DE2534412A1 - Immobilisierte glycoenzyme, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung - Google Patents
Immobilisierte glycoenzyme, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendungInfo
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Description
Immobilisierte Glycoenzyme, Verfahren zu ihrer ■ Herstellung und ihre Verwendung
Gegenstand der Erfindung sind immobilisierte GIycoenzyme, Verfahren
zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung. Gemäß der Erfindung wird ein Glycoenzym mit einem oxydierend wirkenden
Mittel unter Bedingungen behandelt, bei denen im Kohlehydratanteil des Glycoenzyms Carbonylgruppen oder deren Präkursoren,
zum Beispiel Acetale gebildet werden, worauf das oxydierte Produkt unter Bedingungen mit einem Aminogruppen enthaltenden
Material in Kontakt gebracht wird, bei denen sich aus letzterem und dem Glycoenzym eine komplexe Verbindung bildet. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Glycoenzym,
zum Beispiel Glucoseoxydase ausreichend lange mit wässriger Perjodsäure oder einer Natriumperjodatlösung bei einem pH-Wert
von 2,5 bis 7,5 und einer Temperatur von etwa 5 bis 40 C behandelt,
daß ein Teil des Kohlehydrats in ein oxydiertes Produkt umgewandelt wird, das heißt ein Produkt, das Carbonyl-
oder Acetalgruppen enthält. Das oxydierte Glycoenzym wird dann mit einem wasserunlöslichen Polymeren, zum Beispiel p-Amino-
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polystyrol behandelt, so daß sich ein wasserunlöslicher Komplex
aus dem Glycoenzym und dem Polymeren bildet. Die bevorzugteste Enzym-Polymer-Komplexverbindung, zum Beispiel aus Glucoseoxydase
und p-Aminopolystyrol behält im Vergleich zu einer Glucoseoxydaselosung ihre volle Aktivität und besitzt verbesserte
thermische Beständigkeit.
Enzyme können unter Anwendung einer Vielzahl chemischer oder physikalischer Verfahren immobilisiert werden. Bis jetzt umfaßten
alle chemischen Verfahren die Modifizierung der Aminosäurereste eines Enzyms, auch wenn das Enzym andere funktionelle
Gruppen enthielt, die für die Immobilisierung verwendet werden könnten, zum Beispiel die Kohlehydratanteile der Glycoenzyme.
So hat man bereits Glycoenzyme, wie Glucoseoxydase oder Glucoamylase
durch chemische Modifizierung ihrer Aminosäurereste modifiziert. Die letzten Untersuchungen bezüglich der Funktion
der Kohlehydratanteile der Glucoseoxydase haben ergeben, daß der Zuckeranteil an der Katalyse nicht beteiligt ist, so daß
es vorteilhafter erscheint, die Glycoenzyme anstelle über die Aminosäuregruppen über die katalytisch nicht wesentlichen
Kohlehydratgruppen kovalent an wasserunlösliche Polymere zu
binden. Dementsprechend bezieht sich die Erfindung auf die nicht über die Aminosäuren bewirkte Immobilisierung von Enzymen.
Die Modifizierung von Glycoproteinen mit Perjodaten ist bekannt,
vergleiche zum Beispiel Biochemical and Biophysical Research
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Communications, Band 31, Nr. 1, 1968, wo die Modifizierung
von Meerrettich-Peroxidase mittels Natrxuiranetaperjodat unter Bildung eines oxydierten Produkts beschrieben ist. Der Autor
erläutert nicht die weitere Umsetzung dieses oxydierten Produktes , zum Beispiel zur Herstellung eines immobilisierten
Enzyms. Bossard, Annee Biol. 52, 202 (1948), gibt an, daß Perjodsäure die Glucosidase von Mandeln zerstört. Ähnlich
beschreiben Maekawa et al., Band 29, Nr. 7, Seiten 353-356, Proc. Japan Acad. (1953) die Oxydation von O^-Amylase mit
Natriummetaperjodat unter Bildung eines oxydierten Produkts,
das nur einen kleinen Anteil seiner ursprünglichen Wirksamkeit besitzt. Auch hier wird die oxydierte OO-Amylase weder für
eine weitere Umsetzung noch als Präkursor für eine immobilisierte Amylase vorgeschlagen.
In Archives of Biochemistry and Biophysics, Band 103, Seiten
515-518, 1963, beschreiben Pazur et al. die Perjodatoxydation von ^-Amylase und Glucoamylase unter Bildung eines Produkts,
bei dem kein Verlust an enzymatischer Wirksamkeit beobachtet wurde. Auch hier ist jedoch nicht angegeben, daß dieses Produkt
zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms weiter umgesetzt werden könnte. In Arch. Biochemistry and Biophysics, Band 111,
Seiten 351-357 (1956) , beschreiben Pazur et al. die Oxydation des Kohlehydratanteils der Glucoseoxydase mit Natriummetaperjodat.
