DE2603004C2 - Verfahren zur immunochemischen quantitativen Bestimmung von Antigenen mittels Antikörpern - Google Patents
Verfahren zur immunochemischen quantitativen Bestimmung von Antigenen mittels AntikörpernInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur immunochemischen quantitativen Bestimmung von Antigenen mittels
Antikörpern, die an ein poröses, Kapillarität aufweisendes Trägermaterial in Form eines Streifens gebunden
sind.
Die bislang angewandten quantitativen immunochemischen Bestimmungsmethoden beruhen auf der Immunodiffusion,
beispielsweise den nach ihren Erfindern benannten Mancini- oder Ouchterlony-Methoden, oder
auf der Immunoelektrophorese, wie im Fall der Elektroimmunobestimmung nach Laurell. Bei diesen Methoden
und ihren Varianten tritt die notwendige Wechselwirkung zwischen dem Antigen und dem Antikörper durch |
einen Diffusionsprozeß und/oder einen elektrophoretischen Vorgang ein.
Aus der DE-OS 21 64 768 ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer Komponente der
Reaktion zwischen einem spezifischen Bindeprotein und der entsprechenden bindefähigen Substanz beschrieben.
Hierbei wird die Flüssigkeit, welche eine der genannten Komponenten enthält, mit einem Kupplungsprodukt
der bindefähigen Substanz mit einem Enzym und mit in unlösliche Form gebrachten Antikörpern gegen das
spezifische Bindeprotein in Kontakt gebracht Anschließend wird in der flüssigen oder festen Phase des Reak-
tionsgemisches die Enzymaktivität bestimmt Bei dieser Methode werden die Reaktionskomponenten derart
zusammengebracht, daß die Umsetzung vollständig ablaufen kann. Es wird das ganze Trägermaterial mit der
einen Reaktionskomponente in das Probenmedium eingetaucht und gleichzeitig der zu bestimmenden Komponente
und dem markierten Antigen ausgesetzt In diesem Zusammenhang ist auch der Einsatz von eine Farbbildungsreaktion
katalysierenden Enzymen erwähnt.
Ein ähnliches Verfahren ist in der DE-OS 22 06 103 beschrieben. Auch hier wird die zu untersuchende Probe
mit der Gesamtmenge des in unlöslicher Form verwendeten Antikörpers in Kontakt gebracht. Wesentlich ist für
dieses bekannte Verfahren, daß es in zwei Stufen durchgeführt wird. Gemäß der ersten Stufe werden die flüssige
und die feste Phase des Reaktionsgemisches voneinander getrennt. In der zweiten Stufe wird das Enzymkupplungsprodukt
verwendet und die Enzymaktivität bestimmt.
Aus der Veröffentlichung »Clin. Chim. Acta«, Band 48 (1973), S. 109-111, ist zu entnehmen, daß für die
Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern eine fluoreszierende Farbindikatorverbindung eingesetzt werden
kann.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technisch sehr einfaches und innerhalb kurzer Zeit durchführbares
quantitatives Verfahren zur Bestimmung eines Antigens in einer Probe anzugeben.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren der eingangs genannten Art, das dadurch gekennzeichnet ist daß
man einen Abschnitt des Streifens in die das zu bestimmende Antigen enthaltende wäßrige Probe eintaucht, die
durch Kapillarkräfte verursachte Wanderung der Bestandteile dieser Probe auf dem Streifen während einer
gewissen Zeit ablaufen läßt, danach den Streifen aus der wäßrigen Probe entnimmt, den Streifen mit einer
wäßrigen Lösung behandelt, welche Antikörper enthält die an eine wasserlösliche fluoreszierende Farbindikatorverbindung
oder an ein eine Farbbildungsreaktion katalysierendes Enzym gebunden sind, sowie mittels der
entsprechenden Fluoreszenz oder Farbbildungsreaktion die Wanderungsstrecke der Antigene auf dem Streifen
■ bestimmt.
