DE2360794A1 - Verfahren zur herstellung von peptiden - Google Patents

Verfahren zur herstellung von peptiden

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Description

F A RB Yf E R K E II O E C HSTAG.
vormals Meister Lucius £: Brüiiing
Aktenzeichen : HOE 73/F 371
Datum : 3. Dezember 1973
Verfahren zar Herstelltmg von Peptlden
Es ist bekannt, daß man Polyäthylenglykol als. Ester komponente in der Peptldchemie verwenden kann (Nature 237, 2:972, Seite 512-513). Hierbei wurde die gute Löslichkeit dieser Polymeren in Wasser wie auch in organischen Lösungsmitteln benutzt. Die Reaktionen am Polymer v/urden In organischer Phase durchgeführt. Zur Reinigung von Ausgangsmonomeren,, die Im Überschuß eingesetzt werden, benutzte man die Wasserlöslichkeit, verbunden mit der ultrafiltration. Die Monomeren können auf diese Welse abgetrennt werden. Ein gravierender Kachteil dieser Methode 1st der" stete Viechsei von organischer und wäßriger Phase und die oft langen Zeiten bei dei- Ultrafiltration.
Es wur-de nun gefunden, daß die Ester von Aminosäuren und Peptlden mit Polyäthylenglykol (PEG) oder Polypropylenglykol (PPG) praktisch unabhängig von den Eigenschaften des Peptldanteils außerordentlich leicht durch Kristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel gereinigt werden,, d.h., vor allem von überschüßlgen Reaktionspartnern befreit v/erden können.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, zur Herstellung von Peptiden durch Kondensation von Aminosäuren oder Peptiden, die über eine Esterblndung an die freien OH-Gruppen einet gegebenenfalls, mono-acy Her ten oder mono-alkyllerten Polyalkylenglykols vom durchschnittlichen. Molekulargewicht 2 ooo bis 4o ooo, deren
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BAD ORIGINAL!
Alkyleagruppe 2 bis 3 C Atome eimält, gebunden sind, mit weiteren Aminosäuren oder Peptiden und anschließende Abspaltung des erhaltenen Peptids vom Polymeren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die an das Polymer gebundenen Peptide wenigsten einmal vor ihrer Abspaltung vom Polymer und/oder in vorherigen Zwischenstufen dtirch Kristallisation aus organischen Lösungsmitteln bzw. deren Gemischen reinigt.
Als Polymere die auch bei längeren Peptidketten noch kristallin ausfallen, kommen vor allem Polyäther aus Äthylenglykol oder Pro» pylenglykol infrage. Vorzugsweise verwendet man für kleinere Peptide die erfindungsgemäßen Polymere von niederem Molgewicht wie z.B. etwa 2 ooo ~ Io ooo. Sollen größere Peptide synthestisiert werden, ist es jedoch vorteilhaft, Polymere mit höherem Molgewicht zu verwenden. .Neben den Polyäthylen- und Polypr.opylenglykolen kommen auch noch monofunktionelle Polymere in Betracht, bei denen eine Hydroxygruppe des Glykols durch Veräther,ung oder Veresterung blockiert ist.
Die Polyäther können homopolymer aus den gleichen Glykolen, nämlich Polyäthylenglykol (PEG) oder Polypropylenglykol (PPG) aufgebaut sein. Sie können auch verschiedene Gljrkole als Grundbausteine enthalten. Yfesentlich ist, daß neben den ÄthergruppieTungen mindestens noch eine Hydroxyl- oder Halogengruppierung je Molekül Polyäther vorhanden ist, um die Aminosäure binden zu können.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird so ausgeführt, daß an einer funktionellen Gruppe des Polyäthers, z.B. einer Hydroxyl- oder Halogengruppe, die erste Aminosäure über die Carboxylgruppe nach bekannten Verfahren als Ester gebunden wird. Der Amlnosäurepoly-ätherester wird dxirch Zusatz von organischen Lösungsmitteln unter solchen Bedingungen kristallin ausgefällt, daß überschüßige Aminosäure bzw. Aminosäurederivat und Kondensationsmittel in Lösung verbleiben und dadurch einfach und schnell abgetrennt werden können. Z.B. lassen sich die Polymere mit Ätherη, bevorzugt mit Diäthylather oder Diisopropyläther oder auch mit Kohlenwasserstoffen wie z.B. Petroläther aus praktisch allen gebräuchlichen Lösungsmitteln, die jedoch mit den Ä'thern bzw. Kohlenwasserstoffen mischbar sein müßen, kristallin ausfällen. Als Lösungsmittel kommen hierfür in Betracht z.B.