Die Autoren geben an, daß das Enzym aufgrund der
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Oxydation an Aktivität ve.vliert. Eine weitere Umsetzung des oxydierten Produkts, zum Beispiel für die Herstellung von
immobilisierter Glucoseoxydase wird nicht vorgeschlagen.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß immobilisierte Glycoenzyme
leicht dadurch hergestellt werden können, daß man ein
Glycoenzym mit einem oxydierend wirkenden Mittel unter Bedingungen umsetzt, bei denen der Kohlehydratanteil des Glycoenzyms
unter Bildung von Carbonylgruppen oder deren Präkursoren einer Oxydation unterliegt, und das oxydierte Reaktionsprodukt mit
einem Aminogruppen enthaltenden Material zu einem wasserunlöslichen Komplex aus dem Aminogruppen enthaltenden Material
und dem oxydierten Glycoenzym umsetzt. Vorzugsweise besteht das Aminogruppen enthaltende Material aus einem Polymeren,
zum Beispiel p-Aminopolystyrol. Die bevorzugten Enzym-Polymer-'
Komplexe gemäß der Erfindung haben im wesentlichen die gleiche Aktivität wie das native Enzym, besitzen jedoch verbesserte
thermische Beständigkeit.
Glycoenzyme sind Enzyme, die in ihrem Molekül einen Kohlehydratanteil
enthalten. Die Rolle des Kohlehydratanteils in diesen Enzymen ist nicht ganz klar. Man nimmt jedoch an und
es liegen auch einige Beweise hierfür vor, daß sie katalytisch inert, das heißt für die Enzymwirksamkeit nicht wesentlich
sind. Die Erfindung macht von dieser inerten Eigenschaft der
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Kohlehydratanteile Gebrauch, indem sie diese für die Bindung des Glycoenzyms an das Aminogruppen enthaltende Material heranzieht,
so daß das Enzym modifiziert und zum Beispiel wasserunlösliche Komplexe gebildet werden. Die Erfindung betrifft
dementsprechend wasserunlösliche Glycoenzyme, ein Verfahren
zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
Viele Glycoenzyme sind bereits identifiziert, vergleiche zum
Beispiel Pazur et al·, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Band 27, 1972, Academic Press, New York, Seite
301 ff. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch allgemein zur Modifizierung von Glycoproteinen und Glycopeptiden verwendet
werden. Besonders geeignet ist es jedoch für die Modifizierung von Glycoenzymen, wobei der katalytisch inerte Anteil des
Enzyms für die Bildung der wasserunlöslichen Komplexe herangezogen
wird. Durch die Bindung des Enzyms über die katalytisch nicht erforderlichen Gruppen an ein wasserunlösliches Material
können die bei vielen der bekannten Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen auftretenden Probleme, zum Beispiel der
Aktivitätsverlust, vermieden werden.
Erfindungsgemäß ist insbesondere die Immobilisierung von Glucoseoxidase,
Q£-Amylase, Glucoamylase, Invertase, Galactosidase,
Bromelin, Chlorperoxydase, Peroxydase und von verschiedenen Proteasen vorgesehen. Diese Enzyme eignem sich für die folgenden
Verfahren: Entfernung von O2 aus Lösungen (Glucoseoxydase);
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Hydrolyse von Stärke (c^-Amylase, Glucoamylase); Hydrolyse von
Saccharose (Invertase); Hydrolyse von Lactose (Galactosidase); Hydrolyse von Peptlden, Amiden und Estern (Bromelin); Synthese
von Kohlenstoff-Halogen-Bindungen (Chlorperoxydase); Oxydation von Phenolen, Aminophenolen, Diaminen und Aminosäuren in
Gegenwart von H^Op (Peroxydase) und Hydrolyse von Proteinen
(Proteasen).
Für die Oxydation des Kohlehydratanteils der Glycoenzyme zu Carbonylgruppen oder Präkursoren der Carbony!gruppen, zum Beispiel
Acetalen, können verschiedene Oxydationsmittel verwendet werden, zum Beispiel Bleitetraacetat, Manganacetat, Kobaltacetat,
Thalliumacetat, Cersulfat, o.a. Das bevorzugte Oxydationsmittel
ist jedoch ein Perjodat, zum Beispiel Perjodsäure, Natriummetaperjodat, Kaliummetaperjodat usw.
