DE2560557C2 - - Google Patents

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DE2560557C2
DE2560557C2 DE2560557A DE2560557A DE2560557C2 DE 2560557 C2 DE2560557 C2 DE 2560557C2 DE 2560557 A DE2560557 A DE 2560557A DE 2560557 A DE2560557 A DE 2560557A DE 2560557 C2 DE2560557 C2 DE 2560557C2
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Jarmila Janata
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Description

Die Erfindung betrifft eine hydrophobe, proteinimmobilisierte Membran und ein Verfahren zu deren Herstellung.
Die spezifische Reaktion eines speziellen Proteins mit einem anderen ist allgemein bekannt und eine solche tritt beispielsweise bei der Entwicklung spezifischer Antikörper zur Bekämpfung eines speziellen Antigens im Tierkörper auf. Dieses spezifische Ansprechen eines Proteins auf ein anderes wird in der Affinitätschromatographie zur Abtrennung eines spezifischen Proteins ausgenutzt, das in einer speziellen Lösung anwesend ist.
Eine solche selektive Reaktion zwischen zwei Verbindungen existiert bei zahlreichen Substanzen; so reagieren Proteine einschließlich Hormone und Enzyme sowie Poly- und Monosaccharide selektiv mit spezifischen Verbindungen, und alle diese Reaktionen werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung als immunochemische Reaktionen bezeichnet.
Affinitätschromatographische Materialien wie z. B. Säulenpackungen werden ausgehend von hydrophilen polymeren Oberflächen hergestellt, die in Anbetracht ihres polaren Charakters reaktive Stellen besitzen, an die eine proteinreaktive Verbindung angefügt werden kann. Der hydrophile Charakter des Substrats wird durch die Proteinanlagerung nicht beeinträchtigt.
Ein Proteinmolekül wie ein Antikörper oder Antigen in einer Pufferlösung zeigt eine ausgeprägte elektrische Ladung, deren Höhe und Polarität vom isoelektrischen Punkt des Proteins und der Zusammensetzung des Puffers abhängt. Diese Ladung wird durch Antikörper-Antigen-Reaktionen verändert. Obgleich nun die Größe der resultierenden Änderung der elektrischen Ladung nachzuweisen ist, ist die Proteinimmobilisierung auf einer hydrophilen Membran unbefriedigend, da die ionische Wirkung von Wasser auf die polaren Gruppen des hydrophilen Substrats so stark ist, daß sie die durch die immunochemische Reaktion induzierte geringe Änderung des elektrischen Potentials überdeckt.
Aus der DE-OS 22 47 163 ist ein Verfahren zur Herstellung eines Trägermatrix zur Fixierung biologisch wirksamer Stoffe bekannt, wobei man ein Polymer, das Säurehydrazidgruppen oder Säureazidgruppen enthält, durch Umsetzung dieser Gruppen mit einem difunktionellen Reagenz teilweise vernetzt und nicht vernetzte funktionelle Gruppen mindestens teilweise in reaktive Gruppen, die mit dem biologisch wirksamen Stoffen reagieren können, überführt. Das bifunktionelle Reagenz kann eine Kohlenwasserstoffkette mit bis zu 18 Kohlenstoffatomen enthalten, so daß Kohlenwasserstoffketten kovalent über polare Gruppen mit der Trägermatrix verbunden sind. Als Trägermatrix können Carboxylmethylcellulose oder Polyacrylsäure verwendet werden, die hydrophilen Charakter haben. Diese bekannten Membrane eignen sich jedoch nicht zum Nachweis reaktionsfähiger Verbindungen mittels immunochemischer Reaktion durch Messung der Potentialänderung.
