DE2560557C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft eine hydrophobe, proteinimmobilisierte Membran
und ein Verfahren zu deren Herstellung.
Die spezifische Reaktion eines speziellen Proteins mit
einem anderen ist allgemein bekannt und eine solche tritt
beispielsweise bei der Entwicklung spezifischer Antikörper
zur Bekämpfung eines speziellen Antigens im Tierkörper
auf. Dieses spezifische Ansprechen eines Proteins auf ein
anderes wird in der Affinitätschromatographie zur Abtrennung
eines spezifischen Proteins ausgenutzt, das in
einer speziellen Lösung anwesend ist.
Eine solche selektive Reaktion zwischen zwei Verbindungen
existiert bei zahlreichen Substanzen; so reagieren Proteine
einschließlich Hormone und Enzyme sowie Poly- und Monosaccharide
selektiv mit spezifischen Verbindungen, und
alle diese Reaktionen werden im Rahmen der vorliegenden
Beschreibung als immunochemische Reaktionen bezeichnet.
Affinitätschromatographische Materialien wie z. B. Säulenpackungen
werden ausgehend von hydrophilen polymeren Oberflächen
hergestellt, die in Anbetracht ihres polaren Charakters
reaktive Stellen besitzen, an die eine proteinreaktive
Verbindung angefügt werden kann. Der hydrophile
Charakter des Substrats wird durch die Proteinanlagerung
nicht beeinträchtigt.
Ein Proteinmolekül wie ein Antikörper oder Antigen in einer
Pufferlösung zeigt eine ausgeprägte elektrische Ladung,
deren Höhe und Polarität vom isoelektrischen Punkt des
Proteins und der Zusammensetzung des Puffers abhängt. Diese
Ladung wird durch Antikörper-Antigen-Reaktionen verändert.
Obgleich nun die Größe der resultierenden Änderung der
elektrischen Ladung nachzuweisen ist, ist die Proteinimmobilisierung
auf einer hydrophilen Membran unbefriedigend,
da die ionische Wirkung von Wasser auf die polaren Gruppen
des hydrophilen Substrats so stark ist, daß sie die durch
die immunochemische Reaktion induzierte geringe Änderung
des elektrischen Potentials überdeckt.
Aus der DE-OS 22 47 163 ist ein Verfahren zur Herstellung
eines Trägermatrix zur Fixierung biologisch wirksamer
Stoffe bekannt, wobei man ein Polymer, das Säurehydrazidgruppen
oder Säureazidgruppen enthält, durch Umsetzung dieser
Gruppen mit einem difunktionellen Reagenz teilweise vernetzt und
nicht vernetzte funktionelle Gruppen mindestens teilweise
in reaktive Gruppen, die mit dem biologisch wirksamen
Stoffen reagieren können, überführt. Das bifunktionelle
Reagenz kann eine Kohlenwasserstoffkette mit bis zu 18
Kohlenstoffatomen enthalten, so daß Kohlenwasserstoffketten
kovalent über polare Gruppen mit der Trägermatrix
verbunden sind. Als Trägermatrix können Carboxylmethylcellulose
oder Polyacrylsäure verwendet werden, die hydrophilen
Charakter haben. Diese bekannten Membrane eignen
sich jedoch nicht zum Nachweis reaktionsfähiger Verbindungen
mittels immunochemischer Reaktion durch Messung der Potentialänderung.
Aus der DE-AS 19 15 970 ist ein Verfahren zur Herstellung
von Membranen mit immobilisierten aktiven
Proteinen bekannt, bei dem ein Träger mit einer Lösung mindestens
einer aktiven Proteinsubstanz in Gegenwart
eines Brückenbildners umgesetzt wird. Als Träger können
makromolekulare Stoffe auf Basis von Cellulose, Amylose,
Polysacchariden, Alginate, Kollagen, Polyvinylalkohol,
Polysilan, Polyacrylamid oder deren Substitutionsprodukten
verwendet werden. Als Brückenbildner werden
bifunktionelle Verbindungen verwendet. Mit der bekannten
Membran kann die Durchgangsgeschwindigkeit von
Gasen durch die Membran gesteigert werden.
Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine hydrophobe proteinimmobilisierte
Membran sowie ein Verfahren zu deren Herstellung
zur Verfügung zu stellen, mit der die durch
immunochemische Reaktion induzierte Änderung des
elektrischen Potentials ungestört gemessen werden kann,
so daß ein qualitativer, insbesondere quantitativer
Nachweis einer zu einer immunochemischen Reaktion reaktionsfähigen
Verbindung möglich ist.
Die Aufgabe wird mit der im Patentanspruch 1 gekennzeichneten
Membran gelöst. Das Verfahren zur Herstellung der
Membran ist im Anspruch 3 definiert. Die Ansprüche 2 und 4
betreffen vorteilhafte Ausgestaltungen der Membran bzw. des beanspruchten Verfahrens.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die Oberflächenladung
der Polymer/Lösungsgrenzfläche von der
einen Ladung des immobilisierten Proteins (Antikörper)
abhängt, wenn alle Proteine kovalent an der Oberfläche
eines hydrophoben Substrats gebunden sind, das wiederum
auf einem Leiter aufgebracht ist. Wenn in
der Lösung entsprechendes Antigen anwesend ist und
die Bindungsstelle des Antikörpers während der Immobilisierung
(Bindung an das Polymere) nicht zerstört
wird, findet die immunochemische Reaktion an der Grenzfläche
mit daraus resultierender Änderung der Oberflächenladung
statt. Diese Änderung kann potentiometrisch
gegenüber einer Bezugselektrode gemessen werden,
die in die gleiche Lösung eintaucht.
Die Membran umfaßt ein Substrat aus einem hydrophoben Polymeren,
das durch Lösungsmittelwirkung quellbar ist und in dem
eine - vorzugsweise aliphatische - Kohlenwasserstoffkette
mit einer geeignet reaktiven Gruppe aus einem Lösungsmittelsystem
partiell absorbiert ist. Die
resultierende hydrophobe Membran besitzt eine partiell absorbierte
Kohlenwasserstoffkette, die eine protein-reaktive
Gruppe, wie eine Epoxidgruppe, oder eine andere protein-reaktive
Gruppe enthält. Die Kette kann von Kohlenstoff-Kohlenstoffbindungen
verschiedene Verknüpfungen oder Kettenglieder
wie Ätherbindung aufweisen.
Vorzugsweise umfaßt die Membran
Kohlenwasserstoffketten, die in einer mit einem Polypeptid
spezifisch reaktiven Gruppe enden. Die
Membran ist mit Kohlenwasserstoffketten versehen, die jeweils
eine reaktive Gruppe aufweisen, die zur Bindung einer spezifisch
protein-reaktiven Gruppierung durch Kontakt der reaktiven
Gruppe mit der protein-reaktiven Gruppe befähigt
ist, wodurch die protein-reaktive Gruppe über die Kette an die Membran
gebunden wird. Geeignete protein-reaktive Gruppen sind
Antigene oder Antikörper.
Die hydrophobe Membran wird als Hülle einer hochleitfähigen
Elektrode wie beispielsweise Platin verwendet. Ein
Protein, z. B. ein Antikörper, mit einer Selektivität für die
Reaktion mit einem speziellen Protein (Antigen) wird mit der
protein-reaktiven Gruppe zur Reaktion gebracht,
so daß zumindest einige der protein-reaktiven
Gruppen ein Proteinmolekül enthalten. Durch Eintauchen
einer solchen beschichteten Elektrode zusammen mit
einer Bezugselektrode in eine das Antigen enthaltende wäßrige
Lösung erhält man ein elektrisch empfindliches System, das
in der Lage ist, die durch Einfangen eines speziellen Proteins
(Antigens) durch die mit einem immunoreaktiven Antikörper versehene
Elektrode verursachte Änderung der elektrischen Ladung
an der Lösung/Polymer-Grenzfläche zu messen. Alternativ
kann das Antigen für ein selektives Einfangen des Antikörpers
an der Membran immobilisiert werden.