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Halogenkolilemvasserstofte wie Methylenchlor1 id, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benaol, Chlorbenzol, Toluol, Äthylbenzol oder Xylol, stark polare Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Dimethylacetaraid, basische oder saure Lösungsmittel wie Pyridin, Eisessig oder TrI-fluoressigsäure, cyclische Äther wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, Alkohole wie Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, Trifluoräthanol, Methylglycol oder Butylglycol, Ester wie Essigester und Ketone wie Aceton, Methyläthylketon und Cyclohexanon oder Mischlingen dieser Lösungsmittel,
Die Polymere lassen sich auch aus Alkoholen wie Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol oder n-Butanol, Ketonen wie Aceton oder Methyläthylketon sowie Essigester und Tetrachlorkohlenstoff bzw. Mischungen "dieser Lösungsmittel direkt Umkristallisieren.
Die erfindungsgemäße Kristallisation muß nicht nach jedem Reaktionssc.hritt durgeführt werden. Es erweist sich manchmal zweckmäßig, eine der Kristallisationen durch eine andere Reinigungsmethode zu ersetzen.
Die Reaktionsprodukte fallen sofort in reiner Form an und können unmittelbar für die nächste Reaktionsstufe verwendet werden. Falls erforderl-ich, kann die Kristallisation ohne wesentlichen Zeitverlust wiederholt werden.
Die eigentliche Synthese der Peptide unterscheidet sich nicht von der üblichen Technik in homogener Phase. Die einzelnen Reaktionsschritte, die verwendeten Schutzgruppen, Abspaltung- und Kondensationsmethoden sind z.B. in Schröder-Lübke, The Peptides, New York 1964/65 beschrieben und Gegenstand zahlreicher späterer Übersichtsreferate.
Zur Kupplung von Aminosäuren an das Polymer können alle bekannten Methoden der Peptidchemie angewendet werden. Um bei der Kupplung von Acylpeptiden an das Polymer die Racemisierung zu vermeiden, werden zweckmäßig solche Methoden verwendet, die nur minimale Racemisierung zeigen. Die Kupplungsreaktionen werden vorzugsweise in Lösungsmitteln wie Methylenchlorid, Chloroform, Dimethylformamid
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BADORIGINAI.1
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oder Pyridin vorgenommen.
Alle Schutzgruppen, die sich selektiv gegenüber der Esterbindung abspalten lassen, sind geeignet, z.B. läßt sich der Carbobenzoxyrest hier auch durch katalytische Hydrierung abspalten, was z.B bei Styrolharzen als Träger nicht möglich ist.
Das durch stufenweisen Aufbau oder durch Fra.gmentkupplung synthetisierte Peptid kann vom Polymer durch alkalische Hydrolyse, Umesterung, Amonolyse oder Hydrazinolyse abgespalten werden. Ist das abgespaltene Peptid wasserunlöslich, so wird das Polymer durch behandeln mit Wasser in Lösung gebracht und das Peptid abfiltriert. Ist das abgespaltene Peptid in Alkohol löslich, so kann das Polymer aus Alkohol ausgefällt werden und das Peptid durch Einengen des Filtrats gewonnen" werden. Wenn das abgespaltene Peptid wasserlöslich ist, kann man zwischen Methylenchlorid bzw. Chloroform und V/asser verteilen. Das Peptid geht in Wasser, während das Polyäthylenglykol oder Polypropylenglykol in der organischen Phase bleibt.
Weitere Methoden zur Trennung von polymeren Trägern sind Gegenstromverteilung, Säulenchromatographie und Ultrafiltration.
Zwar wußte man, daß z.B. PEG etwa 60% Helixstruktur besitzen kann und damit kristalline Bereiche aufweist. Es war jedoch völlig überraschend, daß Verbindungen, in denen infolge ihres Aminosäure- oder Peptidgehalts sehr unterschiedliche zwischenraolekulare Kräfte zur Wirkung kommen, unabhängig vom Peptidanteil aus geeigneten Lösungsmitteln außerordentlich leicht und rasch kristalline Niederschläge bilden, die leicht filtrierbar sind.
(,die,
Damit istVbisher limitierende Schwierigkeit bei der Peptidsynthese in homogener Phase überwunden, die Produkte der einzelnen Realctionsschritte in bequemer Weise zu reinigen.Die Ausfällung von Peptiden und ihren Derivaten aus dem Reaktionsmedium führte fast immer zu schmierigen, harzigen oder öligen Produkten oder beim Ausfällen in fester Form wurden immer Verunreinigungen eingeschlossen.
