit einer Cholesterinesterase und gleichzeitige oder anschließende Bestimmung des freigesetzten Cholesterins mit einem Cholesterin

umsetzenden Enzym insbesondere nach Patent

(Deutsche Patentanmeldung P 25 06 712), dadurch gekennzeichnet, daß als Cholesterin umsetzendes Enzym eine NAD- bzw.NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase aus einem anaeroben Mikroorganismus oder aus Warmblüterleber verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Cholesterinesterase und NAD- bzw* NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase der zu bestimmenden Probe gleichzeitig zugesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine aus Eubacterium Sp. ATCC 21408 gewonnene Cholesterindehydrogenase verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein durch mechanischen Aufschluß des anaeroben Mikroorganismus in Abwesenheit von oberflächenaktiven Mitteln und Abtrennung der unlöslichen Bestandteile gewonnenes Enzympräparat verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein durch Ammonsulfatzusatz bis zu einer Konzentration von 3,1 M gefälltes, gereinigtes Cholesterindehydrogenasepräparat verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterindehydrogenase aus einem anaeroben Mikroorganismus verwendet wird, welcher in sauerstofffreier Atmosphäre in einem Thioglycolsäure und ein eine 3-ß-OH-Gruppe aufweisendes Steroid enthaltenden Nährmedium gezüchtet wurde.

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7. Reagens zur Durchführung des Verfahrens von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es .

Choles terines ter as e

NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase NAD oder 'NADP

Puffer und gegebenenfalls

Stabilisierungsmittel oder/und

ein oberflächenaktives Mittel entält oder daraus besteht.
8. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es

Choles terines teras e

NAD- bzw. NADP-abhängige Cholesterindehydrogenase ein System zur Bestimmung von Cholestenon

Puffer und gegebenenfalls .

Stabilisierungsmittel oder/und

ein oberflächenaktives Mittel enthält oder daraus besteht.
9. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur Bestimmung von Cholestenon ein mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierendes Hydrazinderivat ist.
10. Reagens nach Anspruch 9, kennzeichnet durch einen Gehalt an 2,4-Dinitropheny!hydrazin.

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