Für die Erzeugung der hydrophoben proteinimmobilisierten Membran
mit selektiver immunochemischer Wirksamkeit
wird ein Substrat aus einem hydrophoben
Polymeren verwendet. Das Polymere ist vorzugsweise mit
einem organischen Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung,
insbesondere mit aliphatischen Lösungsmitteln, quellbar.
Für die praktische Durchführung der Erfindung besonders
brauchbare Polymere sind solche hydrophoben Polymeren, die
keine anhängenden polaren Gruppen enthalten. Zu typischen
Polymeren für diesen Zweck gehören thermoplastische Polymere
wird Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen,
Siliconkautschuk, Polyurethan, Polycarbonat oder Polytetrafluoräthylen.
Warmhärtende Polymere wie Epoxyharze und
vernetzte Polyester können auch angewandt werden. Bevorzugt
werden Polymere, die durch Tauchbeschichtung oder Aufgießen
oder Aufschrumpfen auf eine Elektrode aufgebracht werden
können.
Die polymere Membran wird dann mit einem zur Anquellung
der Membran befähigten Lösungsmittelsystem so lange behandelt,
daß die Membran zumindest soweit angequollen wird,
daß die Kohlenwasserstoffkette in genügender Konzentration,
wie nachfolgend beschrieben, in der Oberfläche der Membran partiell absorbiert
ist. Das Lösungsmittelsystem enthält neben einem geeigneten
Lösungsmittel eine Kohlenwasserstoffverbindung mit einer reaktiven
Gruppe, die sich vorzugsweise am Ende der Kohlenwasserstoffkette
oder in dessen Nähe befindet. Als Lösungsmittel
zum Anquellen der polymeren Membran dienen vorzugsweise solche,
die durch Trocknen des Polymeren ohne weiteres entfernt werden
können. So werden Lösungsmittel mit geringeren Molekulargewichten
im allgemeinen gegenüber solchen mit höheren Molekulargewichten
bevorzugt. Wie im nachfolgenden angegeben ist,
wird bevorzugt, daß das Lösungsmittel einen niedrigeren Siedepunkt
hat und leichter abgedampft wird als die Kohlenwasserstoffverbindung
mit einer reaktiven Gruppe. Eine typische
Lösungsmittelmischung für PVC umfaßt Petroläther mit einem
Siedebereich von 30 bis 60°C und Toluol. Andere Lösungsmittel
oder Mischungen derselben können zum Anquellen von PVC oder
anderen Polymermaterialien benutzt werden, diese sind jedoch
dem Fachmann bekannt oder sie können durch einfache Versuche
ermittelt werden.
Eine typische Kohlenwasserstoffverbindung mit einer
reaktiven Gruppe ist n-Decanol. Weiter im Rahmen der Erfindung
besonders brauchbare Verbindungen sind n-Hexanol,
n-Decylamin, n-Hexyl-amin, n-Decansäure und ähnliche Verbindungen
mit beweglichem Wasserstoff.
Nach Tränken der polymeren Membran mit dem Lösungsmittelsystem
für eine ausreichend lange Zeitdauer zur Herbeiführung
des erforderlichen Quellungsgrades wird die Membran
bei einer geeigneten Temperatur zur Entfernung des Lösungsmittels
ohne Abtrennung wesentlicher Mengen der Kohlenwasserstoffverbindung
mit der reaktiven Gruppe getrocknet. Wenn
Petroläther, Toluol und Lösungsmittel von ähnlichem Siedebereich
benutzt werden, liegt eine typische Trockentemperatur
bei etwa 50 bis 100°C, zweckmäßigerweise 50 bis 60°C (vorzugsweise
unter vermindertem Druck). Die Entfernung des Lösungsmittels
liefert eine Membran mit einer geringen Konzentration
an anhängenden Kohlenwasserstoffketten, von denen jede eine
reaktive Gruppe, wie beispielsweise Hydroxyl-, Amin- oder
Carboxylgruppe, aufweist.