/ί
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Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist, daß Peptide, die normalerweise wasserlöslich sind, keine große Kristallisationstesdoriz; haben und durch die üblichen Verteilungsmethoden zwischen organischem Lösungsmittel und wäßrigen Lösungen nicht gereinigt werden können, als Ester der erfindungsgemäßen Polymere jedoch nunmehr einfach zu handhaben und zu reinigen sind. Auch das Problem der Schwerlöslichkeit vieler Peptide wird durch diese Methode beseitigt.
Die Vorteile der Peptidsynthese in homogener Phase, hohe Umsatzquote, lineare Kinetik und leichte Reaktionskontrolle bleiben bei dem erfindungsgemäßen Verfahren voll erhalten.
Die Peptidsynthese unter Einfluß des erfindungsgemäßen Verfahrens kann automatisiert werden, weil alle Reaktionsstufen einschließlich der Abtrennung überschüßiger Reaktionspartner durch die erfindungsgemäße Kristallisation der Peptid-Polymerverbindungen stets in gleicher Weise und ohne Abweichung verlaufen.
Durch Verwendung geeigneter Schutzgruppen und Kondensationsmethoden kann das Verfahren darüber hinaus zu einem ausgesprochenen Schnellverfahren gemacht werden: So ist z.B. die Boc-Schutzgruppe nach etwa lo-15-Minuten abgespalten. Das Entfernen überschüßigen Lösungsmittels und die erfindungsgemäße Kristallisation durch Zusatz eines Äthers wie Diäthyl- oder Diisoproyläther und das Abfiltrieren nimmt ebenfalls nur lo-15 Minuten in Anspruch.
Die nach diesem Verfahren hergestellten Peptide können als Therapeut ica oder Diagnostica Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zur Hei'Stellung anderer therapeutisch und diagnostisch wertvoller Peptide, wie z.B. Oxytocin, Vasopressin, Glueagon, Sekretin, ACTH,
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Thyroealcitonin, Gastrin, TRH, LH-RII, Substanz P oder Insulin eingesetzt werden.
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Beispiel 1
Synthese des Tetrapeptids H-Leu-AJa-Gly-Val-OH an Polyäthylenglykol (PEG) MG 2000
a). Veresterung von Boc-Val-OH mit PEG MG 2000
2 g PEG MG 2000, 4,34 g Boc-Val-OH und 4,12 g DCciYwerden in 20 ml CHpCIp gelöst und bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit 7 Tage gerührt. Danach wird vom ausgefallenen DC-Harnstoff abgesaugt und die Lösung auf ca. 10 ml eingeengt, auf 0 C bis-10 C abgekühlt und tropfenweise mit kaltem Diäthyläther versetzt, bis die Ausfällung von Boc-Val-PEG vollständig ist. Der Niederschlag wird abgesaugt, in, ca. 10 ml CHpCIp aufgenommen, und erneut bei tiefer Temperatur (-10 c) mit Äther ausgefällt. Der Niederschlag wird wieder abgesaugt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 2,05 S Boc-Val-PEG, Beladung: 70$ resp. 0,7 mM/g (Aminosäure analyse) .- -· * '
Zur Abspaltung der Schutzgruppe (Boc) wird das Boc-Val-PEG mit 20 ml einer Mischung aus CH2Cl2 Trifluoressigsaure (TEA) (i:i) während 20 Minuten bei Raumtemperatur behandelt, anschließend die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt (auf ca. 5 ml) und durch Zutropfen von-kaltem Äther das HrVaI-PEG ausgefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt, in wenig CH2Cl2 aufgenommen, erneut mit Äther ausgefällt und der Rückstand i. V. getrocknet.
Ausbeute: 2,00 g H-VaI-PEG . TFA
b) Peptidsynthese
2,0 g H-VaI-PEG . TFA (1,4 ihM) werden in 20 ml CH2Cl gelöst (l) Jn einem separaten Gefäß wird zu einer Lösung von 5,6 mM Boc-Gly-OH in 10 ml CH2Cl2 langsam 2,8 mM DCCI bei 0° C zugetropft. Nach ca. 30 Minuten bei 0 C wird der entstandene DC-Harnstoff abgesaugt und die klare Lösung (Boc-Aminosäureanhydrid) zu Lösung I zugegeben. Anschließend werden noch 1,5 mM N-Methylmorpholin
( Dieyclohexylcarbcdiimid)
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langsam zugetropft und die Reaktionslöoung- 30 Mim1.ton bei Raumtemperatur gerührt, danach wird auf 10 ml eingeengt und das Polyiuerpeptld durch. Zu tropfen von Diätliyläilier· ausgefällt (~1Ol c Es wird noch 10 Minuten bei -10 C gerührt, dann der Niederschlag abgesaugt und i.V. getrocknet,
Durch Behandlung des Boc-Gly-Val-PEG mit TFA/CH2Cl2 (i:i) wird die Schutzgruppe abgespalten.
