DE2631909A1 - Mehrschichtige membran und ihre verwendung als synthetische haut - Google Patents
Mehrschichtige membran und ihre verwendung als synthetische hautInfo
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Description
Mehrschichtige Membran und ihre Verwendung als synthetische Haut
Die Erfindung betrifft Stoffe, die sich zur Verwendung als synthetische Haut eignen. ,----■ . - ■"."'
Berichte über Versuche, offene Wunden und starke Verbrennungen
zu bedecken, reichen bis zum Jahre 1500 vor Christi Geburt zurück; vgl. J.H. Breasted: "Edwin Smith, Surgical Papyrus",
Band 1, Verlag University of Chicago Press, Chicago, Illinois (1930), Seite 83. Obwohl seitdem umfangreiche Forschungen zur
Entwicklung eines brauchbaren Hautersatzes durchgeführt worden
sind, ist bis jetzt keine brauchbare Alternative für die Autoplastik entwickelt worden. Jedoch haben Beobachtungen, die «
aus den auf diesem Forschungsgebiet bereits durchgeführten Ar- ψ
beiten angesammelt wurden, zur Entwicklung einer Anzahl von Grundvorstellungen geführt, die auf den Aufbau eines Systems
zur Behandlung von offenen Wunden und Verbrennungen dritten Grades mit besserer Aussicht auf Erfolg angewandt werden körinen.
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λ L· V w I V V V
596 112 3,
Die bisherigen Versuche zur Lösung dieses Problems\ die angewandt
wurden, um einen Hautersatz zu entwickeln, können in vier grosse Kategorien eingeteilt werden, nämlich die Homoplastik,
modifizierte Hautxenotransplantationen, synthetische polymere Gebilde und regenerierte (reconstituted) Kollagenfilme
.
Die Anwendung der Homoplastik zur Behandlung -van massiven
Verbrennungen ist gegenwärtig eine übliche Methode. Als Quelle für das Hauttransplantat kann ein lebender Spender oder
Haut dienen, die von Leichen entnommen und in einer Hautbank aufbewahrt worden ist. Die Rechtfertigung für die Anwendung
der Homoplastik ist die Notwendigkeit, den Flüssigkeitsverlust zu vermindern, Infektionen zu verhindern und den Bereich der
Vernarbung zu verkleinern.
In Abwesenheit von eine Immunreaktion unterdrückenden Mitteln werden jedoch Homotransplantate immer abgestossen. Die Abstossung
erfolgt anscheinend in erster Linie auf dem Wege über die Hemmung der Gefässbildung in dem Transplantat, die den Beginn
der Immunreaktion begleitet; vgl. E.A. Guthy, J.B. Billotte, R.J.K. Koumans und J.F. Burke in "Research in Burns", Herausgeber
P. Matter, T.L. Barclay und Z. Konickova, Verlag Hans Huber, Stuttgart, 1971· Aus der Verwendung von eine Immunreaktion
unterdrückenden Mitteln, um die Abstoßung solcher Transplantate zu vermeiden, ergeben sich aber bekanntlich viele
Probleme.
Verschiedene Forscher haben Versuche unternommen, die Immunogenität
(die Immunreaktionen erzeugende Natur) von Homotransplantaten durch Organkulturmethoden zu regulieren. Nach einer
Anzahl von einander widersprechenden Berichten wurden die Ergebnisse einer endgültigen Untersuchung solcher Verfahren von
Ninnemann und Good veröffentlicht, die daraus den Schluss gezogen haben", dass die Modifizierung von Antigenen in KuItur-
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geweben bei diesen Versuchen nicht bewiesen worden war; vgl.
J.L. Ninnemann und R.A. Good, "Transplantation", 1&, 1 (1974).
Ein anderer Versuch, die Homoplastik anzuwenden, war die Untersuchung
der Möglichkeit der Modifizierung von tierischer Haut. Das 'Grundziel dieses Lösungsgedankens ist der Entzug derjenigen
Bestandteile aus der Haut, die die Bildung von Wirtsantikörpern hervorrufen.
Oliver und Mitarbeiter verfolgten diesen Gedanken, indem sie
Schweinehaut mit Trypsin behandelten, um zelluläres und nichtkollagenartiges
Material daraus zu entfernen; vgl. R.F. Oliver, R. A. Grant und CM. Kent, "Brit. J. Exp. Path.", 53, 5^0
(1972). Dies führte zu einem Transplantationsmaterial, das vorwiegend aus unlöslichem"Kollagen aus der ursprünglichen
Morphologie der Dermis bestand und ein zu vernachlässigendes Ausmaß an Antigenität aufwies. Das so erhaltene modifizierte
Hautkollagen wurde auf in voller Dicke ausgeschnittene Hautwunden des Schweins transplantiert und sein weiteres Schicksal
mit demjenigen von Autotransplantaten und Homotransplantaten aus unbehandelter Haut verglichen. Die Autotransplantate verhielten
sich normal, wie es zuvor von Henshaw und Miller beschrieben worden war; vgl. J.R. Henshaw und E.R. Miller,
"Arch. Surg.", 658 (1965). Die unbehandelten Homotransplantate
waren am 5. Tag abgestorben, wobei einkernige Zellen vorhanden waren, und hatten am 10. Tag an der Basis zu degenerieren be gönnen.
Am 20. Tag war die Abstoßung der Homotransplantate praktisch vollständig. Bei den behandelten Hautkollagen-Transplantaten
war der untere Teil des Transplantats am 5. Tag wieder mit Kapillaren und Bindegewebszellen ausgestattet, während
eine epidermische Wanderung durch das Transplantat hindurch
vor sich ging. Die basophile Lyse des Transplantatkollagens begann ungefähr am 5. Tag und war von der Bildung von Infiltrationsund
Granulationsgewebe begleitet, welches.das Kollagen in Gegenwart von vielkernigen Riesenzellen fortschreitend
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ersetzte. Am 20. Tag waren die Transplantate im wesentlichen durch Granulationsgewebe ersetzt und verhielten sich wie offene
Wunden. Hierdurch wird die Notwendigkeit der Erhöhung des Widerstandes von nativem Kollagen gegen Lyse unterstrichen.
Als Ergebnis dieser Untersuchungen verzeichneten Oliver und Mitarbeiter vier Anforderungen an ein erfolgreiches Transplantat:
1. Die Hautkollagenfasern sollen über einen langen Zeitraum
hinweg unverändert bleiben und dadurch einen wesentlichen Strukturrahmen für die Neubildung der Gefäss- und Zellelemente
des Gewebes bilden;
2. das Transplantat soll keine Premdkörperreaktion hervorrufen, die zur schliesslichen Zerstörung des Transplantats
führt, in dem sich frische Zellen gebildet haben;
3. das Transplantat soll ein für das Wachstum und die Entwicklung
normaler Epidermis geeignetes Hautbett bilden; und
4. das Transplantat soll die Bildung von Granulationsgewebe
unterdrücken.
Eine dritte Möglichkeit ist die Verwendung von synthetischen
polymeren Gebilden. Im Schrifttum gibt es zahlreiche Berichte über die Untersuchung der Eignung von polymeren Stoffen für
die verschiedensten biomedizinischen Anwendungszwecke, unter
anderem auch als Hautersatzstoffe und provisorische Wundverbände. In Anbetracht der Fähigkeit der Wissenschaftler auf
dem Gebiete der Polymeren, eine polymere Struktur an nahezu jede beliebige Kombination von physikalischen und chemischen
(aber bisher nur wenigen biologischen) Anforderungen anzupassen, ist dies nicht überraschend. Bei den Untersuchungen über
die Brauchbarkeit von Polymerfilmen als Hautersatz ist bisher
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eine beträchtliche Anzahl von geprüften Stoffen als untauglich
verworfen worden, man hat aber wertvolle Erkenntnisse über die an einen zufriedenstellenden Hautersatz zu stellenden Anforderungen
gewonnen. Zum Beispiel hat die Verwendung einer Samtstruktur zu einer verbesserten Haftfestigkeit an dem Gewebe
geführt, und durch die Entwicklung von Methoden zur Herstellung von sogenannten biologisch verträglichen Polymeren von
gesteuerter Porengrösse ist die Möglichkeit zur Synthese von Stoffen verbessert worden, die imstande sind, in dem Transplantat
Zellenwanderung und -fortpflanzung hervorzurufen;
vgl. C.W. Hall, D. Liotta, J.J. Chidoni, M.E. Debakey und
D,P-. Dressler, "J. Biomed. Mat. Res«,·1, 1_, 187 (1967) und
G.L. Wilkes und S.L. Samuels, 11J. Biomed. Mat. Res.", 7, 541
(1973). Ein anderer aussichtsreicher Gedanke war die Polymerisation von vernetzten Polymeren in Hydrogelform, um eine zusätzliche
Fähigkeit zur Anregung für das Einwachsen von Zellen und die Gefässbildung zur Verfügung zu stellen; vgl. J. Hubacek,
K. Kliment, J. Dusek und Hubacek, "J. Biomed. Mat. Res.", I-,
387 (1967). Die Verwendung von synthetischen Polymeren zum Ersatz
von Haut hat aber bisher nicht zur Lösung des Problems geführt, und zwar hauptsächlich wegen der Häufigkeit von Infektionen
und der Unfähigkeit der bisher untersuchten Stoffe, Gefäss- und Epithelbildung anzuregen..
Da der Hauptbestandteil von normaler Haut Kollagen ist, ware
ein logischer Lösungsgedanke für die Entwicklung eines Hautersatzes
die Untersuchung des Schicksals von regenerierten (reconstituted) Kollagengebilden nach ihrem Inberührungbringen
mit lebendem Gewebe.
Dieser Lösungsweg wurde von einer Anzahl von Forschern angewandt, deren allgemeines Arbeitsverfahren darin bestand, das
Kollagen aus Tieren zu extrahieren, es zu verschiedenen Graden zu reinigen, und es in Folien oder sonstige Gebilde überzuführen,
die als Wundverbände verwendet oder in lebendes Ge-
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webe implantiert wurden, um ihr Schicksal in vivo zu bestimmen. Frühere Arbeiten auf diesem Gebiet haben gezeigt, dass
Kollagen als solches eine chronische Entzündungsreaktion mit anscbliessender Resorption des Implantats hervorruft; vgl.
B.D. Pullinger und A. Pirie, »J. Path. Bact.», 34, 341 (1942).
Grillo und Gross konnten zeigen, dass die Resοrptionsgeschwindigkeit
von Kollagen sich durch gesteuerte Vernetzung mit Formaldehyd vermindern lässt. Sie konnten ferner zeigen, dass
die Immunreaktion auf Implantate aus regeneriertem Kollagen! minimal war; vgl. H.C. Grille und J. Gross, "J. Surg. Res.",
2, 69 (1962).
Enzymatisch modifiziertes Kollagen ist von Rubin und Stenzel hergestellt und ausgewertet worden, die gezeigt haben, dass
diese Behandlung nicht so viel zelluläre Reaktion hervorruft wie das unbehandelte Material. Die Erklärung für dieses unterschiedliche
Verhalten ist die, dass das verwendete Enzym (Proctase) die Telopeptide in wirksamer Weise aus dem Kollagenmolekül
entfernt, ohne die native Molekularstruktur zu zerstören;
vgl. A.L. Rubin und K.H. Stenzel in "Biomaterials" (Herausgeber L. Stark und G. Aggarwal), Verlag Plenum Press,.
New York (1969). Durch die Verwendung von regenerierten Kollagenfolien
sind die Probleme der Lyse, der Infektion und der Verhinderung des Einwachsens von Gewebe und der Gefässbildung,
die bei anderen Methoden auftritt, nicht gelöst worden.
Die Erfindung betrifft eine mehrschichtige Membran, die die für künstliche Haut erforderlichen Eigenschaften aufweist.
Eine erste Schicht ist nicht-immunogen, in Gegenwart von KÖrperflüssigkeiten
unlöslich und in Gegenwart von Körperenzymen nicht-abbaubar. Zu den für die erste Schicht bevorzugten Stoffen
gehören vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte, die durch inniges Inberührungbringen von Kollagen mit
einem Mucopolysaccharid und anschliessendes Vernetzen des da-
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bei entstehenden Produktes synthetisiert werden. Geeignetes Kollagen kann aus einer Anzahl von tierischen Quellen gewonnen
werden, und zu den geeigneten Mucopolysacchariden gehören z..B. Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Dermatansulfat,
Keratansulfat, Heparansulfat, Heparin und Hyaluronsäure.
Das Vernetzen kann auf chemischem Wege, durch Bestrahlung,
dehydrothermisch oder nach einem sonstigen geeigneten Verfahren erfolgen. Eine geeignete chemische Methode ist die Aldehydvernetzung;
jedoch sind andere chemische Vernetzungsmittel ebenso geeignet. Die dehydrothermische Vernetzung, die bevorzugt
wird, erfolgt durch Herabsetzung des Feuchtigkeitsgehalts der Verbundprodukte auf einen sehr niedrigen Wert,'ζ„B. indem
man das Verbundprodukt der Einwirkung von erhöhten Temperaturen
und Hochvakuum aussetzt. Die. dehydrothermische Vernetzung vermeidet die Notwendigkeit, Vernetzungsmittel zuzusetzen und
im Falle von toxischen Stoffen, wie Aldehyden, das nicht-umge-■ setzte Vernetzungsmittel nachträglich zu entfernen; durch dehydrothermische Vernetzung entstehen auch Verbundprodukte,
deren Mucopolysaccharidgehalt in einem weiteren Bereich liegt.
Es wird angenommen, dass die Produkte dieser Synthesen aus Kollagenmolekülen oder Kollagenfibrillen bestehen, an die lange
Mucopolysaccharidketten gebunden sind. Offenbar werden die Mucopolysaccharidketten durch das Vernetzen so fest an das
Kollagen gebunden, dass sie sich nicht eluieren oder anderweitig von ihnen trennen lassen. Mechanisch können diese Stoffe
als Analoge von faserverstärkten Verbundstoffen aufgefasst
werden, in denen das Kollagen die Faser und das Mucopolysaccharid die Einbettungsmasse bildet, weswegen diese Stoffe
hier auch als polymere Verbundprodukte bezeichnet werden.
