DE2545749A1 - METHODS FOR COAGULATING AND SEPARATING BLOOD - Google Patents
METHODS FOR COAGULATING AND SEPARATING BLOODInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufspaltung "bzw. Trennung von Blut in einzelne Bestandteile, insbesondere leichtere und schwerere Phasen.The invention relates to a method for splitting "or Separation of blood into individual components, especially lighter and heavier phases.
Die Blutgerinnung in vitro und die dabei ablaufenden enzymatischen Umsetzungen können bekanntlich durch Kontakt mit kieselsäurehaltigen Stoffen wie Glas, Kaolin, Bentonit, hydratiertem Aluminiumsilikat, Diatomeenerde oder Kieselgur gefördert werden; vgl. J.P. Soulier und O. Prou-Wartelle, in British Journal of Haematology, Band 6, S. 88 - 101.The coagulation of blood in vitro and the enzymatic process taking place As is known, reactions can occur through contact with silicic acid-containing substances such as glass, kaolin, bentonite, hydrated aluminum silicate, diatomaceous earth or kieselguhr are promoted; see J.P. Soulier and O. Prou-Wartelle, in British Journal of Hematology, Volume 6, pp. 88-101.
Die Bluttrennung in vitro wird bisher in der Weise durchgeführt, daß eine Blutmenge in einen Glasbehälter eingegeben und eine Weile ruhig stehen gelassen wird, damit die durch den Kontakt mit der Glaswand aktivierten Gerinnungsfaktoren bis zur Mitte der Probe diffundieren können, bisThe in vitro blood separation has hitherto been carried out in such a way that an amount of blood is placed in a glass container and let it stand still for a while so that the coagulation factors activated by contact with the glass wall can diffuse up to the middle of the sample, up to
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die Probe koaguliert ist. Erst dann, wird das koagulierte ^ Blut zentrifugiert und in eine lichtere, das Serum ent- * haltende Phase sowie eine schwerere, Zellen und Gewebe- . material enthaltende Phase getrennt. ; · _.the sample is coagulated. Only then, the coagulated blood is centrifuged ^ and corresponds to a lighter, serum * holding phase and a heavier, cells and tissue. phase containing material separated. ; · _.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein weniger langwieriges und umständliches Verfahren zur Bluttrennung bereitzustellen.The object of the invention is to provide a less lengthy and cumbersome method for separating blood.
Eine weitere bei Anwendung des bekannten Verfahrens entstehende Schwierigkeit hängt mit der eventuell eintretenden Fibrinbildung in der. leichteren Serumphase zusammen. Wird die Blutprobe zentrifugiert, bevor die Koagulation abgeschlossen ist, so entstehen durch Umsetzung von Fibrinogen und Aktivierungsstoffen in der leichteren Phase Fibrinfasern. Für die zur Analyse der Serumphase verwendeten Vorrichtungen ist diese Verunreinigung mit Fibrin störend oder sogar schädlich.Another difficulty that arises when using the known method depends on the one that may arise Formation of fibrin in the. lighter serum phase together. If the blood sample is centrifuged before the coagulation is complete, fibrinogen is produced by the conversion and activators in the lighter phase fibrin fibers. For those used to analyze the serum phase This contamination with fibrin is disruptive or even harmful to devices.
Erfindungsgemäß soll auch diese Schwierigkeit behoben werden.According to the invention, this difficulty is also to be eliminated.
Schließlich entsteht bisher auch häufig eine Verunreinigung mit Fibrin in Form einer an der Phasengrenzfläche gebildeten sogenannten "weißen Schicht" aus auch nach dem Zentrifugieren in Suspension verbleibenden faserigen Fibrin. Bei der Serumentnahme muß durch sorgfältigstes Absaugen eine Verunreinigung mit Fibrin auch aus dieser Schicht vermieden werden,Finally, so far, contamination has also often arisen with fibrin in the form of a so-called "white layer" formed at the phase interface even after centrifugation fibrous fibrin remaining in suspension. When taking the serum, an impurity must be found through careful suction with fibrin also be avoided from this layer,
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•Auch, dieses !Problem soll erfindungsgemäß gelöst werden.Also, this problem is to be solved according to the invention.
