DE2639234A1 - Immobilisierte proteine und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich in allgemeiner Hinsicht aus Enzymsysteme und im spezielleren auf ein Verfahren und Mittel zur Immobilisierung von Enzymen durch Kuppeln oder Binden derselben mit einem geeigneten.bzw, an ein geeignetes Stütz- oder Trägermaterial.

"Wie in der Fachliteratur belegt ist, sind Enzyme proteinhaltige Substanzen mit im allgemeinen hohen Molekulargewicht, die als biologische Katalysatoren wirken und vielfältige Reaktionen zu fördern vermögen, wie z.B„ die Umsetzung von Glucose mit dem Enzym Glucoseisomerase unter Bildung von Fructose. Nachteiligerweise sind die meisten Enzyme in V/asser löslich und ist es daher schwierig, sie für eine erneute Verwendung aus einer Lösung zu gewinnen und/oder die katalytische Wirksamkeit der Enzyme für eine längere Zeitdauer zu erhalten. Außerdem sind Enzyme häufig füreine Gewinnung oder Erzeugung im industriellen Maßstab kostspielig, Daher sind bisher viele Techniken zur·' Immobilisierung von Enzymen

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und Unlöslichmachen derselben vorgeschlagen worden, beispielsweise durch Binden oder Kuppeln der Enzyme an ein unlösliches bzw. mit einem unlöslichen Stütz- oder Trägermaterial„ Die bisher in Verbindung mit Enzymen benutzten Ausdrücke "immobil" oder "immobilisieren" beziehen sich auf Enzyme, die durch Bindung an ein wasserunlösliches oder Einschluß in einem wasserunlöslichen Trägermaterial im wesentlichen wasserunlöslich gemacht worden sind, und zwar in einer solchen V/eise, daß sie ihre Aktivität beibehalten, leicht aus einer 5.eaktionslösung entfernt und erneut verwendet werden können.

Frühere Versuche zur Durchführung katalytischer Reaktionen unter Verwendung immobilisierter Enzyme sind mehr oder weniger erfolg- : reich gewesen, und zwar je nach dem Verfahren zum Kuppeln oder Binden der Enzyme mit dem unlöGlichen bzw» an das unlösliche Trägermaterial, der Art oder den physikalischen und chemischen Eigenschaften des Trägermaterials selbst und dem Massenübertragungsmechanismus, nach dem ein Substrat mit dem Enzymträgermaterial kontaktiert wird. Unter dem hier benutzten Ausdruck "Substrat" ist eine Substanz zu verstehen, an bzw» mit dem ein Enzym katalytisch reagiert.

ZoBo sind Enzyme an kieselsäurehaltigen Trägermaterialien, wie z.B„ porösen Glasperlen, adsorbiert worden (US-Patentschrift 3 556 945) oder sind an solche porösen Perlen mittels eines Zwischensilankupplers gebunden worden (US-Patentschrift 3 519 538)„ Anstelle von Glasperlen sind poröse Keramikperlen vorgeschlagen worden, an die das Enzym durch Adsorption gebunden wird (US-Pa-

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tent schrift 5 85ο 751)» Weil jedoch derartige poröse G-I as· oder
Keraraikperlen eine äußerst geringe Teilchengröße haben, ist es
zur Erzielung einer enzymatisehen Reaktion erforderlich zu bewirken, daß das Substrat durch ein Füllkörperbett aus vielen deraz»
tigen einzelnen Teilchen fließto Reaktionslagen mit einem Enzym· . füllkörperbet sind kostspielig, sind anfällig für ein Verstopfen '<

oder eine Bildung von Kanälen, stellen einen relativ hohen Wider-» . stand für einen durchfließenden Strom dar und neigen zur Zurück- j haltung des Substrats innerhalb der Poren aufgrund der relativ ^: kleinen Porengröße, wodurch das Problem der Verunreinigung gege· ! ben ist, wenn eine Reihe verschiedener Substrate oder Proben \ durch das Füllkörperbett geführt wird und die Enzymreaktion rela- · tiv schnell stattfindet«, j

; Wie in der Literatur angegeben ist(US*Patentschrift 3 824 150), '· : sind Enzyme außerdem durch mechanisches Einschließen in einem
halbdurehlässigen Trägermaterial, wie z.B. einer Membran, oder
durch chemisches Binden durch ein Verbindungsmittel an natürliche
oder synthetische Materialien, einschließlich Oellulosematerialien in Form von Filterpapier, immobilisiert worden. In dem membranhaltigen Reaktionsgefäß oder dem Reaktionsgefäß zum mechanischen
Einschließen kann die enzymatische Reaktion nur durch Diffusion

der Substratlösung durch das Trägermaterial stattfinden, und
außerdem wird bei Verwendung solcher Trägermaterialien dem Enzym·
system häufig nicht eine besondere Stabilität verliehen. Die Verwendung von cellulosehaltigen! Filterpapier und ähnlichen organischen Trägermaterial!en mit daran gekuppelten oder auf andere

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Weise gebundenen Enzymen leidet unter den mit solchen Trägermaterialien verbundenen Nachteilen insofern, als die letzteren im allgemeinen zerbrechlich sind, chemischem und mikrobiellem Angriff ausgesetzt sind und ohne Beschädigung nicht leicht sterilisiert werden können.

- Es ist ferner noch bekannt, einen wasserunlöslichen Polymerisatüberzug mit Witrilo-, sauren Amido- oder Lxeidogruppen auf ein einphasiges makroporöses polymeres Tra... er na t er i al aufzutragen und dann die enzyme durch Adsorption an die überzogene Ooe-llacne eines solchen Trägermaterials zu binden (Ud-*Patentscnii±-G 3 To j 084)0 Dip L er st ellung von solchen mit überzügen versehenen iteak-

^: tionszonen bzw. Reaktoren ist jedoch zeitraubend und kostspielig, und die Enzymmen^.e, die an ein Einheitsvolurneu des erhaltenen

! Äeaktois gebunden werden kann, ist aufgrund der Tatsache etwas

begrenzt, daß das Trägermaterial makroporös ist. :

Unter Berücksichtigung dieses Standes der fechnik ist ein Haupt- \

ziel der Erfindung, ein verbessertes immobilisiertes Enzymsystem i

I und ein Verfahren zu dessen Herstellung zur Verfügung zu stellen, j

Nach einem anderen kiel der Erfindung soll ein verbessertes Enzym*· system geschaffen werden, das ein Enzym enthält, welches an ein unlösliches, flüssigkeitsdurchlässiges Stütz- oder Trägermaterial |.

j in Form eines mikroporösen Körpers gekuppelt oder gebunden ist, der nicht biologisch abbaubar ist und gegenüber einer Einwirkung von Chemikalien beständig, ist, einen großen Überflächenbereich,, eine hohe Permeabilität und ausgezeichnete physikalische Eestig-

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keitseigenschaften hat, leicht sterilisiert werden kann und rela- ; tiv billig herzustellen ist. ^:

Wach noch eineaa weiteren Ziel der Erfindung sollen ein Verfahren ;

und Mittel zum chemischen Binden eines Enzyms, an einen unlösli- j chen, flüssigkeitsdurchlässigen mikroporösen Erägerkörper vorge- ; schlagen werden, wodurch ein verbessertes immobilisiertes Enzymsystem gebildet werden kann.

! Wach noch einem weiteren Ziel der Erfindung soll ein Mittel zur

!Durchführung eines chemischen Prozesses durch enzymatische Um-

setzung eines Substrats mit einem Enzym, das an einen unlöslichen flüssigkeitsdurchlässigen mikroporösen Körper gebunden ist, zur Verfügung gestellt werden.

Zur Erreichung der vorstehend angegebenen Ziele und Vorteile schlägt die Erfindung, kurz gesagt, einen unlöslichen mikroporösen Körper vor, der eine Polymerisatmatrix oder ein Polymerisat* bindemittel und vollständig in der Matrix verteilte Teilchen aus Füllmaterial enthält. Der mikroporöse Körper wird in einer sol«· chen Weise behandelt, daß er Enzyme an die in der Matrix vollstän« dig verteilten Füll material! en bindet bzw«, die Enzyme mit diesen Teilchen kuppeln. Das erhaltene zusammengesetzte immobilisierte Bnzymsystem kann dann mit einem Substrat kontaktiert werden, um eine enzymatische Reaktion durcnzuführen.

Weitere Ziele und Vorteile der Erfindung sind der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung vollständiger zu.entnehmen.

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Gemäß der Erfindung ist gefunden worden, daß ein verbessertes immobilisiertes Enzymsystem durch Kuppeln oder Binden eines Enzyms an ein unlösliches Stütz- oder Trägermaterial in Form eines beständigen, inerten, dreidimensionalen flüssigkeitsdurchlässigen Körper gebildet werden kann, der ein Bindemittel und

j feinteilige Füllmaterialteilchen enthält, die vollständig in dem

Bindemittel in unbeweglicher oder dimensionsbeständiger Weise verteilt sind, und der ein durchdringendes bzw» in dem gesamten

Körper vorhandenes Netzwerk aus im wesentlichen miteinander verbundenen Mikroporen enthält, welche die Füllmaterialteilchen umgeben und enthalten.

j Ein Beispiel für ein mikroporöses Material des vorstehenden Typs, das besonders geeignet ist und daher besonders für eine Verwen-

dung als unlösliches Enzymstütz- oder -trägermaterial gemäß der j Erfindung brauchbar ist, ist ausführlich in der US-Patentschrift 3 862 o3o beschrieben, auf die hier Bezug genommen wird. Wie dieser US-Patentschrift zu entnehmen ist, enthält ein solches mikroporöses Material eine normalerweise hydrophobe Polymerisatmatrix (z_oB. Polyvinylchlorid), feinteilige normalerweise hydrophile Füllstoffteilchen (z.B. Kieselsäure), welche in der Harzmatrix vollständig dispergiert sind, und ein Netzwerk aus miteinander verbundenen Mikroporen, welches in dem gesamten Material vorliegt. Dieses Netzwerk aus miteinander verbundenen Mikroporen wiederum besteht aus Mikroporen, die zwischen angrenzenden oder benachbarten Teilchen aus dem dispergierten anorganischen Füllst.off, zwischen Teilchen aus dispergiertem Füllstoff und der Harzmatrix sowie in der Harzmatrix selbst vorliegen, wobei die

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Mikroporen eine Teilchengrößenverteilung aufweisen, die sich typischerweise über einen relativ breiten Bereich hinweg von etwa o,o1 Mikron bis etwa 1oo Mikron erstreckt und der mittlere Porendurchmesser der Mikroporen typischerweise in dem Bereich von etwa o,1 Mikron bis etwa o,2 Mikron nach porosimetrischer Bestimmung

. mittels der Queeksilberintr-usionsmethode liegte Die Gesamtporosität eines solchen Materials liegt typischerweise in dem Bereich von etwa 5o bis etwa 7o %, Derartige mikroporöse Materialien sind bisher Z₀B₀ zur Herstellung von Batterieseparatoren, wie in der US-Patentschrift 3 696 o61 beschrieben ist, oder in letzterer

' Zeit als Submikronfiltermittel (US-Patentschrift 3 862 o3o) ver- ^: wendet worden,

" ■ ■ . -

■ Andere mikroporöse Materialien, als sie in der US-Patentschrift

^! 3 862 o3o beschrieben sind, können ebenfalls zur Durchführung

■ der Erfindung verwendet werden₀ So können Z₀B₀ anstelle des thermoplastischen Bindemittelbestandteils des mikroporösen Materials der US-Patentschrift 3 862 o3o synthetische oder natürliche wärmehärtende Kautschukpolymerisate oder Copolymerisate davon verwendet werden.