Die Oxydation von Kohlehydraten und Polysacchariden mit Perjodaten
ist bekannt, vergleiche zum Beispiel J.M. Bobbitt, Advances in Carbohydrate Chemistry, Band 11, 1956, Academic
Press, New York, Seite 1 ff. Dort ist die Verwendung verschiedener Perjodate für die Oxydation von Kohlehydraten angegeben.
Die beschriebenen Verfahren sind allgemein anwendbar für die Herstellung oxydierter Glycoenzyme, die nachfolgend
für die Bildung der erfindungsgemäßen immobilisierten Glycoenzyme verwendet werden.
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Vorzugsweise^ wird das oxydierte Glycoenzym durch Behandlung
des Glycoenzyms mit Perjodat in wässriger Lösung bei pH 2,5
bis 7,5, insbesondere 4,5 bis 6,5 hergestellt. Die Temperatur
beträgt vorzugsweise etwa 5 bis 45 C und insbesondere 10 bis 30 C. Das Glycoenzym kann in einer Konzentration von 0,1 bis
10 mg/ml, zum Beispiel von etwa 2 mg/ml vorliegen. Die Perjodatkonzentration
der wässrigen Lösung beträgt etwa 0,1 bis 5 mg/ml, zum Beispiel etwa 0,5 mg/ml. Diese Bedingungen werden
jeweils so eingestellt, daß ein Glycoenzym erhalten wird, das ausreichend oxydiert ist, aber noch genügend Aktivität für
die Umsetzung mit dem Aminogruppen enthaltenden Material in der nachfolgenden Stufe hat. Das Glycoenzym wird unter Bildung
von Carbony!gruppen oder deren Präkursoren, zum Beispiel
Acetalen, oxydiert, die für die nachfolgende Umsetzung mit der Aminoverbindung benötigt werden.
Es ist bekannt, daß verschiedene Glycoenzyme unterschiedliche Mengen gebundener Kohlehydrate enthalten. Im allgemeinen wird
die Perjodatkonzentration gemäß der Menge des vorhandenen Glycoenzyms und des im Glycoenzym enthaltenen Kohlehydratanteils
eingestellt.
Im allgemeinen wird, bezogen auf das Kohlehydrat, ein Überschuß an Perjodat verwendet, da die Umsetzung normalerweise nicht
vollständig verläuft. Man nimmt an, daß einige der Kohlehyratgruppen
sterisch gegen das Perjodat geschützt sind. Es sind
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jedoch ausreichend Kohlehydratgruppen für .die Bildung der
Carbonylgruppen zugänglich, die für die weitere Umsetzung mit dem Aminogruppen enthaltenden Material erforderlich sind.
Die Oxydation führt man vorzugsweise unter Lichtausschluß durch, um eine zu starke Oxydation des Glycoenzyms zu vermeiden. Die
Kontaktzeit muß ausreichen, um mindestens eine minimale Konzentration
an Carbonylgruppen für die nachfolgende Umsetzung mit dem Aminogruppen enthaltenden Material zu erzielen. Die Dauer
des Kontakts zwischen dem Glycoenzym und dem Perjodat kann zum Beispiel 15 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 30 bis 180
Minuten betragen. Das oxydierte Glycoenzym wird dann vorzugsweise aus der wässrigen, das restliche Perjodat enthaltenden
Lösung abgetrennt. Das oxydierte Glycoenzym kann jedoch auch ohne Abtrennung mit dem Aminogruppen enthältenden Material
umgesetzt werden, vorausgesetzt, daß keine die Umsetzung beeinträchtigenden Verbindungen vorhanden sind, zum Beispiel
Verbindungen, die mit Aminogruppen oder einem Überschuß an Aminogruppen reagieren. Das oxydierte Glycoenzym wird zweckmäßig durch Dialyse gegen eine gepufferte Lösung abgetrennt.
Zum Beispiel kann ein Acetatpuffer bei einem pH-Wert von 5,59 mit einer Membran in Kontakt gebracht werden, die mit der
Lösung des oxydierten Glycoenzyms in Berührung steht, bis kein dialysierbares Material mehr durch die Membran tritt. Das
oxydierte Glycoenzym sollte, wenn es vor der nachfolgenden
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Kupplungsstufe aufbewahrt wird, auf einer Temperatur von unter 25°C gehalten werden.