Wünschenswert ist ferner die Verwendbarkeit auch von Gefäßen, welche kein Glas oder keine Kieselsäure enthalten» z.B. aus Kunststoff oder Metall. Die Erfindung ermöglicht auch diese Anwendung,It is also desirable that vessels can also be used which do not contain any glass or silica »e.g. made of plastic or metal. The invention makes this possible too Use,
Zwar wurde bereits die Verwendung von Kunststoffröhrchen vorgeschlagen, welche zur Koagulationsanregung einzelne Glas- oder Kaolinpartikel enthalten und kräftig bewegt werden. Es ist aber umständlich und ungünstig, eine derartige Durchmischung zur Koagulation vor dem Zentrifugieren vornehmen zu müssen. Die Erfindung schafft auch hier Abhilfe.It is true that the use of plastic tubes has already been proposed which, to stimulate coagulation, use individual glass tubes. or contain kaolin particles and are moved vigorously. However, it is cumbersome and inconvenient to mix it up in this way to carry out coagulation before centrifugation. The invention also provides a remedy here.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Koagulierung und Trennung von Blut in leichtere und schwerere Phasen, bei dem in ein Gefäß Partikel eines koagulationsfordernden, kontaktaktivierenden Materials wie Glas, Kaolin, Bentonit, hydratiertes Aluminiumsilikat, Kieselgur, Diatomeenerde, oder dergleichen gegeben werden, sodann Blut eingefüllt, koagulieren gelassen und zentrifugiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß Größe und Dichte der Partikel im Hinblick auf eine ohne Rühren und Schütteln nahezu gleichzeitig mit der Bluteingabe erfolgende und bis zur vollständigen Eoagulierung verbleibende gleichmäßige Suspension in der gesamten Blutmenge gewählt werden.The invention relates to a process for coagulating and separating blood into lighter and heavier phases, in which particles of a coagulation-promoting, contact-activating material such as glass, kaolin, bentonite, hydrated aluminum silicate, kieselguhr, diatomaceous earth, or the like are added to a vessel, followed by blood is filled, allowed to coagulate and centrifuged, characterized in that the size and density of the particles are selected with regard to a uniform suspension in the total amount of blood which takes place almost simultaneously with the blood input without stirring and shaking and which remains until complete eoagulation.
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Ferner wird ein Verfahren zum Herstellen der verwendeten Partikel offenbart, nach dem Glaspulver einer Dichte größer als die Serumphase mit einer Flüssigkeit einer Dichte nicht größer als die des zu trennenden Blutes gemischt werden, die Mischung bis zur Ausfällung der schwereren Partikel stehen gelassen wird, das Sediment abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit langer und stärker als bei der normalen Blutzentrifugierung zentrifugiert wird, und die hierbei ausgefällten Partikel entfernt und getrocknet werden.Furthermore, a method for producing the used Particles disclosed, after the glass powder of a density greater than the serum phase mixed with a liquid of a density no greater than that of the blood to be separated the mixture is left to stand until the heavier particles precipitate, the sediment is separated and the supernatant fluid is centrifuged longer and more strongly than in normal blood centrifugation, and the particles that have precipitated out are removed and dried.
Die Zeichnungen zeigen geschlossene Gefäße in verschiedenen Stadien der Bluttrennung mit Hilfe kontaktfördernder Partikel.The drawings show closed vessels in different stages of blood separation with the help of contact-promoting particles.
In das mit einem Stöpsel 13 oder dergleichen verschlossene Gefäß 10 aus chemisch trägem, und für Aufrechterhaltung eines Vakuums geeignetem Material, z.B. Glas, Kunststoff usw. wird zunächst das kontaktaktivierende, gerinnungsfordernde Material in Form von Pulver oder Partikeln gegeben.In the vessel 10 closed with a stopper 13 or the like from chemically inert, and for maintaining a Material suitable for a vacuum, e.g. glass, plastic, etc. is initially the contact-activating, coagulation-promoting material given in the form of powder or particles.
Das Gefäß soll mit dem zu trennenden Blut nicht in Umsetzung treten und die erforderlichen Zentrifugalkräfte aushalten. Der Verschluß 13 ist vakuumdicht und kann mit einer Nadel, Kanüle oder dergleichen durchstoßen werden, sodaß z.B. eine siphonartige Blutentnahme möglich ist, vgl. z.B. US-PS 2,460,641. Nicht erforderlich ist, daß das Gefäßmaterial selbst gerinnungsaktivierend ist, jedoch ist wegen seiner Dauerhaftigkeit und guten Adsorption der gerinnungsfördernden Stoffe ein Borsilikatglas wie Corning PYREX^, Nr. 7740 besonders geeignet.The vessel should not be in implementation with the blood to be separated pedal and withstand the necessary centrifugal forces. The closure 13 is vacuum-tight and can with a needle, Cannula or the like are pierced so that, for example, a siphon-like blood withdrawal is possible, see e.g. US-PS 2,460,641. It is not necessary that the vascular material itself is coagulation-activating, but because of its durability and good adsorption of the coagulation-promoting substances a borosilicate glass such as Corning PYREX ^, No. 7740 particularly suitable.