Die Auswahl des Lösungsmittels (und damit seines
Siedepunkts) und der anzuwendenden Drucke bei seiner Entfernung
erfolgt unter Berücksichtigung der Natur und Eigenschaften
der Membran und des Kohlenwasserstoffs. Für die hier
benutzten Polymeren sind Lösungsmittel, von denen sie angequollen
werden, bekannt.
Anschließend an die partielle Absorption der Kohlenwasserstoffkette
an die polymere Membran erfolgt eine Behandlung
zur Erzielung einer proteinimmobilisierten Membran, d. h.
einer Membran mit der Fähigkeit zum Einfangen eines spezifischen
Proteins,
wie bei einer immunochemischen
Reaktion.
Es ist zu bemerken, daß die Kohlenwasserstoffkette
mit einer geeigneten protein-reaktiven Gruppe versehen
werden kann, bevor sie in die Membran eingeführt wird (in
diesem Falle sollte natürlich sichergestellt werden, daß die
Gruppe eine genügende Freiheit zur Entfaltung ihrer Reaktivität
besitzt - vorzugsweise durch Sicherstellung, daß sie
nicht weniger als 6 Kohlenstoffatome von der Membran
entfernt ist) oder aber die Gruppe kann in die Kette nach
deren Absorption an die Membran eingebaut werden.
Protein-reaktive Gruppen können durch Kontakt der
Membran mit einem geeigneten Material erhalten werden, das
zur Reaktion mit der Kohlenwasserstoffkette zur Herbeiführung
der erforderlichen spezifischen Aktivität befähigt
ist oder es kann die Anwendung einer verknüpfenden Gruppe
notwendig sein, um die reaktive Gruppe an der Kette zur
Bindung einer geeigneten protein-reaktiven Gruppe zu
befähigen. Derartige Alternativen ergeben sich dem Fachmann
ohne weiteres, und die Auswahl der geeigneten Arbeitsfolge
wird im Hinblick auf die Eigenart der verschiedenen beteiligten
Materialien und Gruppen getroffen werden.
So kann die Anwendung einer verknüpfenden Gruppe
für Protein zu den folgenden Arbeitsschritten führen:
Nach dem Trocknen der polymeren Membran wird diese in eine
Lösung getaucht, die eine Verbindung mit einer spezifischen
protein-reaktiven Gruppe und einer weiteren reaktiven Gruppe
enthält, die mit der reaktiven Gruppe der nun der Membran angefügten
Kohlenwasserstoffkette reagieren kann. Wenn die
reaktive Gruppe der Kohlenwasserstoffkette beispielsweise
eine Hydroxylgruppe ist, so kann als typische protein-reaktive
Verbindung ein Epichlorhydrin angewandt werden, wodurch eine
verknüpfende Gruppe mit Epoxid und Äther gebildet wird.
Andere Kohlenwasserstoffmoleküle können in die Membran eingeführt
werden, wie beispielsweise aliphatische Amine, vorzugsweise
primäre und sekundäre Amine sowie carboxyhaltige aliphatische
Verbindungen, und diese können zur Reaktion
mit Epichlorhydrin oder einem Bis-Epoxid befähigt sein, in
dem ein Epoxidringpaar für eine Umsetzung vorhanden ist. Erwünschtermaßen
sollte keine Wahrscheinlichkeit für eine Vernetzung
zwischen einem Paar von anhängenden Gruppen bestehen,
die an der Membranoberfläche hängen.
Eine geeignete Behandlungsserie für einen an einer
polymeren Membran partiell absorbierten (hängenden)
aliphatischen Alkohol wird nachfolgend skizziert:
Proteine mit Aminogruppen sind in der Lage, mit der
Epoxidgruppe zu reagieren, die der Membran angefügt ist, unter
Bildung einer Membran mit einem immobilisierten Protein, das
zum Einfangen und Nachweis eines spezifischen Proteins in einer Reaktion
vom immunochemischen Typ befähigt ist.