Erfindungsgemäß werden die Kapillarkräfte eines porösen Trägermaterials ausgenutzt, an das Antikörper
gebunden sind.
Die erfindungsgemäß geeigneten Antikörper enthält man nach an sich bekannten Methoden durch Immunisieren
eines Tieres der Art, das sich von den Tieren jener Art unterscheidet, deren Antigen untersucht werden
soll. Beispielsweise erhält man Antikörper gegen Humanproteine (Albumin, ^-Globulin, Fibrinogen, Transferrin)
ohne weiteres von Kaninchen, Ziegen, Schafen, Pferden und Meerschweinchen. Solche Antikörper sind in dem
Blut der immunisierten Individuen enthalten, und insbesondere enthält die^-Globulinfraktion (Immunoglobulin)
die Antikörper.
Erfindungsgemäß geeignete poröse, Kapillarität aufweisende Trägermaterialien sind beispielsweise die verschiedenartigen,
Cellulosefasern enthaltenden Materialien, wie Filterpapier, Chromatographiepapier, lonenaustauscherpapier,
Celluloseacetatfolien, Celluloseacetatscheiben, CeÜulose-Dünnschichtchromatographiescheiben
sowie Folien aus Materialien, wie Stärke, einem dreidimensionalen Netzwerk oder einer dreidimensionalen
Matrix aus Dextranketten, die mit Epichlorhydrin vernetzt sind, oder Folien aus einem Kunststoff, wie Polyvinylchlorid,
keramischem Material und Kombination, wie Polyvinylchlorid-Siliciumdioxid-Materialien.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Herstellung von zur quantitativen Bestimmung von Antigenen geeigneten Trägermaterialien.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Herstellung von zur quantitativen Bestimmung von Antigenen geeigneten Trägermaterialien.
Binden der Antikörper an das Kapillarität aufweisende Trägermaterial
unter Verwendung von Bromcyan
Man taucht 10 g Filterpapier als Cellulose enthaltendes Material während 5 Minuten in destilliertes Wasser
ein. Anschließend gibt man eine Lösung von 8 g Bromcyan (CNBrJ in 300 ml destilliertem Wasser zu, stellt den
pH-Wert mit 1 m NaOH-Lösung auf einen Wert von 10,5 ein und hält diesen Wert durch entsprechende Mitte)
zur Einstellung des pH-Wertes aufrecht Die Reaktion wird während 20 Minuten durchgeführt, wonach man die
überstehende Lösung abdekantiert Das mit Bromcyan behandelte Cellulosematerial wird über Nacht bei +40C
in einer Lösung von 500 mg Kaninchen-^-globulin-gegen-Human-^globulin (IgG Fc-Fragment) in 10 ml 0,1m
Natriumbicarbonatlösung inkubiert und dann während 3 Stunden mit 100 ml einer 0,005m wäßrigen Äthanolaminlösung
inkubiert wonach man mit 500 ml einer 0,5m Natriumbicarbonatlösung und dann mit 200 ml eines 0,1 m
Acetatpuffers mit einem pH-Wert von 4,0 und dann bei +40C mit 500 ml eines 0,075m Natriumbarbiturstpuffers,
der mit 0,3% Albumin versetzt ist, wäscht
Binden der Antikörper an das Kapillarität aufweisende Trägermaterial
unter Verwendung von Glutaraldehyd
unter Verwendung von Glutaraldehyd
Man inkubiert 0,6 g eines Celluloseacetatfilms mit einer Lösung von 100 mg Kaninchen-^-globulin-gegen-Human-^-globulin
(IgG Fc-Fragment) während 30 Minuten in 10 ml eines 0,1m Phosphatpuffers mit einem pH-Wert
von 6,8. Nachdem man die Lösung abdekantiert hat, inkubiert man den Film während 30 Minuten in 10 ml
einer wäßrigen l°/oigen Glutaraldehyd-Lösung, wonach man das Material während 15 Minuten in 10 ml einer
1,0m wäßrigen Methylaminlösung ir.kubiert Anschließend wäscht man den Film mit 100 ml eines 0,075m Natriumbarbiturat-Puffers
und läßt das Material bei +40C in dem gleichen Puffer, der mit 0,3% Albumin versetzt
worden ist.