Bei Herstellung aus kautschukartigen Polymerisaten werden diese unter Zugabe von Zusätzen, wie ζ_βΒ_β Antiabbaumitteln, Vernetzungsmitteln, inerten I¹UlIstoffen oder dergleichen Zusätzen, · die normalerweise von dem Fachmann zur Herstellung wärmehärtender Zubereitungen verwendet werden, unter Anwendung üblicher Methoden mit einem geeigneten Füllstoff, wie Z₀B₀ Kieselsäurehydrogel oder ausgefälltem Kieselsäurehydrat (d_oh. Kieselsäure nSiO₂»mH₂O, wo-

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rin η und m ganze Zahlen sind), das im Handel erhältlich ist, z.B. unter der Handelsbezeichnung Hi-SiI von PPG Industries, innig vermischt. Das erhaltene Gemisch wird dann zu einer Bahn geformt, vorzugsweise durch Kalandrieren auf einem geeigneten träger (d.h. Papier oder einem dünnen Metallblech oder -sieb), auf Spulen üblicher Größe aufgewickelt und dann unter hydrostatischen Bedingungen in einem Dampfautoklaven zu einem geeigneten Härtungszustand unter Verwendung von unter Druck stehendem Dampf als Wärmequelle vulkanisiert. Die vulkanisierte Bahn wird dann in einem warmen trocknen Luftstrom, der auch zum Entwässern der Kieselsäure dient, getrocknete Ein solches Entwässern führt zur Bildung von Eikroporen in der Bahn aufgrund des Schrumpfens der . Kieselsäure, wobei ein normalerweise hydrophiler mikroporöser • Gegenstand gebildet wird.

!

j In dem fertigen Zustand enthält einen mikroporöse Bahn auf Basis '. eines typischen wärmegehärteten kautschukartigen Polymerisats ; etwa 1 Gewichtsteil kautschukartiges Polymerisat auf etwa o,5 ι

Gewichtsteile Kieselsäure und hat eine Porosität von etwa 6o Yolumenprozent. Die Porengrößenverteilung ist im allgemeinen ziemlich groß und reicht von etwa o,o5 bis 1o Mikron für den größten Seil gemäß der Quecksilberintrusionsmethode, wobei die mittlere Porengröße im allgemeinen etwa 1,4 Mikron beträgt. Solche wärmegehärteten kautschukartigen Polymerisatbahnen sind normalerweise hydrophil, und flüssiges Wasser sinkt schnell in ein solches Material ein und geht ohne Anwendung von Druck hindurch, was anzeigt, daß die Poren im wesentlichen miteinander verbunden sind. Solche Bahnen und das Verfahren zur Herstellung derselben ist be-

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kannt.

In allgemeinerer Hinsicht schlägt die Erfindung die Verwendung der feinteiligen Füllstoffteilchen, die in dem Bindemittel oder der Matrix aus dem mikroporösen Material vollständig dispergiert sind, als aktive Stellen vor, an die Enzyme gebunden werden können. Aufgrund des porösen Aufbaus und der Verteilung der Füll-

. stoffteilchen in der gesamten Matrix oder dem gesamten Bindemittel hat ein solches mikroporöses Material einen relativ großen Oberflächenbereich, im allgemeinen in- der Größenordnung von etwa 80 m /g, und ist die Anzahl der zur Verfügung stehenden Enzym-

!-Bindungsstellen relativ großj daher ist, wie festgestellt worden ι ist, der Beladungsfaktor oder der Anteil Enzyme, der je Einheits-

I
volumen von solchem mikroporösen Material gebunden werden kann, entsprechend groß. Weil jedes Füllstoffteilchen praktisch von dem miteinander verbundenen Netzwerk aus Mikroporen wechselnder Grösse umgeben ist, kommt außerdem ein Substrat in der Form eines flüssigen oder wässrigen Stroms, der z.B. durch eine relativ dünne Bahn aus mikroporösem Material mit an dieses gebundenen Enzymen fließt, unmittelbar in Kontakt mit sehr vielen Enzymstellen bzw. hat einen erhöhten Zugang zu sehr vielen Enzymstellen, wodurch schnelle enzymatische Reaktionen mit hohem Umwandlungswirkungsgrad in das Produkt äußerst stark gefördert werden."Wenn der Reaktionswirkungsgrad des Enzyms relativ hoch ist, kann daher die Bahn sehr dünn sein und finden praktisch vollständige Umsetzungen beinahe sofort beim Durchgang des Substrats durch die Bahn statt. Aus dem gleichen Grunde können Enzyme mit geringerer Reaktionsfähigkeit etwas dickere Bahnen und etwas längere Reaktionszeit-

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spannen zur Erzielung praktisch vollständiger Umwandlungen in das Produkt erfordern«. Aufgrund des hohen Porositätsgrad und der hydrophilen Natur des dispergierten FüllstoffBestandteils wird das mikroporöse Material leicht benetzt und ist für dadurch fließende Flüssigkeiten sehr durchlässige Daher sind relativ niedrige hydraulische Drücke erforderlich, um ein Substrat durch das Material zu führen. Wie z.B. in der US-Patentschrift 3 862 o3o herausgestellt ist, sind Flüssigkeitsdurchsätze von etwa 1,5 Liter/Minu-

p p

te/9,29 dm bis etwa 34,ο Liter/Minute/9,29 dm durch Bahnenmaterialien aus dem bevorzugten mikroporösen Material mit einer Dicke , von etwa o,o5 cm unter einem Druckgradienten von nur o,7 atü und ! mit Füll stoff/ Bindemittel- Verhältnissen in dem Bereich von etwa 1:1 bis etwa 2:1 erreicht worden. Eine Erhöhung des Füllstoff/ Bindemittel-Verhältnisses führt im allgemeinen zu einer Zunahme der Porengröße und einer größeren Gesamtporosität, was eine Er-

I höhung der Permeabilität des Materials bewirkt«, Dementsprechend !

ist das immobilisiertes Enzym enthaltende Trägermaterial der Er- j

j findung besonders für eine Verwendung in Form eines sogenannten Durchflußreaktorkerns geeignet, d.h„ eines Reaktorkerns, in dem die Substratlösung eine Oberfläche des enzymbeladenen Materials durchdringt, katalytisch an dem Enzym umgesetzt wird und das erhaltene Produkt sowie auch irgendwelches unumgesetztes Substrat durch die gleiche oder eine andere Oberfläche des Materials die Reaktionszone verläßt«,

Der Porengrößenbereich des mikroporösen Trägermaterials erstreckt sich über einen relativ großen Bereich (d.h„ etwa o,o1 Mikron bis etwa 1oo Mikron), und die Mikroporen sind im wesentlichen mitein--

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ander verbunden. Das Material enthält daher viele Bahnen ausreichender Größe, durch die das Substrat und/oder das umgesetzte Produkt leicht fließen kann. Der Produktablauf aus dem Material geht daher sehr schnell vor sich und kann im wesentlichen gleichzeitig mit dem Strömungsendpunkt des Substrats durch das trägermaterial beendet sein_c]8it anderen Worten heißt das, daß die mit dem nach der Erfindung vorgeschlagenen Enzymträgermaterial durchgeführten katalytischen Reaktionen einen extrem scharfen Abschluß finden, und dementsprechend können viele unterschiedliche Substratproben in schneller Folge eingetragen werden, ohne daß eine ; Gefahr der Yerunreinigung zwischen nachfolgenden Proben besteht,

was ein äußerst wünschenswerter Yorteil ist, wenn immobilisierte Enzyme verwendet werden, um nachfolgende katalytische Reaktionen '· mit einer Reihe verschiedener Substratproben, wie z.B„ medizini- \ sehen oder industriellen analytischen Instrumenten, durchzuführen_e|

Die vorstehend angegebenen Eigenschaften stellen einen erheblichen Vorteil der Erfindung dar, weil bei anderen bekannten immobilisierten Enzymreaktoren, wie z_oB_e einem Füllbett aus porösen Glasperlen oder dem Membranreaktor, die Porengröße sehr gleichmäßig eingestellt ist und eine solche geringe Größe hat, daß der Materialtränsport durch den Reaktor durch Diffusion stattfindet. Bei solchen auf Diffusion beschränkten Enzymreaktoren kann die Gesamtablaufdauer des Produkts wesentlich hinter dem Substratprobenendpunkt zurückbleiben, so daß das Problem einer Verunreinigung für -eine nachfolgende Substratprobe gegeben ist, die zu schnell in den Reaktor eingetragen wird.

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Außer den obigen Vorteilen hat das mikroporöse Enzymträgermaterial der Erfindung ausgezeichnete Festigkeitseigenschaften, und zwar im allgemeinen eine Zugfestigkeit von 28 kg/cm , eine prozentuale Dehnung unter 2o % und kann daher sehr leicht während der verschiedenen Behandlungsstufen gehandhabt werden, die zum Kuppeln oder Binden von Enzymen erforderlich sind, wie nachfolgend ausführlicher erläutert wird. Außerdem widersteht das mikroporöse Material der Erfindung aufgrund seiner ausgezeichneten G-rößenkonstanz und Festigkeit einem Verdichten unter Hydraulischen Drücken und ist daher besonders für eine Verwendung in Behandlungsreaktoren im Großmaßstab geeignet, in denen große Enzymreaktionsbereiche vorhanden sind und starke dynamische Kräfte auf den Enzymträgerkörper ausgeübt werden, wie z.B„ bei industriellen bzw. chemischen Prozessen unter Anwendung enzymatiseher Reaktionen. Das bevorzugte mikroporöse Material ist außerdem gegenüber Chemikalien, wie Säuren und Alkoholen, beständig und kann erhöhten Temperaturen ausgesetzt werden, onne daß die physikalischen Eigenschaften des mikroporösen Materials beeinträcntigt werden. So ist z.B. festgestellt worden, daß es möglich ist, das bevorzugte mikroporöse Material durch Einbringen in Wasserdampf von 1 atü mit einer Temperatur von 116⁰C für 3o Minuten ohne Beeinträchtigung der Limensionskonstanz oder der physikalischen Eigenschaften des Materials zu wärmesterilisieren.