Aus der DE-AS 19 15 970 ist ein Verfahren zur Herstellung von Membranen mit immobilisierten aktiven Proteinen bekannt, bei dem ein Träger mit einer Lösung mindestens einer aktiven Proteinsubstanz in Gegenwart eines Brückenbildners umgesetzt wird. Als Träger können makromolekulare Stoffe auf Basis von Cellulose, Amylose, Polysacchariden, Alginate, Kollagen, Polyvinylalkohol, Polysilan, Polyacrylamid oder deren Substitutionsprodukten verwendet werden. Als Brückenbildner werden bifunktionelle Verbindungen verwendet. Mit der bekannten Membran kann die Durchgangsgeschwindigkeit von Gasen durch die Membran gesteigert werden.
Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine hydrophobe proteinimmobilisierte Membran sowie ein Verfahren zu deren Herstellung zur Verfügung zu stellen, mit der die durch immunochemische Reaktion induzierte Änderung des elektrischen Potentials ungestört gemessen werden kann, so daß ein qualitativer, insbesondere quantitativer Nachweis einer zu einer immunochemischen Reaktion reaktionsfähigen Verbindung möglich ist.
Die Aufgabe wird mit der im Patentanspruch 1 gekennzeichneten Membran gelöst. Das Verfahren zur Herstellung der Membran ist im Anspruch 3 definiert. Die Ansprüche 2 und 4 betreffen vorteilhafte Ausgestaltungen der Membran bzw. des beanspruchten Verfahrens.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die Oberflächenladung der Polymer/Lösungsgrenzfläche von der einen Ladung des immobilisierten Proteins (Antikörper) abhängt, wenn alle Proteine kovalent an der Oberfläche eines hydrophoben Substrats gebunden sind, das wiederum auf einem Leiter aufgebracht ist. Wenn in der Lösung entsprechendes Antigen anwesend ist und die Bindungsstelle des Antikörpers während der Immobilisierung (Bindung an das Polymere) nicht zerstört wird, findet die immunochemische Reaktion an der Grenzfläche mit daraus resultierender Änderung der Oberflächenladung statt. Diese Änderung kann potentiometrisch gegenüber einer Bezugselektrode gemessen werden, die in die gleiche Lösung eintaucht.
Die Membran umfaßt ein Substrat aus einem hydrophoben Polymeren, das durch Lösungsmittelwirkung quellbar ist und in dem eine - vorzugsweise aliphatische - Kohlenwasserstoffkette mit einer geeignet reaktiven Gruppe aus einem Lösungsmittelsystem partiell absorbiert ist. Die resultierende hydrophobe Membran besitzt eine partiell absorbierte Kohlenwasserstoffkette, die eine protein-reaktive Gruppe, wie eine Epoxidgruppe, oder eine andere protein-reaktive Gruppe enthält. Die Kette kann von Kohlenstoff-Kohlenstoffbindungen verschiedene Verknüpfungen oder Kettenglieder wie Ätherbindung aufweisen.
Vorzugsweise umfaßt die Membran Kohlenwasserstoffketten, die in einer mit einem Polypeptid spezifisch reaktiven Gruppe enden. Die Membran ist mit Kohlenwasserstoffketten versehen, die jeweils eine reaktive Gruppe aufweisen, die zur Bindung einer spezifisch protein-reaktiven Gruppierung durch Kontakt der reaktiven Gruppe mit der protein-reaktiven Gruppe befähigt ist, wodurch die protein-reaktive Gruppe über die Kette an die Membran gebunden wird. Geeignete protein-reaktive Gruppen sind Antigene oder Antikörper.
Die hydrophobe Membran wird als Hülle einer hochleitfähigen Elektrode wie beispielsweise Platin verwendet. Ein Protein, z. B. ein Antikörper, mit einer Selektivität für die Reaktion mit einem speziellen Protein (Antigen) wird mit der protein-reaktiven Gruppe zur Reaktion gebracht, so daß zumindest einige der protein-reaktiven Gruppen ein Proteinmolekül enthalten. Durch Eintauchen einer solchen beschichteten Elektrode zusammen mit einer Bezugselektrode in eine das Antigen enthaltende wäßrige Lösung erhält man ein elektrisch empfindliches System, das in der Lage ist, die durch Einfangen eines speziellen Proteins (Antigens) durch die mit einem immunoreaktiven Antikörper versehene Elektrode verursachte Änderung der elektrischen Ladung an der Lösung/Polymer-Grenzfläche zu messen. Alternativ kann das Antigen für ein selektives Einfangen des Antikörpers an der Membran immobilisiert werden.
