DE2620693C2

DE2620693C2 -

Info

Publication number: DE2620693C2
Application number: DE2620693A
Authority: DE
Inventors: Leland C. Cincinnati Ohio Us Clark Jun.
Original assignee: CHILDREN'S HOSPITAL CINCINNATI OHIO US
Current assignee: CHILDREN'S HOSPITAL CINCINNATI OHIO US
Priority date: 1976-03-12
Filing date: 1976-05-07
Publication date: 1989-09-14
Also published as: JPS6026978B2; JPS52110691A; CA1033810A; GB1541047A; US4040908A; DE2620693A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Cholesterin im Blut unter Verwendung einer polarographischen Zelle gemäß dem Oberbegriff des Patent anspruchs 1.

Analytischen Techniken für biomedizinische und industrielle Anwendung sind bisher bereits beträchtliche Anstrengungen und Untersuchungen gewidment worden. Analytische Techniken sind auf diesen Gebieten der Anwendung, einschließlich der klinischen Diagnose, von entscheidender Bedeutung. Zum Beispiel hat sich während der vergangenen beiden Jahr zehnte der Zusammenhang zwischen Cholesterin, Triglycerid und Arteriosclerose bestätigt und ge klärt. Die Ermittlung einer Erhöhung von Cholesterin oder Triglycerid zu Beginn führt zu einer detaillierteren Be wertung der bei Diagnose und Behandlung geeigneten Lipid- und Lipoprotein-Klassen. Screening-Prozeduren zur quanti tativen Erfassung des Plasmacholesterins sind äußerst wichtig als erste Näherung zu einer Linderung der Arterio sclerose. Wegen der engen Beziehung von Cholesterin und Arteriosclerose sind mannigfaltige Wege zur Messung des Plasmacholesterins geprüft worden. Zur Zeit sind kolori metrische Methoden, einschließlich Isopropanolextraktion und Verseifung, weit verbreitet in Gebrauch und automa tisiert worden, um eine vernünftige Präzision und Genau igkeit bei einem Durchsatz von 30 Proben pro Stunde zu gewährleisten. Die kolorimetrische Methodik ist teuer, verhältnismäßig unspezifisch, unterliegt Störungen selbst bei geringfügigen Änderungen der Feuchtigkeits- und Bilirubinspiegel und erfordert die Verwendung stark korrodierender Mittel wie konzentrierter Schwefelsäure, Essigsäureanhydrid und Essigsäure. Kolorimetrische Methoden erfordern auch Blutproben von mindestens 5 bis 10 ml mit der notwendigen Venipunktur.

Alternativ zur kolorimetrischen Methodik gibt es die enzymatische Cholesterin-Bestimmung mittels ionen selektiver Membranen und auf die Umwandlungsprodukte ansprechender Elektroden.

Dieses Verfahren ist aus "Analytical Chemistry" (Vol. 47, No. 11, Sept. 1975, Seiten 1792-1796) bekannt.

Die Enzyme wurden dabei auf der der Elektrode zugewandten Seite der Membran zugesetzt. Dies ist auch ausführlich beschrieben in der US-PS 35 39 455, allerdings bezogen auf die Messung und Erfassung kleiner Moleküle bei spielsweise der Glucose.

Mit der enzymatischen Umwandlung von Glucose befaßt sich auch die CH-PS 5 69 973. Hierbei kommen inhomogene Membranen zur Anwendung, bei denen die eine, dünnere Schicht für das entstehende Wasserstoffperoxid per meabel ist.

Die Elektrodenzelle ist so ausgebildet, daß sie in die Probenflüssigkeit eingetaucht werden kann. Das Enzym befindet sich chemisch oder mechanisch gebunden auf der der Elektrode zugewandten oder abgewandten Seite der Membran.

Aufgabe der Erfindung war die Entwicklung eines Verfahrens zur quantitativen Bestimmung von Cholesterin im Blut, wobei unter Blut sowohl Vollblut, wie auch Blutplasma oder Blutserum verstanden wird.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß mit den Merkmalen im Kennzeichen des Patentanspruchs 1.

