DE2415257B1 - Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Glucose in Urin - Google Patents
Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Glucose in UrinInfo
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von Glucose im Urin, bestehend
aus einem saugfähigen Träger, der mit Glucoseoxidase, Peroxidase, einem Indikator und einem Puffer
imprägniert ist.
Der Nachweis von Glucose im Harn ist von großer Bedeutung für Diagnose und Verlaufskontrolle des
Diabetes. Auf Grund dieser Tatsache ist eine große Anzahl von sogenannten Schnelltesten in der Patentliteratur
beschrieben, von denen einige im Handel sind. Sie basieren fast ausschließlich auf folgendem
Prinzip: Glucose wird mittels Glucoseoxidase durch Sauerstoff zu Glukonsäure und Wasserstoffperoxid
oxydiert, dieses oxydiert mittels Peroxidase einen Indikator zu einer f art igen Verbindung. Obwohl eine
Reihe solcher Indikatoren beschrieben ist, wird bisher vorwiegend o-Tolidin verwendet.
Im allgemeinen wird für einen solchen Glucose-Test ein pH-Bereich von 4 bis 7 beschrieben, der mit
den üblichen Puffern wie Phosphat-, Citrat- und ähnlichen Puffern eingestellt wird. Bevorzugt ist jedoch
fast ausschließlich pH 5, da bei diesem pH-Wert Empfindlichkeit und Abstufung offensichtlich optimal
sind (vergleiche z. B. US-Patentschriften 3050373 und 28 48 308 sowie DT-PS 15 98 809). Testpapiere
mit diesem pH-Wert haben jedoch den schwerwiegenden Nachteil, daß die Reaktionsfarbe bei der sogenannten
»diabetischen Ketoacidose« abgeschwächt ist, ja sogar völlig unterdrückt sein kann. Bei der
Ketoacidose treten im Harn größere Mengen Acetessigsäure und Hydroxybuttersäure auf, was die
Reaktion der Testpapiere mit einem Puffer von pH 5 stört. Die Ketoacidose tritt hauptsächlich bei Diabetes
auf, aber auch bei anderen Erkrankungen und bei Hungerzuständen. Die »diabetische Ketoacidose«
unterscheidet sich von den anderen nur durch das gleichzeitige Auftreten von Glucose im Harn. Ein
Schnelltest auf Glucose, der bei Ketoacidose gestört wird, ist also weder zur Differential-Diagnose der
Ketoacidose noch zur Diagnose und zur Verlaufskontrolle des Diabetes optimal geeignet.
Unsere Versuche haben gezeigt, daß man durch Heraufsetzung des pH-Wertes der Glucose-Testpapiere
auf 5,8 bis 6,2, vorzugsweise 6,0, die Störung bei Ketoacidose herabmindern kann. Bei der Verwendung
herkömmlicher Puffer zeigt sich jedoch, daß sich die Abstufung der Farbreaktion stark verschlechtert,
ohne daß die Störung in allen Fällen vermieden wird. Außerdem läßt die Haltbarkeit der Testpapiere
in vielen Fällen zu wünschen übrig.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man Glucose-Testpapiere erhält, die empfindlich,
schnell und mit guter Abstufung reagieren und die bei Ketoacidose nicht gestört werden, wenn man bei
einem diagnostischen Mittel der eingangs genannten Art als Puffer 2-(N-Morpholino)-äthansulfonsäure
(MES) verwendet. Auch sind diese Papiere bei länger dauernden Temperaturbelastungen völlig stabil, was
bei der Verwendung in den Tropen von besonderer Bedeutung ist.
2-(N-Morpholino)-äthansulfonsäure ist zwar ein bekannter Puffer; er wurde von Good, Biochemistry
5 (1966), S. 467, für Arbeiten mit biologischen Systemen eingeführt, jedoch ausschließlich in flüssiger
Phase und nicht in festen Reagenzienzubereitungen wie Testpapieren. Für den Fachmann waren die überraschenden
Wirkungen dieses speziellen Puffers bei der Verwendung in Glucose-Testpapieren nicht ohne
weiteres vorhersehbar, zumal andere in biologischen Systemen verwendete Puffer, wie z. B. das sogenannte
Tris, keine dem MES entsprechenden Wirkungen zeigen (vgl. die folgende Tabelle).