Für die Erzeugung der hydrophoben proteinimmobilisierten Membran mit selektiver immunochemischer Wirksamkeit wird ein Substrat aus einem hydrophoben Polymeren verwendet. Das Polymere ist vorzugsweise mit einem organischen Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung, insbesondere mit aliphatischen Lösungsmitteln, quellbar. Für die praktische Durchführung der Erfindung besonders brauchbare Polymere sind solche hydrophoben Polymeren, die keine anhängenden polaren Gruppen enthalten. Zu typischen Polymeren für diesen Zweck gehören thermoplastische Polymere wird Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen, Siliconkautschuk, Polyurethan, Polycarbonat oder Polytetrafluoräthylen. Warmhärtende Polymere wie Epoxyharze und vernetzte Polyester können auch angewandt werden. Bevorzugt werden Polymere, die durch Tauchbeschichtung oder Aufgießen oder Aufschrumpfen auf eine Elektrode aufgebracht werden können.
Die polymere Membran wird dann mit einem zur Anquellung der Membran befähigten Lösungsmittelsystem so lange behandelt, daß die Membran zumindest soweit angequollen wird, daß die Kohlenwasserstoffkette in genügender Konzentration, wie nachfolgend beschrieben, in der Oberfläche der Membran partiell absorbiert ist. Das Lösungsmittelsystem enthält neben einem geeigneten Lösungsmittel eine Kohlenwasserstoffverbindung mit einer reaktiven Gruppe, die sich vorzugsweise am Ende der Kohlenwasserstoffkette oder in dessen Nähe befindet. Als Lösungsmittel zum Anquellen der polymeren Membran dienen vorzugsweise solche, die durch Trocknen des Polymeren ohne weiteres entfernt werden können. So werden Lösungsmittel mit geringeren Molekulargewichten im allgemeinen gegenüber solchen mit höheren Molekulargewichten bevorzugt. Wie im nachfolgenden angegeben ist, wird bevorzugt, daß das Lösungsmittel einen niedrigeren Siedepunkt hat und leichter abgedampft wird als die Kohlenwasserstoffverbindung mit einer reaktiven Gruppe. Eine typische Lösungsmittelmischung für PVC umfaßt Petroläther mit einem Siedebereich von 30 bis 60°C und Toluol. Andere Lösungsmittel oder Mischungen derselben können zum Anquellen von PVC oder anderen Polymermaterialien benutzt werden, diese sind jedoch dem Fachmann bekannt oder sie können durch einfache Versuche ermittelt werden.
Eine typische Kohlenwasserstoffverbindung mit einer reaktiven Gruppe ist n-Decanol. Weiter im Rahmen der Erfindung besonders brauchbare Verbindungen sind n-Hexanol, n-Decylamin, n-Hexyl-amin, n-Decansäure und ähnliche Verbindungen mit beweglichem Wasserstoff.
Nach Tränken der polymeren Membran mit dem Lösungsmittelsystem für eine ausreichend lange Zeitdauer zur Herbeiführung des erforderlichen Quellungsgrades wird die Membran bei einer geeigneten Temperatur zur Entfernung des Lösungsmittels ohne Abtrennung wesentlicher Mengen der Kohlenwasserstoffverbindung mit der reaktiven Gruppe getrocknet. Wenn Petroläther, Toluol und Lösungsmittel von ähnlichem Siedebereich benutzt werden, liegt eine typische Trockentemperatur bei etwa 50 bis 100°C, zweckmäßigerweise 50 bis 60°C (vorzugsweise unter vermindertem Druck). Die Entfernung des Lösungsmittels liefert eine Membran mit einer geringen Konzentration an anhängenden Kohlenwasserstoffketten, von denen jede eine reaktive Gruppe, wie beispielsweise Hydroxyl-, Amin- oder Carboxylgruppe, aufweist.