Vorzugsweise Weiterbildungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Durch die Erfindung werden eine Reihe von Vorteilen erreicht. Im Falle des Cholesterins ist, wie oben dargelegt, das heute weit verbreitet angewendete Meßverfahren eine automatisierte kolorimetrische Methode und in der Ausführung teuer, unterliegt Störungen durch eine Reihe üblicher Substanzen und erfordert die Verwendung stark korrodierender Reagen tien. Sie benötigt auch Blutproben von mindestens 5 bis 10 ml; das Abnehmen solcher Proben ist ziemlich teuer und schmerzhaft. Im Gegensatz hierzu verwendet das erfindungsgemäße Verfahren eine einfache und billige Vorrichtung, erlaubt eine präzise, genaue, empfindliche und spezifische Messung des Cholesterins in 10 bis 50 Mikrolitern oder weniger Plasma ohne die Notwendigkeit zur Verseifung, ohne korrodierende Reagentien oder erhebliche technische Erfahrungen. Daher sind die Vorteile und Vorzüge dieser Erfindung, im Hinblick auf die Bestimmung von Cholesterin, und zwar sowohl des gesamten als auch des freien Cholesterins im Plasma, in einzigartiger Weise erheblich leichter zu realisieren. Da das gewünschte Ansprechen der Elektrode von der Messung der Reaktionsgeschwindigkeit und nicht von einer vollständig stöchiometrisch ab laufenden Umwandlung des Cholesterinesters zu Cholesterin und des Cholesterins zu Peroxid abhängt, können die meisten Bestimmungen in weniger als 4 Minuten erfolgen.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand der Zeichnungen und der Beispiele erläutert werden. Dabei zeigt

Fig. 1 eine schematische Darstellung der polarogra phischen Apparatur, wobei die Probenkammer teilweise im Querschnitt abgebildet ist,

Fig. 2 eine weitere Ausgestaltung der Elektrode,

Fig. 3 eine polarographische Kurve, mit dem Diagramm des Stromes gegen die Zeit für eine Plasmaprobe und eine künstliche Plasmaprobe und

Fig. 4 ein Diagramm des Stromes gegen die Cholesterin konzentration von vorher bestimmten Referenz proben sowohl für die Elektrode des Aufbaus nach Fig. 1 als auch für die Elektrode des Aufbaus nach Fig. 2 mit gebundenem Enzym.

Die Prinzipien der vorliegenden Erfindung lassen sich anhand der Analyse von Plasma auf Cholesteringehalt er läutern. Die Cholesterinester im Plasma werden durch Cholesterinesterhydrolase (CE) nach der folgenden enzy matischen Reaktion 1 umgewandelt:

Sowohl das aus der obigen Esterreaktion freigesetzte Cholesterin als auch das freie Cholesterin im Plasma reagiert in Gegenwart von Sauerstoff (O₂) und Cholesterin oxidase (CO) unter Erzeugung von Cholestenon und Wasser stoffperoxid nach Reaktion 2:

In der polarographischen Apparatur der Fig. 1 oxidiert die Elektrodensonde 5 einen konstanten Teil des Wasser stoffperoxids an der Platinanode 6, wahrscheinlich gemäß Reaktion 3:

H₂O₂→2H⁺+O₂+2e^- (3)

Die Reaktion wird vervollständigt durch eine Silber kathode 7, an welcher Sauerstoff zu Wasser reduziert wird, wahrscheinlich gemäß Reaktion 4:

4H⁺+O₂→2H₂O-4e^- (4)