Wie in der oben erwähnten US-Patentschrift 3 862 o3o ausführlicher beschrieben ist, kann das besonders bevorzugte mikroporöse Material durch Vermischen geeigneter Mengen von einem feinteiligen anorganischen Füllstoff, einem lösungsmittel (z.B. Cyclohexa-

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non) und einem Mchtlösungsmittel (ζ_βΒ. Wasser) unter Bedingungen geringer Scherung unter Bildung eines beständigen, feuchten, freifließenden Pulvers hergestellt werden«, Das Pulvergemisch kann dann extrudiert und kalandriert werden, vorzugsweise unter Bildung eines im wesentlichen ebenen Gebildes oder einer Bahn mit den gewünschten Abmessungen, das bzw. die dann durch ein wässriges Bad geführt wird, um das Lösungsmittel auszulaugen, und dann durch einen erwärmten Luftofen geführt wird, in dem alle Feuchtigkeits- _; spuren entfernt werden_e Gemäß der Erfindung kann dann der erhal-

; tene Gegenstand in Form eines mikroporösen, dimensionsbeständigen, ι ι

! halbstarren, unlöslichen, flüssigkeitsdurchlässigen Körpers so

j behandelt werden, daß Enzyme mit dem Körper gekuppelt oder an den

i
Körper gebunden werden.

Wie allgemein bekannt ist, ist es möglich, Enzyme an unlösliches Stütz- oder Trägermaterial zu binden oder mit diesem laterial zu verknüpfen, indem das Enzym direkt an dem Träger adsorbiert oder das Enzym an dem Träger durch ein als Zwischengruppe dienendes Kupplungsmittel indirekt adsorbiert wird. Das bevorzugte mikroporöse Trägermaterial der Erfindung zeigt hauptsächlich aufgrund der dispergierten Kieselsäurefüllstoffkomponente, wie festgestellt worden ist, eine negative Selbstaufladung (net negative charge), wie durch erhebliche Adsorption von Proteinen daran bei pH-Werten unter dem isoelektrischen Punkt des adsorbierten Proteins nachgewiesen wird. Obwohl demnach eine direkte Adsorption von Enzymen an den dispergierten I'üllstoffteilchen in dem Material möglich ist, ist festgestellt worden, das die (direkte) Adsorptionswirkung von ungenügender Größe ist, um eine relativ schnelle Desorp-

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tion während des Gebrauchs und anschließend einen Verlust enzymatischer Wirksamkeit des zusammengesetzten Enzymsystems zu verhindern.

Bei Durchführung der Erfindung wird daher bevorzugt, das mikroporöse Material in einer solchen Weise zu behandeln, daß eine chemische Bindung zwischen dem katalytisch aktiven Enzym und dem unlöslichen mikroporösen Trägermaterial erhalten wird. In dem un~ behandelten Zustand fehlt dem mikroporösen Material die organisehe Funktionalität, die zur Bildung einer solchen chemischen Bindung gegenüber proteinhaltigen Substanzen erforderlich ist,

i
und daher kann irgendeine bekannte Technik zur Verleihung der erforderlichen Funktionalität dem mikroporösen Material angewendet werden, weil die Erfindung in ihrem breitesten Aspekt auf der Feststellung beruht, daß die Bindung von Enzymen an mikroporöses Ausgangsmaterial zu einem überlegenen zusammengesetzten System mit immobilisiertem Enzym führt» Die meisten bekannten Enzyme können durch kovalentes Binden oder Vernetzen freier Aminoreste oder -gruppen an dem Enzymolekül, die für die enzymatisch^ Wirksamkeit des Enzyms nicht wesentlich sind, an eine Trägermaterialoberfläche, die aliphatische primäre oder sekundäre Amin- oder Hydroxylgruppen oder -reste enthält, immobilisiert werden. Noch andere bekannte Enzyme können in ähnlicher Weise kovalent gebunden oder vernetzt werden an einer Trägermaterialoberfläche, und zwar über andere funktioneile Gruppe, wie z.B. Carboxyl, Isonitril, Aldehyd oder Keton oder ein Anion, um einige wenige Gruppen anzugeben. Unter dem hier benutzten Ausdruck "chemische Bindung" oder "chemisch gebunden" ist daher in allgemeiner Form eine Che

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mische Bindung zwischen dem katalytisch aktiven Protein oder Enzym und den funktionellen Gruppen oder Resten, die dem mikroporösen Ausgangsmaterial verliehen worden sind,- zu verstehen, und dieser Ausdruck ist nicht auf eine spezielle funktioneile Gruppe oder einen speziellen funktionellen. Rest oder ein spezielles Enzym beschränkt. ^:

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann dem mikroporösen Ausgangsmaterial aliphatische primäre Aminfunktionalität durch kovalentes Binden eines Brückenbildungsmittels in Form eines Organosilans, wie z,B_e gamma-Aminopropyltriäthoxysilan, direkt an die dispergierten Füllstoffteilchen in dem mikroporösen Material verliehen werden, während bei einer anderen alternativen i bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dem mikroporösen Mate- j rial aliphatische primäre Aminfunktionalität durch irreversible ^: Chemieadsorption eines Brückenbildungsmittel, wie z.B. Polyäthy-■ lenimin (PEl), direkt an den dispergierten Füllstoffteilchen in ι dem mikroporösen Material verliehen wird. Enzyme können dann ko- : valent gebunden oder vernetzt werden an dem chemisch modifizier-.

j ten mikroporösen Material und im spezielleren an den aliphati-I
sehen primären Amingruppen, die durch das erwähnte Brückenbildungs

mittel der Oberfläche des Materials verliehen worden sind,,

In dem Fall, in dem ein Brückenbildungsmittel, wie Z₀B₀ gamma- -Aminopropyltriäthoxysilan, verwendet wird, wird dieses, wie angenommen wird, hauptsächlich direkt an die hydrophilen anorganischen Füllstoffteilchen kovalent gebunden, welche in dem gesamten polymeren Bindemittelbestandteil des mikroporösen Materials dis-

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pergiert sind» Die Verwendung eines Silanbrückenbildungsmittels zum Binden oder Knüpfen von Enzymen an kieselsäurehaltigen Materialien ist bekannt und z.B₀ in der oben erwähnten US-Patentschrift 3 519 538, auf die hier Bezug genommen wird, beschriebene

In dem Fall, in dem ein Brückenbildungsmittel, wie z-.B, PoIyäthylenimin, verwendet wird, wird dieses, wie angenommen wird, mit den dispergierten hydrophilen anorganischen Füllstoffbestandteilen des mikroporösen Materials über starke Chemiadsorptionskräfte verknüpft oder verbundene Die Verwendung eines makromolekularen Polyelektrolyten oder Polyamine als Brückenbildungsmittel zum Binden oder Verknüpfen von Enzymen an die Oberflächen von kolloidalen Kieselsäureteilchen ist bekannt, wie z.B. aus den US-Patentschriften 3 796 634 und 3 741 871, auf die hier Bezug genommen wird.

In beiden Fällen wird das Enzym vorzugsweise mit dem Brückenbildungsmittel durch ein bifunktionelles elektrophiles Reagens, wie ζ_βΒ_β Glutaraldehyd oder Bisimidatester, vernetzt, so daß die erwünschte kovalente Bindung des Enzyms an die funktionellen Amin-'gruppen erzielt wird, welche den äußeren Oberflächen der hydrophilen Füllstoffteilchen, die vollständig in dem mikroporösen Stütz- oder Trägermaterial dispergiert sind, über das Brückenbildungsmittel verliehen worden sind.

Wenn ein Trägerstoffoberflächen-Adsorptionsbrückenbildungsmittel ZoB. in Form des oben erwähnten Polyäthylenimins ein Brückenbildungsmittel, das an die Trägermaterialoberfläche kovalent gebun-

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den ist, wie z_oB_e gamraa-Aminopropyltriäthoxysilan, verwendet wird,, kann die kovalente Bindung zwischen dem Enzym und dem Trägerstoff in einem Einstufen- oder Zweistufenverfahrensschritt gebildet werden. Bei dem Einstufenverfahrensschritt kann das chemisch modi-; fizierte Trägermaterial gleichzeitig mit dem bifunktioneilen elektrophilen Reagens und dem Enzym behandelt werden, um gleichzeitig eine intermolekulare Vernetzung der reaktionsfähigen Trägermaterialoberfläche des Polymerisats und des Enzyms zu erreichen. G-lutaraldehyd vom industriellen Reinheitsgrad, ein typisch bifunktionelles Reagens, wie oben angegeben ist, enthält erhebliche Mengen löslicher polymerer Verbindungen, die durch intermolekulare Aldolkondensationen des monomeren Dialdehyds gebildet worden sind. Jede Kondensationsstelle führt daher zu einem hoch reaktionsfähigen alpha,beta-ungesättigten Aldehydteil, der sehr schnell Additionsreaktionen vom Michaeltyp mit nucleophilen Gruppen, wie z_eB. aliphatischen Aminen oder anderen Gruppen, unterliegt, welche sich an der Oberfläche von Enzymen befinden. Außerdem können freie aliphatische Aldehydgruppen, die in dem Polymerisat mit reaktionsfähiger Trägermaterialoberfläche vorhanden sind, ebenfalls an den Vernetzungsreaktionen durch Vereinigung mit aliphatischen Aminogruppen des Trägermaterials oder Enzyms unter Bildung Schiffscher Basen teilnehmen. Obwohl der Grad, mit dem die erwünschte kovalente Bindung des Enzyms mit solchen unerwünschten, unproduktiven Reaktionen konkurriert, welche zu einer einfachen Proteinmodifizierung und Vernetzung von reaktionsfähigen Gruppen an der Oberfläche des Trägerstoffs führen, durch Änderung der experimentellen Bedingungen, wie des pH-Werts, der

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Proteinkonzentration und der Konzentration des Vernetzungsmittels, empirisch bestimmt werden kann, ist es schwierig, solche unerwünschten konkurrierenden Reaktionen selektiv zu steuern, weil das Mfunktionelle Vernetzungsmittel immer in einem erheblichen molaren Überschuss während der Umsetzung vorhanden ist. In bestimmten Fällen kann daher die Anwendung des Einstufenverfahrensschritts zu einer teilweisen oder völligen Enzyminaktivierung aufgrund übermäßiger chemischer Kodifizierung des Enzyms oder chemischer Modifizierung wesentlicher aktiver Seitengruppen führen.