Darauf wird eine wässrige Lösung des oxydierten Glycoenzyms,
zum Beispiel eine 0,1 bis 3 %ige Lösung mit dem Aminogruppen enthaltenden Material behandelt. Vorzugsweise besteht das Aminogruppen
enthaltende Material aus einem wasserunlöslichen Material, zum Beispiel einem Polymeren, jedoch können auch Aminogruppen
enthaltende Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht verwendet werden. In dieser Stufe ist der pH-Wert entweder leicht
sauer oder basisch und beträgt vorzugsweise 5,5 bis 6,5 oder 7,5 bis 9,5. Für die Einstellung des pH-Wertes können entweder
HCl oder NaOH verwendet werden. Das Gemisch wird bei einer Temperatur von 5 bis 35 C ausreichend lange gerührt, um den
Glycoenzym-Amino-Komplex zu bilden. Dieser Komplex kann dann
durch Filtrieren aus dem Gemisch abgetrennt werden. Vorzugsweise wird er nacheinander mit Wasser und Salzlösung, zum
Beispiel gepufferter Natriumchloridlösung gewaschen, um jegliches nichtgebundene Enzym zu entfernen.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Aminogruppen enthaltende Material enthält mindestens eine Aminogruppe je
Molekül und vorzugsweise mindestens eine primäre Aminogruppe. Sekundäre Aminogruppen sind für die Umsetzung mit dem oxydierten
Glycoenzym weniger vorteilhaft, und am wenigsten geeignet sind die tertiären Aminogruppen.
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Die Aminogruppe ist so ausgewählt, daß der durch die Umsetzung erhaltene Enzym-Amin-Komplex wasserunlöslich ist. Vorzugsweise
besteht der Komplex aus einem wasserunlöslichen festen Material, der bei enzymkatalysierten Umsetzungen in einem heterogenen
System verwendet werden kann. Amine, die mehr als eine Aminogruppe, insbesondere primäre Aminogruppen enthalten, werden
bevorzugt.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Aminoverbindung kann aus solchen der allgemeinen Formel
R-X-N-R1 ι >
R2
ausgewählt sein, in der R, R1 und R- Wasserstoff atome, Kohlenwasserstoffreste
oder substituierte Kohlenwasserstoffreste sind und X ein Stickstoff- oder Kohlenstoffatom ist. Die Substituenten
der Kohlenwasserstoffreste können Halogen, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor, Silicium oder Stickstoff sein.
R ist vorzugsweise ein im wesentlichen linearer polymerer Rest, der zum Beispiel ein Molekulargewicht von 5OO bis 1 .000.000
hat, und R- und R2 bedeuten Wasserstoff- Wenn X Stickstoff
darstellt, ist eine weitere Gruppe kovalent gebunden, die in der obigen allgemeinen Formel nicht dargestellt ist. Wenn X
Kohlenstoff bedeutet, sind selbstverständlich zwei nichtdargestellte kovalent gebundene Gruppen vorhanden. Im allgemeinen
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handelt es sich bei diesen Gruppen um Wasserstoff oder Kohlenwasserstoff
gruppen mit zum Beispiel bis zu 20 Kohlenstoffatomen. Vorzugsweise stellen diese Gruppen Wasserstoff und C-,- bis
C_-Alky!gruppen und insbesondere Wasserstoff dar.
Bestimmte Substituenten der bevorzugten Gruppe R/ das heißt
der polymeren Gruppe, können an die Polymerkette gebunden sein oder sich in dieser als Heteroatome befinden. Zum Beispiel
können Sauerstoffatome in" Form von Äthern vorliegen, zum Beispiel
kann R ein Polyäthylenoxidrest sein; sie können auch als Carbonylgruppen an die Kohlenstoffkette gebunden sein, zum
Beispiel kann R einen Polyvinylacetatrest darstellen.
Vorzugsweise besteht das Aminogruppen enthaltende Material aus einem wasserunlöslichen Aminogruppen enthaltenden Polymeren,
zum Beispiel aus Poly-p-aminostyrol, Äminoäthylzellulose,
Carboxymethylzellulosehydrazid, Biogel P-2 Hydrazid, einem Derivat von Polyacrylamid {Hersteller Bio-Rad Corp., Richmond,
California), Amino-Sepharose, das nach dem von Cuatrecasas in Journal Biol. ehem., Band 245, Seiten 3059-3065 (1970),
beschriebenen Verfahren hergestellt werden kann, oder aus aminoalkyl!ertem Glas (Hersteller Pierce Chemical, Rockford,
Illinois) u.a.
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Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Aktivität der
Glycoenzym-Poly-p-aminostyrol-Komplexe gemäß der Erfindung im
wesentlichen gleich der des Glycoenzyms in nativem Zustand, das heißt in wässriger Lösung ist. Noch überraschender ist,
daß viele der Glycoenzym-Aminopolymer-Komplexe im Vergleich zu den nativen Enzymen bessere thermische Beständigkeit be-
sitzen.