Es wurde gefunden, dass vernetzte Verbundprodukte aus'Kollagen
und Mucopolysaccharid die vorteilhaften Eigenschaften des nativen Kollagens beibehalten. Ausserdem lassen sich solche
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Stoffe so synthetisieren, dass sie nicht-antigen sind, durch
Kollagenase und andere Enzyme nicht abgebaut werden und in Gegenwart von Körperflüssigkeiten unlöslich sind. Ferner können
solche Verbundprodukte so synthetisiert werden, dass sie die für künstliche Hauttransplantate und Wundverbände geeigneten
Bruchfestigkeiten, Bruchdehnungen und sonstigen mechanischen Eigenschaften aufweisen.
An die erste Schicht ist durch Haftbindung eine die Feuchtigkeit sdurchlässigkeit steuernde Schicht gebunden. Diese
Steuerungsschicht besteht aus einem nicht-toxischen Werkstoff, der der gesamten Membran eine Feuchtigkeitsdurchlässigkeit
(moisture flux) von etwa 0,1 bis 1 mg/cm /h verleiht, die ungefähr
der Feuchtigkeitsdurchlässigkeit von normaler Haut entspricht. Beispiele für Werkstoffe für die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht sind synthetische Polymere,
wie · Siliconharze, Polyacrylsäure- und Polymethacrylsäureester und deren Copolymere sowie Polyurethane.
Die hier beschriebenen Membranen erfüllen wegen ihrer besonderen Kombination von Schichten die Aufgaben von künstlicher
Haut oder Wundverbänden. Die Geschwindigkeiten des Körperfeuchtigkeitsverlustes und des Wärmeverlustes aus dem verletzten
Hautbereich werden so gesteuert, dass sie ähnliche Grossen wie bei -normaler Haut haben. Ausserdem wird durch diese Membranen
bakterielle Infektion vermieden und der Wundbereich gegen mechanischen Abrieb oder sonstige Abnutzung geschützt« Wesentlich
ist, dass Membranen, die mit einer ersten Schicht aus einem vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt
hergestellt sind, eine Schablone (template) für das Einwachsen und die Fortpflanzung (Vervielfältigung) von Zellen aus dem
unter dem verletzten. Hautbereich liegenden subkutanen Gewebe oder aus dem dem verletzten Hautbereich benachbarten Gewebe
der Epidermis, für das Einwachsen und die Fortpflanzung (Vervielfältigung) von Kapillaren und anderen mit darunterliegen-
~ P, —
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dem subkutanem Gewebe in Verbindung stehenden Blutgefässen oder von anderem, an'den Bereich der Verletzung angrenzendem
Gewebe und für die Entwicklung von neuem dermischem und epidermischem
Gewebe darstellt. Diese Membranen sind auch imstande, die Intensität, Richtung und Geschwindigkeit von Ko ntrakturen,
zu denen es im Verlaufe des Heilungsprozesses kommt, unter Kontrolle zu haltern
In der Zeichnung ist die mehrschichtige Membran gemäss der
Erfindung schematisch dargestellt.
Die mehrschichtigen Membranen gemäss der Erfindung bestehen aus mindestens zwei Schichten aus unterschiedlichen Werkstoffen.
Wie die Abbildung zeigt, ist eine erste Schicht 10 vorhanden. Da die Schicht 10 in unmittelbare Berührung mit dem
subkutanen Gewebe oder Wundbett kommt, muss sie drei wesentliche Merkmale aufweisen, nämlich Unlöslichkeit in Körperflüssigkeiten,
Unabbaubarkeit bei Berührung mit Körperenzymen und Nicht-Immunogenität. Diese mehrschichtigen Membranen weisen
ferner mindestens eine zusätzliche Schicht auf, deren Hauptaufgabe es ist, die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit der Gesamtmembran
zu steuern. Die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht 12 ist in der Abbildung als unmittelbar an
die erste Schicht gebunden dargestellt. Es muss -jedoch darauf hingewiesen werden, dass auf der Oberseite der Schicht 12
oder zwischen der ersten Schicht 10 und der die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernden Schicht 12 weitere Schichten hinzugefügt
werden können, sofern diese die wesentlichen Funktionen
dieser Schichten nicht stören.
Ausser den oben erwähnten wesentlichen Eigenschaften für die
erste Schicht gibt es noch andere Eigenschaften, die diese Schicht nach Möglichkeit aufweisen soll.
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Eine solche vorteilhafte Eigenschaft bezieht sich auf die Benetzungs-
und Haftfähigkeit. Es ist wünschenswert, dass die erste Schicht aus einem Werkstoff besteht, der anfänglich von
dem Wundbett benetzt ,wird und an ihm anhaftet,, Dieses sind
Vorbedingungen für die Vermeidung der Bildung von Lufteinschlüssen, die sich später zu Stellen des Bakterienwachstums
entwickeln können. Die sofortige Ausbildung einer massig star-,
ken Bindung zwischen dem Membrantransplantat und dem Wirtsgewebe
schützt das Transplantat gegen Verschiebung über dem Wundbett auf Grund von Scherkräften beim Verbinden und Heilen
und verhindert daher die Bildung von Lufteinschlüssen. Daher verwendet man vorzugsweise für die erste Schicht einen Werkstoff,
der schnell mit dem Wirtsgewebe eine Bindung bildet,
die eine Scherfestigkeit von mindestens etwa 0,7 kg/cm und
vorzugsweise von mindestens etwa 7 kg/cm aufweist.
Ferner ist es wünschenswert, dass die erste Schicht aus einem Stoff besteht, dessen mechanische Eigenschaften es der Membran
gestatten, sich der Wunde wie ein Textilstoff anzuschmiegen ("drape")» und der trotzdem bei der Verwendung nicht reisst„
Daher werden Werkstoffe mit einem Young'sehen Modul zwischen
etwa 7 und 70 kg/cm und einer Bruchfestigkeit von mindestens 7 kg/cm bevorzugt.
Die Epithelbildung an der Grenze zwischen dem Membrantransplantat und dem Gewebe der Epidermis führt zur Bildung einer
natürlichen Sperrschicht gegen Infektion. Eine solche Sperrschicht kann sich dadurch bilden, dass eine Epithelschicht
über oder durch das Transplantat vorrückt, wie es in der Abbildung dargestellt ist. Aus diesem Grunde ist es zweckmässig,
für die erste Schicht einen Werkstoff zu verwenden, der Epithelbildungsgeschwindigke'iten von mindestens etwa 0,1 mm
pro Tag ermöglicht.
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Die Infiltration des mehrschichtigen Transplantats mit Epithelzellen, Bindegewebszellen und anderen Zellen, wie es in
der Abbildung dargestellt ist, ist eine Voraussetzung dafür, dass das Transplantat als Schablone (template) für die Neubildung
von Hautgewebe wirkt. Daher werden Werkstoffe bevorzugt, die eine Infiltrationsgeschwindigkeit solcher Zellen von mindestens
etwa 0,1 nun pro Tag gestatten. Dies ermöglicht den Zellen, in 10 Tagen oder weniger die Hälfte der Dicke einer
Transplantatmembran mit einer typischen Dicke von 2 mm zu
durchsetzen.
Bevorzugte Werkstoffe für die erste Schicht sind vernetzte
Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte. Diese werden durch Inberührungbringen
von Kollagen mit einem Mucopolysaccharid und
anschliessendes Vernetzen des so erhaltenen Kollagen-Mucopolysaccharidprodukts
erhalten. .
Kollagen ist ein Hauptproteinbestandteil des Bindegewebes von Wirbeltieren und wirbellosen Tieren. Es kommt oft in Form
makroskopischer Fasern vor, die sich chemisch und mechanisch von den nicht aus Kollagen bestehenden Gewebekomponenten trennen
lassen. Es eignet sich Kollagen beliebiger Herkunft, das unlöslich oder in sauren, neutralen oder basischen wässrigen
Lösungen löslich ist, sowie die im Handel erhältlichen KoI-lagene.
Typisches Ausgangsgut zur Gewinnung von Kollagen sind Kalbsfell, Rinder-Achillessehne und Rinderknochen.
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Der Ausdruck "Mucopolysaccharid" bezeichnet hexosaminhaltige
Polysaccharide tierischen Ursprungs. Diese Klasse von Verbindungen
wird auch oft als "Glykosaminoglykane11 bezeichnet.
Chemisch sind Mucopolysaccharide in abwechselnder Reihenfolge aufgebaute Copolymere aus glykosidisch gebundenen Hexosaminresten, die sich in mehr oder weniger regelmässiger Weise entweder mit Hexuronsäureresten oder mit Hexoseresten abwechseln; vgl. "Carbohydrate Metabolism and its Disorders" von
K.S. Dodgson und A.G. Lloyd, herausgegeben von F. Dickens und Mitarbeitern, Band 1, Verlag Academic Press (1968).
Chemisch sind Mucopolysaccharide in abwechselnder Reihenfolge aufgebaute Copolymere aus glykosidisch gebundenen Hexosaminresten, die sich in mehr oder weniger regelmässiger Weise entweder mit Hexuronsäureresten oder mit Hexoseresten abwechseln; vgl. "Carbohydrate Metabolism and its Disorders" von
K.S. Dodgson und A.G. Lloyd, herausgegeben von F. Dickens und Mitarbeitern, Band 1, Verlag Academic Press (1968).
Einige der besser bekannten Mucopolysaccharide tierischen Ursprungs
entsprechen den folgenden Strukturformeln:
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112
CIbOK
Hyaluronsäure
Chondroitin-4-sul£at
Chondroitin-6-sulfat
Dermatansulfat
Keratansulfat
UOi
COOH
NHAo
OH
CH.OH
NHAe
OH
COOH
H.COSO»H
HO λ O.
HEPARIH
Heparansulfat
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Zur Herstellung, der hier beschriebenen Verbundprodukte eignen
sich auch andere Mucopolysaccharide, die der Fachmann entweder kennt oder durch Routineversuche ermitteln kann. Eine eingehendere
Beschreibung von Mucopolysacchariden findet sich in dem Werk "Polysaccharides" von G.O. Aspinall, Verlag Pergamon
Press, Oxford (1970).
Typische Ausgangsstoffe für Heparin sind Schweinedarm, Rinderlunge,
Rfhderleberkapsel. und Mäusefell.· Hyaluronsäure kann aus
Hahnenkamm und menschlicher Nabelschnur gewonnen werden, während Chondroitin-4-sulfat und Chondroitin-6-sulfat aus Rinderknorpel
und Haifischknorpel gewonnen werden können. Dermatansulfat und Heparansulfat können aus Schweineschleimhautgewebe
gewonnen werden, während Keratansulfat aus Rinderhornhaut gewonneil
werden kann. ■
Kollagen lässt sich mit einem Mucopolysaccharid in wässrigen.
Lösungen umsetzen, die sauer, basisch oder neutral sein können. Diese Reaktionen können bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
In typischer Weise werden geringe Mengen von Kollagen, z.B. 0,3 Gewichtsprozent, in verdünnter Essigsäure dispergiert
und die -Dispersion gründlich gerührt. Dann setzt man langsam, z.B. tropfenweise, das Polysaccharid zu der wässrigen Kollagendispersion
zu, was zur gemeinsamen Ausfällung von Kollagen" und Mucopolysaccharid führt. Der gemeinsam ausgefällte Niederschlag
ist eine verschlungene Masse von Kollagenfibrillen, die
mit Mucopolysaccharid überzogen sind, und ähnelt etwas einem Garnknäuel. Diese verschlungene Fasermasse .kann durch Homoge-.
nisieren in eine homogene Dispersion von feinen Fasern übergeführt werden, die dann abfiltriert und getrocknet werden. Gemeinsam
ausgefällte Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte sind von V. Podrazky, F.S. Steven, D.S. Jackson, JvB. Weiss und '■-■
S«J'e- Leibovich untersucht worden; vgl. "Biochim. Biophys.
Acta.", 229, 690 (1971).
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Obwohl das Reaktionsprodukt aus Kollagen und Mucopolysaccharid
aus dem wässrigen Medium, in dem es sich bildet, gemeinsam ausfällt, wurde gefunden, dass die Mucopolysaccharidkomponente
in anderen wässrigen Lösungen in Lösung gehen kann. Dies trifft besonders auf konzentriertere wässrige Salzlösungen,
wie Körperflüssigkeiten, zu. Es ist z.B. bekannt, dass gemeinsame Ausfällungen von Kollagen und Mucopolysaccharid in
0,01 molarer Kochsalzlösung unlöslich, in 0,1-molarer Kochsalzlösung
etwas löslich und in 0,4-molarer Kochsalzlösung recht löslich sind - die physiologische Konzentration beträgt
etwa 0,14-molar NaCl. Diese Reaktionsprodukte haben daher nur
eine begrenzte Unlöslichkeit und kommen als solche nicht für
die erste Schicht der als. synthetische Haut verwendbaren mehrschichtigen
Membranen in Betracht.
Während die oben beschriebene Mitfällungsmethode "bevorzugt wird, können Kollagen und Mucopolysaccharide auch in anderer
Weise umgesetzt werden. Das wesentliche Erfordernis ist, dass die beiden Stoffe unter solchen Bedingungen innig miteinander
in Berührung gebracht werden, dass sich die Mucopolysaccharide an die Kollagenketten binden können. Eine andere geeignete
Methode ist das Beschichten von Kollagen mit Mucopolysaccharid, indem man z.B. aus Kollagen hergestellte Erzeugnisse, wie
Blätter, Folien und Röhren, in eine Lösung des Mucopolysaccharide eintaucht. Eine geeignete Abänderung des letztgenannten
Verfahrens besteht darin, dass man zuerst ein Erzeugnis, wie ein Blatt, eine Folie oder eine Röhre, das aus einem
anderen Material als Kollagen, wie z.B. aus einem synthetischen, natürlichen oder modifizierten natürlichen Polymeren,
besteht, mit Kollagen beschichtet und das mit Kollagen beschichtete
Erzeugnis (Blatt, Folie, Röhre usw.) dann in die Mucopolysaccharidlösung eintaucht. Eine noch andere geeignete
Methode besteht darin, das-Kollagen mit den Mucopolysacchariden,
beide in Form von trockenem Pulver, innig zu mischen.