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Die kontaktaktivi er enden Partikel bestehen "beispielsweise aus Glas, Kaolin, Bentonit, hydratiertem Aluminiumsilikat, Kieselgur, Diatomeenerde usf. Die Dichte ist größer als die Serumphase. Ihre Größe ist so klein, daß sie beim Einfüllen oder Einziehen des Blutes in den Behälter 10 im Blut gleichmäßig suspendiert werden und zumindest während der einsetzenden Koagulierung ohne Rühren in Suspension bleiben, andererseits sind die Partikel aber so groß und dicht, daß sie durch Zentrifugieren ohne Schwierigkeit ausgefällt werden können, z.B. im Falle des erwähnten Borsilikatglases von einer Dichte im Bereich von 2,16 - 2,45 g/ccm. Durch die Größenwahl läßt sich ein zu starkes oder zu langes Zentrifugieren vermeiden, das zur Hämolyse der roten Blutkörper führen und den Anteil an Milchdehydrogenase, Kalium oder Hämoglobin im Serum nach oben verfälschen kann.The Kontaktaktivi he end particles exist "for example made of glass, kaolin, bentonite, hydrated aluminum silicate, Kieselguhr, diatomaceous earth, etc. The density is greater than the serum phase. Their size is so small that when they are poured in or drawing the blood into the container 10 to be evenly suspended in the blood and at least during the onset Coagulation remain in suspension without stirring, but on the other hand the particles are so large and dense that they can pass through Centrifugation can be precipitated without difficulty, e.g. in the case of the aforementioned borosilicate glass of one density in the range of 2.16-2.45 g / ccm. By choosing the size you can avoid centrifuging too hard or too long, lead to hemolysis of the red blood cells and the amount of milk dehydrogenase, potassium or hemoglobin in the serum can falsify above.
Die maximale Größe der Partikel wird günstigerweise so gewählt, daß sie die ersten 2-5 Min. der Koagulation ohne Rühren in Suspension bleiben.The maximum size of the particles is expediently chosen so that they can coagulate the first 2-5 minutes without Stir to stay in suspension.
Besonders günstig ist ein feines Pulver, das suspendiert bleibt und in den von den Gefäßwänden entfernteren Teilen seine aktivierende Wirkung entfaltet, bzw. für die Aktivierung eine größere Gesamtoberfläche zur Verfügung stellt, gleichzeitig aber wegen der geringen Partikelmasse beim Zentrifugieren weniger stark oder häufig mit den roten Blutkörpern zusammenstößt, und die Gefahr der Hämolyse nicht so groß ist.A fine powder that remains suspended and activates in the parts more distant from the vessel walls is particularly favorable Effect unfolds or provides a larger total surface area for activation, at the same time but because of the low particle mass, it collides less strongly or frequently with the red blood cells during centrifugation, and the risk of hemolysis is not so great.
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Zur Bereitung der gerinnungsaktivierenden Partikel wird z.B. das Borsilikatglas Corning 7740 mit einer Dichte von ca. 2,23 g/ccm in der Kugelmühle gemahlen und zur Entfernung größerer Partikel durch ein -325 mesh Sieb geleitet. Das feinteilige Glas wird dann mit Wasser gemischt, und 5 Min. stehen gelassen, bis sich die schwereren Partikel abgesetzt haben, der überstehende Teil abgegossen und 7 Min. mit bis zu 1100 G- zentrifugiert, und das Zentrifugat im Vakuum bei 1000C getrocknet. Die erhaltene Partikelgröße ist 0,4 - 20/um, 4/um im Durchschnitt. Hierdurch erhält man gleichmäßige, nicht auf die Randteile beschränkte und ohne Rühren bleibende Suspensionen mit der Möglichkeit der beschädigungsfreien Trennung durch Zentrifugieren. Die Größenverteilung der Partikel hängt von ihrer Dichte ab. Da die Partikeloberflächen unregelmäßig und ungleichmäßig sind, sind die von der Flüssigkeit ausgeübten Reibungskräfte nicht genau bestimmbar. Ein zahlenmäßiger Größenbereich der geeigneten Partikel läßt sich daher nicht angeben, da die Ausfällung bzw. Sedimentation von der Zentrifugalkraft und den Reibungskräften abhängt. Der Bereich wird daher funktional definiert (vgl. die vorstehenden Ausführungen und den Hauptanspruch).To prepare the coagulation-activating particles, for example, the borosilicate glass Corning 7740 is ground in a ball mill with a density of approx. 2.23 g / ccm and passed through a -325 mesh sieve to remove larger particles. The finely divided glass is then mixed with water and left to stand for 5 minutes until the heavier particles have settled, the protruding part is poured off and centrifuged for 7 minutes at up to 1100 G, and the centrifugate is dried in vacuo at 100 ° C . The particle size obtained is 0.4-20 µm, 4 µm on the average. This gives uniform suspensions that are not restricted to the edge parts and remain without stirring, with the possibility of damage-free separation by centrifugation. The size distribution of the particles depends on their density. Since the particle surfaces are irregular and uneven, the frictional forces exerted by the liquid cannot be precisely determined. A numerical range of sizes of the suitable particles cannot therefore be given, since the precipitation or sedimentation depends on the centrifugal force and the frictional forces. The area is therefore functionally defined (cf. the statements above and the main claim).