Legt man die obigen Reaktionen den Prinzipien des Betriebs in Fig. 1 der Zeichnung zugrunde, dann ist Fig. 1 eine schematische Veranschaulichung einer Apparatur, die die polarographische Zel le 9 mit Elektrodensonde 5 und Probenküvette oder -kammer 8 wie dergibt. Beim speziellen Betrieb, dessen Beschreibung folgt, wur de ein Glucose-Analyzer der Yellow Springs Instrument Company, modifiziertes Model 23, verwendet. Die Zelle ist mit ihrer ei genen Potentialquelle versehen, welche in diesem Fall einen Batte rie 10 ist, die eine angelegte Spannung von etwa 0,6 Volt verwen det. Der positive Pol der Batterie 10 ist mit der polarographi schen Platinanode 6 verbunden, die einen Frontdurchmesser (11) von 0,5 mm aufweist, während eine benachbarte Silberreferenzka thode 7 eine aktive wirksame Oberfläche 12 von etwa 0,5 cm² auf weist. Die Maximalleistung liegt in der Größenordnung von 100 Nanoampere. Ein G-2500 Varian Streifenkartenschreiber, nicht ge zeigt, wurde verwendet, um die laufenden Messungen zu machen. Die Elektrodensonde 5 ist nur schematisch abgebildet; sie enthält ein Isolationsträgerglied 13 und die Elektroden sind ebenfalls voneinander isoliert. Die Spitze der Elektrodensonde ist durch eine Cellophanmembran 14 abgedeckt (2,86 cm Dialyseschlauch, A.H. Thomas Co., Kat. Hr. 4465-A2), welcher zum Schutze der Elektro den dient und eine Diffusionsstrecke zu diesen aus der Probenkammer 8 mit einem Volumen von 0,40 ml dient, die auf 38°C thermo statisiert ist. Membran 14 ist an der Elektrodensonde durch einen O-Ring 15 befestigt. Die Cellophanmembran 14 ist genügend permea bel, so daß Wasserstoffperoxid, Wasser, Sauerstoff und Salz schnell passieren können, jedoch ist sie für die zu untersuchende Substanz und störende Substanzen wie Katalyse und das Enzym, welches die Reaktion in Gegenwart von Sauerstoff unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid bewirkt, impermeabel. Auf Seite der Probenkam mer 8 ist eine dünne, für Sauerstoff permeable Membran, z. B. aus Silikonkautschuk, angeordnet, welche den Durchtritt von Luft oder Sauerstoff aus einer Rührpumpe in das in der Probenkammer 8 ent haltene Enzym-Elektrolyt-Gemisch gestattet; das Gas wird über die Belüftung eliminiert. Die aktive Front 11 der Anode ist mit Kapillarabstand von der Cellophanmembran 14 entfernt angeordnet und befindet sich in Kontakt mit dem Elektrolytgemisch. Wie er wähnt, ist die Referenzsilberkathodenoberfläche 12 der Platin anodenfront (11) benachbart angeordnet und steht ebenfalls mit dem Elektrolytgemisch in Berührung.

Eine Spritze zur Injektion der Plasmaprobe ist zusammen mit dem Puffervorrat, der Injektionsöffnung, dem Septumcord und der Aus wurfentfernung gezeigt, womit das Fließschema der Probenanalyse veranschaulicht ist. Ein typisches schematisches elektrisches Sy stem enthält ein Galvanometer 16, welches den Strom mißt, der durch die enzymatische Cholesterinreaktion über die Erfassung des Nebenproduktes Wasserstoffperoxid der Reaktion erzeugt wird. Der so erzeugte Strom ist dem Cholesterinspiegel in der Plasmaprobe direkt proportional.

Betriebsfähig wird die polarographische Membranapparatur der Fig. 1 zur quantitativen Bestimmung von Cholesterin verwendet, das mittels eines Enzyms unter Erzeugung von schließlich Wasserstoff peroxid umsetzbar ist. Wäßriger Elektrolyt und Pufferlösung wer den in die Probenkammer 8 gegeben. Cholesterinoxidase und -ester hydrolase werden beide in die Probenkammer 8 auf die Elek trode entgegengesetzte Seite der Membran 14 gegeben zur enzyma tischen Reaktion mit dem Cholesterin in einer Plasmaprobe unter schließlicher Erzeugung von Wasserstoffperoxid. Die zu analysie rende Plasmaprobe wird in die Kammer 8 mittels der Spritze durch den Septumgummi gegeben. Sauerstoff wird durch die Rührpumpe über die permeable Silikonkautschukmembran in die belüftete Probenkam mer geliefert. Somit befinden sich der Plasmateil, der das zu ana lysierende Cholesterin enthält, und die Enzyme auf der Seite der Membran, die der Elektrodensonde 5 entgegengesetzt ist. Wenn das Cholesterin, sowohl das freie als auch das veresterte, in dem Plasma mit dem Enzymsystem aus CO und CE in Berührung kommt, findet in Gegenwart von Sauerstoff - wie oben beschrieben - die en zymatische Reaktion unter Erzeugung von Cholestenon und Wasser stoffperoxid statt. Das Wasserstoffperoxid wiederum diffundiert in die Cellophanmembran und kommt in Kontakt mit der Platinanode. Zu diesem Zeitpunkt erfolgen die Reaktion an der Platinanode und der Silberkathode. Es wird ein Strom erhalten, der durch die Zelle fließt und direkt proportional ist der Menge am diffundier tem Wasserstoffperoxid. Die Bestimmung des durch die Zelle flie ßenden Stromes durch das Galvanometer 16 ist eine Funktion der gebildeten Menge Wasserstoffperoxid und eine Anzeige für die Men ge Cholesterin im Plasma. Die enzymatische Reaktion braucht nicht vollständig zu sein, da die polarographische Anode die Ge schwindigkeit der Wasserstoffperoxid-Bildung mißt.