Die wasserunlöslichen Komplexe gemäß der Erfindung können in allen Verfahren verwendet werden, in denen jetzt die nativen
Glycoenzyme zur Anwendung kommen. Dabei ist es aufgrund der größeren thermischen Beständigkeit der Komplexe möglich, diese
Verfahren bei höheren Temperaturen durchzuführen, ohne daß eine Denaturierung der Enzyme eintritt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Die Aktivität der Glucoseoxydase von Aspergillus niger (Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.) wurde spektrophotometrisch
bei 460 run mittels des gekuppelten Peroxydase-o-Dianisidin Systems unter Verwendung von D-Glucose in 100 mM
Phosphatpuffer bei pH 6,0 und 25 C gemessen, vergleiche H.H. Weetall und L.S. Hersh, Biochim. Biophys. Acta, Band 206,
Seiten 54-60 (1970). Die Aktivität des immobilisierten Enzym-
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derivates wurde nach der Methode von 0. Zarborsky und J. Ogletree, Biochim. Biophys. Acta, Band 289, Seiten 68-76
(1972), bestimmt.
Die Konzentration der Glucoseoxydase wurde spektrophotometrisch bei 450 nm (50 mM Acetatpuffer, pH 5,6) unter Verwendung des
4-1-1 Extinktionskoeffxzienten 1,41 χ 10 M cm ermittelt. Die
Konzentration des katalytisch wirksamen Enzyms wurde spektrophotometrisch unter Verwendung des molaren Differentialextinktionskoeffizienten
bei 450 nm von 1,31 χ 10 M cm festgestellt, vergleiche M.K. Weibel und H.J. Bright, J. Biol. Chem.,
Band 246, Seiten 2734-2744 (1971). Die Konzentration des katalytisch wirksamen Enzyms wurde spektrophotometrisch unter Verwendung
des molaren Differentialextinktionskoeffizienten bei
4 -1 -1
450 nm von 1,31 χ 10 M cm durch anaerobe Titration des Enzyms mit Glucose festgestellt, vergleiche M.K. Weibel und H.J. Bright, Biochem. J., Band 124, Seiten 801-807 (1971). Der Proteingehalt des Enzym-Polymer-Komplexes wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt, vergleiche O.R. Zaborsky und J. Ogletree, Biochim. Biophys. Acta, Band 289, Seiten 68-76 (1972). Die Menge des Proteins wurde aus der festgestellten Menge Alanin (AIa), Valin (VaI) und Glutaminsäure (GIu) ermittelt und unter der Annahme, daß das Molgewicht des Enzyms 150.000 beträgt und daß je Molekül 108 Alanin-, 79 Valin- und 99 Glutaminsäureeinheiten vorhanden sind, vergleiche J.E. Pazur, K. Kleppe
450 nm von 1,31 χ 10 M cm durch anaerobe Titration des Enzyms mit Glucose festgestellt, vergleiche M.K. Weibel und H.J. Bright, Biochem. J., Band 124, Seiten 801-807 (1971). Der Proteingehalt des Enzym-Polymer-Komplexes wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt, vergleiche O.R. Zaborsky und J. Ogletree, Biochim. Biophys. Acta, Band 289, Seiten 68-76 (1972). Die Menge des Proteins wurde aus der festgestellten Menge Alanin (AIa), Valin (VaI) und Glutaminsäure (GIu) ermittelt und unter der Annahme, daß das Molgewicht des Enzyms 150.000 beträgt und daß je Molekül 108 Alanin-, 79 Valin- und 99 Glutaminsäureeinheiten vorhanden sind, vergleiche J.E. Pazur, K. Kleppe
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und A. Cepure, Arch. Biochem. Biophys., Band 111, Seiten
351-357 (1965).
Zu einer Lösung von 40,2 mg (2f68 χ 10 Mol) Glucoseoxydase
in 20 ml 50 mM Acetatpuffer vom pH 5,60 in einem auf 25 C
gehaltenen und gegen Licht geschützten Thermostaten wurden unter Rühren 0,4 ml einer Perjodsäürelösung (9,12 mg, 4,00 χ
10 Mol) gegeben. Die gelbe Lösung wurde 4 Stunden gerührt, dann wurden 0,025 ml Äthylenglykol (4,48 χ 10 Mol) zur Umsetzung
mit dem überschüssigen Perjodat zugefügt, und es wurde noch eine halbe Stunde gerührt. Die Lösung wurde darauf unter
einem Stickstoffdruck von 3,5 kg/cm in eine Ultrafiltrationszelle
(Amicon Modell 202) übergeführt, die mit einem XM-50-Filter ausgestattet war, und gegen 50 mM Acetatpuffer vom
pH 5,59 dialysiert, bis kein dialysierbares Material mehr austrat. Die Umwandlung der Perjodsäure nach vierstündiger
Umsetzung mit der Glucoseoxydase, bezogen auf die Extinktionsänderung bei 223 nm, vergleiche J.J. Dixon und D. Lipkin,
Anal. Chem., Band 26, Seiten 1092-1093 (1954), betrug 61,6 %. Das oxydierte Enzym wurde bei 5 C aufbewahrt.