In Fällen, in denen eine übermäßige Enzyminaktivierung durch chemische Modifizierung erhalten wird, wird das Zweistufenverfahren angewendet, bei dem das chemisch modifizierte Trägermaterial zunächst mit dem bifunktionellen Reaktionsmittel vernetzt und dann mit dem Enzym vernetzt wird. Bei Anwendung einer geeignet hohen Konzentration von dem Vernetzungsmittel können bimolekulare Reaktionen der Oberflächenaminogruppen konkurrierend zu intramolekularen Umsetzungen, wie Vernetzungen, auftreten,, Dieses führt zu einer hohen Oberflächendichte von Seitengruppen, die mit nucleophilen Seitenkettengruppen von Enzymen reagieren können„ Nach Entfernung des überschüssigen unumgesetzten Vernetzungsmittels kann dann das Enzym mit dem modifizierten Trägermaterial umgesetzt werden, wobei eine kovalente Bindung zwischen Enzym und Trägermaterial erzielt wird. Es ist festgestellt worden, daß das vorstehende Zweistufenverfahren eine sehr geringe Modifizierung des Enzyms ergibt, weil nur Gruppen in der Nähe des Kontaktbereichs zwischen dem Enzym und der reaktionsfähigen Oberfläche

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des Trägermaterials reagieren.

Zahlreiche andere chemische Vorgänge oder Chemikalien als die oben erwähnten bifunktionellen Reagentien können zum kovalenten Binden von Enzymen an chemisch modifiziertes Trägermaterial angewendet werden. Dazu gehören ζ «3ο die Acylierung der aliphatischen Aminogruppe an der reaktionsfähigen Oberfläche des Trägermaterials mit Bernsteinsäureanhydrid unter Bildung einer aliphatischen Carboxylseitengruppe, die anschließend mit nucleophilen Seitenkettengruppen von Enzymen in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimide umgesetzt wird, die direkte Umsetzung der Aminogruppe ^; an der reaktionsfähigen Oberfläche des Trägermaterials mit Seiten- ] kettencarboxylgruppen von Enzymen in Gegenwart eines wasserlöslij chen Carbodiimids, die Acylierung der Aminogruppe an der reak-' ί tionsfähigen Oberfläche des Trägermaterials mit p-Eitrobenzoyl- ! chlorid, Reduktion der Arylnitrogruppe zu einer Arylamingruppe ■ mittels Natriumdithionit, Oxidation der Arylaminogruppe bu einem

Aryldiazoniumsalz mittels salpetriger Säure und nachfolgende Umsetzung mit aromatischen Seitenkettenresten von Proteinen zu einer beständigen Azobindung, sowie die Acylierung der Aminogruppe an der reaktionsfähigen Oberfläche des Trägermaterials mit Terephthaloylchlorid, Umsetzung der p-Benzoylsäurehalogenid-Seitengruppe mit Hydrazid zu einem Benzoylazid und schließlich Umsetzung mit nucleophilen Seitenkettengruppen von Enzymen.

Zur Umsetzung des Enzyms mit dem chemisch modifizierten Trägermaterial wird das Enzym vorzugsweise in eine Pufferlösung gebracht und die Umsetzung bei Temperaturen durchgeführt, die genü-

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gend niedrig sind, so daß eine Deaktivierung des Enzyms oder wesentliche Änderungen in dem Konfirmationszustand des Enzyms vermieden werden«, Im allgemeinen sind Temperaturen in dem Bereich · von etwa 5 bis etwa 5o°C geeignet. Es ist bekannt, den pH-Wert der Enzymreaktionslösung in der gewünschten weise durch Verwendung geeigneter Puffer, je nach dem speziellen zu bindenden Enzym, einzustellen. Gleichfalls können die Enzymkonzentration in der gepufferten Reaktionslösung und dementsprechend das Ausmaß, in dem das chemisch modifizierte Trägermaterial mit Enzymen beladen werden soll, je nach dem Umsetzungsgrad des Enzyms, der Konzentration des Substrats und der Eließgeschwindigkeit des Substrats durch den Reaktorkern gewählt werden.

Die Erfindung soll nun in den nachfolgenden Beispielen weiter beschrieben werden. Diese Beispiele dienen nur der Erläuterung der _; Erfindung und sollen die Erfindung nicht beschränken. ;

Beispiel 1 i Herstellung von unbehandeltem Enzymträgerkörper

Eine Bahn aus mikroporösem Material wurde hergestellt, indem zunächst 9fO8 kg Polyvinylchloridharz (Conoco 5385) mit einer Teilchengröße von etwa 177 Mikron und 18,16 kg präzipitiertes Kieselsäurehydrat (HiSiI 233) in einem Eischer geringer Scherkraft für Flüssigkeiten und festes Material (Petterson Kelley X für etwa 3 Minuten vermischt wurden. Dann wurden unter fortwährenden, Rühren 24,79 kg lösungsmittel (Cycloiiexanon) innerhalb von 2o Minuten mittels einer Pumpe zugegeben. Dann wurden 26,79 kg Wasser zu dem Gemisch in dem Mischer unter Rühren innerhalb von 2o Minuten zuge-

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geben, so daß ein feuchtes, beständiges, freifließendes Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde dann in einen Schraubenextruder mit einer Temperatur der Laufbuchse von etwa 49°C eingetragen, und das extrudierte Material wurde zwisehen die Walzen eines Kalanders geführt, um so eine im wesentlichen ebene Bahn mit einer Dicke von o,5 mm zu erhalten. Die Bahn wurde dann durch ein Ex- ; traktionswasserbad mit einer Temperatur von 77⁰C geleitet und anschließend in einem Warmluftofen bei 1o7°C für 6 Minuten getrocknet. Die fertige mikroporöse Bahn hatte eine relativ breite Porengrößenverteilung, die sich von etwa o",o1 bis etwa 1oo Mikron erstreckte, und einen mittleren Porendurchmesser in dem Bereich von etwa o,15 bis etwa o,25 Mikron, bestimmt nach" der Quecksilberintrusionsmethode. Außerdem betrug die Gesamtporosität dieses Materials etwa 65 Yolumenprozent und machte der Gehalt an dispergiertem Füllstoff (d_eh_e Kieselsäure) etwa 56 Gew_o-% aus. Flüssiges Wasser sank schnell in das Material ein, und zwar ohne Anwendung von Druck, was anzeigte, daß die Mikroporen im wesentlichen miteinander verbunden waren. Aus der erhaltenen im wesentlichen wölbungsfreien, halbstarren, mikroporösen Bahn wurden mehrere unbehandelte Trägerkörper in einer Größe von 5 x 5 cm geschnitten und durch Eintauchen in ein Dampfbad für eine Stunde wärmesterilisiert und dann nach dem Abkühlen an der offenen Luft getrocknet,

Beispiel 2

Chemische Modifizierung durch kovalente Bindung Ein nach dem Beispiel 1 hergestellter unbehandelter Trägerkörper wurde einer 1o%igen (Vol/Vol) wässrigen Lösung von gamma-Amino- propyltriäthoxysilan, die 1 % (Vol/Vol) konzentrierte HCl ent-

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hielt, 24 Stunden lang ausgesetzt. Der behandelte Trägerkörper wurde mit Wasser und 1 Mol/l NaCl gewaschen, um alle umgesetzten Chemikalien zu entfernen«, Das Vorhandensein von aliphatischen primären Aminogruppen wurde dann qualitativ bestimmt, indem der behandelte Körper mit o,5 % (Gew.-/VoI) Trinitrobenzolsulfonsäure in o,1 Mol Natriumtetraboratpuffer bei 21⁰C behandelt und ein intensiv oranges Trinitrophenylaminderivat an der Oberfläche des

behandelten Trägerkörpers festgestellt wurde. Ein anderer nach j
' dem Beispiel 1 hergestellter unbehandelter Trägerkörper wurde in

i ' ι

; gleicher Weise untersucht, doch zeigte sich bei diesem Test keine Reaktion,, Die Elementaranalyse des behandelten Trägerkörpers er-

; gab einen Stickstoffgehalt von o,5 %, bezogen auf das Trockenge- ; wicht, über dem des unbehandelten Trägerkörpers_e Die Beständig- j keit der Aminofunktional!tat an dem behandelten Trägerkörper ergabj sich daraus, daß nach dem Aufbewahren in V/asser für 1 2 Monate j praktisch kein Stickstoffverlust aufgetreten war. Der behandelte Trägerkörper zeigte identische Fließfähigkeiten wie der unbehandelte Trägerkörper und war gegenüber Änderungen der Puffer oder der Ionenstärke nicht empfindlich.

Beispiel 3 Chemische Modifizierung durch Chemiadsorption

Ein anderer nach dem Beispiel 1 hergestellter unbehandelter Trägerkörper wurde einer 5%igen (Gew./Vol) wässrigen Lösung von verzweigtkettigem Polyäthylenimin (PEI) mit einem Molekulargewicht von 5o ooo bei Raumtemperatur für eine Stunde ausgesetzte Das behandelte Trägermaterial wurde mit Wasser und 1 KoI NaCl zur Entfernung von etwa vorhandenem unadsorbiertem PEI gewaschen. Es

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wurde der gleiche Test wie in dem Beispiel 2 mit Trinitrobenzolsulfonsäure durchgeführt, und ein intensiv oranges Trinitrophenylaminderivat wurde an der Oberfläche des behandelten Trägerkörpers festgestellt, was das Vorhandensein einer wesentlichen aliphatischen Aminfunktionalität anzeigte Der Stickstoffgehalt des behandelten Trägerkörpers wurde durch Elementaranalyse quantitativ bestimmt und betrug 1,25 % Stickstoff, bezogen auf das Trockengewicht, gegenüber o,o2 % Stickstoff, bezogen auf das Trockengewicht, eines unbehandelten Trägerkörpers. Die Chemiadsorption von PEI an dem unbehandelten Trägerkörper erschien praktisch irreversibel, weil das PEI nicht entfernt werden konnte, wenn der Trägerkörper Lösungen mit.hoher Ionenkonzentration (z.B. 1 Mol HaCl oder 1 Mol Κ^ΗΡΟ,/ΚΗ^ΡΟ.) bei pH-Werten zwischen 3. und 9 ausgesetzt wurde«. Nur in dem Fall stark saurer Bedingungen ; (Eintragen in 1 Mol HCl für 2 Stunden) fand eine teilweise Desorp-i tion statt, die etwa 5o % des Stickstoffgehalts entsprach, wie durch Elementaranalyse festgestellt wurde₀ Der Oberflächenbereich des behandelten Trägermaterials betrug nach der Standard-BET- -Methode 55,4 m. /g gegenüber 81,1 m /g für die Kontrolle. Der mit ; PEI behandelte Trägerkörper zeigte identische Fließfähigkeiten :

wie ein unbehandelter Trägerkörper, unabhängig von dem verwen- j deten Puffer oder der angewendeten Ionenkonzentration.