Die Auswahl des Lösungsmittels (und damit seines Siedepunkts) und der anzuwendenden Drucke bei seiner Entfernung erfolgt unter Berücksichtigung der Natur und Eigenschaften der Membran und des Kohlenwasserstoffs. Für die hier benutzten Polymeren sind Lösungsmittel, von denen sie angequollen werden, bekannt.
Anschließend an die partielle Absorption der Kohlenwasserstoffkette an die polymere Membran erfolgt eine Behandlung zur Erzielung einer proteinimmobilisierten Membran, d. h. einer Membran mit der Fähigkeit zum Einfangen eines spezifischen Proteins, wie bei einer immunochemischen Reaktion.
Es ist zu bemerken, daß die Kohlenwasserstoffkette mit einer geeigneten protein-reaktiven Gruppe versehen werden kann, bevor sie in die Membran eingeführt wird (in diesem Falle sollte natürlich sichergestellt werden, daß die Gruppe eine genügende Freiheit zur Entfaltung ihrer Reaktivität besitzt - vorzugsweise durch Sicherstellung, daß sie nicht weniger als 6 Kohlenstoffatome von der Membran entfernt ist) oder aber die Gruppe kann in die Kette nach deren Absorption an die Membran eingebaut werden. Protein-reaktive Gruppen können durch Kontakt der Membran mit einem geeigneten Material erhalten werden, das zur Reaktion mit der Kohlenwasserstoffkette zur Herbeiführung der erforderlichen spezifischen Aktivität befähigt ist oder es kann die Anwendung einer verknüpfenden Gruppe notwendig sein, um die reaktive Gruppe an der Kette zur Bindung einer geeigneten protein-reaktiven Gruppe zu befähigen. Derartige Alternativen ergeben sich dem Fachmann ohne weiteres, und die Auswahl der geeigneten Arbeitsfolge wird im Hinblick auf die Eigenart der verschiedenen beteiligten Materialien und Gruppen getroffen werden.
So kann die Anwendung einer verknüpfenden Gruppe für Protein zu den folgenden Arbeitsschritten führen: Nach dem Trocknen der polymeren Membran wird diese in eine Lösung getaucht, die eine Verbindung mit einer spezifischen protein-reaktiven Gruppe und einer weiteren reaktiven Gruppe enthält, die mit der reaktiven Gruppe der nun der Membran angefügten Kohlenwasserstoffkette reagieren kann. Wenn die reaktive Gruppe der Kohlenwasserstoffkette beispielsweise eine Hydroxylgruppe ist, so kann als typische protein-reaktive Verbindung ein Epichlorhydrin angewandt werden, wodurch eine verknüpfende Gruppe mit Epoxid und Äther gebildet wird. Andere Kohlenwasserstoffmoleküle können in die Membran eingeführt werden, wie beispielsweise aliphatische Amine, vorzugsweise primäre und sekundäre Amine sowie carboxyhaltige aliphatische Verbindungen, und diese können zur Reaktion mit Epichlorhydrin oder einem Bis-Epoxid befähigt sein, in dem ein Epoxidringpaar für eine Umsetzung vorhanden ist. Erwünschtermaßen sollte keine Wahrscheinlichkeit für eine Vernetzung zwischen einem Paar von anhängenden Gruppen bestehen, die an der Membranoberfläche hängen.
Eine geeignete Behandlungsserie für einen an einer polymeren Membran partiell absorbierten (hängenden) aliphatischen Alkohol wird nachfolgend skizziert:
Proteine mit Aminogruppen sind in der Lage, mit der Epoxidgruppe zu reagieren, die der Membran angefügt ist, unter Bildung einer Membran mit einem immobilisierten Protein, das zum Einfangen und Nachweis eines spezifischen Proteins in einer Reaktion vom immunochemischen Typ befähigt ist.