Binden von Antikörpern an das Kapillarität aufweisende Trägermaterial
durch Adsorption oder Absorption
Man inkubiert 10 g von handelsüblichem Polyvinylchlorid-Siliciumdioxid in Form eines mikroporösen Kunststoff
blattes mit einem Siliciumdioxidgehalt von etwa 50% über Nacht bei +40C mit einer Lösung von 500 mg
Kaninchen-^-globulin-gegen-Human-^-globulin (IgG Fc-Fragment) in 100 ml eines O,lm-Phosphatpuffers mit
einem pH-Wert von 6,8. Nach dem vollständigen Inkubieren wäscht man das Material mit 11 einer phosphatgepufferten
physiologischen NaCl-Lösung mit einem pH-Wert von 7,0. Das erhaltene Polyvinylchlorid-Siliciumdioxid-Blatt
mit dem daran adsorbierten ^-Globulin wird zwischen Filterpapier getrocknet.
Herstellung von fluoreszierenden Antikörper-Komplexen
(Konjugaten)
(Konjugaten)
a) Man löst 720 mg Kaninchen-z-globulin-gegen-Human-^-globulin (IgG Fc-Fragment), 0,57 g NaCl, 0,259 g
NaHCO3 und 0,049 g Na2CO3 · 10 H2O in 72 ml destilliertem Wasser. Man kühlt die erhaltene Reagenslö- eo
sung in einem Eisbad und versetzt sie unter Rühren mit 36 mg Fluoreszeinisothiocyanat. Man läßt die
Lösung während 18 Stunden in der Kälte unter Rühren stehen. Anschließend dialysiert man die Mischung
gegen eine phosphatgepufferte physiologische Natriumchloridlösung mit einem pH-Wert von 7,0 bis die
Dialyseflüssigkeit nicht mehr fluoresziert. Der erhaltene Antikörper-Komplex wird eingefroren.
b) Man löst 720 mg Kaninchen-^-globulin-gegen-Human-^-globulin (IgG Fc-Fragment), 0,57 g NaCI, 0,259 g
NaHCO3 und 0,049 g Na2CO3 · 10 H2O in 72 ml destilliertem Wasser. Man kühlt die erhaltene Reagenslösung
in einem Eisbad und gibt unter Rühren eine Lösung von 9 mg Rhodamin in 2 ml Aceton zu. Man rührt
die Lösung in der Kälte während 18 Stunden. Anschließend dialysiert man die Mischung gegen eine
phosphatgepufferte physiologische Natriumchloridlösung mit einem pH-Wert von Γ.0, bis die Dialyseflüssigkeit
nicht mehr fluoresziert Der erhaltene Antikörper-Komplex wird eingefroren.
c) Man löst 720 mg Kaninchen-^-globulin-gegen-Human-^globulra (IgG Fc-Fragment), 0,57 g NaCl, 0,259 g
NaHCO3 und 0,049 g Na2CO3 · 10 H2O in 72 ml destilliertem Wasser. Man kühlt die erhaltene Reagensmischung
in einem Eisbad und gib:: unter Rühren eine Lösung von 20 mg Dansylchlorid in 7 ml Aceton zu. Man
rührt die Lösung dann während 18 Stunden in der Kälte. Anschließend dialysieri man «lie Mischung gegen
eine phosphatgepufferte physiologische Natriumchloridlösung mit einem pH-Wert von 7,0, bis die Dialyseflüssigkeit
nicht mehr fluoresziert. Der erhaltene Antikörper-Komplex wird dann gefroren.