Bei der praktischen Durchführung der zur Zeit bevorzugten Ausfüh rungsform der Erfindung verwendet man bei der Bestimmung von Chole sterin die folgenden Materialien und Methoden.

Küvettenreagenz

Die Zusammensetzung des Küvettenreagenzes ist in Tab. I zusammengefaßt. Das pH wurde auf 6,6 unter Verwendung der beiden Phosphatsalze eingestellt.

Tabelle I

Die von den Küvettenreagenzbestandteilen ausgeübten Funktionen sind ebenfalls in Tab. 1 oben zusammengefaßt. Natriumazid, das als Pufferpräservativ und Katalaseinhibitor verwendet wurde, war auch bei der Stabilisierung von in die Küvette injiziertem Wasser stoffperoxid wirksam. Wie oben dargelegt, war es wegen der hohen Katalasegehalte in Gesamtblut nicht möglich, die Bestimmung mit ungebundenem Enzym weder im Gesamtblut noch in Blut, das stark hämolysiert worden war, durchzuführen.

Enzyme

Cholesterin-oxidase (CO) (Enzyme Commission No. 1.1.3.6) stammte aus Nocardia oder Brevi bacterium sp. Das CO wurde durch Lösen von 9,4 I.E. Enzym in 1 ml 1%igen Triton X-100 (ein nichtionischer Alkaryläther der Rohm & Haas) rekonstituiert; die Enzymaktivität wird in Internationalen Einheiten (I.E.) wie dergegeben. Cholesterinesterhydrolase (CE) (Enzyme Commission No. 3.1.1.13) wurde aus Rinderpankreas hergestellt und durch Lö sen von 9,4 I.E. in 1 ml 1%igem Triton X-100 rekonstituiert.

Cholesterin-Standards

Cholesterin wurde durch Umkristallisieren aus Aceton und Trocknen über Kieselsäuregel gereinigt. Es wurde in der Lösung eines oberflächenaktiven Mittels unter Verwendung von Branson Model J17A-Sonikatoren emulgiert. Geeignete Standards von Cholesterinemulsionen werden hergestellt, die 200 mg% in 1%iger Stearatlösung mit einem auf 7,1 eingestellten pH oder 200 mg% in Triton X-100 enthalten. Technisch hergestellte Standards wurden auch zur Ableitung von Verdünnungskurven verwendet. Ge poaltes Humanplasma, wiederholt voranalysiert nach der kolorime trischen Methodik AA-II ("Lipid Research Clinies Program", Manual of Laberatory Operations, National Heart and Lung Institute, Bethesda, Maryland, Bd. 1, 1974) wurde verwendet, um Standard kurven zur Analyse von Humanplasmaproben abzuleiten.

Vor Analysieren der Humanplasmaproben nach der erfindungsgemäßen Cholesterinelektrodenmethode und zum Vergleich mit der kolorime trischen Technologie AA-II wurden die experimentellen Bedingun gen, einschließlich Enzymkonzentration, Temperatur, pH, Reak tionsdauer, usw. und Einstellungen der Apparaturempfindlichkeit einzeln und in Kombination abgestimmt, um die optimalen Bedin gungen zu ermitteln, und zwar wie folgt.