Beispiel 4

Enzymku-p-plungsreaktion (Glucoseoxidase) j

Der nach dem Beispiel- 3 behandelte Trägerkörper wurde für eine |

Stunde einer 1 obigen (Vol/Vol) Lösung von Glutaraldehyd bei einem ! pH-Wert von 7 ausgesetzt. Der Trägerkörper wurde dann mit Wasser

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gewaschen und für eine stunde in eine Lösung von Glucoseoxidase eingetragen, welche aus Aspergillus niger gewonnen und bis zur Homogenität auf gereinigt worden war₀ .uDie Bedingungen waren folgende: Glucoseoxidase-Konzentration von 2o mg/ml in o,1 KoI KpHPO,/KHpIO,-Puff er mit einem pH-Wert von 6,0 bei Umgebungstemperatur, Ein direktes Puupen der Enzyiülösung durch den Trägerkörper unter einem positiven hydraulischen Druck verbesserte die Enzymaufnähme im Verhältnis zu der, die durch einfaches Aussetzen der Lösung (durch Inkubation) erzielt wuiae. Die temperatur bei der Kupplurigsrealition ist nicht wesentlich, wobei lediglich aas Erfordernis beachtet werden muß, daß die Temperatur nicht den V/ärmeaktivierungsbereich von 5o°C für Glucoseoxidase überschreitet. Der Trägerkörper wurde dann ausgiebig mit Wasser und 1 fcol KaCl gewaschen, um unumgesetztes Enzym zu entfernen, Elektroph.ile Rückstände auf der Oberfläche des Trägerkörpers wurden durch Behan- ] dein des zusammengesetzten Systems mit immobilisiertem Enzym mit ,0,1 Mol Äthonalamin bei einem pH-Wert von 7»ο mit einem Gehalt { an 5o mMol LIaCSBH, erreicht. Das immobilisierte Enzym schien eine ^j unbegrenzte Haltbarkeit bei einer Lagerung bei 4⁰C in o,1 Mol i KpHPO,-Puffer bei einem pH-Wert von 6,0 zu haben.

Beispiel 5 Ein-Enzymreaktor

Die folgende Reaktion wurde unter Verwendung eines Paars Scheiben | mit Durchmessern von 1,5 cm durchgeführt, die nach dem Beispiel 4 hergestellt worden waren und in geschichteter Anordnung in einem Durchflußreaktor angebracht war, in dem der Fließvektor des Substrats im wesentlichen senkrecht zu der Ebene jeder scheibe war.

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Der Querschnitt von jeder montierten Scheibe, der dem Flüssig-

2 keitsstrom gegenüber ausgesetzt war, betrug 79 mm « Glucoseoxidase

(E.C.1.1o3o4e) katalysiert die aerobe Oxidation von Glucose ß-D-Glucose + O^ ■■'■■ D-Gluconolacton + H^Op.

Die enzymatische Aktivität in dem Schichtscheibenreaktor wurde durch Ermittlung der Sauerstoffabnahme des nach unten fließenden

Stroms aus dem Reaktor mit einem biologischen Sauerstoff-Monitor, ;

Modell Hr. 53, erhalten von Yellow Springs Instrument Company, ^l

j gemessen. Eine Lösung von o,15 mMol Glucose bei anomerischem j Gleichgewicht in luftgesättigtem o,1 Mol Na-Acetat-Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 wurde durch den Reaktor mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute gepumpt. Die umwandlung des Meßsubstrats, ß-D-Glucose verlief quantitativ gemäß der Sauerstofferschöpfung im Abstrom des Reaktors. Die Verweildauer des Probenstroms im Kontakt mit dem Reaktor betrug etwa 1,6 Sekunden. Die integrierte Form der Geschwindigkeitsgleichung für Glucoseoxidase unter diesen experimentellen Bedingungen ist genau bekannt, und es kann berechnet werden, daß die untere Grenze für die Konzentration von immobilisiertem Enzym 1o mg/ml ist. Die ungewöhnliche hohe Aktivität des Schichtscheibenreaktors wird dem Fehlen von inneren Massentransporteffekten zugeschrieben, d.h., es wurde kein Anzeichen für Beschränkungen durch inneren Massentransport bei dem Reaktor festgestellt.

Ein zweiter Satz von geschichteten Scheiben wurde nach dem Beispiel 4 hergestellt und in einem Durchflußreaktor montiertj die Scheiben wurden jedoch mit wesentlich verringerter Konzentration

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von immobilisiertem Enzym hergestellt, d.h„ um einen Faktor von 1o_e Eine 1. mMol Glucoselösung in o,1 Mol Na-Acetat-Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 wurde dann durch den zweiten Scheibenreaktor mit Strömungsgeschwindigkeiten, die ausreichend schnell waren, so daß der Reaktor nach kinetischer Art arbeitete, gepumpt, wobei nur eine teilweise Umwandlung von Glucose in Gluconolacton stattfand. Es wurde festgestellt, daß der unter dieser Bedingung bestehende Grad der Substratumwandlung durch den Reaktor hochempfindlich gegenüber der Enzymkonzentration ist. Bei einer Beachtung im kontinuierlichen Betrieb für eine Zeitspanne von vier Stunden, wurde keine Änderung in dem bestehenden Umwandlungsgrad festgestellt, was anzeigt, daß aus dem Reaktor keine enzymatische Aktivität verloren gegangen ist.

Beispiel 6

Enzymatische Kupplungsreaktion (Alkoholdehydrogenase) Ein anderer nach dem Beispiel 3 behandelter Trägerkörper wurde für eine Stunde einer 1o%igen (Vol/Vol) wässrigen lösung von Glutaraldehyd mit einem pH-Wert von 7 ausgesetzt. Der Trägerkör-, per wurde dann mit Wasser gewaschen und für eine Stunde in eine Lösung von Alkoholdehydrogenase gebracht. Die Bedingungen der

!
Enzymkupplungsreaktion waren wie folgt: Alkoholdehydrogenasekon- ! zentration 5 mg/ml in o, 1 Mol K₂HPO./EHgPO.-Puffer, pH 6,o, entj haltend o,1 mMol EDTA und lo/uMol NADH (reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid) bei Umgebungstemperatur„ Der Trager körper wurde dann ausgiebig mit dem Puffer der Umsetzung und 1 EoI NaCl gewa-

ο

sehen, um unumgesetztes Enzym zu entfernen_e Unumgesetzte elektrophile Rückstände auf dem Trägerkörper wurden durch Behandlung des

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zusammengesetzten immobilisiertes Enzym enthaltenden Systems mit o,1 Mol Athanolamin mit einem pH-Wert von 7_}o enthaltend 5o mMol NaCnBH-,, entfernte Die Enzymbeladung· betrug 11 mg/g des Trägermaterials und wurde durch Kessung der Stickstoffzunähme auf dem Trägerkörper vor Entfernung der unumgesetzten elektrophilen Rückstände ermittelte

Alkoholdehydrogenase (EC 1.1.1.1) katalysiert die reversible Oxidation von primären Alkoholen gemäß der Gleichung

Alkohol + NAD® Aldehyd + NADH + H© \

■ Die enzymatische Aktivität in einem Schichtscheibenreaktor wurde ermittelt durch spektrophotometrisches Messen der Bildung von * NADH (34o nm) im Abstrom des Reaktors mit einem Durchfluß-Adsorp- j tionsfähigkeits-Monitor (Kodell UA-5, erhältlich von Instrumentation Specialities Co.). Eine einzelne 1,5-Cui-Scheibe mit dem ; immobilisierten Enzym wurde in einem Durchflußreaktor wie in dem ! Eeispiel 5 montierte Eine Lösung von 5o mMol Äthanol und o,5 mMol j NAD⁺ in o,1 Mol K₂HPO₄ZKH₂PO₄-PUffer, pH 7,4, enthaltend 1o,uMol

j EDTA wurde durch den Reaktor mit einer Stömungsgeschwindigkeit

von 1 ml/Minute gepumpt. Die berechnete "Umwandlung (im Gleichgewicht) für die Umsetzung unter diesen Bedingungen beträgt 16 % der Ausgangs-NAD -Konzentrationo Es wurde eine vollständige Gleich gewichtseinstellung beobachtet, was anzeigt, daß ein Kontakt von wenigen Millisekunden mit dem immobilisierten Enzym in dem Reaktor ausreicht, um die thermodynamische Grenze der Umsetzung zu erreichen. Um die Stabilität des immobilisierten Enzyms zu demonstrieren, wurde ein Satz von Bedingungen gewählt, bei dem der

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Reaktor für 24 Stunden auf kinetische Art und Weise "betrieben wurde. Weil die Umwandlung der Substrate zu Produkten äußerst empfindlich auf eine Erhaltung des ^Katalysators unter diesen Bedingungen reagiert, zeigt eine Abnahme des Umsetzungsgrads eine Einbusse an Enzym oder eine Inaktivierung des Enzyms an_o Die Bedingungen des Versuchs waren: 5 mlol Äthanol und 5o/UMol NAD⁺ in o,1 Mol K₂HPO₄/KH₂PO -Puffer, pH 7,0, enthaltend 1o/uMol EDEA. Diese lösung wurde durch den Reaktor mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/Minute für 24 Stunden unter fortwährender Messung und Aufzeichnung des Substratumwandlungsgrad gepumpt. Es wurde festgestellt, daß die Umwandlung konstant während dieser Dauer blieb, was eine vollständige Erhaltung des immobilisierten Systems anzeigte

Beispiel 7

"gandem"-Enzymreaktor

Ein Scheibenreaktorsystem mit drei verschiedenen zusammengesetzten Systemen mit immobilisiertem Enzym wurde zur Katalysierung ι der nachfolgenden Reaktionsfolge hergestellt:

: Sucrose +. H₂O ct~]>.Giucose + Fructose

; <X-D~Glucose , ,/0 -D-&lucose

/3-D~Glucose + O₂ ,. ζ «D-Gluconolacton + H₂O₂

: Die Glucoseoxidase war homogen und wurde aus Aspergillus niger : gewonnen, das Aldose- -epimeraseenzym (EC 5.1.3.3) wurde aus

Schweineniere gewonnen und hatte eine Reinheit von 2o % (Gew„/ i
■'· Gew_e), und die <£ -D-Er uc t of ur ano sidase (EC 3,2.1.26) wurde in

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hoher Reinheit aus Candida utilis gewonnen. Jedes der oben genannt ten Enzyme wurde kovalent immobilisiert an einem Paar von 1,5~cm- -Scheiben gemäß dem Verfahren des Beispiels 4 mit einer Enzymkonzentration von 2o mg/ml ο Die Reaktion zur Entfernung von Aldehyd wurde nicht angewendet. Die beiden Sätze aus drei Scheiben (von denen jede Scheibe in jedem Satz eines der drei Enzyme nach Kupplung und in der oben angegebenen Reihenfolge enthielt) wurden dann in dem Durchflußreaktor des Beispiels 5 schichtförmig angeordnet» Eine 1 mMol-Lösung aus ultrareiner Sucrose in o,o5 Mol ^! KpHPO., pH 6,o, mit Luft gesättigt bei 25°C» wurde dann durch den; Reaktor mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,2 ml/Minute ge- '

j pumpt. Die Umwandlung betrug gemäß Messung der Sauerstoffabnahme !