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Der Fachmann auf dem Gebiete der Herstellung von Folien, Filmen, Röhren und anderen Formkörpern nach Methoden, die in der
Kunststoff-, Elastomer- und Textilindustrie bekannt sind, versteht ohne weiteres,- dass-das, wie oben beschrieben, hergestellte
Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt sich nach diesen Methoden ebenfalls zu Folien,- Filmen, Röhren und sonstigen Formkörpern
verformen lässt. ' ·.
Um eine bedeutende Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegen die Kollagenresorption zu erzielen, müssen mindestens etwa 0,5 Gewichtsprozent
Mucopölysaccharid an die ,Kollagenketten gebunden sein. Die obere Grenze richtet sich nach den an dem Kollagen
für die Bindung des Mucopolysaccharids zur Verfugung stehenden Stellen. Für Verbundprodukte, bei denen das Mucopölysaccharid
Chondroitin-6-sulfat ist, sind Mucopolysaccharidgehalte von etwa 28 Gewichtsprozent erzielt worden; mit Hyaluronsäure andererseits
ist als" obere Grenze etwa.25 %■ erzielt worden.
Die Umsetzung mit den Mucopolysacchariden verleiht dem Kollagen auch eine weitere wertvolle Eigenschaft, nämlich die Unfähigkeit,
bei einem-Wirtstier eine Immunreaktion (Fremdkörperreaktion) hervorzurufen. Um Kollagen in ein Material überzuführen,
welches nach dem Implantieren nicht als Fremdkörper erkannt wird, muss das Kollagen mit mindestens etwa 1 Gewichtsprozent
Mucopölysaccharid umgesetzt werden.
Der Unlöslichkeitsgrad der Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte kann durch Vernetzung nach Wunsch erhöht werden. Allgemein
eignet sich für die Vernetzung dieser Verbundprodukte jede Verne'tzungsmethode, die sich auch zum Vernetzen von Kollagen
eignet. Durch die Vernetzung wird die Auflösung des Mucopolysaccharids in wässrigen Lösungen verhindert, wodurch diese
Stoffe für chirurgische Prothesen usw. geeignet werden.
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Die Vernetzung hat auch noch eine andere wichtige Aufgabe, indem sie die Widerstandsfähigkeit dieser Stoffe-gegen Resorption
erhöht. Die genaue Funktion der Vernetzung in dieser Beziehung ist noch nicht bekannt; es kann jedoch, sein, dass die Hucopolysaccharideinheiten
durch die Vernetzung fest an Stellen auf der Kollagenkette gebunden werden, die normalerweise von
Kollagenase angegriffen v/erden. . " . ' . .
Es wurde gefunden, dass die vernetzten Verbundprodukte ein MQ
(Zahlenmittel des Molekulargewichts zwischen Vernetzungsstellen)
zwischen etwa 800 und 60 000 aufweisen sollen. Stoffe mit
M -Werten unter etwa 800 oder über etwa 60 000 zeigen eine bedeutende
Verschlechterung ihrer mechanischen Eigenschaften. Verbundprodükte mit einem M_ zwischen etwa 5000 und 10 000 ha-
ben offenbar die beste Kombination von mechanischen Eigen- '
schäften und werden daher bevorzugt. ■'"·".
Die Vernetzung kann nach vielen Methoden erfolgen, die in die
allgemeinen Kategorien der chemischen Vernetzung, der Strahlung svernetzung und der dehydrothermischen Vernetzung fallen.
Ein Vorteil der meisten, hier in Betracht gezogenen Vernetzungsmethoden einschliesslich der Vernetzung durch Glutar- .
aldehyd und der dehydrothermischen Vernetzung ist der, dass dabei auch das Bakterienwachstum auf diesen Stoffen vernichtet
wird. Die Verbundprodukte werden also bei ihrer Vernetzung gleichzeitig sterilisiert. · .
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596 112 *
Eine geeignete chemische Vernetzungsmethode für Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte
ist die Aldehydvernetzung. Bei diesem Verfahren werden die Stoffe in wässriger .Lösung mit
Aldehyden behandelt, die als Vernetzungsmittel wirken. Geeignete Aldehyde sind z.B. Formaldehyd, Glutaraldehyd und
Glyoxal. Der bevorzugte Aldehyd ist Glutaraldehyd, weil er die gewünschte Vernetzungsdichte schneller liefert als andere
Aldehyde und ausserdem imstande ist, die Vernetzungsdichte auf einen verhältnismässig hohen Wert zu erhöhen.
Nicht-umgesetzte Aldehyde sollen aus den Kollagen-Mucopolysaccharidprodukten
entfernt werden, da restliche Aldehydmengen recht toxisch wirken. Wenn man die Verbundprodukte in Aldehydlösungen
taucht, kommt es, wie gefunden wurde, zum teilweisen Entzug der Polysaccharidkomponente durch Auflösung,
wodurch der Gehalt des Endprodukts an Polysaccharid vermindert wird.
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Andere geeignete chemische Methoden sind die Carbodiimidkupplung,
die Azidkupplung und die Diisocyanatvernetzung.
Die bevorzugte Yernetzungsmethode wird hier als dehydrothermisches
Verfahren bezeichnet. Bei der dehydrothermischen Vernetzung braucht kein besonderes Vernetzungsmittel zugesetzt zu
werden. Das Verfahren beruht auf dem Entzug eines grossen Prozentsatzes
des V/assers aus dem zu vernetzenden Produkt. Die Menge an Wasser, die entzogen werden muss, richtet sich nach
vielen Faktoren; allgemein muss jedoch eine ausreichende Menge Wasser entzogen werden, um die gewünschte Vernetzungsdichte zu
erreichen. So kann man das Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt der Einwirkung erhöhter Temperaturen und/oder von Vakuum unterwerfen,
bis der Feuchtigkeitsgehalt auf äusserst geringe Werte vermindert worden ist. Wenn kein Vakuum zu Hilfe genommen
wird, können Temperaturen über etwa 80° C und vorzugsweise über 90° C angewandt werden. Bei 23 C eignet sich ein. Vakuum
von mindestens etwa 10 mm Quecksilbersäule und vorzugsweise weniger als 10"* mm Quecksilbersäule. Erhöhte Temperatur und
Vakuum können auch gemeinsam angewandt v/erden, und dies ist
die vorteilhafteste und daher bevorzugte Methode. Bei einem
-5 ' " · . Vakuum von mindestens etwa 10 mm Quecksilbersäule" arbeitet
man vorzugsweise bei Temperaturen von mindestens etwa 35° C. Im allgemeinen werden die Stoffe der Einwirkung von erhöhten
Temperaturen und. Vakuum ausgesetzt, bis der gewünschte Grad von Unlöslichkeit erreicht ist. Je höher die. Temperatur ist, '
desto geringer ist das Vakuum, das' erforderlich ist, um eine gegebene Vernetzungsdichte zu erzielen,"und" umgekehrt. "■..·".'_
Ein .typisches ■Vernetzungsverfahren zur Erreichung eines In
zwischen etwa 5000 und 10 000 besteht darin, dass man das
Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt 24 Stunden der Einwirkung
einer Temperatur von 95° C und eines Vakuums von 0,01 mm-Hg unterwirft. Dieses dehydrothermische Vernetzungsverfahren
vermeidet gewisse Nachteile der Aldehydvernetzungs-
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methode und führt zur Bildung von Verbundprodukten, bei denen verhältnismässig grosse Mengen von Mucopolysaccharid fest an
die Kollagenkette gebunden sind.
Der Mechanismus, nach dem die dehydrotherinische Vernetzung
verläuft, ist noch nicht genau bekannt. Es kann sich um eine Amidkondensation handeln, an der £-Aminogruppen des Kollagens
und Carboxylgruppen des Mucopolysaccharids.beteiligt sind, es
kann sich um eine Veresterung handeln, an der Carboxylgruppen das Kollagens und Hydroxylgruppen des Mucopolysaccharids beteiligt"
sind, oder es kann sich um eine Veresterung der Carboxylgruppen des Mucopolysaccharids mit den Hydroxylgruppen des
Kollagens handeln. Möglicherweise finden alle drei Arten von Reaktionen zu einem gewissen Ausmaß statt. Eine genauere Beschreibung
der dehydro thermischen Vernetzung geben I.V. Yannas und A.V. Tobolsky in der Arbeit "Crosslinking of Gelatin by
Dehydration», »Nature», Band 215, Nr. 5100, Seite 509-510,
29. Juli 1967.
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Vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte sind im
einzelnen in der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung, betitelt: "Vernetztes Polymeres", entsprechend der USA-Patentanmeldung
Serial No. 596 111 vom 15. Juli 1975, beschrieben.
Vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte können
derart synthetisiert werden, dass sie alle Eigenschaften, die für die erste Schicht wesentlich sind, und ausserdem viele,
wenn nicht alle derjenigen Eigenschaften aufweisen, die für die erste Schicht erwünscht sind.
Die Immunogenität von, wie oben beschrieben, hergestellten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukten ist zu vernachlässigen,
was aus den nachstehend beschriebenen Implantationsund Transplantationsversuchen an Meerschweinchen hervorgeht.
Wenn diese Stoffe subkutan implantiert oder anstelle von Hauttransplantaten verwendet werden, verursachen sie in dem Wirtsgewebe eine gelinde Entzündungsreaktion, die sich in einigen
polymorphkernigen Leukozyten und Monozyten äussert. Typischerweise
werden Lymphozyten weder im Inneren dieser Implantate oder Transplantate noch in dem sie umgebenden Gewebe festgestellt.
Häufig ist beobachtet worden, dass eine Kollagenfasersynthese
an der Grenzfläche zwischen dem Implantat und dem Wirtsgewebe stattfindet, wobei es zur Bildung von Faserbrücken
zwischen den benachbarten Oberflächen und einer sich daraus ergebenden mechanischen Verankerung des Implantats an dem
Wirtsgewebe kommt. Die Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte besitzen daher nicht nur eine sehr schwache Immunogenität, sondern scheinen ausserdem Medien zu sein, die die Binde»
gewebszellenwanderung und Kollagensynthese begünstigen.
Um- ein Maß für die Widerstandsfähigkeit der Verbundprodükte
gegen enzymatischem Abbau in vitro zn- gewinnen9 wurde ein©
mechanochemische Methode angewandt. Nach dieser Methode wird das Verbundprodukt in Gegenwart einer Lösung von Kollagenase
bis zu einem bestimmten Grad gedehnt und die Entspannungsgeschwindigkeit
der auf das Material einwirkenden Kraft gemessen. Bei Verwendung von bakterieller Kollagenase wurde immer
eine Abnahme der Kraft mit der Zeit beobachtet. Die negative Steigung der linearen Kurve, die den Logarithmus der Kraft in
Abhängigkeit von der Zeit (1/*£ ) darstellt, dient als Maß für
die Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaues. Die Methode liefert Daten für Kollagenfasern, die mit anderen, durch subkutane
Implantation in Meerschweinchen erhaltenen bekannten Daten übereinstimmen; vgl. I.V. Yannas, J.F. Burke, C. Huang
und P.L. Gordon: "Correlation of In ViVo Collagen Degradation Rate With In Vivo Measurements","J, Biomed. Materials
Research", im Druck, 1975. Nach dieser Methode wurde gefunden, dass der enzymatische Abbau von Kollagen durch vernetzte Verbundprodukte,
bei denen das Mucopolysaccharid eine Sulfatgruppe enthält, stark gehemmt wird. Dieser Befund stimmt sehr
gut mit in vivo-Untersuchungen an Meerschweinchen überein.
Für die erste Schicht besonders bevorzugte Werkstoffe sind vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte, die etwa
6 bis 15 % sulfathaltiges Mucopolysaccharid enthalten und bis auf einen Mc-Wert zwischen etwa 5000 und 10 000 vernetzt
sind. Chondroitin-6-sulfat bildet besonders hervorragende
Verbundstoffe.
Wie oben erwähnt, enthalten die mehrschichtigen Membranen noch eine zweite Schicht, deren Hauptaufgabe es ist, die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit
der Gesamtmembran zu steuern, wie es in der Abbildung dargestellt ist.
Aus normaler, unverletzter menschlicher Haut (Unterarm) fliesst Feuchtigkeit mit Geschwindigkeiten Inder Grössenordnung
von-0,5 mg/cm /hj vgl« D. Spruit und K.E. Malten?
nDermatologicaw -, V52, 115· (1966). Nach dem Entfernen des
Stratum corneum (und möglicherweise eines Teils des Stratum
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granuTosum) durch "Abziehen" mit Klebband steigt der Feuehtigkeitsverlust
um das 100- bis 200-fache auf 60 bis 100 mg/cm /h
an. Dieser Wert ist der Verdampfungsgeschwindigkeit aus einer
freien Wasseroberfläche vergleichbar, die unter den obigen Bedingungen
gleichwertigen Versuchsbedingungen 85 mg/cm /h beträgt;
vgl, D. Spruit, "Dermatological, 141, 54 (1970).
Offensichtlich ist also das Stratum corneum die Hauptsperrschicht
der Haut gegen Wasserverlust, da ihre Entfernung zu einer Wasserverlustgeschwindigkeit führt, die nahezu elbeisso
gross ist wie diejenige von einer freien Wasseroberflache«. Der
Wirkungsgrad dieser Feuchtigkeitssperrschicht ist unabhängig von der Richtung der Wasserströmung? denn es wurde (iunter Verwendung
von -tritiumhaltigem Wasser) bewiesen, dass die Geschwindigkeit
des Durchdringens von flüssigem Wasser durch die
TJnterarinhaut 0,6 mg/cm /h beträgt, wenn das Wasser auf die
Aussenseite der Haut aufgebracht wird; vgl. A.M. Downes.,
T.M. Sweeney und A.G. Matoltsy, 11J. Invest. Derm.11, Jö, 230
(1967).