Zu weiteren Techniken bei der Herstellung einer proteinimmobilisierten Membran gehören:
(a) Thiophosgen- oder Isocyanatkopplung (b) Azo-Kupplung
Ein weiteres Proteinkupplungssystem umfaßt die Erzeugung einer Diimidverknüpfung zwischen der Kohlenwasserstoffkette und einem Proteinmolekül; eine aliphatische Verbindung mit einer Carboxylgruppe wird mit Carbodiimid umgesetzt, dessen Reaktionsprodukt mit einem geeigneten Protein zur Reaktion gebracht wird.
Nach Umsetzung der protein-reaktiven verknüpfenden Verbindung (d. h. der eine proteinimmobilisierende Gruppe enthaltenden Verbindung wie z. B. Epichlorhydrin) mit dem beweglichen Wasserstoff der in der Membranoberfläche partiell absorbierten Kohlenwasserstoffkette zur Bildung der proteinverknüpfenden Gruppe, wird die Membran, vorzugsweise gewaschen und in eine Lösung gebracht, die das zu immobilisierende Protein mit spezifischer Antikörper-Antigenreaktivität enthält. Zimmertemperatur ist eine bevorzugte Reaktionstemperatur und der Ablauf der Reaktion über ein bis zwei Tage wird im allgemeinen bevorzugt. Die Reaktion erfolgt im allgemeinen in einem leicht basischen Medium.
Nach Umsetzung des Proteins erfolgt eine Behandlung zum Fortspülen von Resten nicht-umgesetzter Materialien und ferner vorzugsweise eine Umsetzung mit einer Verbindung zur "Neutralisation" irgendwelcher nicht-umgesetzter protein-reaktiver Gruppen, die nach Reaktion mit dem Proteinmolekül verblieben sind. (Nicht-umgesetzte protein-reaktive Gruppen haben die Tendenz, polar zu sein und sie sind ebenfalls unerwünscht, da sie unspezifisch mit Proteinen reagieren und bei einem Proteinnachweis fehlerhafte Ergebnisse liefern können).
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Membran wird eine aliphatische Kohlenwasserstoffverbindung mit einer reaktiven Gruppe verwendet, die zumindest 6 Kohlenstoffatome von einem Ende derselben entfernt ist. Bevorzugt werden Kettenlängen, bei denen die Hauptkette der Kohlenwasserstoffverbindung 8 bis 12 Kohlenstoffatome enthält und die Kettenlänge wird vorzugsweise so gewählt, daß die spezifische reaktive Gruppe von der Membranoberfläche um zumindest 8 Kohlenstoffatome entfernt ist. Wenn eine protein-reaktive verknüpfende Verbindung, die mit der reaktiven Gruppe der Kohlenwasserstoffverbindung zur Reaktion gebracht wird, eine größere Kettenlänge besitzt, so daß die am Ende gebildete protein-reaktive Gruppe von der Oberfläche um zumindest 6 Kohlenstoffatome entfernt hängt, braucht die Kettenlänge des Kohlenwasserstoffs nicht so lang zu sein.
Die erfindungsgemäßen Membranen können zum qualitativen und vorzugsweise quantitativen Nachweis der Anwesenheit einer speziellen Verbindung in einer gegebenen Mischung, wie z. B. einer die Verbindung enthaltenden Lösung eingesetzt werden.
Eine Beschichtung oder Hülle aus der eine Kohlenwasserstoffkette mit einer reaktiven Gruppe enthaltenden hydrophoben polymeren Membran wird auf der Meßelektrode in einer Dicke von etwa 10 bis 50 µm gebildet, wobei Dicken von etwa 20 bis 40 µm besonders bevorzugt werden. Vorzugsweise ist die Membran nicht dicker als 100 µm und nicht dünner als 5 µm. Ein Protein wird an der Membran immobilisiert. Die Meßelektrode wird in Verbindung mit einer Bezugselektrode verwendet. Die beiden Elektroden werden in eine Mischung, typischerweise eine Lösung, eingetaucht, die ein Protein oder eine andere Verbindung des zu identifizierenden Typs enthält. Die Meßelektrode und die Bezugselektrode werden mit einem Meßgerät verbunden, das auf sehr geringe Änderungen des elektrischen Potentials anspricht. Beim Einfangen des speziellen Proteins durch die Meßelektrode ändert sich das elektrische Potential an der Polymer/Lösungsgrenzfläche. Diese geringe Änderung wird vom Meßgerät nachgewiesen, das in der elektrischen Schaltung eine hohe Impedanz besitzt und die Anwesenheit der Verbindung somit anzeigt. Durch Eichung kann das Meßgerät für eine quantitative Bestimmung der in der Lösung anwesenden Verbindungsmenge verwendet werden.