jo Beispiel 5
Herstellung von Laktatdehydrogenase-isoenzym-FL»-Antikörperkomplex
(Konjugat)
Man dialysiert eine Suspension von 4,5 mg Laktatdehydrogenaseisoenzym-H4 in Ammoniumsulfat gegen
einen O.lm-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,8. Unter Rühren gibt man 2,25 mg Kaninchen-^-globulingegen-Haman-^-globulin
(IgG Fc-Fragment) und einen Phosphatpuffer in einer solchen Menge zu, daß sich ein
Gesamtvolumen von 135 ml ergibt Nachdem sich das gesamte Kaninchen-^-globulin gelöst hat gibt man
tropfenweise 45 μΐ l°/oiger Glutaraldehydlösung zu und läßt die Reaktionsmischung während 2 Stunden bei
Raumtemperatur stehen. Dann dialysiert man die Mischung gegen einen Natriumbarbiturat-Puffer und läßt den
Komplex bei +4°C stehen. Vor der Verwendung wird das Material mit 10 ml Barbituratpuffer, der mit 2%
Albumin versetzt worden ist verdünnt
Überprüfung der Bindung des Antikörpers an das Trägermaterial
Für die Untersuchung werden jeweils zwei Streifen der gemäß den Beispielen 1 bis 3 mit Antikörpern
behandelten porösen Trägermaterialien und zwei unbehandelte Streifen aus dem gleichen porösen Material
eingesetzt Ein Streifen einer jeden Art (das heißt ein unbehandelter Streifen und ein behandelter Streifen) wird
in einer Lösung von 1 mg Human-/-globulin (IgG) in 1 ml Natriumbarbituratpuffer inkubiert. Dann werden
sämtliche Streifen insgesamt zehnmal mit 20 ml Natriumbarbituratpuffer, der 0,15m NaCl enthält gewaschen,
wonach die Streifen während 10 Minuten in einer Lösung des Fluoreszeinisothiocyanat-Antikörper-Komplexes
inkubiert werden. Nach wiederholten Waschvorgängen entsprechend der zuvor durchgeführten Stufe werden
die Streifen getrocknet und im Ultraviolett-Licht mit einer Wellenlänge von 340 nm untersucht, wobei sich zeigt,
das Fluoreszenz nur bei jenen Streifen auftritt die die gebundenen Antikörper enthalten und in der IgG-Lösung
inkubiert worden sind. Bei der Untersuchung der nach der Verfahrensweise des Beispiels 3 hergestellten Streifen
werden als Kontrollmaterialien Streifen verwendet die mit Rinderalbumin behandelt worden sind.
Quantitative immunochemische Bestimmung
Beispiel A
Beispiel A
Die zu untersuchende Probe wird — in bekannter Menge, die vorzugsweise zwischen 1 μΐ und 3 μΐ liegt — auf
ein erfindungsgemäß eingesetztes, Kapillarität aufweisendes Trägermaterial zusammen mit einem gleichen
Volumen einer Standardlösung aufgebracht die einen bekannten Gehalt des zu untersuchenden Antigens
aufweist wobei man neben der Testlösung verschiedene Verdünnungen bereitet.
Als mobile Phase zur Erleichterung der Wanderung unter Einwirkung der Kapillarkräfte wird beispielsweise
ein O,O75m-Natriumbarbituratpuffer, der mit 0,3% Albumin versetzt ist eingesetzt.
Die Kapillarwanderung kann sowohl in offenen als auch geschlossenen Testbehältern durchgeführt werden.
Weiterhin kann man die mobile Phase sich aufwärts oder abwärts bewegen lassen. Günstigerweise sollte man
einen geschlossenen Behälter anwenden und die mobile Phase aufsteigen lassen. Nach einer beliebigen Zeit nach
Beginn der Wanderung unter Einwirkung der Kapillarkräfte, die sich von etwa 10 bis etwa 45 Minuten erstreckt
wird das feuchte Trägermaterial in eine Antikörperlösung überführt, die entweder an Fluoreszeinisothiocyanat
oder an Laktatdehydrogenase gebundene Antikörper enthält Die bevorzugte Inkubationszeit für diese beiden
Indikatorlösungen beträgt 10 Minuten. Nach dem Inkubieren wird das Trägermaterial während 5 Minuten unter
laufendem Wasser mit einer Temperatur von + 37° C gewaschen, wonach man vorzugsweise zweimal während 5
Minuten in 20 ml eines Natriumbarbituratpuffers inkubiert, der 0,2% Albumin und 0,15m NaCl enthält.