Zu weiteren Techniken bei der Herstellung einer proteinimmobilisierten
Membran gehören:
Ein weiteres Proteinkupplungssystem umfaßt die Erzeugung
einer Diimidverknüpfung zwischen der Kohlenwasserstoffkette
und einem Proteinmolekül; eine aliphatische Verbindung mit
einer Carboxylgruppe wird mit Carbodiimid umgesetzt, dessen
Reaktionsprodukt mit einem geeigneten Protein zur Reaktion
gebracht wird.
Nach Umsetzung der protein-reaktiven verknüpfenden
Verbindung (d. h. der eine proteinimmobilisierende Gruppe enthaltenden
Verbindung wie z. B. Epichlorhydrin) mit dem beweglichen
Wasserstoff der in der Membranoberfläche partiell absorbierten Kohlenwasserstoffkette
zur Bildung der proteinverknüpfenden Gruppe, wird
die Membran, vorzugsweise gewaschen und in eine Lösung gebracht,
die das zu immobilisierende Protein mit spezifischer Antikörper-Antigenreaktivität enthält. Zimmertemperatur
ist eine bevorzugte Reaktionstemperatur und der Ablauf der
Reaktion über ein bis zwei Tage wird im allgemeinen bevorzugt.
Die Reaktion erfolgt im allgemeinen in einem leicht basischen
Medium.
Nach Umsetzung des Proteins erfolgt eine Behandlung
zum Fortspülen von Resten nicht-umgesetzter Materialien und
ferner vorzugsweise eine Umsetzung mit einer Verbindung zur "Neutralisation"
irgendwelcher nicht-umgesetzter protein-reaktiver
Gruppen, die nach Reaktion mit dem Proteinmolekül
verblieben sind. (Nicht-umgesetzte protein-reaktive Gruppen
haben die Tendenz, polar zu sein und sie sind ebenfalls
unerwünscht, da sie unspezifisch mit Proteinen reagieren und
bei einem Proteinnachweis fehlerhafte Ergebnisse liefern können).
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Membran
wird eine aliphatische Kohlenwasserstoffverbindung
mit einer
reaktiven Gruppe verwendet, die
zumindest 6 Kohlenstoffatome
von einem Ende derselben entfernt ist. Bevorzugt werden Kettenlängen, bei denen die
Hauptkette der Kohlenwasserstoffverbindung 8 bis 12
Kohlenstoffatome enthält und die Kettenlänge
wird vorzugsweise so gewählt, daß die spezifische reaktive
Gruppe von der Membranoberfläche um
zumindest 8 Kohlenstoffatome entfernt ist. Wenn
eine protein-reaktive verknüpfende Verbindung, die mit der reaktiven Gruppe der Kohlenwasserstoffverbindung zur
Reaktion gebracht wird, eine größere Kettenlänge besitzt,
so daß die am Ende gebildete protein-reaktive Gruppe von
der Oberfläche um zumindest 6 Kohlenstoffatome entfernt hängt,
braucht die Kettenlänge des Kohlenwasserstoffs nicht so lang zu sein.
Die erfindungsgemäßen Membranen können
zum qualitativen
und vorzugsweise quantitativen Nachweis der Anwesenheit einer
speziellen Verbindung in einer gegebenen Mischung, wie z. B.
einer die Verbindung enthaltenden Lösung eingesetzt werden.
Eine Beschichtung oder Hülle aus der eine Kohlenwasserstoffkette
mit einer reaktiven Gruppe enthaltenden hydrophoben
polymeren Membran wird auf der Meßelektrode
in einer Dicke von etwa 10 bis 50 µm gebildet,
wobei Dicken von etwa 20 bis 40 µm besonders bevorzugt werden.
Vorzugsweise ist die Membran nicht dicker als 100 µm und nicht
dünner als 5 µm. Ein Protein
wird an der
Membran immobilisiert. Die Meßelektrode wird in Verbindung
mit einer Bezugselektrode verwendet. Die beiden Elektroden
werden in eine Mischung, typischerweise eine Lösung, eingetaucht,
die ein Protein oder eine andere Verbindung des zu
identifizierenden Typs enthält. Die Meßelektrode und die Bezugselektrode
werden mit einem Meßgerät verbunden, das auf
sehr geringe Änderungen des elektrischen Potentials anspricht.