Die Bezugselektrode kann aus irgendeinem von einem weiten Bereich von geeigneten Elektrodenmaterialien bestehen, von denen viele bekannt sind, obgleich gefunden wurde, daß es vorteilhaft ist, als Bezugselektrode eine zweite Elektrode zu verwenden, die mit der Meßelektrode im wesentlichen identisch ist, nur daß die spezifischen reaktiven Stellen durch ein geeignet reaktives Blockierungsmittel blockiert sind, so daß die Bezugselektrode nicht mehr auf die zu prüfende spezielle Verbindung anspricht. Sie spricht dagegen (wie die Meßelektrode) auf eine nicht-selektive Absorption anderer Moleküle der Testlösung an, so daß der Effekt einer solchen nicht-selektiven Adsorption, im Falle daß sie auftritt, kompensiert werden kann; durch Messung des Potentials einer aktiven Meßelektrode gegenüber dem Potential einer identischen Bezugselektrode mit blockierten Bindungsstellen kann der Einfluß nicht-spezifischer Wechselwirkungen wirksam ausgeschaltet werden.
Beispiel 1
Eine proteinimmobilisierte Membran wurde durch Tauchbeschichtung einer Platinelektrode in eine Polyvinylchloridlösung gebildet. Die Beschichtung wurde getrocknet und hatte eine Dicke von etwa 25 µm.
Die mit Polyvinylchlorid beschichtete Elektrode wurde 3 Stunden lang bei Zimmertemperatur in eine Lösungsmittellösung getaucht. Das Lösungsmittel wurde durch 4,5 Volumenteile Petroläther und 4,5 Volumenteile Toluol gebildet und enthielt 1 Volumenteil n-Decanol. Die Elektrode wurde dann etwa 16 Stunden lang in einen Vakuumofen von 50°C gebracht.
Die getrocknete Elektrode wurde 2 Stunden lang bei etwa 60°C in eine Lösung getaucht, die 10% Epichlorhydrin in 1molarer Natriumhydroxydlösung enthielt. Die Elektrode wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und etwa 48 Stunden lang bei Zimmertemperatur in eine 0,5molare Natriumbicarbonatlösung mit dem Protein Koncanavalin A gebracht.
Die Meßelektrode wurde dann aus der Lösung entfernt und mit 0,5molarer Bicarbonatpufferlösung sowie 0,1molarem Kaliumhydrogenphthalatpuffer bei einem pH von 3,0 mit 1molarem Natriumchloridgehalt und dann mit destilliertem Wasser und schließlich mit 0,1molarer Lösung von Tris-(hydroxylmethyl)-aminomethan-Puffer mit einem pH von 7,8 mit einem Gehalt an 0,5molarer Äthanolaminlösung gewaschen. (Das Äthanolamin wurde zur Blockierung von irgendwelchen nicht-umgesetzten Epoxygruppen verwendet).