Cholesterin-oxidase-Konzentration

Initialstudien über das An sprechen der Elektrode auf CO-Injektion erfolgten unter Verwen dung von 50 µl Hundeplasma und verschiedener Mengen CO. Die sta bilsten und reproduzierbarsten Signale wurde mit 0,15 I.E. CO bei einer konstanten Ablesung nach 6 bis 8 Minuten beobachtet. Bei Verwendung größerer Mengen CO (1,93, 0,99 und 0,522 I.E.) konnte eine Peakaktivität nach entsprechend 2,3 und 4 Minuten erhalten werden, jedoch unterschied sich das Gesamtelektrodensig nal nicht von dem mit 0,14 I.E. beobachteten. Bei Verwendung von 50 µl Humanplasma wurde optimales Ansprechen der Elektrode mit 0,15 I.E. beobachtet, wobei größere Mengen Enzym variierende Er gebnisse hervorbrachten und kleinere Mengen Reaktionen ergaben, die nicht zu einem stabilen Peakniveau führten.

Cholesterinesterhydrolase Konzentration

Unter Verwendung von 50 µl Humanplasma und 0,15 I.E. CO wurden Serienstudien mit variieren den CE-Konzentrationen durchgeführt. Ein maximales Ansprechen der Elektrode wurde im Bereich zwischen 0,094 und 0,40 I.E. fest gehalten, wobei die reproduzierbarsten Signalkurven bei 0,2 I.E. erhalten wurden. Es wurde auch offensichtlich, daß gleichzeitige Injektion von CO und CE die gleichen Ablesungen für das Gesamt cholesterol (innerhalb von 6 bis 8 Minuten) ergaben wie eine getrennte Vorinkubation des CE mit Plasma und anschließende In jektion des Plasma-CE-Gemisches zusammen mit CO.

Wirkung der Temperatur

Unter Verwendung von 50 µl Plasma und der optimalen Konzentrationen CO (0,15 I.E.) und CE (0,20 I.E.) wurden die Temperatureffekte überschlagen. Bei Temperaturen von oder unter 30°C waren die Reaktionsgeschwindigkeiten sehr gering (12 bis 15 Minuten bis zur Erreichung des Elektrodenpeaksignals) und das Gesamtsignal der Elektrode gering. Obwohl lineare Stan dardkurven bei diesen niedrigeren Temperaturen erhalten werden könnten, waren diese sehr unverläßlich, so daß eine mäßige Än derung in der Elektrodenansprechung große Änderungen im gemessenen Cholesterolgehalt erzeugten, wenn man von der Standardkurve ablas. Bei 50°C und 60°C waren die Reaktionsgeschwindigkeiten höher (Peakaktivitäten wurden in 2 Minuten erreicht) bei erhöh ten Gesamtablesungen des Elektrometers. Bei diesen Temperaturen wandert jedoch das Elektrodensignal, wahrscheinlich wegen der raschen Beschädigung der Cellophanmembranen und des Lösens des "O"-Ringes, der die Membran hielt. Bei 38°C, der zur Zeit ver wendeten Temperatur, waren die Reaktionsgeschwindigkeiten mittel mäßig (4 bis 8 Minuten), die Standardkurven linear und es wurde eine ausgezeichnete Membranhaltbarkeit festgestellt, wobei Mem branen für Wochen ohne erforderliche Änderungen aktiv einge setzt wurden.

pH-Optimum

Die enzymatische Reaktion war über einen breiten pH- Bereich stabil, wie Tab. II zusammengefaßt wiedergibt.

Tabelle II

Wirkung des pH′s auf den Elektrodenstrom in Gegenwart von Hundeplasma und Cholesterin-oxidase sowie zugesetzter Cholesterin-oxidase plus Cholesterinester-hydrolase

Das pH des Küvettenreagenz wurde mit Phosphorsäure- oder einer konzentrierten Kaliumhydroxidlösung eingestellt. Nach Füllen der Küvette mit dem geeigneten Puffer wurden 50 µl Hundeplasma in jiziert und nachfolgend CO zugesetzt. Nach Erreichen eines Peak stromes wurde dann CE injiziert und der Strom erneut aufgezeich net, nachdem der Peak erreicht und stabilisiert war. Das pH von 6,6, das bei der schließlichen Analysenmethode verwendet wurde, wurde aus Zweckmäßigkeitsgründen gewählt.