Beim Einfangen des speziellen Proteins durch die Meßelektrode
ändert sich das elektrische Potential an der Polymer/Lösungsgrenzfläche.
Diese geringe Änderung wird vom Meßgerät nachgewiesen,
das in der elektrischen Schaltung eine hohe Impedanz
besitzt und die Anwesenheit der Verbindung somit anzeigt.
Durch Eichung kann das Meßgerät für eine quantitative Bestimmung
der in der Lösung anwesenden Verbindungsmenge verwendet
werden.
Die Bezugselektrode kann aus irgendeinem von einem
weiten Bereich von geeigneten Elektrodenmaterialien bestehen,
von denen viele bekannt sind, obgleich gefunden wurde, daß es
vorteilhaft ist, als Bezugselektrode eine zweite Elektrode
zu verwenden, die mit der Meßelektrode im wesentlichen identisch
ist, nur daß die spezifischen reaktiven Stellen durch
ein geeignet reaktives Blockierungsmittel blockiert sind,
so daß die Bezugselektrode nicht mehr auf die zu prüfende
spezielle Verbindung anspricht. Sie spricht dagegen (wie die
Meßelektrode) auf eine nicht-selektive Absorption anderer Moleküle
der Testlösung an, so daß der Effekt einer solchen
nicht-selektiven Adsorption, im Falle daß sie auftritt, kompensiert
werden kann; durch Messung des Potentials einer aktiven
Meßelektrode gegenüber dem Potential einer identischen
Bezugselektrode mit blockierten Bindungsstellen kann
der Einfluß nicht-spezifischer Wechselwirkungen wirksam ausgeschaltet
werden.
Eine proteinimmobilisierte Membran wurde durch
Tauchbeschichtung einer Platinelektrode in eine Polyvinylchloridlösung
gebildet. Die Beschichtung wurde
getrocknet und hatte eine Dicke von etwa 25 µm.
Die mit Polyvinylchlorid beschichtete Elektrode wurde
3 Stunden lang bei Zimmertemperatur in eine Lösungsmittellösung
getaucht. Das Lösungsmittel wurde durch 4,5 Volumenteile
Petroläther und 4,5 Volumenteile Toluol gebildet und
enthielt 1 Volumenteil
n-Decanol. Die Elektrode wurde dann
etwa 16 Stunden lang in einen Vakuumofen von 50°C gebracht.
Die getrocknete Elektrode wurde 2 Stunden lang bei
etwa 60°C in eine Lösung getaucht, die 10% Epichlorhydrin
in 1molarer Natriumhydroxydlösung enthielt. Die Elektrode
wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und etwa 48
Stunden lang bei Zimmertemperatur in eine 0,5molare Natriumbicarbonatlösung
mit dem Protein Koncanavalin A gebracht.
Die Meßelektrode wurde dann aus der Lösung
entfernt und mit 0,5molarer Bicarbonatpufferlösung sowie
0,1molarem Kaliumhydrogenphthalatpuffer bei einem pH
von 3,0 mit 1molarem Natriumchloridgehalt und dann mit destilliertem
Wasser und schließlich mit 0,1molarer Lösung von
Tris-(hydroxylmethyl)-aminomethan-Puffer mit einem pH von 7,8
mit einem Gehalt an 0,5molarer Äthanolaminlösung gewaschen.
(Das Äthanolamin wurde zur Blockierung von irgendwelchen
nicht-umgesetzten Epoxygruppen verwendet).
Die Meßelektrode wurde dann über ein empfindliches
Meßgerät mit einer Bezugselektrode verbunden. Das verbindende
System zwischen den beiden Elektroden sollte im allgemeinen
eine hohe Impedanz besitzen. Von Koncanavalin A ist bekannt,
daß es gewisse verzweigte Polysaccharide, die nichtreduzierende
alpha-D-Hexapyranosyl- oder beta-D-Fructofuranosylendgruppen
enthalten, selektiv ausfällt. Hefe-Mannan gehört zu dieser Gruppe
und ist als am reaktivsten bekannt. Das Ansprechen einer
Koncanavalin A-Meßelektrode auf unterschiedliche Hefe-
Mannankonzentrationen bei pH 6,0 und 3,5 ist in Fig. 1 dargestellt.