im Ablauf des Reaktors 1o % der- theoretischen Umsetzung, bezogen auf die bekannte Stöchiometrie der Gesamtreaktion, Die maximale

: Umwandlung, die erzielt werden konnte, war jedoch 25 %, weil gelöster Sauerstoff das begrenzende Substrat darstellt (25o/uMol)_o

j Unter den in diesem Beispiel angewendeten Bedingungen ist die Aldose-1-epimerase das Geschwindigkeitsbegrenzende Enzym, Bei langsameren Strömungsgeschwindigkeiten und dementsprechend längeren Verweilzeiten im Reaktor näherten sich die ermittelten Um-

\ Wandlungen 25 %·

j Beispiel 8

! Immobilisation von Glucoseisomerase aus mikroporösem üEräger- ! material

Glucoseisomerase (E.G. ) katalysiert die reversible

gegenseitige Umwandlung von β -D-Fructose in <yL -D-Glucose gemäß der folgenden Gleichungs

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- 3ο -

β-D-FrUc to se (B.C. ) _v d-D-Glucose

Tier Scheiben mit einem Durchmesser von 26 mm wurden aus einer Bahn aus mikroporösem Material (Beispiel 1) zugeschnitten und nach dem Beispiel 3 behandelt und schachtförmig in einem Standardmilliporenfilterhalter ohne Dichtung unter Bildung eines Durchflußreaktors angeordnete Die mit PEI beladenen Trägerscheiben wurden modifiziert, indem Glutaraldehyd /""1ο % (Gew./Vol) mit pH-Einstellung auf 8,o_7 durch den Reaktor im Umlauf aus einem 1oo-ml-Reservoir für eine Stunde gepumpt wurde« Der Trägerkörper wurde dann in-situ durch Pumpen von 5oo ml (etwa 1/2 Stunde) deionisiertes Wasser und 2oo ml Hepes-Puffer oder eines entsprechenden Puffers (d.h. 2 g/l HgSO₄·7Η₂0 und o,2 g/l CoSO₄/7H₂O, pH 7,o-7>5 in deionisiertem Wasser) durch den Reaktor gewaschen. Eine Lösung von Glucoseisomerase mit einem pH-Wert von 7,5 (3o ml enthaltend o,43 Einheiten/ml) wurde durch ein Milliporen-o,65-Mikron-Filter geleitet und durch den Scheibenreaktor für 1 Stunde bei Raumtemperatur zirkulieren gelassen. Der hier benutzte Ausdruck "Einheiten" bezieht sich auf Aktivitätseinheiten, und daunter ist die Enzymmenge zu verstehen, die die Umwandlung von 1 Mikromol ß~D-Fructose in^C-D-Clucose je Minute bei 25 C katalysiert. Der Reaktor wurde mit etwa 500 ml Hepes-Puffer gewaschen, bis kein Protein im Ablauf gefunden werden konnte. j : ias in diesem Beispiel immobilisierte Clucoseisomeraseenzym ! ! wurde als lyophilisiertes Ganzzellenhomogenisat aus Streptomyces j ; albus gewonnen (von Novo enzyme Corporation) und gereinigt durch j Isolierung von löslichem Protein und Fraktionierung mit Ammoniumsülfat (AmSO.). Obwohl die Fraktionierung zum Teil von der An- [

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fangsproteinkonzentration der bei der Proteinisolierungsstufe erhaltenen überstehenden Lösung abhängt, wird die Hauptglucoseaktivität im allgemeinen in dem ?o-85 % AmSO.-Pellet gefundene Die Proteinpellets, die den Hauptteil der Aktivität enthalten, werden in etwa 2o - 3o ml Hepes-Puffer gelöst und unter Verwendung von 4 Liter Puffer für 24· Stunden "bei 4°C unter Anwendung eines Standardeelluloseacetatdialyserohrs dialysiert. Obwohl die Enzymherstellung an diesem Punkt gewünschteufalls für eine Yer-. wendung bei der Immobilisation geeignet ist, kann das obige _; Enzymkonzentrat noch weiter nach Standardgelpermeationstechniken gereinigt werden₀ Der Proteinversuch mit der ablaufenden Spül-

j lösung wurde unter Anwendung der folgenden Reaktionsfolge durchgeführt:

A -D-ITruc to se -r-

GI

-D-Glucose

geschwindigkeitsbegrenzend b. (/,-D-Glucose l-D-Glucose

c. A -D-Glucose + 1/2 O

Gluco seoxidase schnell

■^D-Gluconolacton + 1/2 H₂O₂

^{2 H}2°

Wie oben erwähnt ist, katalysiert Glucoseisomerase die resersible Umwandlung von^D-Fructose in ei -D-Glucose. Bei 25°C hat die Gleichgewichtskonstante dieser Reaktion einen einheitlichen Mittelwert und führt zu einem annähernd 5o-5o Gemisch von β -D-Fructose und o£ -D-Glucose. Die spontane Epimerisation der ZwischenverbindungiZ-D-Glucose in/5-D-Glucose verläuft unter den YerSuchsbedingungen nicht genügend schnell, um eine Ansammlung .dieser Zwischenverbindung verhindern zu können, und daher wird

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Aldose-1-epimerase der Versuchsiοsung zugegeben, um die Umsetzung äieser Zwischenverbindung zu erleichtern.Bei-' dieser Umsetzung wird die aerobe {Glucoseoxi das e) Oxidation vonβ -B-Glueοse zu D^&ΊμοοηοIacton'in Gegenwart von Catalase ermittelt, wobei ein stöchiometrisehes Gesamtverhältnis von zwei Moleny^^D-Fructose je KoI Sauerstoff (O₂)gegeben ist. Biese Endreaktion wird mit-einem biologischen Sauer stoff monitor (wie ζ ,B-, YSI,- ; odell 33) aufgezeichnet. ■

Der Versuch wurde folgendermasse durchgeführt: In eine Reaktionszelle, die auf eine temperatur von 25 C eingestellt worden war, wurden 3 ml von 0,01-molarem Phosphatpuffer, pH 8, zugegeben, und mit einem Ehomasrührer mit einer Einstellung auf 5 wurde gerührte= Dann wurden 30 Mikroliter Sigma-Glucoseoxidase Typ Y, welche 10fach konzentriert war, und* 100 Mikroliter Aldose-1-epimerase T" hergestellt naciTlepedes und Chase ("Äldose-1-Epimerase fro-m Hog Eidney; Isolation and Evidence of Purity, Chemical Studies ans Inhibition Kinetics", S.L.Lapedes und A.M. - . Chase, Biochem, & Biophys, Res. Comm_o, J51, 967 (1963) oder auf entsprechende ¥eise_>-7zugegeben_oAnschließend wurden 10 Mikroliter Sigma-C-100 Catalase ( mit· einer Konzentration von 5 mg/ml) und 20 Mikroliter von 72%iger (4_f0-molarer) β-D-Fructose in die Zelle eingetragen. Nach dem Rühren der erhaltenen lösung für insgesamt 3 bis 5 Minuten wurde die Elektrode eines biologischen Sauerstoffmonitors (Modell 53 YSl) sorgfältig in die Zelle eingeführt, wobei sichergestellt wurde, daß keine luftblasen zurückblieben, welche z„B. der Elektrode, den Zellenwandungen oder dem unteren Ende des Rührstabs anhaften könnten» Bei dem Recorder

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des biologischen Sau er stoff monitors (Modell 53 Ϊ£>Ι), der mit einer Registrierstreifengeschwindigkeit von 1,27 cm je Minute arbeitete, wurde ein konstanter Kurveaverlauf ermöglicht, d„h„, eine lineare Grundlinie erhalten, lach Erhalt einer linearen Grundlinie wurden 100 Mikroliter.der Pufferlösung in die Reaktionszelle eingetragen, und es wurde wiederum ermöglicht, daß der Kurvenverlauf beim Recorder eine Linearität erreicht. Der Versuch verläuft linear bis 10 Mikromol 0_? je Minute, wenn auch im allgemeinen langsamere Geschwindigkeiten unter Benutzung einer gestreckten Skalenordnung an dem Sauerstoffmonitor angewendet werden. Keine Verschiebung in der Neigung der Recorder-Kurve zeigt das Fehlen von aktivem Enzym in der Pufferspüllösung an.

Eine Beladung von 0,7 Einheiten Glucoseisomerase je ml Reaktormatrix wurde berechnet unter Zugrundelegung des Aktivitätsverlusts der die Immobilisierung verwendeten Proteinlösung.

Beispiel 9

, Vergleich von mirkoporösem Trägermaterial mit Glas mit eingestellter Porengröße (CPG)

ί _

■ Glasteilchen mit einer Teilchengröße von 420 bis 177 Mikron und imit einer eingestellter Porengröße wurde von Electronucleonics

I-

!Corporation erhalten und nach Standardmethoden /"""Immobilized ^Enzymes: A Prototype Device for the Analysis of Glucose in Biologizal Fluids Employing Immobilized Glucose Oxidase", H.K.Wei- !bel u.a., Anal. Biochenu, jJ2, 502 (1973}/ chemisch modifiziert, jum kovalent gebundene, aliphatische Aminofunktionalität an den Außen- und Innenoberflächen davon einzuführen,, 2 g von dem aminomodifizierten CPG wurden entgast und in 100 ml Hepes-Puffer für

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eine halbe Stunde suspendiert "bzw· auf ge schlämmt. Die überstehende Lösung wurde von dem Bett abgesaugt, und die Teilchen wurden erneut in 1oo ml einer 1 obigen wässrigen Glutaraldehydlösung für 1 Stunde suspendiert. Die CPG-Teilchen wurden ausgiebig durch Suspendieren und Dekantieren gewaschen, bis der Geruch von Glutaraldehyd verschwunden war. 1ö ml der Enzymlösung, enthaltend o,43 Einheiten/ml, pH 7»5, wurden den Teilchen zugegeben und für 1 Stunde der Umsetzung überlassen. Ein 1,2-ml-Volumen von den Teilchen. wurde in eine schmale Säule (mit einem Durchmesser von o,6 cm) unter Bildung eines Füllbettreaktors eingetragen und mit Hepes- -Puffer gespült, bis kein Protein in der überstehenden Lösung festgestellt wurde (nach Bestimmung gemäß der Versuchstechnik des Beispiels 8). Unter Zugrundelegung des Aktivitätsverlusts der Reaktionslösung entsprach die Beladung o,66 Einheiten/ml (CPG hat ein Schüttgewicht von o,36 g/ml), was im wesentlichen der des !Trägermaterials mit immobilisiertem Enzym nach dem Beispiel 8 ent-