Zum Aufbau einer als künstliche Haut verwendbaren Membran muss
man sich bemühen» ein Material zu finden, das den gleichen
Feuchtigkeitsdurchlässigkeitswert hat wie normale Hauto Wenn
die normalen Durehlässigkeitsgeschwindigkeitswerte überschritten werden, wird, das Wirtsgewebe in der Nachbarschaft des
Transplantats sowie das Transplantat selbst dehydratisiert;
wenn andererseits viel geringere Durchlässigkeitsgeschwiiidigkeiten
vorherrschen, kann es zum Ödem kommen. Diese Erwägungen gelten natürlich nur unter Bedingungen des innigen Kontakts
zwischen Transplantat und Wirtsgewebe j sollten sich an der
Grenzfläche wesentliche Lufteinschlüsse bilden, so können bedeutende
Feuehtigkeitsmengen von dem Wirtsgewebe an die Atmosphäre
entweichen, ohne durch das Transplantat hindurchzugehen·
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Daher wird die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem Werkstoff hergestellt, der eine Feuchtigkeitsdurchlässigkeit
je Flächeneinheit der Gesamtmembran von mindestens etwa 0,1 bis 1 mg/cm /h ergibt. Vorzugsweise beträgt
die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit je Flächeneinheit etwa
• 2
0,3 bis 0,5 mg/cm /h, was ungefähr dem Bereich der Durchlässigkeit
menschlicher Unterarmhaut entspricht. Diese Werte erzielt man durch entsprechende Kombination von Dicke und Wasserdurchlässigkeit.
Die andere wesentliche Eigenschaft dieser Schicht ist die, dass sie nicht-toxisch sein muss. Der Werkstoff soll keine
toxischen Stoffe enthalten, die aus der Schicht in die mit dem mehrschichtigen Membrantransplantat in Berührung stehenden Gewebe
diffundieren oder aus der Schicht extrahiert werden können. Ferner soll der Werkstoff gegen den enzymatischen Abbau
oder sonstigen auf einer Berührung mit anderen Schichten der Membran oder mit Gewebe beruhenden Abbau widerstandsfähig
sein, der zur Bildung von Stoffen führen könnte, die für das benachbarte Gewebe toxisch sind.
Ebenso wie die erste Schicht soll auch die Schicht, die in
erster Linie die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuert, noch andere vorteilhafte Eigenschaften aufweisen. So ist es wünschenswert,
dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht an der nassen Oberfläche der ersten Schicht mit
einer Bindungsscherfestigkeit;von mindestens etwa 0,7 und vorzugsweise
etwa 7 kg/cm anhaftet. Ebenso ist es wünschenswert, dass sie einen Youngrsehen Modul im Bereich von etwa 7 bis
2 ■ ?
kg/cm , eine Bruchfestigkeit von etwa 7 bis 70 kg/cm und
eine Bruchdehnung von etwa 20 bis 100 % aufweist.
Ferner ist es vorteilhaft, wenn die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit
steuernde Schicht sterilisationsfähig ist, d.h. physikalischen oder chemischen Behandlungen unterworfen werden
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596 112 #Γ
kann, durch die Bakterien oder Bakteriensporen an der Oberfläche
abgetötet werden. Geeignete Sterilisierungsmethoden sind trockene Wärme, Einwirkung von Äthylenoxid·, Bestrahlung,
Eintauchen in Glutaraldehydlösung usw.
Es ist auch wünschenswert, dass der Werkstoff der die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit
steuernden Schicht, wenn er in flüssiger oder halbflüssiger Form auf die erste Schicht aufgetragen
wird, in die erste Schicht zu nicht mehr als etwa 20 Gewichtsprozent der fertigen, halbfesten oder festen gehärteten
Form der ersten Schicht eindringt Ein weiteres Eindringen ist schädlich, weil die Porosität der Kollagen-Mucopolysaccharidschicht
dadurch beträchtlich abnehmen und infolgedessen der Feuchtigkeitsdurchtritt durch die letztgenannte
Schicht und die sich in ihr abspielenden Wiederherstellungsvorgänge, wie das Einwachsen von Gewebe, Gefässbildung usw.,
behindert werden wurden.
Schliesslich ist es auch erwünscht, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit
steuernde Schicht Widerstandsfähigkeit gegen jeden Abbauproze.ss aufweist, der durch die Nähe oder
den Kontakt dieser Schicht mit angrenzenden Schichten oder Gewebe hervorgerufen wird und zu einer bedeutenden Beeinträchtigung
der oben erwähnten biologischen, mechanischen und chemischen Eigenschaften führen würde.
Gewisse synthetische polymere Stoffe genügen den wesentlichen und auch vielen der erwünschten Eigenschaften der die
Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernden Schicht. Zu diesen gehören Siliconpplymere, wie "Silastic Medical Adhesive"
(Dow Corning), ein Gemisch aus einem·Siliconpolymeren mit
endständigen Hydroxylgruppen und Methyltriäthoxysilan, das
unter dem Einfluss von Feuchtigkeit zu einer biegsamen, zähen Schicht erhärtet, die sehr gut an den Werkstoffen der ersten
Schicht, wie vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbund-
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produkten, anhaftet, Polyacrylsäure- oder Polymethacrylsäureester oder deren Copolymere, wie der aus einem Copolymerisat
aus Acrylsäureäthylester und Acrylsäure gebildete Acrylkautschuklatex, der auf den Werkstoffen der ersten Schicht einen
biegsamen Film bildet und Carboxylgruppen enthält, die mit den Hydroxylgruppen der vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte
unter Bildung starker Bindungen reagieren, Polyurethane, wie ein Reaktionsprodukt von überschüssigem
Toluylendiisocyanat mit einem Gemisch aus Diolen und Triolen,
welches ein reaktionsfreudiges, unter der Einwirkung von Feuchtigkeit
aushärtendes Prepolymeres darstellt, das imstande ist, auf vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukten
eine elastomere Schicht zu bilden, und das chemische Gruppen aufweist, die mit Aminogruppen oder Hydroxylgruppen solcher
Verbundprodukte reagieren. Der Fachmann ist imstande, durch Routineversuche andere Stoffe zu ermitteln, die sich als Werk-,
stoffe für die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht eignen.
Ein Siliconpolymeres wird für die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit
steuernde Schicht bevorzugt. Es ist als nicht-toxisches Produkt in einem sorgfältig gesteuerten medizinischen
Gütegrad erhältlich. Sein Fliessvermögen ist von thixotroper
Art, so dass es sich gleichmässig mit der Rakel auf die Oberfläche
der Schicht aus dem Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt mit einer gesteuerten Eindringtiefe in die letztgenannte
Schicht auftragen lässt. Die Härtung kann bei 100 % relativer Feuchte erfolgen, wodurch die Dehydratisierung der unteren,
aus dem Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt bestehenden Schicht und die Verformung des mehrschichtigen Gebildes verhindert wird. Das Siliconpolymere erhärtet durch Umsetzung
mit Hydroxylgruppen, und da die aus dem Kollagen-Mucopolysaccharid- Verbundprodukt bestehende Schicht Hydroxylgruppen
enthält, können sich genügend kovalente Bindungen zwischen den Schichten bilden, so dass -diese zufriedenstellend
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aneinander anhaften und kein Klebstoff erforderlich ist, um "
die Siliconpolymerschicht an die aus dem Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt
bestehende Schicht zu binden.
Mehrschichtige Membranen können auch unter Verwendung eines
unter der Einwirkung von Feuchtigkeit aushärtenden,Siliconelastomeren als Bindemittel zwischen der Kollagen-Mucopolysaccharidschicht
und einem anderen Material hergestellt werden. Durch Aufbringen eines dünnen (0,025 bis 0,05 mm dicken)
Films auf einen Film aus synthetischen Polymeren, wie den
segmentierten Polyurethanen, Methacrylsäurehydroxyäthylester oder anderen "Hydrogelen", Polyethylenterephthalat oder PoIytetrafluoräthylen,
oder aus modifizierten natürlichen Polymeren, wie Celluloseacetat, oder aus natürlichen Polymeren, wie
Elastin (dem faserförmigen, unlöslichen, nicht-kollagenarti-"■
gen Protein, das in Bindegewebe, wie der Brustaorta und dem Nackenband,vorkommt), kann man ein mehrschichtiges Verbundprodukt
durch 16- bis 24-stündiges Aushärten bei Raumtemperatur und 100 % relativer Feuchte erhalten.
Wenn eine mechanische Verstärkung erwünscht ist, kann man eine - Schicht aus Gaze oder anderem Textilstoff oder Netzwerk
verwenden. Baumwolle oder ein sonstiges Textilnetzwerk kann als Verstärkungsmaterial eingelagert werden, indem man den
Textilstoff über das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt legt und über dem Textilnetzwerk auf die Oberfläche der
Kollagen-Mucopolysaccharidschicht mit der Rakel das llSilasticn-Silicon aufträgt. Durch Aushärten Übernacht (16 bis
24 Stunden) bei Raumtemperatur und 100 % relativer Feuchte kann man einen verstärkten Schichtstoff erhalten, der etwas
steifer ist als ein Schichtstoff ohne das Textilnetzwerk, aber eine wesentlich verbesserte Zugfestigkeit aufweist.
Die Dicke der synthetischen Haut steht zu den folgenden Parametern
in Beziehung: (1) der Dicke der zu ersetzenden Haut,
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596 112 J?
(2) der Art und den Abmessungen der Wunde, (3) der Dicke der
zur Steuerung der Feuchtigkeitsdurchlässigkeit erforderlichen. Deckschicht und (4) der Beziehung zwischen Nähbarkeit und
Dicke.
Im Falle von Meerschweinchenhaut von voller Dicke beträgt die mittlere Dicke der ausgeschnittenen Haut 0,64 bis 0,75 mm.
Schichtstoffe zum Ersatz von Meerschweinchenhaut weisen eine Schicht aus Kollagen-Chondroitin-6-sulfat von einer Dicke von
0,38 mm und eine Schicht aus dem Siliconpolymeren von einer Dicke von 0,13 mm auf., Diese Kombination liefert die gleiche
Feuchtigkeitsdurchtrittsgeschwindigkeit wie Meerschweinchenhaut und lässt sich bei Transplantationsversuchen leicht an
den Umfang des Wundbettes annähen.
Die niedrigste erreichbare Grenze der Dicke der Kollagen-Mucopolysaccharidschicht
hängt von der Teilchengrösse der Kollagen-Mucopolysaceharid-Verbundprodukte ab und liegt typischerweise
im Bereich von 0,04 bis 0,05 mm. Die obere Grenze der Dicke richtet sich nach der beabsichtigten Anwendungsart,
und in der Praxis sind unbegrenzt grosse Dicken verfügbar,
deren Grösse von der Menge der Dispersion abhängt, die auf einer gegebenen Filterfläche abfiltriert wird. Nach dem hier
beschriebenen Verfahren lassen sich Dicken von 2,5 bis 5 nun leicht erreichen; jedoch werden für die Anwendung als Hautersatz
Dicken im Bereich von 0,64 bis 2,5 mm bevorzugt.
Andererseits wird die Dicke der Deckschicht von der gewünschten Feuchtigkeitsdurchlässigkeit und Wasserdampfdurchlässigkeit
des Polymeren bestimmt, das zur Herstellung der Deckschicht verwendet wird. Im Falle von "Silastic Medical Grade11-Silicon
besteht eine typische mehrschichtige künstliche Haut von dem gewünschten Bereich der Feuchtigkeitsdurchlässigkeit
aus einem 0,13 mm dicken Siliconfilm, der auf eine 0,38 mm dicke Schicht aus Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt
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aufgetragen ist. Wenn man Polymere mit niedrigen Wasserdampfdurchtrittsgeschwindigkeiten
verwendet, muss die Dicke der
die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernden Schicht entsprechend verringert werden.
die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernden Schicht entsprechend verringert werden.
Die hier beschriebenen mehrschichtigen Membranen eignen sich als Verbände zur Behandlung von Brand-, Schnitt-, Riss-,
Schürfwunden und anderen ähnlichen Zuständen, bei denen Verletzung oder Zerstörung von Haut durch mechanische, thermische, chemische oder sonstige äussere Schädigung durch örtliche oder allgemeine Krankheiten gegeben ist. Die Membranen selbst können auch als künstliche Transplantate verwendet
werden, in welchem Falle sie die Funktionen von normaler Haut ersetzen und eine Schablone (template) für die Zellenregenerierung bilden.
Schürfwunden und anderen ähnlichen Zuständen, bei denen Verletzung oder Zerstörung von Haut durch mechanische, thermische, chemische oder sonstige äussere Schädigung durch örtliche oder allgemeine Krankheiten gegeben ist. Die Membranen selbst können auch als künstliche Transplantate verwendet
werden, in welchem Falle sie die Funktionen von normaler Haut ersetzen und eine Schablone (template) für die Zellenregenerierung bilden.
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Herstellung von Kollagendispersionen und Mucopolysaccharidlösungen
Das in diesem Beispiel verwendete Kollagen -wurde"hergestellt,
indem gekalkte Kalbshäute in Streifen von 9,5 mm Breite und dann zu dünnen Stücken zerschnitten wurden. Diese dünnen Hautstücke
wurden mit 3 Teilen Wasser behandelt, die 0,3 % Propionsäure
und 0,1 % Benzoesäure enthielten, iiach 4 Stunden
hatte sich ein Gleichgewicht eingestellt, und die Lösung hatte einen pH-Wert von ungefähr 5,3. Die Kollagenaufschlämmung wurde
von dem Wasser getrennt und mit Hilfe eines zentrifugal wirkenden Schneid- und Mahlgeräts zu Produkten von unterschiedlichen
Teilchengrössen und Strukturen vermählen. Die Kalbshautkollagenaufschlämmung (Gewichtsverhältnis von Wasser
zu Haut 1:1) hatte einen Gelatinegehalt von etwa 2 %. Ferner
enthielt sie 0,41 % Calcium und 0,041 % Magnesium. Physikalisch
bestand die Aufschlämmung aus hochgradig verschlungenen Fibrillenaggregaten.