Nach Herleitung der optimalen Küvettenreagentien, Enzymkonzentra tionen und Reaktionsbedingungen wurden die folgenden Messungen des Plasmacholesterols unter Auswertung verschiedener vorher be stimmter oder gewogener Standardcholesterollösungen, Ableitung von Verdünnungskurven und Untersuchungen hinsichtlich der Präzi sion, Genauigkeit, Empfindlichkeit und Spezifität vorgenommen.

Plasma, Probenherstellung und Analyse

Alle Plasmaproben wurden mittels Venipunktur in EDTA enthaltenden Röhrchen nach 12 bis 14 stündigen Fasten gesammelt und das Plasma durch Zentrifugation bei 4°C abgetrennt. Blut von kleinen Tieren wurde durch Orbital blutung oder Herzpunktur gesammelt. Die Küvette für den Analysa tor wurde so angeordnet, daß sie zwischen den Analysen wieder holt mit 0,5M Phosphatpuffer bei 38°C und einem pH von 6,6 ge spült wurde. Nach dem Spülen wurde die Küvette entleert und mit Küvettenreagenz gefüllt, das die in Tab. I angegebene Zusammen setzung aufwies. Plasma (20 bis 50 µl) wurde dann unter Verwen dung einer Mikroliterspritze injiziert, gefolgt von 25 µl Chole sterin-oxidase (0,15 I.E.) und 20 µl CE (0,20 I.E.). Das Elek trodensignal wurde nach Erhalt einer konstanten Stromable sung (4 bis 8 Minuten) abgelesen. Für Messungen des freien und veresterten Cholesterins wurde das Plasma zunächst injiziert, gefolgt von einer CO-Injektion. Nachdem ein stabiles Stromsignal für freies Cholesterin erhalten worden war, wurde das CE inji ziert, wobei ein zweites stabiles Signal für die Cholesterin ester erhalten wurde. Nach Analyse der jeweiligen Plasmaprobe wurde die Küvette mit Phosphatpuffer dreimal gespült und die nächste Probe eingegeben.

Zu Beginn wurden Cholesterinsuspensionen mit der Apparatur der Fig. 1, wie oben beschrieben, gemessen. Wie Fig. 3 zusammenfaßt, war die polarographische Kurve für kristallines Cholesterin in 1%igem Triton X-100 fas identisch mit derjenigen für Plasma. Dann wurden Verdünnungskurven unter Verwendung bekannter kristal liner Cholesterinproben in 1%igem Triton X-100 (Kurve A) und verdünnter vorher analysierter Standardplasmaproben (Kurve B) erhalten (Fig. 4). Die Meterablesungen der Fig. 4 repräsentieren lediglich den nichtkalibrierten Stromfluß bei Strompeaks für je de der Proben, aufgetragen gegen den vorher bestimmten Choleste rolgehalt der jeweiligen Probe. Die Verdünnungskurven der Fig. 4 waren äußerst linear (r=0,999, 0,993) von 12,5 bis 300 mg/100 ml. Demgemäß waren die Stromablesungen dem Cholesterolgehalt der Proben direkt proportional und belegen die Güte der Methode. Da keine künstlichen Emulsionen in zufriedenstellender Weise Plasma simulieren können, erfolgten diese Serienuntersuchungen des Cho lesterolgehalts von Humanplasma unter Verwendung vorher analy sierter Referenzplasma-Standardproben, die nach der oben genann ten kolorimetrischen Methode AA-II gemessen wurden.