Aufarbeitung analog a) Ausbeute: 1,98 g H-Gly-Val-PEG . TFA In der gleichen Weise vird H-Gly-Val-PEG . TFA .-nit 2,8mM Boc-Ala Anhydrid zur Reaktion gebracht. Nach Abspaltung der Schutzgruppe und Ausfällung mit Äther erhält man 1,96 g H-Ala-Gly-Val-PEG· . TFA. Durch entsprechendes Umsetzen von H-Ala-Gly-Val-PEG . TFA mit Boc-Leu-Anhydrid (i,8mM) werden 1,95 g Boc-Leu-Ala-Val-PEG erhalten. Die Aminosäureanalyse einer hydrolysierten Probe dieser Substanz zeigt folgendes Aminosäufeverhältnis:
VaI.: GIy : -AIa : Leu= 1,00:1,01:0,99:1,01
c) Abspaltung und Isolierung des Peptids Eine Lösung von 1,0 g Boc-Leu-Ala-Gly-Val-PEG in 10 ml H-O/ Dioxan (i:i) und 1,5 ml 1 N KOH wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Mit 1,5 ml 1 N HCl wird genau neutralisiert und zur Trockne eingedampft. Zur Entfernung der Salze wird der Rückstand 2 mal mit je 20 ml CH2Cl2 digeriert und das unlösliche K Cl abfiltriert. Das CHpCIp wird abgezogen, der Rückstand in 20 ml abs Äthanol "aufgenommen und 2 Stunden auf -10 C abgekühlt. Der entstandene Niederschlag (PEG) wird bei 15 000 u/Min, abzentrifugiert, die überstehende Lösung abdekantiert und der Rückstand erneut in Äthanol aufgenommen, abgekühlt und nochmals abzentrifugiert. Die vereinigten Lösungen von Äthanol werden auf 10 ml eingeengt und bei -10 C über Nacht stehen gelassen. Der Niederschlag (leichte Trübung) wird abgesaugt und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das so erhaltene Boc-Tetrapeptid (275 mg) wurde zur Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit 10 ml TFA/CHpClp behandelt und das Lösungsmittel i.V. abgezogen. Der Rückstand wurde in H9O aufgenommen, die Lösung mit schwach basischem Ionenaustausche bei pH 6 behandelt und nach Abfiltrieren des Austauschers gefriergetrocknet. Ausbeute 202 mg, korrekte Aminosäure analy se .
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BAD ORIGiNAL
Beispiel 2:
Synbliese des Tetrapeptide H-Leu-Ala-Gly-Val-OH an Polypropylenglycol (PPG)
a) Veresterung von Boc-\ral-OH mit PPGVmd~~Abspaltung der Schutzgruppe
j 6OOOJ
5,0 g PPGi, h,3k'g Boc-Val-OH ( = 20mM) und 4,12 g DCCI werden in 50 ml CHpCIp gelöst und bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit während 7 Tagen gerührt. Danach wird die Lösung analog Beispiel 1 a) aufgearbeitet. Ausbeute: 5»0 g H-VaI-PPG-. TFA. Beladung: 0,3mM/g (AS-Analyse).
b) Peptidsynthese
5,0 g H-VaI-PPG . TFA in. der"im Beispiel 1 b) beschriebenen Yeise mit je 3mM Boc-Gly-Anhydrid, Boc-Ala-Anhydrid und Boc-Leu-Anhydrid umgesetzt. Nach der letzten Kupplung (Boc-Leu) erhält man 4,7 s Boc-Leu-Ala-Gly-Val-PPG.
Die Aminosäureanalyse ergibt: VaI:GIy:AIa:Leu = 1,00:0,00:0,99
: 1,02
c) Abspaltung und Isolierung des Peptide:
Zur Abspaltung des Peptids wird eine Lösung von 4,0 g Boc-Leu- , Ala-Gly-Val-PPG in 4o ml HpO/Di-oxan (1 :·4) und 2 ml 1 N KOH zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Neutralisation mit 2 ml 1 N HCl wird zur Isolierung des Peptids analog zu Beispiel 1 c) vorgegangen.
Die Ausbeute an rohem Tetrapeptid ist 4i0 mg. Der Peptidanteil im rohen Tetrapeptid beträgt 68°/o. (AS-Analyse), d.h. bezogen auf VaI"beträgt die Totalausbeute 65/&·
Die Aminosäureanalyse ergibt:
VaI : GIy : AIa : Leu : = 1,00 : 1,01 : 0,99 : 1,00 Im dünnschichtchromatographischen Vergleich mit dem Beipiel in 1 synthetisierten Tetx^apeptid verhält sich das Produkt identisch.