Die Kalbshautkollagenaufschlämmung wurde durch wiederholte
Ausfällung aus einer trüben Dispersion in 0,05-molarer Essigsäure mit 0,2-molarer Mononatriumphosphatlösung (Na^PO^) gereinigt.
Nach dem Reinigen wurde das Kollagen in 0,05-molarer Essigsäure oder in einer Citronensäure-Pufferlösung von einem
pH-Wert von 3,2 (0,1-molare-Citronensäure, 0,2-molares Mononatriumphosphat)
dispergiert. Die Dispersion wurde gründlich in einem Waring-Mischer homogenisiert, bis die Extinktion
einer .0,3 g Kollagen je 100 ml enthaltenden Dispersion bei
440 mu, bestimmt mit einem Spektrophotometer (CoIeman Junior
■II A, Maywood, Illinois), 0,5 betrüg. Die so erhaltenen Kollagendispersionen
wurden bis zur Weiterverarbeitung bei 4 C gelagert . . . -
Mucopolysaccharidlösungen wurden aus Natriumheparin, Hyaluron-:
säure bzw. Chondroitin-6-sulfat hergestellt. Das Natrium-
$09885/0331
heparin, aus Schweinedarmschleimhaut'gewonnen, mit 143 U.S.P.-Aktivitätseinheiten
je mg wurde von Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois, erhalten. Die Hyaluronsäure wurde aus Hahnenkamm
nach der von D.A*. Swann in "Biochim. 3iophys. Acta",
136, 17 (1968),"beschriebenen Methode hergestellt. Die so erhaltene Hyaluronsäure enthielt 47,1 % Hexuronsäure und 42,6 %
Hexosamin. · ' ■
Chondroitin-4-sulfat aus Rindernasenknorpel wurde nach der
Methode hergestellt, die von L. Roden, J.R. Baker, J.A. Cifonelli und" M.B. Mathews in "Methods .of Enzymology",
herausgegeben von V. Ginshurg, Band 28B, Verlag Academic Press, New York, Seite 73ι beschriebenist. Heparansulfat und
Dermatansulfat wurden aus SchweineSchleimhautgewebe extrahiert
und nach den Methoden gereinigt, die von J.A. Cifonelli und
L. Roden in "Biochemical Preparations", JU2, 12 (1968),. beschrieben sind. . - .,-.
Chondroitin-6-sulfat, gewonnen aus Haifischknorpel - Gütegrad
B, wurde von Calbiochem, San Diego, California, erhalten.
Es enthielt 2,66 % Stickstoff * 37 »2 Si Glucuronsäure und 5,61 %
Feuchtigkeit. :
Heparin, Hyaluronsäure, Chondroitin-4-sulfat, Heparansulfat,
Dermatansulfat und Chondroitin-6-sulfat wurden in einer Konzentration
von 1 g je 100 ml in einer Citronensäure-Phosphatpufferlösung
(pH 3,2) gelöst. Die Mucopolysaccharidlösungen wurden bei 4° C aufbewahrt. . .
B^i spiel 2
Herstellung von gemeinsamen Niederschlägen aus Kollagen und
Heparin sowie aus Kollagen und Hyaluronsäure ■
Eine Dispersion von 0,3 g Kollagen je 100 ml 0,05-molarer
Essigsäure wurde bei .23Q C mit einem Polytetrafluoräthylenrüh-
609886-/
rer gründlich gerührt. Während des Mischens der Dispersion wurde
Heparin "bzw. Hyaluronsäure in einer Konzentration von 1 g je 100 ml 0,05-molarer Essigsäure aus einer Bürette mit einer
Geschwindigkeit von 0,1 ml/sec zugetropft. Beim Zusatz des
Mucopolysaccharids wurde das Kollagen in Form einer verschlungenen
Masse aus mit Mucopolysaccharid beschichteten Kollagenfibrillen mitgefällt, die einem Garnknäuel ähnelte. Sobald
90 Gewichtsprozent Kollagen mit 10 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid
in dieser Weise gemeinsam ausgefällt worden waren, zeigte eine systematische Massenbilanz, dass 95 $£ des ursprünglichen
Mucopolysaccharids mitgefällt worden waren.
Nach der gemeinsamen Ausfällung wurde die verschlungene Fi- . brillenmasse im'Waring-Mischer homogenisiert, bis die Fibril-·
len etwa -1 mm lang waren. Das Gemisch aus Fibrillen in
0,05-molarer Essigsäure trennte sich, wenn es langer als 5 Hinuten ruhig stehengelassen wurde, in zwei Phasen, weswegen es
vor dem Filtrieren gemischt werden musste. Die Kollagen-Mucopolysaccharid-Dispersion
wurde durch eine Nutsche, auf der sich ein Filterpapier von Schleicher und Schuell (Keene, New
Hampshire) Nr. 576 befand, abgesaugt. Der gemeinsame Niederschlag wurde unter atmosphärischen Bedingungen dehydratisieren
gelassen, bis der Feuchtigkeitsgehalt etwa 20 Gewichtsprozent betrug.
Herstellung von gemeinsamen Ausfällungen
von Kollagen und Chondroitin-6-sulfat " \
Eine Dispersion von 0,3 g Kollagen je 100 ml Citronensäure-Phosphatpufferlösung
(pH 3,2) wurde bei 23° C mit einer 1 g Chondroitin-6-sulfat je 100 ml Pufferlösung (pH 3,2) von 23° C
gemeinsam ausgefällt. Der Niederschlag wurde gemäss Beispiel 2
homogenisiert, filtriert und an der Atmosphäre trocknen gelassen. ...
- 32 - '
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Beispiel 4
Aldehydvernetzung eines Kollagen-Chondroitin-6-sulfat-Verbundprodukts
'
Die nach Beispiel 3 hergestellte gemeinsame Ausfällung von Kollagen-Chondroitin-6-sulfat wurde durch Eintauchen in "eine
0,02-molare Lösung von Glutaraldehyd vernetzt. Durch diese Behandlung
wurde ein Bruchteil der Polysaccharidkomponente auf den Kollagenfibrillen oder -molekülen immobilisiert. Die Vernetzung
machte sich daran bemerkbar, dass es nicht gelang, das Polysaccharid aus dem mit dem.Aldehyd behandelten Film
durch längeres Auswaschen mit einer Phosphatpufferlösung, die 0,4-molar an Natriumchlorid war und einen pH-Wert von 7,4 aufwies,
und die als Lösungsmittel für Chondroitin-6-sulfat bekannt ist, zu entfernen» Nicht-umgesetzter Aldehyd wurde durch
Behandeln mit einer Lösung von 5,5-Dimethylcyclohexandion-(1,3)
(Dimedon) entfernt. Nach dem Verdampfen des Wassers hinterblieb ein Film, der bis etwa 10 Gewichtsprozent Polysaccharid
enthielt. . - ■ ,
Beispiel 5 ■ " ...
Das Produkt des Beispiels 3 wurde in einem Vakuumofen 48 Stunden
der Einwirkung einer Temperatur von 115° C und eines Vakuums von mindestens 0,3 mm. Hg ausgesetzt. Nach dieser Behandlung
Hessen sich.weniger, als 10 Gewichtsprozent des ursprünglich
in den Film eingelagerten Polysaccharids durch 48-stündiges Eintauchen in destilliertes Wasser, welches als Lösungsmittel
für Chondroitin-6-sulfat bekannt ist, entfernen.
Beispiel 6 Hexosaminanalyse und Molekulargewicht zwischen
den Vernetzungsstellen ' - .
Da Mucopolysaccharide hexosaminhaltige Polymere sind, steht
der Hexosamingehalt in direkter Beziehung zu der Menge des je-
09 886/03
weiligen Mucopolysaccharide in einem Verbundprodukt. Sobald
erst einmal die Beziehung zwischen dem Hexosamingehalt und dem Gewicht für ein jedes Mucopolysaccharid festgestellt worden
ist, ist die Bestimmung einfach. Die Analyse ist im einzelnen in der Doktorarbeit von C. Huang, Meeh. Eng.. Dept., M.I.T.,
Cambridge, Massachusetts, Kapitel 3, 4 (1974), beschrieben. Die Methode kann folgendermaßen zusammengefasst werden:
Eine bekannte Gewichtsmenge des 48 Stunden bei 105 C im Va- kuum
getrockneten Verbundprodukts wird in eine'5 ml fassende
Ampulle eingebracht und mit 1 ml 8-molarer Salzsäure versetzt.
Die Ampulle wird evakuiert, dann mit Stickstoff gespült und unter Vakuum zugeschmolzen. Die Hydrolyse beginnt,
wenn die Ampulle in einen Ofen mit Luftumlauf bei 95° C eingesetzt wird. Nach 4-stündigem Verweilen bei 95° C wird die Ampulle
mit Leitungswasser auf 10 C gekühlt. Dann wird der Inhalt bei 40 C zur Trockne eingedampft, bis nur noch trockenes
Hydrolysat hinterbleibt. Das Hydrolysat wird in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von etwa 50 bis 150 mg Mucopolysaccharid
je ml Wasser gelöst. 1 ml der Hydrolysatlösung wird
zu 1 ml einer 8-volumprozentigen Lösung von Acetylaceton in
1-molarer Natriumcarbonatlösung zugesetzt. Bei 1-stündigem
Erhitzen auf 95 C reagiert das in dem Hydrolysat enthaltene Hexosamin mit dem Acetylaceton in alkalischer Lösung unter
Bildung von Pyrrolderivaten. Nach dem Kühlen der Lösung auf 10° C. setzt man 5 ml 95-prozentiges Äthanol und 1 ml Ehrlichsches
Reagens [hergestellt durch Lösen von 1,33 g p-Dimethylaminobenzaldehyd
(DAB) in 50 ml 6-molarer Salzsäure und Zusatz von' 50 ml 95-prözentigem Äthanol] zu und mischt dann
gründlich. Die Reaktion zwischen dem DAB und den Pyrrolderivaten führt zur Bildung eines "Chromophors, welches dem Produkt
eine intensive rote Farbe verleiht. Nach 2-stündigem Stehenlassen der Mischung wird" die Extinktion bei 527 mu gegen
eine Reagens-Leerprobe mit Hilfe eines Coleman Junior II A-Spektrophotometers gemessen. Die Ergebnisse der Analyse werden
mit genormten Eichkurven für ein jedes Mucopolysaccharid verglichen.
_ 34 _
609886/0338
Die Ergebnisse der Hexosaminanalyse verschiedener vernetzter Kdllagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte, die nach den Verfahren
der vorhergehenden Beispiele hergestellt worden sind,
finden sich in Tabelle I. Der Mucopolysaccharidgehalt vor dem
Vernetzen betrug für jedes in Tabelle I aufgeführte Verbundprodukt etwa 10 ?6. Offenbar sind während des Vernetzens mit GIutaraldehyd
und beim nachfolgenden Waschen grosse Mengen an Mucopolysaccharid verlorengegangen. Dies bedeutet, dass die
Löslichkeit der unvernetzten Mucopolysaccharide in der wässrigen Glutaraldehydlösung, in die sie zum Zwecke der Vernetzung
eingetaucht v/erden, hoch ist. Bei der dehydrothermischen Vernetzung wurden nur höchstens 10 % Mucopolysaccharid ausgewaschen,
während bei der Vernetzung mit Glutaraldehyd bis zu 61 % ausgewaschen wurden.
Die mechanischen Eigenschaften der Verbundprodukte werden stark von der Anzahl der Vernetzungsstellen je Polymerkette
beeinflusst. Das Molekulargewicht zwischen Vernetzungsstellen (M0) ist umgekehrt proportional der Anzahl der Vernetzungsstellen je Volumeneinheit. Die Werte für M_ können durch Messen
des Spannungs-Dehnungsverhaltens der thermisch denaturierten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte bestimmt werden.
Diese Methode ist in dem Werk "The Physics of Rubber
Elasticity" von L.R.G. Treloar, 2.Auflage, Verlag Clarendon
Press,(1958), beschrieben. Eine Zusammenfassung der Versuchsergebnisse
für verschiedene Kollagen-Mucopolysaccharid^Verbundprodukte
findet sich in Tabelle I.