Puffer (pH 6,0)
Reaktionsfarbe mit 100 bis 1000 mg % Glucose im Harn
Störung durch 250 mg %
Acetessigsäure und
2000 mg % ^-Hydroxybuttersäure im Harn
Acetessigsäure und
2000 mg % ^-Hydroxybuttersäure im Harn
Reaktionsabfall
nach 30 Tagen bei 6O0C
MES, 0,5 m
(vgl. Beispiel 1)
(vgl. Beispiel 1)
Phosphat, 0,25 m
Citrat, 0,25 m
Citrat, 0,5 m
Tris-Citrat, 0,5 m
Imidazol, 0,25 m
3-Aminopyridin, 0,5 m
Malonat, 0,5 m
Maleat, 0,125 m
Pyrophosphat, 0,25 m
Citrat, 0,25 m
Citrat, 0,5 m
Tris-Citrat, 0,5 m
Imidazol, 0,25 m
3-Aminopyridin, 0,5 m
Malonat, 0,5 m
Maleat, 0,125 m
Pyrophosphat, 0,25 m
Vergleich mit pH 5:
Citrat, 0,25molar
Citrat, 0,25molar
hellgrün bis blauschwarz
hellgrün bis graugrün
hellgrün bis graugrün hellgrün bis dunkelgrün hellgrün bis grün
hellgrün bis graugrün
grüngelb bis hellgrün
graugrün bis dunkelgrün hellgrün bis graugrün
hellgrün bis dunkelgrün
hellgrün bis graugrün hellgrün bis dunkelgrün hellgrün bis grün
hellgrün bis graugrün
grüngelb bis hellgrün
graugrün bis dunkelgrün hellgrün bis graugrün
hellgrün bis dunkelgrün
dunkelgrün bis blauschwarz keine Störung
mäßige Störung
mäßige Störung
mäßige Störung
geringe Störung
starke Störung
geringe Störung
mäßige Störung
mäßige Störung
mäßige Störung
mäßige Störung
mäßige Störung
geringe Störung
starke Störung
geringe Störung
mäßige Störung
mäßige Störung
mäßige Störung
starke Störung
praktisch kein Abfall
sehr starker Abfall
starker Abfall
starker Abfall
starker Abfall
sehr starker Abfall
keine Reaktion mehr
starker Abfall
mäßiger Abfall
sehr starker Abfall
starker Abfall
starker Abfall
starker Abfall
sehr starker Abfall
keine Reaktion mehr
starker Abfall
mäßiger Abfall
sehr starker Abfall
geringer Abfall
3 4
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, liefert nur MES Glucoseoxidase 222 mg
als Puffersubstanz in jeder Hinsicht optimale Test- Peroxidase 28 mg
papiere. Mit den übrigen gebräuchlichen und auch MES-Puffer
ungewöhnlichen Puffersubstanzen erhält man Test- (pH 6,0; 1,0 M wäßrige Lösung) ... 50 ml
papiere, die eine zum Teil beträchtliche Störung durch 5 Tartrazin 80 mg
Acetessigsäure und Hydroxybuttersäure (d. h. bei o-Tolidin ι... 420 mg
Ketoacidose) aufweisen und außerdem weniger emp- Äthanol 33 ml
findlich und/oder weniger haltbar sind. Wasser, destilliert ad 100 ml
Der erfindungsgemäß verwendete MES-Puffer wird
in Konzentrationen von 25 bis 75 mMol, Vorzugs- io Das Testpapier reagiert mit Urinen, die von 50 bis
weise 50 mMol, pro 100 ml Imprägnierlösung ein- 1000 mg% Glucose enthalten, mit hellgrünen bis
gesetzt. Man erhält den gewünschten pH-Bereich von blauschwarzen Farbtönen in guter Farbabstufung.