Wie man sieht, ändert sich das Potential des Systems
mit der Konzentration der Hefe-Mannanlösung. Dagegen wird
keine Potentialänderung beobachtet, wenn eine Agrarlösung zu
der gemessenen Lösung hinzugegeben wurde. Agar ist ein Polysaccharid,
das mit Koncanavalin A nicht reagiert. Das Ausbleiben
einer Änderung der elektrischen Eigenschaften des Systems
bei der Zugabe von Agar besagt, daß die Selektivität des
Koncanavalins A trotz seiner Immobilisierung an der hydrophoben
Membran erhalten bleibt.
Ein weiteres Beispiel für die spezifische Eigenart
der Meßelektrode wird in Fig. 2 veranschaulicht.
Eine Meßelektrode wurde wie in Beispiel 1 hergestellt.
Mit den anhängenden Epoxydgruppen wurde Kaninchen-
Antihuman-7S-gamma-Globulin umgesetzt. Die Meßelektrode
wurde dann in eine Lösung von Human-7S-gamma-Globulin bei
pH 5,00 getaucht, deren Konzentration verändert wurde. Die
Konzentrationsänderung wurde elektrisch nachgewiesen.
Man weiß, daß die immunochemische Reaktion zwischen
Antihuman-7S-gamma-Globulin vom Kaninchen und Human-7S-gamma-
Globulin bei pH 7,8 nicht auftritt. Wenn die immobilisiertes
Antihuman-7S-gamma-Globulin vom Kaninchen enthaltende Immunoelektrode
in eine Lösung von Human-7S-gamma-Globulin getaucht
wurde, konnte (unter diesen Bedingungen) kein elektrisches
Ansprechen beobachtet werden.
Die immunochemischen Reaktionen blieben erhalten,
auch wenn eine Verbindung auf einer hydrophoben polymeren Membran
immobilisiert war.
Claims (4)
1. Hydrophobe proteinimmobilisierte Membran, gekennzeichnet
durch
- a) ein hydrophobes polymeres Substrat,
- b) partiell in der Oberfläche des polymeren Substrats absorbierte Kohlenwasserstoffketten, die eine protein- reaktive Gruppe umfassen, und
- c) daß zumindest einige der protein-reaktiven Gruppen ein Proteinmolekül enthalten.
2. Membran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
nicht mit einem Proteinmolekül umgesetzte protein-reaktive
Gruppen ein reaktionsblockierendes Molekül enthalten.
3. Verfahren zur Herstellung einer hydrophoben proteinimmobilisierten
polymeren Membran mit anhängenden protein-reaktiven
Gruppen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
- a) Behandlung eines hydrophoben polymeren Substrats mit einem Lösungsmittelsystem, das ein zur Anquellung des Polymersubstrats befähigtes Lösungsmittelsystem und eine aliphatische Verbindung mit einer reaktiven Gruppe umfaßt, die zumindest 6 Kohlenstoffatome von einem Ende derselben entfernt ist;
- b) Trocknen des lösungsmittelbeladenen polymeren Substrats zur im wesentlichen vollständigen Entfernung des Lösungsmittels unter Bildung eines Substrats mit einer partiell in der Oberfläche absorbierten aliphatischen Kette, die eine reaktive Gruppe aufweist und
- c) Umsetzung einer protein-reaktiven Verbindung mit reaktiver Gruppe mit der (reaktiven Gruppe der) aliphatischen Kette unter Bildung eines Substrats mit daran hängender protein-reaktiver Gruppe, und
- d) dadurch, daß ein Protein mit spezifischer Antikörper- Antigenreaktivität mit der protein-reaktiven Gruppe zur Bildung eines Substrats mit anhängendem immobilisierten Protein umgesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung der Membran
nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung
mit nicht-umgesetzten protein-reaktiven Gruppen
zur Blockierung weiterer Reaktionen derselben umgesetzt
wird.
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