609886/0 338
Tabelle, I
Material Vernetzung % MPS
Material Vernetzung % MPS
Kollagen Kollagen-Η Kollagen-Η Kollagen-Η
Kollagen-Η Kollagen-CS-6 Kollagen-CS-6
Kollagen-HA Kollagen-HA
G | (24, | 7,4) | C) | 0,0 |
G | (24, | 3,2) | 5,7-1,2 | |
G | (48, | 7,4) | C) | 5,5-1,3 |
G | (24, | 3,2 | 4,oii,o | |
24, | 7.4) | C) | ||
D | (48, | 90° | 9,7±1,0 | |
G | (24, | 3,2) | 3,9^0,3 | |
D | (48,- | 90° | 9f6±1,1 | |
σ | (24, | 7,4) | 2,3^0,4 | |
D | (48, | 90° | 9,0^0,5 | |
'2631909 | - io so |
Mc C- | 500 |
1 | 400 |
9 | 200 |
. 1 | 800 |
1 | 800 |
2 | 800 |
6 | 200 |
1 | 200 |
2 | 500 |
2 |
G = Glutaraldehyd bei 23° C (Stunden, pH)
D = dehydrοthermisch (Stunden, Temperatur)
H = Heparin
CS-6 = Chondroitin-6-sulfat
HA = ■■ Hyaluronsäure
MPS = Mucopolysaccharid
Durch Beschichten von Kollagen mit Mucopolysacchariden
hergestellte Verbundprodukte
hergestellte Verbundprodukte
Es wurden Mucopolysaccharidlösungen durch Lösen von 40 mg des
betreffenden Mucopolysaccharids in 20 ml Citronensäure-Phosphatpuffer
(pH 3,2) hergestellt. Ein Stück einer unlöslichen
Kollagenfolie wurde dann zu jeder der Mucopolysaccharidlösungen zugesetzt und,das Ganze· auf einer konstanten Temperatur
von 37° C gehalten und 24 Stunden inkubieren gelassen.. Dann
wurde zu der Lösung Glutaraldehyd bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,025 Mol/l zugesetzt. Das Kollagen wurde weitere 24 Stunden in dieser Lösung belassen und dann in eine auf
einem pH-Wert von 7,4 gehaltene, 0,025-molare Lösung von GIu-
Kollagenfolie wurde dann zu jeder der Mucopolysaccharidlösungen zugesetzt und,das Ganze· auf einer konstanten Temperatur
von 37° C gehalten und 24 Stunden inkubieren gelassen.. Dann
wurde zu der Lösung Glutaraldehyd bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,025 Mol/l zugesetzt. Das Kollagen wurde weitere 24 Stunden in dieser Lösung belassen und dann in eine auf
einem pH-Wert von 7,4 gehaltene, 0,025-molare Lösung von GIu-
609886/0338
taraldehyd überführt. Die letztere Verfahrensstufe wurde durchgeführt,
um eine wirksame Vernetzung des Kollagens zu gewährleisten. Nach 24-stündigem Verbleiben in der Glutaraldehydlösung
wurden die Kollagenfasern zweimal mit destilliertem V/asser gesprült und in eine 0,2-gewichtspfozentige Lösung von
Dimedon überführt, um den Überschuss von nicht-umgesetztem Aldehyd zu entfernen. Nach weiterem 24-stündigem Verbleiben in
der Dimedonlösung wurden die Fasern fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 4 C in Citronensäure-Phosphatpufferlösung
bei einem pH-Wert von 7,4 aufgehoben. Die gewichtsprozentuale Menge von Mucopolysaccharid, die sich an das Kollagen
gebunden hatte, wurde durch Hexosaminanalyse bestimmt. Das Molekulargewicht M" '·. zwischen den Vernetzungsstellen wurde nach
dem von R.L.G. Treloar in "The Physics of Rubber. Elasticity",
2.Auflage, Clarendon Press (1958), beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle II.
Tabelle | II | .t. | |
Material % MPS (ίθ | ,5) . | ' 3 800 | |
Kollagen . O | 4 100" | ||
Kollagen-CS-6 11,3 | 4 000 | ||
Kollagen-CS-4 8,7 | 4 200 | ||
Kollagen-HA ' 8,2 | 3-90.0 | ||
Kollagen-DS - 8,2 | 3 800 | ||
Kollagen-H · 8,7 | ·;■■■ 3 800 | ||
Kollagen-KS 10,5 | = Dermatansulfat . | ||
CS-6 | = Choridroitin-6-sulfät | DS | = ·Heparin |
CS-4 | = Chondroitin-4-sulfat | H- | =.. Keratansulfat |
HA | = Hyaluronsäure | KS | |
MPS | = Mucopolysaccharid | ■"■·''- . | |
-37 -
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Beispiel 8
Enzymatischer Abbau von durch Beschichten von Kollagen mit Mucopolysaccharid hergestellten Verbundprodukten
Es wurde eine Untersuchung des enzymatisehen Abbaues von nach
Beispiel 7 durch Beschichten von Kollagenfasern mit Mucopolysaccharid hergestellten Verbuhdprodukten durchgeführt. Die mit
Mucopolysaccharid beschichteten Kollagenfolien wurden in Bandform in Gegenwart einer Lösung von Kollagenase -(40 Einheiten
je ml) um 4,0-0,5 % gedehnt-, und die auf das Band ausgeübte
Kraft als Funktion der Zeit registriert. Es wurde gefunden, dass die Kraft durch eine einzige negative Exponentialgrösse
der Zeit dargestellt v/erden kann und daher ein Diagramm der Abhängigkeit des Logarithmus der Kraft von der Zeil: eine gerade
Linie ergibt. Die Steigung der Geraden ergibt 1/τ,
einen Wert, der als Maß für die Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaues des Kollagens durch Kollagenase venvendet wird.
Die Ergebnisse finden sich in Tabelle III.
T a b e 1 1 e III
* | Λ/Κ χ 104 (-0,07) | |
Material | % MPS (ίο,5) | (min"1) |
Kollagen | 0 | 8,48 |
Kollagen-CS-6 | 11,3 . | 1,46 |
Kollagen-CS-4 | . 8,7 | 0,88 |
Kollagen-HA | 8,2 | . 5,38 |
Kollagen-DS | 8,2 | 0,90 |
Kollagen-H | 8,7 | 0,98 . |
Kollagen-KS | 10,5 | 1,10 |
- 38 -
60 9886/0338
Beispiel 9
Enzymatiseber Abbau von durch gemeinsame Ausfällung von
Kollagen und Chondroitin-6-sulfat hergestellten
Yerbundprodukten
Nach dem Verfahren des Beispiels 4 aus Kollagen und Chondroitin-6-sulfat hergestellte Verbundprodukte wurden auf
ihre Anfälligkeit für den Abbau durch Kollagenase untersucht. Hierbei wurde die im vorhergehenden Beispiel beschriebene Methode
mit dem Unterschied angewandt, dass der Dehnungsgrad 20-2 % betrug. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
. T a b e 1 le IV ·
% CS-6 (-0,2)
1,8
3,0
4,8
6,5
8,6 11,2 13,3
14,9 . 16,0
Beispiel 10 " - .
Mechanische Eigenschaften von vernetzten Kollagen- . - ■
Mucopolysaccharid-Verbundprodukten
Die mechanische Untersuchung erfolgte mit einem Instron-Zugfestigkeitsprüfgerät
unter Verwendung einer Belastungszelle vom Typ B. Von jedem zu untersuchenden Material wurden hanteiförmige Proben von 6,35 mm Breite und 0,25 mm Dicke hergestellt.
Das obere Ende einer jeden Probe wurde an der BeIa-
ν " ■
. ■ : \ ■ -'39. - - ■ ■-. ■;■■■·-.■■..
609886/0338 .
1/ε χ ίο2 (±ο,οο9) | |
Mr (±1000) | (min"1) |
15 000 | 0,255 |
14 000 | 0,149 |
12 000 | 0,153 |
13 000 | 0,093 |
11 000 | 0,084 |
9 000 | 0,049 |
10 000 | '- ' - 0,052 - ' " |
12 000 | 0,047 . |
11.000 | 0,064 |
14 000 | 0,067 |
stungszelle des Zugfestigkeitsprüfgerätes befestigt, während das untere Ende durch eine Klemmvorrichtung an der Gleitbacke
befestigt wurde. Die Dehnung der Probe wurde aus der Bewegung der Gleitbacke berechnet. Alle Messungen wurden bei konstanter
Dehnungsgeschwindigkeit von 50 %/mln unter Spannung bei
37° C in einer Citronensäure-Phosphatpufferlösung bei einem
pH-Wert von 7,4 durchgeführt.
Für jedes Material wurden aus der experimentellen Spannungs-Dehnungskurve
die Werte für die Kraft je Flächeneinheit beim Bruch oder die Bruchfestigkeit (U.T»S.), die Tangente an der
Spannungs-Dehnungskurve bei 1-prozentiger Dehnung (1 %-Tangentenmodul),
die Bruchdehnung (E.B.) und die zum Bruch erforderliche Arbeit (Brucharbeit) berechnet.
Die Ergebnisse finden sich in Tabelle V.
- 40 -
609886/0338
. Tabelle
Material · . | Vernetzung | (24, | 90 | 7, | 0O | % MPS | _ | 1 %,Tangen | ; .U.T.S., | E.-B. ,· | Bruch | A | 4 | |
Brust-Aorta | (48, | 90 | 3, | 0O | _ | 9200 | tenmodul ', | kg/cm | arbeit 2 |
5 | ||||
Kollagen | D | (0,25,· | 3, | 7,4) | 0,0 | 6500 ' | kg/cm | . 25,2 | .85 | |||||
Kollagen | D | (24, | 90 | 4 | 0,0 | 3800 | 3,5 ' · | .26,6*0,7 | 40*10 | |||||
Kollagen ' | G | (24, | 7, | 2) \ | ■ ο,ο | 1200 ' | .'16,45*3,5· | 36,75*4,55 | 45*5" | kg/cm -% | N3 CD |
|||
Kollagen | G | (48, | 3, | 2) | 0,0 | 9400 | . 35*4,55 .' | ' 23,4*3,57 | 15*2 | *10 % | CO | |||
Kollagen-H | G | (48, | 3, | 0C) | 5,7*1,2 | 6800 | 66,5*7 '. | 25,13*0,77 | 10*1 | 1470 | CD | |||
Kollagen-H | G | (24, | 7, | 4) | 5,7*1,2.. | 2800 | 126*14 | '9,1*1,4 | 23*2 | 616 | O CD |
|||
cn ο |
Kollagen-H | D | (24, | 90 | 2) | 9,7*1,0 | 1800 | 14,2*2,1 | 11,2*1,4 | 16*2 | 756 | |||
co OO , |
Kollagen-H · | G | (48, | 90 | 2) ■■ | 5,5*1,2· | 6800 | 33,25*4,9 | 30,1-2,8 | 35*1 ' | . 350 | |||
CO ' σ> *» |
Kollagen-CS-6 | . G | (24, | G . <=>■ Glutaraldehyd oei | 4) | 3,9*0,3 | 5500 | 21*0,7 | '26,6*3,5 | .14*3- | 133 | |||
ο ι | Kollagen-CS-6 | G | (48, | 0O | 3,7*0,3 | 2500 | 133*42 . | • 9,1*0,7 | 21*2 | 84 | ||||
CO | Kollagen-CS-6 | G | (48, | 0C):. | .3,5*0,3 | 1200 | . 24*8,4 | 6,44*2,8 | 16±2 | 77 | ||||
CO. . , ' GO |
Kollagen-CS-6."". | D | 230C. | 9,6*1,1 | 2500. | 15,8*0,7. | 9,31*2,1 | 11*3 | 371 | |||||
Kollagen-HA . ·. ' I |
D | 9,0*0,5 | (Stunden, pH) | 17,7*6,44 | 44,17*1,96 | 20*1 | 224 | |||||||
D β dehydrοthermisch (Stunden, Temperatur) . | 49*4,55 | 34,3*4,9 · | 20*1 | ' 77 | ||||||||||
MPS ss' Mucopolysaccharid | 30,1*2,8 | β Hyaluronsäure | 57, | |||||||||||
H · ■» Heparin | HA | 45, | ||||||||||||
■-■■'■■ .''.·.'· | CS-6 | 497 | ||||||||||||
'.,'.■ | U.T. | 266 | ||||||||||||
E.B. | ||||||||||||||
= Chondroitin-6-sul.fat | ||||||||||||||
S. = Bruchfestigkeit | ||||||||||||||
= Bruchdehnung | ||||||||||||||
Beispiel 11
Erhöhte Zähigkeit auf Grund der Einlagerung von Mucopolysacchariden
Ein Vergleich von Proben aus Kollagen und aus vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukten bei ähnlichem Vernetzungsgrad
führt zu der Schlussfolgerung, dass die Anwesenheit des Mucopolysaccharids- die Zähigkeit des Kollagens bedeu^-
tend erhöht. Beispielsweise ist die Brucharbeit für aus der vorhergehenden Tabelle ausgewählte Stoffe bei ähnlichen Vernetzungsdichten
in Tabelle VI angegeben.
Brucharbeit, •Material 'JiMPS " M„ kg/cm2-% ^1O %
Kollagen 0,0 1200 133 Kollagen-CS-6 9,6-1,1 1200 497
¥ie sich aus der Tabelle ergibt, wird durch die Einlagerung von etwa 10 Gewichtsprozent Chondroitin-6-sulfat in Kollagen
die Brucharbeit von 133 auf 4.97 kg/cm -% erhöht. Da die Bruch
arbeit bei einem M-Wert von etwa 6500 maximal ist, ist es
wahrscheinlich, dass ein Verbundprodukt aus Kollagen und"
Chondroitin-6-sulfat mit einem Mucopolysaccharidgehalt von •10 Gewichtsprozent und einem M_ von 6500 eine Bruchenergie
• 2
von mehr als etwa 770 kg/cm -%, der höchsten Bruchenergie auf
weisen könnte, die für reines Kollagen unter den Bedingungen dieser Versuche festgestellt worden ist.
42
"6 0"9.8 8 67 0 3" 3.8
B e i s ρ i e 1 12
Untersuchung der Yiider Standsfähigkeit gegen Resorption und
des Nichtauftretens von Fremdkörperreaktion gegen die
Verbundprodukte in vivo
In diesem Beispiel wurden vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharidraembranen,
die einerseits durch Beschichten von Kollagen mit je einem der Mucopolysaccharide gemäss Beispiel 7 und andererseits
durch gemeinsame Ausfällung von Kollagen mit je . einem der Mucopolysaccharide gemäss Beispiel 2 und 3 hergestellt
worden waren, subkutan in Meerschweinchen implantiert, wie nachstehend beschrieben.
Die Kollagen-Mucopolysaccharidmembranen waren durch das Vernetzungsverfahren sterilisiert worden. Das Eintauchen in ein'
Aldehydbad (und insbesondere ein Glutaraldehydbad) für eine
Zeitdauer von mehreren Stunden, wie in Beispiel 4 beschrieben, ist eine bekannte Methode zum chemischen Sterilisieren verschiedener Stoffe vor dem Implantieren oder sonstigen chirurgischen
Verfahren. Ferner ist bekannt,· dass die mehrstündige
Einwirkung von Temperaturen, über 100° C eine andere Methode
zum Sterilisieren von Stoffen ist, die implantiert oder anderweitig in der Chirurgie verwendet werden so.llen. Vfenn andererseits
die Stoffe längere Zeit vor dem Implantieren hergestellt
worden sind, sollen sie vorzugsweise unmittelbar vor dem Implantieren
durch 24-stündiges Eintauchen in ein Gemisch aus.' 70 % Isopropanol und 30 % Wasser bei 23° C desinfiziert werden.