5,8 bis 6,2, vorzugsweise 6,0, wenn man die wäßrige Urine, die zusätzlich 250 mg% Acetoacetat und etwa
Aufschlämmung von 2-(N-Morpholino)-äthansuIfon- 2000 mg % /J-Hydroxybuttersäure enthalten, zeigen
säure mit der nötigen Menge konzentrierter Natron- 15 praktisch die gleichen Farbreaktionen. Keine Ände-
Iauge versetzt. Im gewünschten pH-Bereich resultiert rung wird außerdem beobachtet, nachdem das Test-
dabei eine homogene Lösung. Neben Glucoseoxidase, papier 15 Tage bei 60°C oder 4 Monate bei 40°C
Peroxidase und einem Indikator (vorzugsweise o-Toli- gelagert wurde,
din), die in den üblichen Konzentrationen eingesetzt
werden, können auch noch Hilfsstoffe wie Lösungs- 20 Beispiel2
Vermittler (z. B. Polyvinylpyrrolidon oder Polyäthylen-
glykol) und Netzmittel (z. B. Natriumlauroylsarkosinat Filterpapier (Whatman Nr. 6) wird mit einer
oder Natriumlaurylsulfat) bei der Herstellung der Lösung folgender Zusammensetzung getränkt und
Testpapiere Verwendung finden. Desgleichen ist ein bei 50°C getrocknet:
Zusatz von gelben Farbstoffen (z. B. Tartrazin oder 25
Naphtholgelb S) zweckmäßig, da sie den Farbum- Glucoseoxidase 222 mg
schlag deutlicher sichtbar machen. Peroxidase 28 mg
Als saugfähige Träger kommen vor allem Filter- MES-Puffer
papiere in Frage, aber auch Vliese und Filze aus (pH 5,8; 1,0 m wäßrige Lösung) ... 65 ml
Cellulose oder Kunststoffen können verwendet werden. 3° Tartrazin 80 mg
Zur Herstellung der neuen diagnostischen Mittel Polyvinylpyrrolidon 300 mg
wird in bekannter Weise ein saugfähiger Träger, vor- o-Tolidin 420 mg
zugsweise Filterpapier, mit einer Lösung getränkt, Äthanol 30 ml
welche die oben angegebenen Bestandteile enthält, Wasser, destilliert ad 100 ml
und anschließend getrocknet. 35
Als Lösungsmittel für die Imprägnierlösung kommen Das Testpapier hat praktisch die gleichen Eigen-
vor allem Gemische aus Wasser und leichtflüchtigen schäften wie das Testpapier gemäß Beispiel 1.
organischen Lösungsmitteln, z. B. niederen Alkoholen,
in Frage. Beispiel 3
Die auf diese Weise erhaltenen Teststreifen können 40
als solche verwendet werden, nachdem sie in Streifen Filterpapier (Schleicher und Schüll 595) wird mit
geschnitten sind. Gewünschtenfalls kann man die einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt
Papierstreifen aber auch zwischen Kunststoff-Folien und bei 50°C getrocknet:
einsiegeln (vgl. DT-PS 15 46 307) oder auf derartige Glucoseoxidase 222 me
Folien aulsiegeln bzw. aufkleben; vorzugsweise wer- 45 Peroxidase 28 me
den sie zwischen einer Kunststoff-Folie und einem MES Puffer
feinmaschigen Netzwerk gemäß DT-PS 2118455 (PH 6,2; 1,0 m wäßrige Lösung) ... 25 ml
eingesiegelt Natriumlauroylsarkosinat 100 mg
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung Naphtholgelb S 100 mg
näher erläutert. So o-Tolidin 420 mg
Beispiel 1 Äthanol 33 ml
_., . ,„,,., , „ , .... -„_ ,.T™ . , Wasser, destilliert ad 100 ml
Filterpapier (Schleicher und Schüll 597 NF) wird
mit einer Lösung folgender Zusammensetzung ge- Auch dieses Testpapier besitzt praktisch die gleichen
tränkt und bei 50°C getrocknet: 55 Eigenschaften wie das Testpapier gemäß Beispiel
Claims (3)
1. Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Glucose in Urin, bestehend aus einem saugfähigen
Träger, der mit Glucoseoxidase, Peroxidase, einem Indikator und einem Puffer imprägniert
ist, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer 2-(N-Morpholino)-äthansulfonsäure
verwendet.
2. Diagnostisches Mittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des
Puffers zwischen 5,8 und 6,2 liegt.
3. Diagnostisches Mittel gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des
Puffers 6,0 beträgt.
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DE3222366A1 (de) * | 1981-06-17 | 1982-12-30 | Fuji Photo Film Co., Ltd., Minami-Ashigara, Kanagawa | Analysenmaterialien fuer glucoseoxidase-enzym-reaktionssysteme in fluessigkeitsproben |
EP1919286A2 (de) * | 2005-06-10 | 2008-05-14 | Mannatech, Inc. | Saccharidbiomarker-schnelltest |
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