Zu 5 ml einer Lösung von 10 mg oxydierter Glucoseoxydase wurden
250 mg feinpulvriges p-Aminostyrol (Hersteller Polysciences
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Inc., Warrington, Pennsylvania) gegeben. Die Suspension wurde mit 0,1 normaler NaOH auf pH 9 eingestellt, eine Stunde bei
etwa 25°C gerührt und dann durch einen 0,45 ,u Milliporenfilter filtriert. Der Feststoff wurde mit 1 Liter Wasser und 1 Liter
1 M NaCl in 50 mM Phosphatpuffer vom pH 6,4 gewaschen. Nachdem der Feststoff mit einigen ml Wasser gewaschen worden war, wurde
im Waschwasser keine weitere Aktivität festgestellt. Das ursprüngliche
Filtrat zeigte hohe Aktivität, die NaCl-Waschlösung keine Aktivität.
Die Kupplung der oxydierten Glucoseoxydase mit p-Aminostyrol
führte zu einem aktiven Enzym-Polymer-Komplex. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß das
Enzym über eine Iminbindung an die Polymeren gebunden ist. Wenn jedoch das Aminogruppen enthaltende Material ein Hydrazid*
ist, liegt eine Hydrazonbindung vor. Die Proteinbeladung (mg Enzym je g Enzym-Polymer-Komplex) beträgt bei dem p-Aminostyrol
5 bis 8 mg. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms entspricht der Aktivität der nativen und oxydierten Enzyme,
vergleiche die nachstehende Tabelle I. Dies beruht wahrscheinlich auf der Immobilisierung des Enzyms über die katalytisch
nicht wesentlichen Kohlehydratgruppen, da im Enzym keine oxydierten Aminosäurereste festgestellt wurden.
^ Der Komplex wurde 6 Wochen in 1OO mM Phosphatpuffer von pH 6,31
·/ aufbewahrt. Er behielt seine Aktivität und der Puffer blieb
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1 2
inaktiv, was anzeigt, daß keine Desorption auftrat.
Die Tabelle II zeigt die thermische Beständigkeit der Glucoseoxydase.
Es ist festzustellen, daß das native und das oxydierte Enzym ähnliche Beständigkeit haben (das oxydierte Enzym ist
etwas beständiger), während die wasserunlöslichen Komplexe eine deutlich verbesserte Beständigkeit zeigen. Andere Aminogruppen
enthaltende Polymere (Aminoäthylzellulose, Carboxymethylzellulosehydrazid,
Biogel-P-2 Hydrazid und Amino-Sepharose) wurden ebenfalls für die Immobilisierung oxydierter Glucoseoxydase
verwendet, siehe die nachstehende Tabelle III.
Die Enzym-Polymer-Komplexe wurden bei 60 C als wässrige Suspension
oder Lösung (natives Enzym) in einem Natriumacetatpuffer bei pH 5,6 auf ihre thermische Beständigkeit untersucht
Die Konzentration des nativen und des oxydierten Enzyms wurde auf 0,4 mg/ml eingestellt. Die Konzentration der Komplexverbindung
betrug etwa 0,75 mg/ml.
Tabelle I Aktivität von Glucoseoxydasen
Glucoseoxydase spezifische Aktivität
(Einheiten/mg Protein)
nativ ' 91,9(a)
oxydiert 92,5(a)
gebunden an p-Aminostyrol 93,1 '
^ bezogen auf Protein, das durch anaerobe Spektraltitration
mit Glucose bestimmt wurde.
bezogen auf Protein, das durch Aminosäureanalyse bestimmt wurde. Proteinbeladung5,87 mg Enzym/g Enzym-Polymer-Komplex.