Bei der Bestimmung von serienmäßigen Standardverdünnungskurven wurde offenbar, daß eine allmähliche und in dem meisten Fällen kleinere Herabsetzung der Empfindlichkeit mit der Zeit eintrat, was zu einer Parallelverschiebung nach unten bei der Standard verdünnungskurve ohne Änderung der Steigung oder Linearität führ te. Um genauste und präzise Ergebnisse zu gewährleisten, war es notwendig, täglich zwei oder mehrere Standardverdünnungskurven mit einem gelegentlichen Referenzplasma zu fahren, das den unbe kannten Proben zugeordnet wurde, um auf Empfindlichkeit zu prü fen.

Die Präzision der Cholesterol-Elektrodenmethode wurde bewertet, indem mehrere Aliquote von gepoolten, vorher analysierten Refe renzplasmaproben mit Analysen vom gleichen Tag und Tagespräzi sion verwendet wurden. Der Koeffizient vom gleichen Tag für die Variation wurde berechnet durch Messen des Cholesterolgehalts von 20 Aliquoten von einem einzigen voranalysierten Referenz plasmapool bei einem Gesamtcholesterolgehalt von 230 mg/100 ml. Der Variationskoeffizient betrug 1,3% für diese Analysen vom gleichen Tag. Die Präzision zwischen den Tagen des Cholesterol- Elektrodensystems wurde bewertet, indem mehrere Aliquote von einem voranalysierten Referenzplasmapool von 230 mg/100 ml ver wendet wurden. Der Variationskoeffizient, gemessen in 2 Aliquoten von diesem Pool über einen Zeitraum von 10 Tagen (20 Proben ins gesamt), betrug 1,2%.

Die Genauigkeit der Cholesterol-Elektrodenmethode wurde bewertet, indem paarweise Vergleiche mit Duplikataliquoten nach der obigen kolorimetrischen Methode AA-II ausgeführt wurden. 120 Plasmapro ben, die aus Screening-Studien erhalten wurden, wurden verwendet bei einem Wertebereich für Plasmacholesterol von 126 bis 381 mg/ 100 ml. Die nach den beiden Methoden bestimmten Cholesterol werte zeigten starke Korrelation (r=0,914, p · 0,001), wobei die mittleren ± SEM-Werte für die kolorimetrische und elektrodi metrische Methode 175±3,3 und 168±2,6 mg/100 ml entsprechend betrugen. Die mittlere Differenz von 7,06 mg/100 ml, wobei die kolorimetrische Methode regelmäßig höher als die Cholesterol-Elek trodenmethode ausfiel, war bei paarweisen Testen der Unterschiede bedeutend (p · 0,001), stellte jedoch nur eine Differenz von 4% zwischen den Methoden dar. Wenn 25 µl einer kristallen Chole sterolemulsion (100 mg/100 ml) zu 25 µl Plasma (115 mg/100 ml) gegeben wurde, war die Ausbeute 97% der erwarteten Werte.

Methode mit gebundenem Enzym

Das Verfahren mit gebundenem Enzym dieser Erfindung wurde bei spielsweise ausgeführt unter Benutzung der Sonde 17 der Fig. 2 mit einer Kollagenmembran 18 und Glutaraldehyd-gebundener Chole sterol-oxidase (CO) 19. Nach Einpassen der Kollagenmembran 17 über die Elektrode, wie bei Fig. 1 beschrieben, wurde die Membran vorsichtig mit einer sehr dünnen Schicht aus 25%igem Glutaralde hyd überzogen. Etwa 20 I.E. kristallines CO wurden dann behutsam auf die Oberfläche der mit Glutaraldehyd behandelten Membran ge setzt und ein Tropfen Glutaraldehyd oben über das Enzym gegeben. Die Elektrode mit gebundendem Enzym wurde dann 30 Minuten an der Luft getrocknet und in die Küvettenkammer 8 anstelle der Sonde von Fig. 1 gesetzt. Bei Verwendung des Membransystems mit gebun denem Enzym wurden Plasma und CE - wie oben angegeben - injiziert, jedoch ohne zusätzliche Injektion des CO. Für analytische Zwecke erfolgte, nachdem einmal eine konstante Ablesung nach dieser In jektion erhalten worden war, die Standardinjektion des CO, um zu bestimmen, welcher Betrag an Enzym-Substrat-Reaktivität im Über schuß zu derjenigen vorlag, die durch das System mit gebundenem Enzym gegeben war. Unter Verwendung des Membransystems mit gebun dener Cholesterol-oxidase der Fig. 2 und Injektion von Plasma und Cholesterol-esterase wurde ebenfalls eine lineare Plasmastan dardkurve (Kurve C) erhalten (Fig. 4). Das Elektrometersignal entsprach etwa 1/10 des Signals mit der freien injizierten Oxi dase.