S O9J8J2 6/0936 BAD ORIGInÄT
■- 1(5 -
3·
Synthese von Ärg-Pro-Lys-Pro~Gln--Gln-Phe-PIie~Gly-Leu~MGt ■('· Sub- stanz P") an VVlG. UG 15 ooo.
a) .Veresterung von 3oc-Met-OH mit PEG MG 15 OQO
7,50 g PEG HG 15 000 (= 1mM funktionelle Gruppen), 1OmM Boc-Met-OH und 1OmM DCCI "werden in 50 ml CH2Cl2 gelöst und 7 Tage bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit gerührt. Danacia wird abfiltriert, die Lösung auf ca. 20 ml eingeengt, auf -10 C abgekühlt und das Boc-Met-PEG durch Zutropfen von kaltem Diäthyläther unter Rühren ausgefällt. Die Mischung wird noch weitere 10 Minuten bei -10 C gerührt,.der Niederschlag mit einer Glasfritte abgesaugt und i.V. getrocknet. Das weiße Pulver wird erneut in 30 ml CHpClp gelöst und wie oben beschrieben mit Äther ausgefällt. Nach Abfiltrieren und Trocknen des Niederschlags werden 7»50 g Boc-Met-PEG erhalten. Die Beladung nach. Aminosäureanalyse beträgt 0,08mM/g resp. 6ofo d. Th.
b) Peptidsynthese "
7,00 g H-Met-PEG-" . TFA (= O,56mM) werden in 70 ml CH2Cl2 gelöst (Lösung i) . In einem seperaten Gefäß werden 2,3mM Boc-Leu-0H in wenig CH^Cl- gelöst, auf 0 C abgekühlt und 1 ,15mM DCCI zugefügt. Nach 30-minütigem Rühren bei 0°C wird das Gemisch, unter Abfiltrieren des ausgefallenen DC-Harnstoffs zu Lösung. I gegeben. Anschließend werden dem Reaktionsgemisch. 0,60mM N-Meth.ylmoi-ph.olin langsam zugetropft und die klare Lösung 30 Minuten stehen gelassen. Danach wird die Lösung i.V. auf ca. 30 ml eingeengt, auf -10C abgekühlt und unter heftigem Rühren langsam Diäthyläther zugetropft (ca. 200ml), bis das Polymerpeptid quantitativ ausgefallen ist. Die Mischung wird dann noch weitere 10 Minuten bei -10C gerührt und anschließend über eine Glasfritte der Niederschlag abgesaugt. Zur vollständigen Entfernung der überschüssigen Boc-Aminosäure wird das Polymerpeptid erneut in wenig CH?C1 (ca. 30 ml) aufgenommen und wie oben beschrieben mit Äther ausgefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 6,98 g Boc-Leu-Met-PEG.
Das geschützte Polymerpeptid wird in einer Mischung aus TEA/CH Cl (1:1) gelöst (10^o-ige Lösung) und 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
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.. η ßAD ORIGINAL
Anschließend vird die Lösung eingeengt (auf ca. 30 nil) und das Folyrricrpeptid unter Kühlting axv£ -10 C und heftigem Rühren mit Diäthyläther ausgefällt. Nach Absaugen und Trocknen des Rückstandes wird in ca. 30 ml CHpClp aufgenommen und mit Äther gefällt. Das weiße Pulver wird erneut abgesaugt und i.V. getrocknet^ bis zur Gewichtskonstanz.
Ausbeute: 6,95 g H-Leu-Met-PEG . TFA
In der oben beschriebenen Weise werden nacheinander folgende Aminosäurederivate gekuppelt (gleiche Mengenverhältnisse:)
a) Boc-Gly-OH: Ausbeute an H-Gly-Leu-Met-PEG . TFA = 6,98 g
b) Boc-Phe-OH: Ausbeute an H-Phe-Gly-Leu-Me't-PEG , TFA =
6,93 s
c) Boc-Phe-OH: Ausbeute an Phe-Phe-Gly-Leu-Met-PEG . TFA =
6,92 g
d) Boc-Gln-OH: Der Synthesezyklus wird hierbei wie folgt abgewandelt:
Boc-Gln-OH wird in einer Mischung aus DMF/CHpCl,, (1:2) gelöst.