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Tabelle II | oxydiert p-Aminostyrol-Komplex | 100 | |
Thermische Beständigkeit | 100 | 76,8 | |
76,0 | 60,0 | ||
Zeit, Stunden |
59,1 | 59,4 | |
O | Relative Aktivität der Glucoseoxydasen, % | 49,3 | 56,6 |
0,25 | nativ | 38,1 | 48,1 |
0,50 | 100 | 30,0 | 41,4 |
0,75 | 63,4 | 21,0 | 34,5 |
1,0 | 47,1 | 11,0 | 28,6 |
1,5 | 36,8 | 6,4 | 24,6 |
2,0 | 27,4 | 4,0 | 24,3 |
3,0 | 15,7 | 2,7 | 12,7 |
4,0 | 8,7 | _ | |
5,0 | 3,5 | ||
6,0 | 1,8 | ||
48,0 | 1,1 | ||
0 | |||
_ |
€09809/0968
253U12
Thermische Beständigkeit von Glucoseoxydase Bio-Gel-P-2 Hydrazid-Komplex
O 100
0,5 96,7
1,0 78,9
1,5 64,0
2,0 64,4
■2,5 66,7
3,0 51,7
24,0 27,2
53,0 12,1
68,0 5,4
92,0 4,4
Thermische Beständigkeit von Glucoseoxydase Amino-Sepharose-Komplex
0 100
0,5 85,2
1,0 93,8
1/5 . 76,7
2,0 85,0
2,5 86,1
3,0 71,7
SG9809/Q966
Chromatographie und Bindung oxydierter Glucoseoxydase an
Aminoäthylzellulose
Aminoäthylzellulose
Auf eine Säule aus Aminoäthylzellulose (Bio-Rad Cellex-AE mit
einer Austauschkapazität von 0,25 mg/g) mit einem Durchmesser von 0,9 cm und einer Länge von 12,5 cm, die zuvor mit 100 ml
5 M NaCl-50 mM Natriumacetat-Puffer vom pH 4,93 und mit 100 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer vom pH 4,94 unter Verwendung einer Präzisionspumpe bei einer.Geschwindigkeit von 40 ml/Std. gewaschen worden war, wurde 1,0 ml native oder oxydierte Glucoseoxydase aufgebracht. Es wurden 1 ml Anteile gesammelt und die Extinktion bei 280 nm registriert. Nachdem 30 ml die Säule
passiert hatten, wurde der Puffer von 50 mM Natriumacetat vom pH 4,93 auf 1 M NaCl-50 mM Acetat vom pH 4,94, dann auf 2,5 M NaCl-5O mM Acetat vom pH 4,94 und schließlich auf 5 M NaCl-50 mM Acetat vom pH 4,94 geändert. Nach der Elution mit dem 5 M
NaCl-Puffer wurde die Säule mit 50 mM Acetatpuffer vom pH
4,93 gewaschen. Getrennte aber gleiche Säulen wurden für native und oxydierte Glucoseoxydase verwendet. Am Ende der Elution
wurde die Aktivität in beiden Aminoäthylzellulosesäulen festgestellt (Aktivität wurde sowohl an der Spitze als auch am
Boden der Säule beobachtet).
5 M NaCl-50 mM Natriumacetat-Puffer vom pH 4,93 und mit 100 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer vom pH 4,94 unter Verwendung einer Präzisionspumpe bei einer.Geschwindigkeit von 40 ml/Std. gewaschen worden war, wurde 1,0 ml native oder oxydierte Glucoseoxydase aufgebracht. Es wurden 1 ml Anteile gesammelt und die Extinktion bei 280 nm registriert. Nachdem 30 ml die Säule
passiert hatten, wurde der Puffer von 50 mM Natriumacetat vom pH 4,93 auf 1 M NaCl-50 mM Acetat vom pH 4,94, dann auf 2,5 M NaCl-5O mM Acetat vom pH 4,94 und schließlich auf 5 M NaCl-50 mM Acetat vom pH 4,94 geändert. Nach der Elution mit dem 5 M
NaCl-Puffer wurde die Säule mit 50 mM Acetatpuffer vom pH
4,93 gewaschen. Getrennte aber gleiche Säulen wurden für native und oxydierte Glucoseoxydase verwendet. Am Ende der Elution
wurde die Aktivität in beiden Aminoäthylzellulosesäulen festgestellt (Aktivität wurde sowohl an der Spitze als auch am
Boden der Säule beobachtet).
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV zusammengestellt. Zu bemerken ist, daß das oxydierte Enzym
609S09/0966
während der Elution in viel geringerer Menge zurückgewinnbar ist, was anzeigt, daß sich ein wasserunlöslicher Enzym-Aminopolymer-Komplex
gebildet hat.
Der oxydierte Enzym-Aminopolymer-Komplex wurde auf seine Aktivität
untersucht. Es wurde gefunden, daß er gegenüber dem Enzym in nativem Zustand erhöhte Wirksamkeit besitzt.