!sprach. Die relativen Volumen der Scheiben (Beispiel 8) und der IHillbettreaktoren lagen innerhalb von 2o % und betrugen 1,o und h,2 ml. Die Reaktoren wurden empirisch bewertet, indem der Umwandjlungsgrad einer 7,2 %igen (Gew./VoI) Pructoselösung (o,4 molar), pH 7fO, bei mehreren Strömungsgeschwindigkeiten in dem Hepes-Puffer gemessen wurde« Glucose wurde durch Verdünnen des Reaktqrablaufs (loofach) mit o,1 molarem Natriumacetat, pH 5,5, und Messen des Endpunkts des SauerstoffVerbrauchs in Gegenwart der betreffenden Enzyme gemessen« Die Analyse der Aktivität von immobili- '. sieitem Enzym wurde nach der gleichen Technik durchgeführt, wie sie für die Lösungen gemäß den Angaben in dem Beispiel 8 angewen-

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2839234

- 35 - :

det-wurde, mit der ■ Ausnähme_f daß die erste üiiisetzun-g schon stattgefunden hat und* '-man nur die- ^ -D~Glucosemenge!in dem ablaufeii"-de"n Strom des Reaktors zu messen braucht* Dementsprechendhat die Umsetzung ■ - " ^; " ' - ■ ' ' " - - ":■■-·■ ■ -■"■"-■-"

β -D-Fructose

£2

^-D-Glueose

in dem -Reaktor schon stattgefunden und wird mit einer .7, Fruetoselosung in Hepes-Püff er durchgeführt,. 3>ie analytische Reihenfolge für den ReaktoraTiLauf ist die gleiche, wie" die chungen "b, e und d der Reaktionsfolge bei der in dem obigen ,Bei- ; spiel 8 angegebenen Tersuchstechnik«

Die Tersuchsbedingungen zur Ermittlung des Wirkungsgrad dex* Um* Setzung von β -D-Fjnictose in ^-D-G-lucose in ^em Reaktorablauf sind folgendermaßen: In die Reaktionszelle, die in ein Grleichge-■ wichtszustaäd bei 25°C gebracht worden war., wurden 5 ml ilatriumacetatpuffer, pH 5,5, mit einer Pipette eingetragen und mit einem

Thomasrührer bei einer Einstellung von 5 gerührt. Dann wurden 60 Mikroliter Glueoseoxidase, 2oo Mikroliter Aldose-i-epimerase und 1o Mikroliter Catalase in die Zelle eingetragene Nach dem Rühren der erhaltenen Lösung für insgesamt 3 bis 5 Minuten wurde die Elektrode dea ISI-Sauerstoffmonitors sorgfältig in die Zelle eingeführt, so daß keine Luftblasen an den Oberflächen der Elektrode, der Zelle oder in der Lösung selbst zurückblieben. Bei dem Recorder des biologischen Sauerstoffmonitors (YSI), der mit einer Registrierstreifengeschwindigkeit von 1,27 cm je Minute arbeitete,· wurde eine Stabilisierung zu einer konstanten Grundlinie ermöglicht. Nach Erhalt einer linearen Grundlinie wurden 3o Mikroliter Reaktorablauf in die Reaktionszelle eingetragen, und es wurde

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wiederum eraiöglicht, daß die Kurve eine konstante Heizung erreichte. ' ' '

Die Ergebnisse der emoirischen Bewertung werden nachfolgend tabellenförmig angegeben, Die Immobilisations- u.nd die Reaktorversuche wurden parallel aia gleichen Tag durchgeführt, so daß ein direkter Vergleich gezogen werden konnte_β Per Wirkungsgrad von Jedem Reaktor war über eine Zeitdauer von 6 Stunden hinweg unverändert, wie durch die konstante gleichmäßige Umwandlung von Fructose in Glucose festgestellt wurde., wenn die beiden. Reaktoren in kinetischer Art betrieben wurden,

Füllbettreaktor ('"Volumen 1.2 rnlp .._.--.

Strömungsgesehwlndlffkeit % Umwandlung Verweildauer. , 1,5o ml/min ... σ, 38 % . . 0,92 rain o»69 ml/min ο,56:?ό 1,74 min o,2o ml/min 1,5ο % .. β,οο mi»

Scheibenreaktor (Volumen "Uo ml) ' " ;

0,75 ml/min . · o,81 % i,33min

0,37 .ml/min 1,3o % 2,72 min

o,18 ml/min 2,45 % 5,5ο min

Wie den vorstehenden Werten zu entnehmen ist, beträgt der Wirkungsgrad des Füllbettreaktors gleichbleibend nur βο bis 7o % des Wirkungsgrads der Schichtscheibenanlage, wenn die Verweilzeitspannen normiert werden. Dieses ist sehr überraschend im Hinblick auf Berechnungen, welche ergeben, daß die "Massenkonzentration" des Enzyms aus praktischen Gründen bei beiden Reaktoren gleich ist. Der Scheibenreaktor verblieb bei Raumtemperatur in G-egenwart der

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BAD ORIGINAL

- 57 -

Substratlösung 5 Tage. Die Transporteigenschaften des Reaktors waren danach unverändert, und die prozentuale Umwandlung betrug bei o,37 ml/min etwas mehr als 1,5o %_o

Beispiel 1o

Mikroporöses Trägermaterial mit wärmegehärteter Matrix TJm zu zeigen, daß die Matrix oder der Bindemittelbestandteii des mikroporösen Enzymträgermaterials der Erfindung nicht auf ein thermoplastisches polymeres Harz beschränkt ist, wurde eine Bahn aus mikroporösem Material durch gründliches Vermischen von 1oo Gewichtsteilen Naturkautschuk, 165,5 Teilen Kieselsäurehydrogel, '■_ 3,1 Teilen inerten Füllstoffs (Kautschukstaub), 39,ο Teilen Schwefel, o,8 Teilen Stearinsäure und o,8 Teilen Diphenylguanidin ' in einem Banbury-Mischer unter_:Bildung eines, homogenen Gemischs ! hergestellt. Die kalandrierte Bahn wurde auf eine Spule aufge- j wickelt und in einem Autoklaven für 35 Minuten bei 172⁰C und einem!

• Druck von to,85 atü vulkanisiert. Die vulkanisierte Bahn wurde dann unter Entfernung aller Feuchtigkeitsspuren luftgetrocknet„

■ Das erhaltene mikroporöse Material ist äußerst porös mit Mikroporen, deren Größe von etwa o,5 Mikron bis etwa 5 Mikron variiert,

: und mit einem mittleren Porendurchmesser von etwa 1,5 Mikron ge-

j maß Bestimmung nach der Quecksilberintrusionsmethode. Außerdem ; beträgt die Gesamtporosität dieses Materials etwa 56 Volumenproj ζent und macht der dispergierte Füllstoff (z„B_o Kieselsäure) etwa 26 Gewe-?o aus« Proben mit einem Durchmesser von 1,3 cm wurden aus der fertigen mikroporösen Bahn auf einer Presse ausgestanzt und zur Herstellung von Einscheibenreaktoren wie folgt verwendet:

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1. Reaktor Nr. 1 - Inkubation nur von Enzym

2. Reaktor Nr₀ 2 - Inkubation von Polyäthylenimin, Glutar

aldehyd und Enzym

Zum Vergleich, wurde ein dritter Einscheibenreaktor (Reaktor Hr. 3) hergestellt, indem eine Scheibe aus dem Material des Beispiels 1. mit einem Durchmesser von 1,3 cm gebildet wurde und Polyäthylenimin, Glutaraldehyd und Enzym inkubiert wurden.

Jede mikroporöse Reaktorscheibe (Nur Reaktoren Mr. 2 und 3), die zu der geeigneten Größe zugeschnitten worden war, wurde für 3o Minuten in.2o cm von 5%igem Polyäthylenimin unter häufigem Schütteln zur Entfernung.von Luftblasen eingetaucht. Die Teile wurden dann für 3o Minuten in einer.1-molaren Lösung von Natriumchlorid gewaschen, um Polyäthylenimin zu fixieren, und anschliessend gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, um das gesamte Natriumchlorid aus den Reaktorscheiben zu entfernen,, Dafür waren

j vier V/aschvorgänge erforderlich, jeder mit 5o ml für 1o Minuten» Die Reaktorscheiben wurden dann in 5o cm einer 1o%igen wässrigen Glutaraldehydlösung mit. einem pH-V/ert von 9 unter häufigem Bewegen, um ein gleichmäßiges Eindringen des Glutaraldehyds in die

] Scheiben sicherzustellen, eingetaucht. Iiach- der Inkubation von Glutaraldehyd wurden die Scheiben gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, wobei viermal mit je 5o ml V/aschwasser für 1o Minuten gewaschen wurde. Glucoseoxidase (I27o Einheiten/ml) wurie bis auf 5o/5o mit Phosphatpuffer (o,1 molar, pH 6) verdünnt,, Die erhaltene Lösung (5o cm ) wurde mit verdünnter Natronlauge auf einen pH-Wert von 6 eingestellt, und die Scheiben der Reaktoren

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1, 2 und 3 wurden für 3ο Minuten in diese Xösung eingetaucht. Nach der Inkubationsdauer von 3o Minuten wurden die Reaktor se Reiben entfernt und gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, um freies Enzym aus dem porösen Material-zu"entfernen, so daß nur das immobilisierte Enzym zurückbleibt«, ^:;

Jeder der obigen drei Reaktoren wurde auf seine Aktivität bezug— 'lieh der Umwandlung von JJ-D-Glue ο se in D-Glueoiiolaeton untersucht^ und die V/asserstoffperoxidkonzentration in dem Reaktorablauf wurde aufgezeiennet, Sie Substratlosung-"■:(- β -D-Glucose, O₉13 ^: millimalar in- o,.1 molarem Ealiumphosphatpuffer, pH -6} würde dureh ' die Reaktoren mit variierenden Strömungsgesenwindigkeitfin ge- ^: pumpt, und der iLMauf wurde anfgefangen und auf Wasserstoffi>er- |

■ oxid hin unter sucht * das .sich gemäß der Gleichung.· ^; . j 1/2 O₂ *

₂ * E₂D +/3-D-GlUeOSe . _fi ^ ₊

j In die Analysatorküvette werden 25 ml der Peroxidäselösung (1o mg/ 5 ml in Kaliumphospiiätpuffer _Λ pH .6) und 5o Mikr.oliter reduziertes- -0-Dianisidin-Itösung (2% in'Methanol) eingetragen* Die Küvette wird mit dem Reaktorablauf gefüllt, bewegt und auf die optische Dichte hin mit einem Spektrometer (Bausch & lomb Spectronic 2o) bei 460 Millimikron gegenüber einer Blindprobe untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse werden nachfolgend summarisch wiedergegeben..