Durch das Eintauchen in diese Flüssigkeit werden weder die Vernetzungsdichte noch andere wichtige Strukturmerkmale
der Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte geändert.
Die subkutane Implantation wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Weisse weibliche Hartley-Meerschweinchen- mit ".:
einem Gewicht von ungefähr 400 g wurden als Versuchstiere verwendet.
Über 7 Tage vor der Implantation hinweg wurde eine Gewichtsänderungsgeschichte für jedes Tier aufgenommen. Kurz vor
609886/0338
der Implantation wurde der Rücken eines Jeden Tieres mit einer elektrischen Haarschneidemaschine in einer Fläche von etwa
6 cm χ 5 cm geschoren, und lose Haarabfälle wurden sorgfältig
abgesaugt. Dann wurde das Tier durch Einwirkung eines Gemisches aus Sauerstoff und Halothan anästhesiert und sein Rücken
mit einem Gemisch aus 70 % Isopropanol und 30 % Wasser gewaschen.
.
Auf einer Seite des Rückens des Tieres wurde ein 2,5 cm langer Schnitt geführt. Der Schnitt wurde so ausgeführt, dass
zwischen der Dermis und' dem Panniculus carnosus eine Tasche
entstand. In-diese Tasche wurde die Probe so eingesetzt, dass
die ganze Probe flach in der Tasche lag. Dann wurde der Schnitt mit" Nylon-Nahtmaterial zugenäht. Um den Schnitt zu
schliessen, wurden etwa 5 bis 6 Stiche ausgeführt. Auf der anderen Seite des Rückens des Meerschweinchens "wurde das Verfahren
mit einer gleichen Probe wiederholt. Dann wurde die rechte. Seite für histologische Untersuchungen verwendet, während Proben
von der linken Seite nach dem Explantieren zur physikalisch-chemischen Kennzeichnung verwendet wurden.
Am 4., 10. bzw» 20. Tag nach der Implantation wurden die Tiere getötet, indem sie in einen Äther enthaltenden Exsikkator eingebracht
wurden. Sowohl von den linken als auch von den rech- "
ten Implantationsstellen wurden unter der subkutanen Schicht Gewebe quadrate von 3,8 cm χ 3,8 cm derart ausgeschnitten, dass
sie implantierten Proben in dem Gewebe verblieben. Das Gewebe
von der rechten Seite wurde in 10-prozentige Formalinlösung
eingelegt und dann, wie nachstehend beschrieben, für histologische Untersuchungen verwendet. Das Gewebe von der linken
Seite "wurde in 50 ml sterile Dulbeccosche Lösung eingetaucht, die einige Tropfen Chloroform (als Bactericid) enthielten,
und nicht langer als 24 Stunden vor der Entfernung der Probe
unter Kühlung gelagert. ■''.■■■
6 09886/0338
Das Entfernen der Probe in dem Gewebe erfolgte, indem das Ge-.
webe auf den Tisch eines schwach vergrössernden Mikroskops (das mit einer Kamera ausgerüstet war) gelegt und das subkutane
Gewebe derart von der Dermis abgezogen wurde, dass der. Zustand der Probe in dem Gewebe klar in dem Mikroskop untersucht
werden konnte. Dies wurde ermöglicht, indem zuerst ein Schnitt zwischen der Dermis und dem subkutanen Gewebe geführt
wurde und die beiden Teile dann vorsichtig mit einer Pinzette voneinander getrennt wurden. Bei Beobachtung im Mikroskop
konnten an dem Gewebe und der darin eingebetteten Probe Merkmale, wie die Bindung von Geweben an das implantierte Material,
festgestellt werden. Das Entfernen der Probe aus dem Gewebe erfolgte auf dem Mikroskoptisch mit Hilfe einer ,.Pinzette. :
Nachdem das Material aus dem Gewebe entfernt worden war, wurde es bei 4° C in Dulbeccoscher Lösung aufbewahrt, bis es zur Bestimmung
der folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften benötigt wurde: ...
1. Die bruchteilmässige (anteilige) Gewichtsänderung der Probe AW/Vi^. Dieser Viert wurde durch Bestimmung des Trockengewichts
der Proben (nach 48-stündigem Dehydratisieren bei 1.05° C unter einem Druck von 10 mm Hg) erhalten. Die anteilige
Gewichtsänderung wurde dann aus der Gleichung .
■ ¥Q - W,
berechnet, in der'VL das Trockengewicht der explantierten Pro
be und W. das Trockengewicht der Probe vor dem Implantieren
bedeutet (der letztgenannte ¥ert wurde unter Verwendung einer Kontrollprobe bestimmt). ; :,
2. Zugmodul E (in frfd/cxa. ). Dieser wurde nach der in Bei-.
spiel 10 beschriebenen Methode mit dem Unterschied erhalten, dass der Modul als die Steigung des geraden Teils der Spannungs-Dehnungskurve
bestimmt wurde. ■ ·
- Ht -
mischen wurde gemäss Beispiel 4 bestimmt.
3. Molekulargewicht M_ zwischen Vernetzungsstellen. Dieses
Die charakteristischen Eigenschaften von Kollagen-Mucopolysaccharidproben
unmittelbar vor der Implantation sowie am 4., 10. und 20. Tag nach der Implantation sind für Produkte,
die durch Beschichten von Kollagen mit verschiedenen Mucopolysacchariden vor der Vernetzung hergestellt worden sind,
in Tabelle VH und für Produkte, die durch gemeinsame. Ausfällung von Kollagen mit Mucopolysacchariden vor der Vernetzung
hergestellt worden sind, in Tabelle VIII angegeben.
- 46 -
60988670338
" · Tabelle VII
Durch Beschichten von Kollagen mit Mucopolysaccharide^
hergestellte Verbundprodukte.
Eigenschaften vor und nach, der Implantation. .
Vor der Eigen- · Implanta- Verweilzeit in vivo
schäften tion 4 Tage 10 Tage 20 Tage
(1) Kollagen
1 ίο, 04 -0,16^0,04 -0,15-0,04 -0,31-0,04
—9
■E X 1^2 3,3^,3 2,5^0,3 1,4±0,3 1,6^0,3
(dyn ·cm~ )
M, χ 103 3,8^0,5 6,6^0,5 6,1^0,5 8,6-0,5
(2) Kollagen-Hyaluronsäure .
Δ¥/¥± 0,00^0,04 -0,12^0,04 -0,30^0,04 -0,28^0,04
—9
E X 1°2 3,5^,3 2,3ίθ,3 1,8^0,3
(dyn-cm )
-0,9-0,3
M0XiO"*3 4,2^0,5 7,2±0f5 6,7^0,5. 8,5-0,5
(3) Kollage.n-Heparansulfat . .
Δ¥/¥± 0,00^0,04 . -0,06^0,04 +0,04^0,04 +0,38^0,04
—9 ·
E X 1°2 4*0-0i3 . 3,5-0,3 3,8io,5 3,6^0,5
(dyn«cm ) .
Mn x10"3 3,8Ϊ0,5 4,6ίθ,5 4,7^0,5 4,5-0,5
(4) Kollagen-Heparin
Δ¥/¥± 0,00^0,04-0,02^0,04 +0,08-0,04 +0,32-0,04
-9 ' ·■■■■."·
E X 1°2 4,2i0,3 3,9^0,3 4,2±0,3 4,3^0,3.
(dyn·cm )
Mc χ 10~3 ; 3,8^0,5 4,3-0,5 4,3^,5 3,6ίθ,5
609886/0338
- Fortsetzung der Tabelle VII -
Vor der Eigen- Implanta- Verweilzeit in vivo '
schäften tion 4 Tage 10 Tage 20 Tage
(5) Kollagen-Dermatansulfat .
Δν//¥± O,OO±O,.O4 -0,09-0,04 -0,05-0,04 +0,31-0,04
Δν//¥± O,OO±O,.O4 -0,09-0,04 -0,05-0,04 +0,31-0,04
E x 1°2 3,9-0,3 4,0^0,3 3,oio,3 3,1-0,3
(dyn«cm )
Kn x 10"3 4,0±0,5 4,9-0,5 5,3^0,5 5,2^0,5
(6) Kollagen-Chondroitin-6-sulfat
Δ%/¥± O,Ooio,O4 -0,02-0,04 -0,07-0,04 +0,40^0,04
Ξ X 1-2 4»oi°»3 3,βίο,3 3,2^0,3 3,3^0,3
(dyn«cm~ )
M„ χ 10~3 4,1^0,5 4,3^0,5 5,7^0,5 5,4^0,5
60 9 8 86/0338
Tabelle- VIII
Durch gemeinsames Ausfällen von Kollagen
mit Chondroitin-6-sulfat hergestellte Verbundprodukte;
Eigenschaften vor und nach der Implantation
mit Chondroitin-6-sulfat hergestellte Verbundprodukte;
Eigenschaften vor und nach der Implantation
Eigen- ' Implanta- Verweilzeit in vivo
schäften tion 4 Tage 10 Tage . 20 Tage
(T) Kollagen ·
1 0,00*0,02 -0,16*0,02 -0,52*0,02 -0,60-0,02
—8
E x 10_2 1,8*0,2. 1,3-0,2 ' 1,4*0,2 0,7*0,2
(dyn»cm~ )
■ M, χ 10"4 1,5-0,1 2,4*0,1. 3,5-0,1 3,8*0,1.
(2) 1,8 Gew.-% Chondroitin-6-sulfat
Δν//¥± 0,00*0,02 -0,20^0,02 -0,28^0,02 -0,39-0,2
-8
E X 1-2 1»9-0,2 1,5^0,2 . 1,0^0,2 1,0^0,2
(dyn»cm~ ) ■
M^ χ 10"4 1,4-0,1 1,8^0,2 2,9-0,2 3,0^0,2
(3) 4,8 Gew.-$ Chondroitin-6-sulfat
Δ¥/¥± 0,00*0,02 -0,04*0,02 -0,08*0,02 +0,33*0,2
E X % 1f8*0i2 1,5*0,2 1,2*0,2 1,3*0,2
(dyn«cm ) :
ΜΛ χ 10"4 1,3*0,1 1,5*0,2 2,0*0,2 2,4*0,2
(4) 11,2 Gew.-% Chondroitin-6-sulfat
Δ¥/¥± 0,00*0,02 -0,04*0,02 +0,18*0,2 +0,65*0,2
—8
E X 12p 1,9*0,2 1,6*0,2 .1,6*0,2 1,7*0,2
(dynvcm"" )
Mc χ 10"4 1,0*0,1 . 1,4*0,1 1,3*0,1 1,6*0,1
■ . · - 49 - ■
609886/0338
Aus den Tabellen VII und -VIII geht hervor., dass in fast ,allen
Fällen, in denen Kollagen mit einem Mucopolysaccharid entweder nach dem Beschichten oder nach der gemeinsamen Ausfällung
mit einem Mucopolysaccharid vernetzt wurde, der anteilige Gewichtsverlust unterdrückt wurde, woraus sich ergibt, dass der
Abbau des Kollagens durch die Umsetzung mit dem Mucopolysaccharid in wirksamer Weise verhindert wurde. Die einzigen
Ausnahmen waren mit Hyaluronsäure (einem nicht-sülfatierten
Mucopolysaccharid) beschichtetes Kollagen und mit nur 1,8 Gewichtsprozent Chondroitin-6-sulfat gemeinsam ausgefälltes
Kollagen; im letzteren Falle wurde der anteilige Gewichtsverlust des Kollagens nicht vollständig verhindert, sondern nur
verzögert. In allen anderen Fällen kehrte sich ein gelegentlieber sehr geringer anfänglicher Gewichtsverlust, der möglicherweise
auf die Entquellung der implantierten Probe zurückzuführen war, gewöhnlich am 10. Tage um, bis das Implantat am
20. Tage schwerer als zur Zeit der Implantation war. Die Ge-5
v/ichtszunähme des Implantats war auf das Anhaften einer gewissen
Menge des umgebenden Gewebes an dem Implantat zurückzuführen, wenn das letztere aus dem Versuchstier entfernt wurde.
Das an dem Implantat anhaftende Gewebe wurde analysiert, wobei sich herausstellte, dass es fast vollständig aus Kollagen bestand, eine Beobachtung, die zeigt, dass durch die Zellen in
den umgebenden Geweben neues Kollagen synthetisiert worden war. Daher verhinderte die Reaktion mit sulfatierten Mucopolysacchariden
nicht nur den Abbau des Kollagens, sondern führte auch zur Bildung eines Verbundproduktes, welches imstande war,
die Synthese von neuem Bindegewebe auf seiner Oberfläche durch, die Zellen in dem umgebenden Gewebe hervorzurufen.
Der Schutz gegen Resorption, den das Kollagen durch.die Umsetzung
mit sulfatierten Mucopolysacchariden erhält-, - aussert sich
auch in der Verhinderung einer wesentlichen Abnahme des Moduls E und einer Abnahme der Vernetzungsdichte (Erhöhung von Mc),
die bei Kollagen selbst oder bei einem Verbundprodukt aus
- 50-
609886/0338
Kollagen und Hyaluronsäure beobachtet wird. Die Aufrechterhaltung von E und M_ auf verhältnismässig konstanten Höhen (innerhälb
der experimentellen Unsicherheitsgrenzen) bis zum 20. Tage nach der Implantation von Verbundprodukten aus Kollagen
und einem der sulfätierten Mucopolysaccharide ist ein Anzeichen für ein vernetztes makromolekulares Netz, welches in
dem Gewebe des lebenden Tieres mindestens 20 Tage intakt bleibt.