Die Aktivierungszeit zur Darstellung von Boc-Gln-Anhydrid beträgt nur 5 Minuten. Nachträglich ausfallender DC-Harnstoff wird nach beendeter Kupplung abgesaugt. Zur quantitativen Entfernung des überschüssigen Boc-Gln-OH wird das geschützte Polymerpeptid nach zweimaliger Fällung mit Diäthyläther in abs. Äthanol unter Erwärmen gelöst (10^-ige Lösung) und abkühlen lassen. Nach ca. 2 Stunden bei -5 C wird der Niederschlag durch Zentrifugieren (30 Min. bei 10 000" U/Min.) und Abdekantieren des Überstandes isoliert und getrocknet. Das Dürmschichtchromatogramm zeigt, daß alle überachüsse'entfernt sind. Die Abspaltung der Boc-Gruppe erfolgt durch 10-minütiges Behandeln mit TFA/CH Cl bei 0°C. .Anschließend wird das Peptidpolymer direkt aus der Lösung mit Äther ausgefällt. Ausbeute an H-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu~Met-PEG . TFA = 6,88 g
e) Boc-Gln-OH: Gleiches Vorgehen wie unter d) beschrieben. Ausbeute an .H-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-PEG . TFA= 6,70 g
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Zum Lösen des Polymerpepfcids we I'd en ab diesel" Stufe 20^ DMF z,ui:i CIi9C1 r. '/.uü'esobzt .
f) Boc-Pro-OH Ausbeute an H-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe~Gly-Leu-Met~PEG . TFA = 6,60 g
g) Boc-Lys( Z)-OH, Ausbeute an H-Lys( Z)-Pro-Gln-Gln-Pb.e-Ph.e-Gly-Leu-Met-PEG . TFA = 6,57 g
h) Boc-Pro-OH, Ausbeute an H-Pro-Lys(z)-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-PEG . TFA = 6,25 g
i) Z-Arg(Tos)-OH, die Entfernung der Überschüsse erfolgte analog vie unter d) beschrieben. Ausbeute an Z-Arg(Tos)-Pro-Lys(z)-Pro-Glh-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-PEG = 6,05 g
c) Abspaltung und Isolierung des Peptide;
Zur Abspaltung des vollgeschützten Peptide vom Träger durch Ammonolyse werden 4,0 g Polymerpeptid in ko ml Äthanol abs. und 20 ml CH_C1„ gelöst, die Lösung bei -10 C ca. jO Minuten mit Ammoniak gesättigt (Druckflasche) und "h Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen; Anschließend wird das Lösungsmittel abdestilliert und der feste Rückstand mit hO ml H_0 (pH 5) digeriert. Das wasserunlösliche Peptid wird abzentrifugiert (30 Minuten bei 15 000 u/Min.), die überstehende Lösung' abdekantiert und mit ca. 20 ml H_0 behandelt.
Nach erneutem Abzentrifugieren, Abdekantieren und Lyophilisieren bleiben 520 mg rohes Peptid zurück.
Ausbeute: 520 mg "Substanz P" vollgeschützt.'
Das IR-Spektrum des Peptide zeigt, daß das Polymer quantitativ entfernt ist.
Abspaltung der Schutzgruppen:
220 mg vollgeschütztes Peptid werden 1 Stunde bei 0 C mit HF behandelt (unter Zusatz von 2 ml Anisol), anschließend das HF entfernt (N^-Strom) und im Exsikkator getrocknet. Der Rückstand wird dann mit je 30 ml Essigester und 0,1 N- Essigsäure extrahiert. Die Essigesterphase wird drei mal mit; HpO extrahiert und die wässrigen Phasen vereinigt. Nach 2-maligem Lyophilisiex^en bleiben 180 mg rohes Peptid zurück.
Ausbeute: 180 mg "Substanz P"
- 13 -
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Die Beladung- des Polymers betrug nach dem letzten SyntheseZyk 5l> ';> (bezogen auf I-Iet) .
Die Ausbeute bei der Abspaltung durch Aramonolyse beträgt 90fo el.Th. (aus AS-Analys e).
d) Reinigung und Charakterisierung des Peptids
Das Synthese-Rohprodukt wies papierlektrophoretisch bei pH 1.9 vier ninhydrinpositive Banden auf*. Die Reinigung und Entsalzung erfolgte durch kontinuierliche Hochspannungs-Elektrophorese im freien Pufferfiltn bei pH 1.9 (Elektrolyt: 14,5 ml konz. Ameisensäure und 11,9 ml Eisessig in 5 000 ml Wasser).- Die Feldstärke betrug ca. 35 V cm . Ca 100 rag Rohprodukt imi'den in 5 tnl P^iffer gelöst und bei der Anode (über Gläschen i) zugeführt. Die Fraktioneneinteilung ergab sich aus Tüpfelproben mit Ninhydrin und Sakaguchi, sowie direkten Papierelektrophoresen mit konzentrierten aliquotem Pröbchen-aus den einzelnen Gläschen. Die unten angegebenen Pools wurden zweimal mit Wasser lyophilisert:
Fraktion 27 - 33s · Ca. 25 mg wiesses, stark hygroskopisches
Pulver:
entspricht nach den bisherigen Prüfungen reiner Substanz P.