Das membrangebundene Enzym bietet unerwarteterweise auch ein Mit tel zur direkten Analyse des Gesamtbluts ohne notwendige Katala seinhibierung. Bei einer solchen Analyse kann die Enzymreaktions geschwindigkeit (d. h. H₂O₂-Bildung), die in der unmittelbar an grenzend an die Enzymschicht 19 eintritt, an der Anode erfaßt werden, um die Cholesterolgehalte in der Gesamtblutprobe zu ermit teln. Laufende Ablesungen waren möglich, obwohl man erwarten soll te, daß H₂O₂ in die Probenkammer unter Zerstörung durch die Kata lase diffundiert.

Unter Anwendung der oben für die Bestimmung des Cholesterols in Blutplasma beschriebenen Techniken wurden analoge Analysen des Blutplasmas anderer Tiere durchgeführt, wie in der folgenden Tab. III zusammengefaßt wird.

Tabelle III

Die Analysen einer Reihe weiterer Flüssigkeiten sind in Tab. IV wiedergegeben.

Tabelle IV

Die Tabellen III und IV enthalten Strompeakwerte für freies Cho lesterol und Cholesterolester in tierischen Blutarten und einer Reihe von Flüssigkeiten. Die Verhältnisse aus freiem zu Ester cholesterolgehalt stimmen mehr oder weniger mit aus der Litera tur verfügbaren Daten überein.

Wie oben diskutiert wurde, befinden sich die Elektroden in elek trisch isolierter Beziehung zueinander und das Elektrolytmaterial füllt die Probenkammer, um einen elektrischen Weg zwischen bei den Elektroden zu liefern. Zu typischen Elektroylten zählen Na trium- oder Kaliumchloridpuffer, einschließlich Carbonate, Phos phate, Bicarbonate, Acetate oder Alkali- oder Seltenerdmetall- oder andere organische Puffer bzw. Gemische derselben. Die Lö sungsmittel für einen solchen Elektrolyt können sein Wasser, Glykole, Glycerin und deren Gemische. Die oben beschriebenen Elek troden waren eine Platinanode und damit verbundene Silberkatho de, diese sind jedoch nur repräsentativ für weitere Elektroden, die der Fachmann bei der praktischen Durchführung des erfindungs gemäßen Verfahrens verwenden kann. Neben den oben verwendeten Cellophan- und Kollagenmembranen können andere Membranen benutzt werden, die für das Cholesterin impermeabel, jedoch für Wasserstoffperoxid permeabel sind. Die Erfindung ist nicht auf eine spezielle Membran beschränkt. Außerdem kann die für Sauerstoff durchlässige Membran, die hier aus einem Silikon gummi-Plastikmaterial besteht, durch andere Materialien ersetzt werden, wie in der US-PS 35 39 455 beschrieben.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Cholesterin im Blut unter Verwendung einer po larographischen Zelle, die eine gegenüber durch enzymatische Umwandlung gebildetem Wasserstoff peroxid empfindliche Elektrode enthält, die hinter einer für Wasserstoffperoxid permeablen Membran angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutprobe in eine als Zelle ausgebildete Kammer zusammen mit Cholesterinoxidase und gege benenfalls Cholesterinesterhydrolase eingebracht wird, in die die mit der für Wasserstoffperoxid permeablen, für Cholesterin impermeablen Membran umgebene Elektrode hineinragt und daß der Kammer durch eine für Sauerstoff permeable Silikonmembran Sauerstoff zugeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als für Wasserstoffperoxid permeable Membran Cellophan verwendet wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Cholesterinoxidase und ggf. Cholesterinesterhydrolase auf der von der Elektrode abgewandten Seite der Membran immo bilisiert ist.