Die Figur 2 zeigt, wie beim Einfüllen der Blutprobe in das Gefäß gleichzeitig die kontaktaktivierenden Partikel gleichmäßig im gesamten Blut suspendiert werden. Ist ein dichter Verschluß 13 des ausgepumpten Gefäßes vorgesehen, so kannFIG. 2 shows how, when the blood sample is filled into the vessel, the contact-activating particles are uniformly at the same time be suspended throughout the blood. If a tight seal 13 of the pumped-out vessel is provided, so can
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nach. Vornahme einer Venenpunktur mit der Nadel 40 das Blut unmittelbar in das Gefäß gesaugt werden.after. Making a venipuncture with the needle 40 the blood be sucked directly into the vessel.
Infolge der gleichmäßigen Suspension "bestehen überall kontaktaktivierende Stellen; das Blut koaguliert daher sehr rasch, die Koagulation ist nach 2-15 Min. abgeschlossen. Sodann wird die Probe zentrifugiert. Hierbei wird entsprechend Figur 3 das Blut in die leichtere Serumphase 16 und die schwerere, Zellen und Fasermaterial enthaltende Phase 18 getrennt. Die kontaktaktivierenden Partikel liegen jetzt ebenfalls getrennt vor und sind mit 20 bezeichnet.As a result of the uniform suspension "there are contact-activating agents everywhere Place; the blood therefore coagulates very quickly and the coagulation is complete after 2-15 minutes. The sample is then centrifuged. Here, according to Figure 3, the blood is in the lighter serum phase 16 and the heavier phase containing cells and fiber material 18 separated. The contact-activating particles are now also present separately and are denoted by 20.
Nach einer in der Figur 4 dargestellten bevorzugten Ausbildung wird eine bestimmte Trenngelmenge 30 aus thixotropem, inaktivem Material mit einem spezifischen Gewicht zwischen dem der zu trennenden Phasen in das Gefäß gegeben und ein dieses zu Beginn des Zentrifugierens nach oben drückendes Aktivatorelement 32 in einer zunächst etwas in das Gel eingedrückten Lage vorgesehen. Me kontakt aktivier enden Partikel werden hierbei zweckmäßig in eine Vertiefung 33 des Elementes gefüllt, und gehen bei Einführung der Blutprobe von selbst und ohne Rühren oder Schütteln in Suspension. Beim Zentrifugieren werden die Partikel 20 ausgefällt, und das emporsteigende Gel hält die schwerere und leichtere Blutphase voneinander getrennt .According to a preferred embodiment shown in FIG. 4, a certain amount of separating gel 30 is made of thixotropic, inactive material with a specific gravity between that of the phases to be separated in the vessel and a this activator element 32, which presses upwards at the beginning of centrifugation, is initially pressed slightly into the gel Location provided. Me contact-activating particles are expediently placed in a recess 33 of the element filled, and go into suspension by themselves and without stirring or shaking when the blood sample is introduced. When centrifuging the particles 20 are precipitated and the ascending gel keeps the heavier and lighter blood phases separated from one another .
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Das erfindungsgemäße Verfahren macht es überflüssig, zur Einleitung der Blutkoagulierung den Gefäßinhalt zu rühren oder das Gefäß zu schütteln oder in eine horizontale Lage zu bringen, vielmehr gehen die Partikel von selbst in Suspension und bewirken eine so rasche Koagulierung und Umwandlung des gesamten Fibrinogengehalts in Fibrin, daß diese bei Beginn des Zentrifugierens abgeschlossen ist und in der getrennten Serumphase keine Fibrinbildung stattfindet.The inventive method makes it unnecessary to initiate To prevent blood coagulation, stir the contents of the vessel or shake the vessel or bring it into a horizontal position, rather, the particles go into suspension by themselves and cause such a rapid coagulation and transformation of the whole Fibrinogen content in fibrin that this was at the start of centrifugation is complete and no fibrin formation takes place in the separate serum phase.
Bei direkter Blutentnahme durch Venenpunktur kann das Gefäß während der Koagulation und Zentrifugierung geschlossen bleiben, was aus hygienischen Gründen günstig ist, z.B. Ansteckungsgefahr durch krankes Blut herabsetzt.If blood is drawn directly through venipuncture, the vessel can remain closed during coagulation and centrifugation. which is beneficial for hygienic reasons, e.g. reduces the risk of infection by sick blood.
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