Fraktion 35 - 39: Reine Nebenkomponente mit der elektro-
•: phoretischen Beweglichkeit von 0,69 x Lys .
Die Totalausbeute-an reiner "Substanz P" beträgt in Bezug auf das C-terrninale eingesetzte Met ca. 35 /° d.Th."
Beispiel hi
Synthese des Tripeptide Pyroglu-His-Pro-NH2(TRH) an PEG, MG 6
a) Veresterung von PEG
6 g PEG MG 6 000 (= 2mM OH-Gruppen) , 10 mM Boc-Pro--0H und 10 mM DCCI werden in 60 ml CH„C1„ gelöst und bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit 7 Tage gerührt. Anschließend wird vom ausgefallenen DC-Harnstoff abgesaugt und der Lösung 5 mM Boc-Pro-Anhydrid zugesetzt (separate Darstellung des Anhydrids mit DCCI
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- Mt- -
analog den Beispielen 1 ~ 3 )·
Die homogene Lösung wird 12 Stunden am Rückfluß erhitzt, auf ca. 20 ml eingeengt und das Boc-Pro-PEG durch Zutropfen von ca.. 200 ml Äther ausgefällt, Nach Absaugen des Niederschlags wird erneut in 20 ml CH?C1„ aufgenommen und wieder mit Äther gefällt. Zur Abspaltung der Boc-Gruppe wird der trockene Rückstand in 60ml einer Mischung aus TFA/CH„C.1_ (i:i) gelöst und 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wird die Trifluoressigsäure am Vakuum abgezogen und zur eingeengten Lösung Äther zugetropft, bis alles H-Pro-PEG- . TFA ausgefallen ist. Nach Absaugen, Aufnehmen in CH?C1„, erneutem Ausfällen mit Äther und Trocknen des Niederschlags werden 5>98 g H-Pro-PEG . TFA erhalten. Beladung 0,17mM/g (Aminosäureanalyse) = 51 /° el. TIi.
b) Fragmentkupplung .
3 S H-Pro-PEG . TFA (= 0,5 mM) werden in einer Mischung aus 10 rnl CH2 Cl„ und 10 ml DMF gelöst, auf—30°C gekühlt und mit 0,55 mM N-Methyl-morpholiii neutralisiert.
280 mg = 1 mM Pyroglu-His-N-H werden in einer Mischung aus 5 ml DMSO, 5 ml DMF und 2,5 ml 2,A-N HCl/Tetrahydrofuran bei 0° gelöst, auf -20 C gekühlt, mit.0,2 ml Isoamylnitrit versetzt, 30 Minuten bei -20 C gerührt und durch Zugabe von 0,85 ml Triäthylamin neutralisiert. Diese Mischung wird zur ebenfalls auf -30 C gekühlten H-Pro-PE'G-Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten unterhalb 0 C und V2 Stunden bei k C gerührt, anschließend i.V. zur Trockne eingedampft und in 30 ml abs. Methanol unter Erwärmen aufgenommen. Die klare Lösung wird zur Kristallisation des PEG-Peptids zunächst bei 4°C (2 Stunden), dann bei -10°C stehengelassen (über Nacht) und anschließend vom ausgefallenen PEG-Peptid bei 10 U/Min, abzentrifugiert. Die überstehende Lösung wird abdekantiert, der Rückstand erneut in Methanol aufgenommen, das PEG-Peptid erneut bei tiefer Temperatur ausgefällt und atifgearbeitet.
Ausbeute: 2,85 S Pyroglu.-His-Pro-PEG
Das Produkt zeigt ein Aminosäure verhältnis von Pro: GIu = 1 ,00 : 0,71
Zur erneuten Fragmentkondensation wird dieses Produkt in 20 ml
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. - 15 -
CH_C1„ gelöst, mit N-Methyl-morpholin neutralisiert und wie oben beschrieben mit 280 mg.= 1 niM Pyroglu-His-N-H umgesetzt. Nach Aufarbeitung des Reaktionsprodukts werden 2,70 Pyroglu-His-Pro-PBG zurückerhalten. Das Amino s äureve rhältni s einer hydrolysierten Probe zeigt: Pro : GIu = 1,00 : 1,00
c) Abspaltung durch Ammonolyse
2,5 g Pyroglu-His-Pro-PEG werden in einer Mischung aus 50 ml MeOH und 25 ml CTI-Cl« gelöst. Die Lösung wird bei -10°C.mit NH gesät-:' tigt und während h Tagen bei Raumtemperatur*aufbewahrt. Anschliessend wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 50 ml MeOH gelöst und das PEG durch A-bkühlen der Lösung auf 0°C über Nacht ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, erneut mit MeOH behandelt und in analoger Weise wie oben das PEG auskristallisiert. Die vereinigten Methanollösungen werden zur Trockne eingedampft, das Rohpeptid in wenig Wasser aufgenommen und zur Entfernung der letzten Spuren von PEG das Produkt durch Sepliadexchromatographie (G 15) über eine Säule (2,5 x 120 cm) aufgetrennt. Die vereinigten, tollidinpositiven Fraktionen ergeben nach Abdampfen des Wassers 115 mg Pyroglu-His-Pro-NH0, was einer Ausbeute von 71 $ d.Th. entspricht, bezogen auf Pro vor der Abspaltung. Die Gesamtausbeute der. Synthese, bezogen auf die erste Aminosäure (Pro), beträgt 6k<fo d.Th.