Reaktor

Die kleinste Enzymaktivität wurde von diesem Reaktor gezeigt. Die vorhandene Aktivität wurde leicht durch Auswaschen entfernt, als

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BAD ORIGINAL

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die G-lucoselösung durch den Reaktor gepumpt wurde, was anzeigt, daß das Enzym nicht an das Kittel gebunden, sondern in den Poren enthalten war,

fi.eaktor

Dieser Reaktor zeigte eine gute Aktivität am ersten Tag und war weitgehend so aktiv wie die Kontrolle (Reaktor 3), wenn der Kie~ selsäuregehalt des Materials normaliert wurde» Bei einer'Strömungsgeschwindigkeit von o,5 cm /min durch einen Bereich mit einem Durchmesser von 1 cm zeigte die Scheibe eine Aktivität von o,65 Einheiten/g Material, Die Aktivität schien am zweiten Tag geringfügig abzufallen, doch wurde dieses nicht quantitativ bestimmt.

Reaktor Kr, 3

Dieser Reaktor zeigte eine gute Aktivität und behielt eine konstante Reaktionsgeschwindigkeit für beide fage_o Bei einer 5tömungsgeschwindigkeit von o,5 cm /min durch einen Bereich jiit einem. Durchmesser von 1 cm zeigte die Scheibe eine Aktivität von 1,8 ; Einheiten/g Material,

j Die Aktivität des Reaktors 2 war etwa halb so groß wie die des j ι Reaktors 3« Das I-'aterial des Reaktors 2 enthielt rund die Hälfte des Kieselsäurefüllstoffs des Reaktors 3- Dieses zeigt, daß der Füllstoffbestandteil (Kieselsäure) in dem mikroporösen Material das Hauptbindemittel für das immobilisierte Enzym darstellt, und nicht die umgebende Matrix, wie Z₀B. aus Hartkautschuk oder PoIyv inylchiοrid·

Bestimmte vorstehende Beispiele erläutern das immobilisierte En-

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zymsystem der Erfindung in Form eines sogenannten Schichtscheiben- oder Durchflußreaktorsο Viele andere Reaktorformen können jedoch angewendet werden. Z.B₀ kann das mikroporöse Ausgangsmaterial in die Form eines hohlen Rohrs gebracht werden und in der oben beschriebenen Weise behandelt werden, um katalytisch aktive Enzyme daran zu binden oder zu knüpfen. Ein Substrat kann dann zum Fließen in das Rohr an dem einen Ende gebracht und enzymatisch umgesetzt werden beim Durchfließen durch da=! Rohr und kontaktieren mit der Innenwand des Rohrs, wonach dann das erhaltene Produkt am anderen Ende des Rohrs zum Ausfließen gebracht werden kann_o

Gleichfalls können in Fällen, in denen das Substrat eine relativ hohe Viskosität hat, oder es aus anderen Gründen erwünscht ist, einen Reaktor beispielsweise vom Füllbettyp, Wirbelbettyp :der ^: Rührtanktyp anzuwenden, an Bahnen aus mikroporösem Ausgangsmaterial wie oben Enzyme gebunden und immobilisiert werden und dann die erhaltenen Bahnen zerschnitten ode;: in kleine Stücke mit praktisch irgendeiner geeigneten Größe zerteilt werden (wie z„B_o als Stücke, Körner, Perlen, Pulver usw.). Die erhaltenen zerteilten immobilisierten Enzymteilchen können dani. nach bekannten Anwendungstechniken, welche solche Formen von Trägermaterial mit immobilisiertem Enzym erfordern, eingesetzt werden.

Die Immobilisationsprinzipien der Erfindung sind auch auf andere proteinhaltige Substanzen als Enzyme anwendbar, wie z.B. auf Antikörper oder Antigene. Die Erfindung ist dementsprechend nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt.

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Claims (1)

1. - 42 Patentansprüche

   m} Unlösliches zusammengesetztes System, gekennzeichnet durch den Gehalt an einem mikroporösen Körper, der ein Bindemittel, viele feiriteilige Füllstoffteilchen, die in dem gesamten Bindemittel dispergiert sind, und eine proteinhaltige Substanz enthält, welche an mindestens einen Teil der in dem Bindemittel vollständig verteilten Füllstoffteilchen gebunden ist«,

   2o Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der mikroporöse Körper ein Netzwerk von im wesentlichen miteinander verbundenen Mikroporen enthält und die Größenverteilung der Mikroporen von etwa o,o1 Mikron bis etwa

   ^: 1oo Mikron, gemäß porosimetrischer Bestimmung mittels der Queck- : silberintrusionsmethode, reicht,

   3o Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 1, dadurch ■

   j gekennzeichnet, daß die dispergierten Füllstoffteilchen mindestens

   etwa 25 % des Gesamtgewichts des mikroporösen Eörpers ausmachen.

   4o Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die dispergierten Füllstoffteilchen kieselsäurehaltiges Material enthalten,,

   5. Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel Polyvinylchlorid enthält.

   6„ Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel Hartkautschuk enthält,

   7o Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinhaltige Substanz ein katalytisch

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   aktives Enzym ist_o

   80 Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das katalytisch aktive Enzym an mindestens einen Teil der dispergierten Füllstoffteilchen durch ein Zwischenbindemittel chemisch gebunden ist,

   9β Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Zwischenbindemittel an die Füllstoffteil- ■ chen kovalent gebunden ist und das katalytisch aktive Enzym an das Zwischenbindemittel kovalent gebunden oder mit diesem vernetzt! : ist» ;

   I00 Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 8, dadurch · ^: gekennzeichnet, daß das Zwischenbindemittel an der Oberfläche von ; ' mindestens einem Teil der dispergierten Füllstoffteilchen chemiad-

   sorbiert ist und das katalytisch aktive Enzym an das Zwischenbin- \ demittel kovalent gebunden oder mit diesem vernetzt ist» j

   11β Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Glucoseoxidase ist«

   j 12. Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Aldose-i-epimerase ist.

   13« Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß"das Enzym ^-D-Fructofuranosidase ist.

   14o Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Alkoholdehydrogenase ist.

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   15o Unlösliches zusammengesetztes System nach Anspruch 7, dadurcn gekennzeichnet, daß das Enzym Glucoseisomerase ist,

   16_β Verfahren zum Immobilisieren von proteinhaltigen Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen unlöslichen mikroporösen Trägerkörper herstellt, der ein Bindemittel und viele in dem gesamten Bindemittel dispergierte feinteilige Fülitoffteilchen enthält, und eine proteinhaltige Substanz an wenigstens einen Teil der vielen dispergierten Füllstoff teilchen bindet,,

   17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinhaltige Substanz ein katalytisch aktives Enzym ist„

   18, Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man das katalytisch aktive Enzym an die Oberfläche von den Füllstoffteilchen chemisch bindet, indem man den Trägerkörper mit einem Zwischenbindemittel unter Eildung organischer funktioneller Gruppen behandelt, die kovalent an die besagte Oberfläche gebunden sind, und den so behandelten Trägerkörper einer Lösung aussetzt, die das besagte Enzym enthält, und dadurch dieses Enzym an die organischen funktionellen Gruppen an der Oberfläche der Füllstoffteilchen kovalent bindet.

   19o Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man den behandelten Trägerkörper einem Vernetzungsmittel aussetzt, bevor man ihn der Enzymlösung aussetzt.

   2o„ Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man den behandelten Trägerkörper gleichzeitig der Enzymlösung und einem Vernetzungsmittel aussetzt.

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   21„ Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Zwischenbindemittel ein Organosilan ist«

   22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Organosilan gamma-Aminopropyltriäthoxysilan ist.

   23· Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man das katalytisch aktive Enzym an die Oberfläche der Füllstoffteilchen durch Behandeln des Trägerkörpers mit einem Zwischenbinde-

   - mittel unter Bildung organisch funktioneller Gruppen, die an den besagten Oberflächen chemiadsorbiert sind, und Aussetzen des behandelten Trägerkörpers einer das Enzym enthaltenden Lösung, so

   ; daß das Enzym an die organischen funktionellen Gruppen an der
   Oberfläche der Füllstoffteilchen kovalent gebunden werden, chemisch bindete

   24ο Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man den behandelten Trägerkörper einem Vernetzungsmittel vor dem Aussetzen der Enzymlösung aussetzte

   25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man den behandelten Trägerkörper gleichzeitig der Enzymlösung und
   einem Vernetzungsmittel aussetzt»

   26. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Zwischenbindemittel ein Polyelektrolyt ist.

   27o Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyelektrolyt Polyäthylenimin ist.

   28. Unlösliches zusammengesetztes System, dadurch gekennzeichnet,

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   daß es einen mikroporösen Kö'rpox enthält, welcher ein Bindemittel und viele in dem gesamten Bindemittel dispergierte feinteilige Füllstoffteilchen enthält und ein Netzwerk aus im wesentlichen miteinander verbundenen Mikroporen aufweist, sowie eine proteinhalt ige an mindestens einen Teil der Füllstoffteilchen gebundene proteinhaltige Substanz enthält, und daß mindestens ein Teil der Füllstoffteilchen, an die die proteinhaltige Substanz gebunden ist, in der Lage ist, ein Substrat in den miteinander verbundenen Mikroporen zu kontaktieren*

   29o Unlösliches zusammengesetztes System, dadurch gekennzeichnet, ^! daß die proteinhaltige Substanz ein katalytisch aktives Enzym ist„

   i

   . 3oo Verfahren zur Durchführung eines chemischen Verfahrens unter

   j enzymatischer Umsetzung eines Substrats, dadurch gekennzeichnet, daß man das Substrat mit einem unlöslichen mikroporösen Körper · mit daran gebundenen katalytisch aktiven Enzymen kontaktiert und j

   das Reaktionsprodukt gewinnt,

   31« Verfahren nach Anspruch 3o, dadurch gekennzeichnet, daß der mikroporöse Körper in Form eines" Seaktorkerns vorliegt, der eine Bahn mit einer vorbestimmten Dicke enthält, und man zur enzymatischen Umsetzung eines Substrats dieses durch die besagte Bahn leitet»

   32. Verfahren nach Anspruch 3o, dadurch gekennzeichnet, daß der mikroporöse Körper in Form eines Reaktorkerns vorliegt, der eine hohles Rohr mit einem Einlaßende und einem Auslaßende enthält, und man zur enzymatischen Umsetzung eines Substrats dieses durch

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   das Einlaßende einleitet, um die Innenoberfläche des Rohrs zu kontaktieren, und das Produkt durch das Auslaßende des liohrs gewinnt.

   33. Verfahren nach Anspruch 3o, dadurch gekennzeichnet, daß der mikroporöse Körper in Form vieler zerteilter Teilchen vorliegt, und man zur enzymatischen Umsetzung eines Substrats dieses mit vielen dieser zerteilten Teilchen kontaktiert.

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