Die Meßelektrode wurde dann über ein empfindliches Meßgerät mit einer Bezugselektrode verbunden. Das verbindende System zwischen den beiden Elektroden sollte im allgemeinen eine hohe Impedanz besitzen. Von Koncanavalin A ist bekannt, daß es gewisse verzweigte Polysaccharide, die nichtreduzierende alpha-D-Hexapyranosyl- oder beta-D-Fructofuranosylendgruppen enthalten, selektiv ausfällt. Hefe-Mannan gehört zu dieser Gruppe und ist als am reaktivsten bekannt. Das Ansprechen einer Koncanavalin A-Meßelektrode auf unterschiedliche Hefe- Mannankonzentrationen bei pH 6,0 und 3,5 ist in Fig. 1 dargestellt. Wie man sieht, ändert sich das Potential des Systems mit der Konzentration der Hefe-Mannanlösung. Dagegen wird keine Potentialänderung beobachtet, wenn eine Agrarlösung zu der gemessenen Lösung hinzugegeben wurde. Agar ist ein Polysaccharid, das mit Koncanavalin A nicht reagiert. Das Ausbleiben einer Änderung der elektrischen Eigenschaften des Systems bei der Zugabe von Agar besagt, daß die Selektivität des Koncanavalins A trotz seiner Immobilisierung an der hydrophoben Membran erhalten bleibt.
Beispiel 2
Ein weiteres Beispiel für die spezifische Eigenart der Meßelektrode wird in Fig. 2 veranschaulicht.
Eine Meßelektrode wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Mit den anhängenden Epoxydgruppen wurde Kaninchen- Antihuman-7S-gamma-Globulin umgesetzt. Die Meßelektrode wurde dann in eine Lösung von Human-7S-gamma-Globulin bei pH 5,00 getaucht, deren Konzentration verändert wurde. Die Konzentrationsänderung wurde elektrisch nachgewiesen.
Man weiß, daß die immunochemische Reaktion zwischen Antihuman-7S-gamma-Globulin vom Kaninchen und Human-7S-gamma- Globulin bei pH 7,8 nicht auftritt. Wenn die immobilisiertes Antihuman-7S-gamma-Globulin vom Kaninchen enthaltende Immunoelektrode in eine Lösung von Human-7S-gamma-Globulin getaucht wurde, konnte (unter diesen Bedingungen) kein elektrisches Ansprechen beobachtet werden.
Die immunochemischen Reaktionen blieben erhalten, auch wenn eine Verbindung auf einer hydrophoben polymeren Membran immobilisiert war.

Claims (4)

1. Hydrophobe proteinimmobilisierte Membran, gekennzeichnet durch
  • a) ein hydrophobes polymeres Substrat,
  • b) partiell in der Oberfläche des polymeren Substrats absorbierte Kohlenwasserstoffketten, die eine protein- reaktive Gruppe umfassen, und
  • c) daß zumindest einige der protein-reaktiven Gruppen ein Proteinmolekül enthalten.
2. Membran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nicht mit einem Proteinmolekül umgesetzte protein-reaktive Gruppen ein reaktionsblockierendes Molekül enthalten.
3. Verfahren zur Herstellung einer hydrophoben proteinimmobilisierten polymeren Membran mit anhängenden protein-reaktiven Gruppen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
  • a) Behandlung eines hydrophoben polymeren Substrats mit einem Lösungsmittelsystem, das ein zur Anquellung des Polymersubstrats befähigtes Lösungsmittelsystem und eine aliphatische Verbindung mit einer reaktiven Gruppe umfaßt, die zumindest 6 Kohlenstoffatome von einem Ende derselben entfernt ist;
  • b) Trocknen des lösungsmittelbeladenen polymeren Substrats zur im wesentlichen vollständigen Entfernung des Lösungsmittels unter Bildung eines Substrats mit einer partiell in der Oberfläche absorbierten aliphatischen Kette, die eine reaktive Gruppe aufweist und
  • c) Umsetzung einer protein-reaktiven Verbindung mit reaktiver Gruppe mit der (reaktiven Gruppe der) aliphatischen Kette unter Bildung eines Substrats mit daran hängender protein-reaktiver Gruppe, und
  • d) dadurch, daß ein Protein mit spezifischer Antikörper- Antigenreaktivität mit der protein-reaktiven Gruppe zur Bildung eines Substrats mit anhängendem immobilisierten Protein umgesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung der Membran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung mit nicht-umgesetzten protein-reaktiven Gruppen zur Blockierung weiterer Reaktionen derselben umgesetzt wird.
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