Das Aminosäureverhältnis des so erhaltenen Produkts beträgt Pro: His: GIu = 1,00 : 0,96 : 0,99· Das dünnschichtchromatographische Verhalten dieses Materials entspricht demjenigen Pyroglu-His-Pro-NH„, das auf klassischem Weg durch die gleiche Kupplung hergestellt wird.
Beispiel 5:
Synthese des Tetrapeptide H-Leu-Ala-Gly-Val-OH an PEG 20 000
20 g H-VaI-PEG MG 20 000(Veresterung analog Beispiel 1, Beladung 85$ d.Th. = 0,085 mMol/g) werden in 100 ml CHpCl2 gelöst, mit 1,9 .inMol Triäthylamin und 5,0 mMol Z-GIy-ONP versetzt und 2.h Stunden bei Raumtemperatur gerührt. AnschlieiSend wird die Lösung auf ca. ho iri'l eingeengt und mit Diächyläther zweimal gefällt. Der Rück-
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** Ό *~*Ι^ΛΓ^ /%Ki/Mfti«ig '
stand wird nach Absaugen auf einer Glas frit te in 300 EiJ Methanol gelöst, mit 2,5 ml >IN HCl / MeOH und Pd/O versetzt und bei RT und Normaldruck hydriert, bis keine Wasserstoffaufnahme mehr stattfindet.
Der Katalysator wird abfiltriert, das Filtrat eingeengt und mit Diäthyläther versetzt. Das auskristallxsxerte Polymerpeptid vrird zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Ausbeute an H-GIy-VaI-PEG ί 19,3 g
Xn analoger Weise wird H-Gly-Val-PEG zuerst mit Z-AIa-ONP und anschließend mit Z-Leu-ONP umgesetzt. Nach Trocknung werden schließlich 18,5 g H-Leu-Ala-Gly-Val-PEG erhalten.
Die Aminosäureanalyse ergibt:
VaI : GIy : AIa : Leu = 1,00 : 0,95 : 0,99 : 0,99
Beispiel 6; Synthese des Tetrapeptide H-Leu-Ala-Gly-Val-OH an PEG,
MG 2000 nach Blockierung- restlicher Hydroxylgruppen am PEG
Analog zu Beispiel 1 werden 2 g PEG, MG 2000, 4,^4 g BOC-VaI-OH und 4,12 g DCCI in 20 ml CHpCl« gelöst und bei Raumtemperatur sieben Tage gerührt.
Anschließend wird vom ausgefallenen DC-Harnstoff abgesaugt und dem klaren Filtrat 20 inM Acetanhydrid zugesetzt. Die Lösung wird h Stunden unter Rückfluß gekocht, dann auch ca. 10 ml eingeengt und wie in Beispiel 1 angegeben aufgearbeitet.
Die Peptidsynthese wird dann analog zu Beispiel 1 durchgeführt. Nach Abspaltung und Isolierung des Peptide wird die gleiche Ausbeute und Aminosäurezusammensetzung wie in Beispiel 1 erhalten.
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Claims (1)

  1. PATENTANSPRUCH
    Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch Kondensation von Aminosäuren oder Peptiden, die über eine Esterbindung an die freien OH-Gruppen eines gegebenenfalls mono-alkylierten Polyalkylenglykols vom durchschnittlichen Molekulargewicht 2 ooo bis 4o ooo, deren Al· kylengruppe 2 bis 3 Atome enthält, gebunden sind, mit weiteren Aminosäuren oder Peptiden und anschließende Abspaltung des erhaltenen Peptids vom Polymeren, dadurch gekennzeichnet, daß man die-an das Polymer gebundenen Peptide wenigstens einmal vor ihrer Abspaltung vom Polymer und/oder in vorherigen Zwischenstufen durch -Kri> jtallisation aus organischen Lösungsmitteln bzw. deren Gemischen reinigt.
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