Chromatographie und Bindung von nativer und oxydierter Glucoseoxydase an Aminoäthylzellulose
mg aufgebrachtes Protein
mg zurückgewonnenes Protein (löslich)
% Rückgewinnung
mg nicht zurückgewonnenes Protein (auf Aminoäthylzellulose)
native oxydierte Glucoseoxydase Glucoseoxydase
2,94
2,67
2, | 54 | o, | 84 |
86, | 4 ? | 31, | 5 ? |
ί | > | ||
0,40 (durch Differenz) |
1,83 (durch Differenz) |
Bindung der oxydierten Glucoseoxydase an Carboxylmethylzellulose-Hydrazid
Oxydierte Glucoseoxydase wurde an das Hydrazid von Carboxymethyl-Zellulose
(Enzite, CMC-Hydrazid), Hersteller Miles Laboratories,
809809/0966
Elkhardt, Indiana, auf ähnliche Weise wie an Polyaminostyrol
gebunden. Die Bedingungen waren: 250 mg Enzite und 10,2 mg
oxydierte Glucoseoxydase wurden in 10 ml einer wässrigen Acetatpufferlösung bei pH 5,06 18 Stunden bei 5 C in Kontakt gebracht.
Das Waschen des Enzym-Polymer-Komplexes verursachte aufgrund eines Zusammenklumpens Probleme - was bei der Kontrolle
(Glucoseoxydase und Carboxymethylzellulose-Hydrazid) nicht beobachtet wurde. Der Komplex wurde mit 130 ml 50 mM Natriumacetat
bei pH 4,94 und mit 600 ml 1 M NaCl in 50 mM Natriumacetatpuffer bei pH 4,8 gewaschen, bis im Filtrat (etwa 150 ml)
keine Aktivität mehr beobachtet wurde. Der Feststoff war aktiv und wurde im Puffer bei 5 C aufbewahrt.
Der Kontrollfeststoff besaß ähnlich wie p-Aminostyrol ebenfalls
nur geringe Wirksamkeit.
Bindung der Glucoseoxydase an das Hydrazid von Bio-gel P-2
Die Bindung oxydierter Glucoseoxydase an das Hydrazid von Bio-Gel P-2 (0,074 bis 0,149 mm) wurde in 50 mM Natriumacetat vom
pH 5,51 19 Stunden lang bei 5 C durchgeführt. Ein entsprechender
Kontrollversuch wurde unter Verwendung nativer Glucoseoxydase durchgeführt. Der gebildete Komplex wurde mit 50 mM
Natriumacetatpuffer vom pH 5,6, 1 M NaCl-50 mM Natriumacetat vom pH 5,8 und 2,0 M NaCl-50 mM Acetat vom pH 5,1 gewaschen.
Im Gegensatz zur oxydierten Glucoseoxydase konnte die gesamte Aktivität (das adsorbierte Enzym) durch Waschen mit 2 M NaCl
aus dem native Glucoseoxydase-Hydrazidkomplex entfernt werden,
609809/Oftfifi
Claims (11)
- 253U12PatentansprücheWasserunlösliche Enzym-Polymer-Komplexe, bestehend aus einem im Kohlehydratanteil oxydierten Glycoenzym, das kovalent an ein Aminogruppen enthaltendes Material gebunden ist.
- 2. Komplexe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus Glucoseoxydase besteht.
- 3. Komplexe nach Anspruch 1, dcidurch gekennzeichnet, daß das Aminogruppen enthaltende Material polymer ist und aus einem Polyacrylamidderivat oder p-Amino-polystyrol besteht,
- 4. Komplexe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aminogruppen enthaltende Material aus einem Carboxymethyl Zellulosederivat besteht.
- 5. Verfahren zur Herstellung der Komplexe nach Anspruch 1 durch Immobilisierung eines Glycoenzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man den Kohlehydratanteil des Glycoenzyms unter Bedingungen oxydiert, bei denen mindestens eine Carbonylgruppe oder deren Präkursor gebildet wird und das erhaltene oxydierte Glycoenzym mit einem Aminogruppen enthaltenden Material umsetzt.609809/0966
- 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet/ daß man das Glycoenzym mit einem Perjodat enthaltenden Material oxydiert, das oxydierte Glycoenzym vom Perjodat enthaltenden Material trennt, und das oxydierte Glycoenzym mit einem wasserunlöslichen Aminogruppen enthaltenden Polymeren umsetzt.
- 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Glycoenzym aus Glucoseoxydase besteht.
- 8. Verfahren nach Anspruch 6 ur.d 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche Polymere aus p-Aminostyrol besteht.
- 9. Verfahren nach Anspruch 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet/ · daß man das Glycoenzym in wässriger Lösung bei pH 2/5 bis 7/5 mit dem Perjodat behandelt.
- 10. Verfahren nach Anspruch 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Perjodat aus Per jodsäure oder Natritunperjodat besteht.
- 11. Verfahren nach Anspruch 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die ümsetzungs temperatur etwa 5 bis etwa 45°C beträgt.schikö603809/0966
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