Wenn fluoreszierende Antikörper für die Identifizierung verwendet werden, wird die Strecke, die der Antikörper
gewandert ist, im Ultraviolettlicht mit einer Wellenlänge von 340 nm bestimmt. Wenn eine Laktatdehydrogenase-Antikörper-Lösung
verwendet wird, wird das Trägermaterial in einem wie folgt zusammengesetzten Farbstoffbad behandelt:
Man löst 30 mg 2,2'-Di-p-nitrophenyl-5,5'-di-phenyl-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-diphenylen)-ditetrazoliumchlorid
(Nitroblautetrazolium) und 40 mg Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) in 56 ml 0,5m Tris-Puffer mit einem
pH-Wert von 7,4. Die Mischung versetzt man mit 1,60 ml 3,6m Lihtiumlaktatlösung, 5 ml 0,O6m Calciumcyanidlösung
und einigen Körnchen Methylphenazoniummetasulfat, die man in 2 ml destilliertem Wasser gelöst hat. Das
Kapillarität aufweisende Trägermaterial wird bei +370C in dem Farbstoffbad inkubiert, bis eine deutliche
Färbung beobachtet werden kann. Die Farbentwicklung ist eine Folge der Tatsache, daß die Laktatdehydrogenase
die Reaktion
Laktat + NAD «■ Pyruvat + NADH2
katalysiert und daß das gebildete NADH2 quantitativ den Nitroblautetrazolium-Farbstoff zu einer unlöslichen,
lila gefärbten, formazanartigen Verbindung reduziert (siehe Fieser & Fieser, Organic Chemistry, Reinhold Publishing
Corporation, New York, 1956).
Die angefärbten, mit Antigen bedeckten Bereiche des Trägermaterials nehmen mit zunehmendem Antigengehalt
der untersuchten Proben zu. Die gebundenen Antikörper-Moleküle verzögern die Wanderung der Antigen-Moleküle
durch Austauschreaktionen während der Wanderung unter Einwirkung der Kapillarkräfte. Je höher
die Antigenkonzentration ist, um so geringer ist die Verzögerungswirkung, da die durchschnittliche Zeit, während
der ein Antigenmolekül an einen Antikörper gebunden bleibt, mit zunehmender Antigenkonzentration
abnimmt.
Man taucht Streifen aus dem erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper enthaltenden, porösen (das heißt
Kapillarität aufweisenden) Trägermaterial in bestimmter Tiefe, beispielsweise 3 mm, in ein geringes Volumen
einer Lösung des zu untersuchenden Antigenmaterials ein. Man läßt die in dieser Weise in Gang gebrachte
Wanderung aufgrund der Einwirkung der Kapillarkräfte während etwa 3 bis etwa 20 Minuten fortlaufen,
wonach man die Wanderung unterbricht, indem man den Streifen aus der Lösung nimmt. Dann wird die
Wanderungsstrecke des Antigens in der in Beispiel A beschriebenen Weise gemessen und das Ergebnis wird
nach der dort angegebenen Methode bewertet.
Die Streifenform des porösen Trägermaterials kann unterschiedlich ausgebildet sein und z. B. die Dicke von
Filterpapier aufweisen oder erforderlichenfalls etwas dicker sein oder in Form eines Films (der auch eine
Membran oder eine Schicht sein kann) oder einer Scheibe vorliegen.