An dem aus der rechten Seite des. Versuchstieres am 4., 10. und
20. Tage entnommenen Gewebe-Implantatblock wurden histologische
Untersuchungen durchgeführt. Zur Herstellung der Proben für die histologische Untersuchung wurde das folgende genormte
Verfahren angewandt:
1. Das Gewebe wurde mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur in 10-prozentigem Formalin (Fischer Scientific Co.', NJ).
fixiert. : .- ; ' '
2,- Dann wurde es durch aufeinanderfolgendes Eintauchen in
Gemische aus Wasser und Äthylalkohol mit Alkoholgehalten von ". 50 %, 70 %; 85 %, 95 % bzw. 100 % dehydratisiert, wobei die"
Dauer des Eintauchens in ein jedes Gemisch 1 Stunde betrug.
3. Dann wurde das Gewebe 2 Stunden in Dioxan getaucht, bevor
es in ein Gewebe-Einbettungsmedium (Paräplast; F. 56-57°C;
Cur tin Scientific Co"., Houston, Texas) eingebettet wurde. Das
Einbetten erfolgte, indem das. Gewebe zunächst 4 Stunden in das auf 58 C gehaltene geschmolzene Paraffin eingebracht wurde, wobei das Paraffin stündlich ausgewechselt wurde. Dann wurde
das. Gewebe in eine Form eingelegt und in einen frischen
Ansatz von Paraffin eingebettet. . · V" .
4. ' Der das Gewebe enthaltende Paräffinblock wurde dann
-20 Minuten in einem zerkleinertes Eis enthaltenden Bad auf 0° C
609886/03 38
gekühlt und auf einem Mikrotom (Minot Custom Microtome; International Equipment Co., Needham Heights, MAj montiert.
Scheiben des das Gewebe enthaltenden Paraffins wurden mit dem Mikrotom auf Dicken von etwa 6 ^u geschnitten.
5. Die mit dem Mikrotom geschnittene Probe wurde dann auf einem klaren Mikroskop-Objektträger montiert und durch je
3 Minuten langes Eintauchen der montierten Probe'in zwei Ansätze
von Xylol von Paraffin befreit.
6. Dann wurde die Probe durch aufeinanderfolgendes Eintauchen
in Gemische aus Wasser und Äthylalkohol mit Alkoholgehalten von 100 %, 95 %, 85 %, 70 >, 50 % bzw. 0 % dehydratisiert,
wobei die Eintauchzeit in jedes Gemisch 1 Stunde betrug. Schllesslich wurde die Probe gründlich mit destilliertem
Wasser gespült. .
7. Dann wurde die Probe 5 Minuten mit Hämatoxylin gefärbt
und kurz mit destilliertem Wasser gespült. Überschüssiger Farbstoff wurde durch Spülen der Probe mit 0,5-prozentigem
Säurealkohol (70 % Äthylalkohol in konzentrierter Salzsäure) entfernt. Schliesslich wurde der Säurealkohol durch Spülen
der Probe und 1/2-stündiges Eintauchen in Wasser ausgewaschen.
8. Die Probe wurde sodann 3 Minuten in 0,5-prozentiger wässriger
Eosinlösung'gefärbt und hierauf fünfmal mit frischem
Wasser gespült. . ^ :
9. Die Probe wurde, wie für Stufe (2) beschrieben, dehydratisiert und dann einige Male mit Xylol gewaschen..
10. Hierauf wurde die Probe mit Hilfe eines bleibenden Montiermittels
(Harleco Synthetic Resin; Hartman-Leddon Co.,". Philadelphia, PA) auf einem reinen Deckglas montiert.
- 52 -
609886/033 8
11. Das die gefärbte Probe aufweisende Deckglas wurde unter dem Mikroskop untersucht.
Die histologischen Untersuchungen zeigten, dass das Ausmaß und die Stärke von chronischer Entzündung in dem das Kollagenimplantat
umgebenden Gewebe stetig abnahm, wenn der Chondroitin-6-sulfatgehalt einer Reihe von Implantaten auf der
Basis von gemeinsam ausgefällten Kollagen~Ghond.roitin-6-sulfat-Verbundprodukten
im Bereich von 1,8 bis 11,2 Gewichtsprozent zunahm. Diese Ergebnisse zeigten, dass das in den Verbundprodukten
verwendete Kollagen zwar für sich allein eine mäßige Immunreaktion hervorrief, die Umsetzung des Kollagens
mit dem Chondroitin-6-sulfat jedoch zu einer praktisch vollständigen
Unterdrückung dieser Immunreaktion führte. Gleiches wurde auch festgestellt,.wenn das Implantat.aus einem ■Verbundprodukt
bestand, welches durch Beschichten von Kollagen.mit
einem der sulfatierten Mucopolysaccharide erhalten worden war. Die histologischen Beobachtungen zeigten, dass die Fähigkeit
von implantiertem Kollagen, bei dem Wirtstier eine Fremdkörperreaktion hervorzurufen, durch Umsetzung mit einem jeden
der sulfatierten Mucopolysaccharide gesteuert und unterdrückt werden konnte. ' .
609886/0338
596 112
Beispiel 13
Beispiel 13
Herstellung eines zweischichtigen Schichtstoffs aus einer ersten Schicht aus Kollagen-Chondroitin-6-sulfat und einer
zweiten Schicht aus einem "Silastic!t-Siliconpolymeren
150 ml einer 0,67-gewichtsprozentigen Kollagendispersion, hergestellt
nach Beispiel 1, wurden unter schnellem Rühren mit 50 ml Citronensäure-Phosphatpuffer (pH. 3t2) gemischt, die
0,2 g Chondroitin-6-sulfat enthielten. Der Niederschlag wurde durch eine Nutsche auf ein Filterpapier von 11 cm Durchmesser
(Schleicher und Schuell Nr. 589) abfiltriert. Die so erhaltene Verbundproduktfolie aus Kollagen-Mucopolysaccharid wurde von
dem Filterpapier entfernt, in 0,02-molare Glutaraldehydlösung getaucht und nach Beispiel 4 verarbeitet. Die Dicke der entstandenen
Folie betrug 0,38 bis 0,43 mm.
Die Verbundproduktfolie wurde dann mit Löschpapier getrocknet und mit Hilfe eines Spatels mit einem 0,13 mm dicken Überzug
eines Siliconklebstoffs ("Medical Grade Silastic", Typ A, der Dow Corning Co.) beschichtet. Das beschichtete Verbundprodukt
wurde 16 Stunden bei 73° C und 100 % relativer Feuchte in einem Exsikkator gehalten. Nach dem Sterilisieren in Isopropylalkohol
und Auswaschen mit sterilem destilliertem Wasser und steriler Dulbeccoscher Lösung wurde die beschichtete Folie
auf ihren Wert als synthetische Haut untersucht.
Das nach Beispiel 13 hergestellte und mit Siliconharz beschichtete
Kollagen-Chondroitin-6-sulfat-Verbundprodukt wurde auf
die gewünschten Abmessungen (4 cm χ 6 cm) geschnitten und zum
Desinfizieren 24 Stunden bei 23° C in ein Gemisch aus 70 % Isopropanol und 30 % Wasser getaucht. Die Hantierung der Proben
erfolgte in einer sterilen Atmosphäre, die durch einen Abzug (Tenney Relialab Laminar flow hood) zur Verfügung gestellt
- 54 609886/0338
596 112 ^
wurde. Während der Hantierung der Probe wurden chirurgische
Handschuhe und Masken verwendet. Nach dem Entfernen aus der Alkohollösung wurden die Proben zweimal mit sterilem destilliertem
Wasser gewaschen und dann bis zur Verwendung bei h C.
in Dulbeccoscher Lösung aufbewahrt. Nach Beendigung dieses Verfahrens ergaben bakteriologische Untersuchungen der
Kollagen-Chondroitin-ö-sulfatproben auf gram-positive und
gram-negative Bakterien und auf anaerobe Mikroorganismen negative Resultate.
Die Transplantation wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.
Als Versuchstiere wurden weisse weibliche Hartley^ Meerschweinchen von ungefähr 400 g Körpergewicht verwendet.
Für einen Zeitraum von 7 Tagen vor der Transplantation wurde für jedes Tier die Geschichte seiner Gewichtsänderung aufgenommen.
Kurz vor der Transplantation wurde der Rücken eines jeden Tieres über eine Fläche von 6 cm χ 5 cm hinweg mit der
Haarschneidemaschine geschoren, und lose Haarabfälle wurden sorgfältig abgesaugt. Dann wurde das Tier durch Einwirkenlassen
eines Gemisches aus Sauerstoff und Halothan anästhesiert und sein Rücken mit einer Lösung von 70 % Isopropanol und 30 %
Wasser gewaschen.
Über eine Fläche von 4 cm χ 6 cm hinweg wurden entsprechend .
einer mit Jodlösung markierten Kontur, die der Grosse des . Transplantats entsprach, Schnitte ausgeführt. Die Haut über
dem Panniculus carnosus wurde ausgeschnitten, wobei sorgfältig darauf geachtet wurde, nur ein minimales Bluten hervorzurufen. Alles Blut wurde aus der Wunde durch Abtupfen mit mit
steriler Kochsalzlösung befeuchteten sterilen Gazebäuschen
entfernt. Das Transplantat wurde dicht angrenzend an die Haut am Umfang der Wunde über das Wundbett gelegt. Dann wurde das
Transplantat mit Nahtmaterial aus Nylon angenähtj wobei ungefähr
16 Nähte nahe der Wunde angewandt wurden. Das Tier wurde
mit einem seinen Körper umgebenden Verband bedeckt, der um das
- 55 -
609886/0338
596 112
Genick herum befestigt wurde, um Verschiebungen zu verhindern. Während der Dauer des Versuchs war jedes untersuchte Tier in
einem gesonderten Käfig untergebracht.
Die untersuchten Tiere wurden täglich gewogen, und das Gewicht wurde verzeichnet. Nach 5 Tagen wurde der Verband geöffnet und
die Transplantatstelle untersucht. Die Tiere wurden nach unterschiedlichen Zeitspannen getötet, und das Transplantat sowie
das Wundbett wurden ausgeschnitten und in zwei gleiche Abschnitte unterteilt. Ein Abschnitt wurde der histologischen
Untersuchung unterworfen, und der andere Abschnitt wurde ohne weitere Behandlung unter einem schwach vergrössernden Mikroskop
beobachtet. Durch Abheben des Transplantatmaterials von dem Gewebe mit einer Pinzette konnte der Zustand der Wundstelle
und des Transplantats untersucht werden. Für Zeiträume bis zu 10 Tagen war kein Anzeichen für Gewebewachstum in das Transplantat
hinein und kein Anzeichen von Wundkontraktion oder akuter Entzündung festzustellen. Die Epithelbildung am Umfang
des Wundbettes war minimal.
Mit Kollodium beschichtete mehrschichtige Kollagen-Chondro itin-6-sulfat-Membran
Ein nach Beispiel 5 hergestelltes Kollagen-Chondroitin-6-sulfat-Verbundprodukt
wurde nach dem Verfahren des Beispiels 14 auf ein Meerschweinchen transplantiert. Nach dem Einnähen wurde
das gesamte Transplantat zusammen mit etwa 3,2 mm der benachbarten Haut mit einer Kollodiumlösung (Celluloseester in
einem geeigneten organischen Lösungsmittel) beschichtet und vor dem Anlegen eines Verbandes gründlich trocknen gelassen.
Das Verhalten des Transplantats und des Gewebes war ähnlich wie in Beispiel 14, jedoch sprang der Überzug am 10. Tag infolge
Versprödung, und es erfolgte eine Dehydratisierung der Kollagen-Chondroitin-6-sulfatschicht unter Kontraktion der Wunde
und Epithelbildung längs der Ränder der Wundstelle„
- 56 609886/0338
Claims (1)
- Patentansprüche( 1J Mehrschichtige Membran, dadurch gekennzeichnet, dass siea. eine erste Schicht aus einem Werkstoff, der in Gegenwart von Körperenzymen nicht abgebaut wird, in Gegenwart von Körp.erflüssigkeiten unlöslich und nach der Transplantation oder Implantation nicht-immunogen ist, undb. eine die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem nicht-toxischen Werkstoff aufweist, die der mehrschichtigen Membran eine Feuchtigkeitsdurchlässig-keit von etwa 0,1 bis 1 mg/cm /h verleiht.· Mehrschichtige Membran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Schicht aus einem verhetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt besteht, das mindestens etwa 0,5 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid enthält.3. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem natürlichen Polymeren besteht.4. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem synthetischen Polymeren besteht.- 57 -609886/0338596 112 £$5. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt ein sulfathaltiges Mucopolysaccharid enthält.6. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt etwa 6 bis 12 Gewichtsprozent sulfathaltiges Mucopolysaccharid enthält.7. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das sulfathaltige Mucopolysaccharid Chondroitin-6-sulfat, Chondroitin-4-sulfat, Heparin, Heparansulfat, Keratansulfat oder Dermatansulfat ist.8. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt bis zu einem M-VTert zwischen etwa 800 und 60 000 vernetzt ist.9. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das sulfathaltige Mucopolysaccharid Chondroitin-6-sulfat ist.10. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 4 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem synthetischen Polymeren, nämlich einem Siliconharz, Polyacrylsäureester, Polymethacrylsäureester oder Polyurethan, besteht.11. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht aus einem Siliconharz besteht.- 58 -609886/0338596 112 S512. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die die Feuchtigkeitsdurchlässigkeit steuernde Schicht der mehrschichtigen Membran eine Feuchtigkeitsdurchlässigkeit von etwa 0,3 bis 0,5 mg/cm /h verleiht.13. Mehrschichtige Membran nach Anspruch 1 bis 12j dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Gesamtdicke von etwa 0,64 bis 2,5 mm aufweist.14. Verwendung der mehrschichtigen Membran gemäss Anspruch 1 bis13 als synthetische Haut.15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt verwendet wird, welches etwa 6 bis 12 Gewichtsprozent sulfathaltiges Mucopolysaccharid enthält und bis zu einem M -Wert von etwa 5000 bis 10 000 vernetzt worden ist.- 59 -609886/0338Leerseite
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