In dem Ausdruck »Trägermaterial« wird der Begriff »Träger« in dem Sinn verwendet, daß die Antikörper an
das Trägermaterial gebunden sind, beispielsweise durch Adsorption oder durch eine sogenannte kovalente
Bindung, wobei das Material in Form eines Teststreifens vorliegt, der das poröse, Kapillarität aufweisende
Antikörper-Trägermaterial umfaßt, an das die Antikörper gebunden sind.
Das mikroporöse Kunststoffblatt aus Polyvinylchlorid, das mit feinteiligem, im wesentlichen gleichmäßig in
der porösen Polymerisatmatrix verteiltem Siliciumdioxid modifiziert ist, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, kann
aus einem ähnlichen Blatt aus einer in gleicher Weise durchlässigen oder porösen, ununterbrochenen Polymerisatmatrix
aus den normalerweise leicht zugänglichen Vinylchlorid-Propylen-Mischpolymerisaten oder Vinylchlorid-Vinylacetat-Mischpoiymerisaten
bestehen, in die allen Fällen fein verteiltes Siliciumdioxid in ähnlicher Weise eingebettet ist
Das Beispiel 3 wurde in gleicher Weise durchgeführt, wobei jedoch das mikroporöse Kunststoffblatt durch ein
mikroporöses Kunststoffblatt aus einem mit Siliciumdioxid modifizierten Vinylchlorid-Propylen-Mischpolymerisat
und im anderen Fall durch ein entsprechendes mikroporöses Kunststoffblatt aus einem siliciumdioxidmodifizierten
Vinylchlorid-Vinylacetat-Mischpolymerisat ersetzt wurde.
Die obengenannten mikroporösen Blätter sind mit einem mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis etwa 1 μπι
und mehr erhältlich, beispielsweise mit einem Porendurchmesser von 0,1, 0,2, 0,3 und 0,5 μΐη, wobei diese
Materialien eine Gesamtporosität (durch das Einführen von Quecksilber gemessen) von etwa 1,1 bis etwa
1,8 mm pro Gramm im Fall des siliciumdioxidmodifizierten mikroporösen Kunststoffmaterials aufweisen.
Claims (5)
1. Verfahren zur immunochemischen quantitativen Bestimmung von Antigenen mittels Antikörpern, die an |
ein poröses, Kapillarität aufweisendes Trägermaterial in Form eines Streifens gebunden sind, dadurch |
gekennzeichnet, daß man einen Abschnitt des Streifens in die das zu bestimmende Antigen enthalten- |
de wäßrige Probe sintaucht, die durch Kapillarkräfte verursachte Wanderung der Bestandteile dieser Probe
auf dem Streifen während einer gewissen Zeit ablaufen läßt, danach den Streifen aus der wäßrigen Probe
entnimmt, den Streifen mit einer wäßrigen Lösung behandelt, welche Anthcörper enthält, die an eine wasserlösliche
fluoreszierende Farbindikatorverbindung oder an ein eine Farbbildungsreaktion katalysierendes
ι ο Enzym gebunden sind, sowie mittels der entsprechenden Fluoreszenz oder Farbbildungsreaktion die Wanderungsstrecke
der Antigene aud dem Streifen bestimmt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägermaterial in Form eines
Streifens Stärke, Polyvinylchlorid, keramisches Material oder eine, fein verteiltes Siliciumdioxid enthaltende
Matrix aus Polyvinylchlorid, Vinylchlorid-Propylen-Mischpoylmerisat oder Vinylchlorid-Viynlacetat-Mischpolymerisat
einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Trägermaterial einsetzt, an das die
Antikörper durch Adsorption oder unter Verwendung von Bromcyan oder Glutaraldehyd durch kovalente |
Bindungen gebunden sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägermaterial eine Polyvinylchlorid-Siliciumdioxid-Kombination,
an welche Antikörper gegen Human-^-globulin adsorbiert sind, einsetzt
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbindikatorverbindung Fluoreszeinisothiocyanat,
Rhodamin oder Dansylchlorid einsetzt
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