DE2326863A1 - Verfahren zur herstellung biokompatibler und biofunktioneller materialien - Google Patents

Verfahren zur herstellung biokompatibler und biofunktioneller materialien

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DE2326863A1
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Gottfried Prof Schmer
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US Atomic Energy Commission (AEC)
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Description

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eingegangen QmJJ °- 7±_
J, 4 ~ * Γ R-26O,237
United States Atomic Energy Commission, Washington, O.G., U.S.A.
Verfahren zur Herstellung biokompatibler und biofunktlonelier Materialien.
Die Erfindung bezieht sich' auf ein Verfahren zur Herstellung von Materialien, die sowohl biokompatibel als auch biofunktionell sind; die Erfindung bezieht sich auch auf diese Materialien selbst.
Es wurden bereits zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, um Materialien zu finden, die über zahlreiche Jahre hinweg \iogenüber Körperflüssigkeiten biologisch und chemisch stabil sind. Obwohl dieses Ziel noch nicht erreicht v/urde, konnte dcvh eine Anzahl vielversprechender Materialien, insbesondere für Bl ut-
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verträglichkeit, entwickelt werden. Die Oberflächeneigenschnftan dieser Materialien können wie folgt- in Kategorien untergebiracht werden: Sie sind entweder von niedriger Polarität (beispielsweise Silicone, Kohlenstoffe), von hoher Polarität (beispielsweise Hydrogele, geladene Oberflächen) oder biologischer Natur (beispielsweise Heparin, Protein oder zellüberzogen). Obwohl Silicone der Niedrigpolaritätsgruppe ziemlich inert gegenüber menschlichem Gewebe sind, so ist es doch wohl bekannt, daß langsam fließendes Blut das Bestreben hat, bei Berührung mit Siliconoberflächen zu koagulieren. Diese Koagulation kann mit der Adsorption an den Oberflächen von Körperchen aus dem Blut in Beziehung gebracht werden, wobei die sich ergebende modifizierte Oberfläche Wcihrscheinlich direkt für die Throrabusbildung verantwortlich ist. Hydrogele, d.h. stark mit Wasser angeschwollene polymere Gele, die leicht vernetzt sein können, sind von Interesse und besitzen wegen ihrer stark hydrierten Polymernetzwerke eine ausgezeicJ.iJii.e Kompatibilität mit Körperflüssigkeiten.- Unglücklicherweise rae.cht genau die Eigenschaft, welche die Hydrogele als Biomaterialicn so interessant macht, nämlich die hohe Hydration (Viassergehalt von 25 - 95%), diese Materialien dann ungeeignet, v/enn eine minimale Festigkeit erforderlich ist. Diese Schwäche macht es allgemein erforderlich, daß das Hydrogel mit Stoff oder Fasern verstärkt wird, die weiterhin mit einem stärkeren Träger vernetzt sind oder diesen überziehen.
Was die biologischen Oberflächen betrifft, so sind viele interessante biologisch aktive Moleküle als Überzug auf verschiedenen Substraten angebracht worden, beispielsweise durch physikalische Adsorption, elektrostatische Bindung und kovalente Bildung. Beispielsweise ist im US Patent 3 453 194 ein Siiicongegenstand beschrieben, der.für die medizinische Einpflanzung geeignet ist; dieser Gegenstand wird dadurch hergestellt, daß' man eine Siliconoberfläche einer Ionisationsstrahlung hoher Energie aussetzt und die Oberfläche mit Heparin in Kontakt bringt, um eine AufPfropfung (Vereinigung) zu bewirken. Diese Schritte sind auch umkehrbar.
Dieses bekannte Verfahren hat Nachteile im Zusammenhang mit der Herstellung von Gegenständen, die anti-
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koagulativ gegenüber Blut gemacht sind, was auch das Ziel dieser Erfindung ist. Zum einen hat das Verfahren einen äußerst niedrigen Wirkungsgrad hinsichtlich der Aufpfropfmig von Heparin mit der Siliconoberfläche. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn das Heparin aufgebracht wird, nachdem die Siliconoberflache einer Stählung ausgesetzt wurde. Wenn die Siliconoberfläche zuerst mit dem Heparin in Kontakt gebracht wird und sodann bestrahlt wird,· so tritt ein wesentlich ernsteres Problem auf: Die unbekannten Eigenschaften der Langzeitstabilität und/oder Giftwirkungen von Fragmenten natürlicher biologischer Moleküle, wie beispielsweise von Heparin, die der Strahlung ausgesetzt wurden. Darüber hinθus beschränkt die Tatsache, daß große Zonen, vorhanden sind, wo kein Heparin vorhanden ist und somit das Blut den Siliconoberflächen ausgesetzt wäre, die Verwendung derartiger eingepflanzter Gegenstände auf Gebiete mit hoher Blutströmung. Die Blutkoagulation erfolgt durch Siliconoberflächen wesentlich schneller in Gebieten mit geringen Strömungsgeschwindigkeiten.
Die vorliegende Erfindung bezweckt, Materialien vorzusehen, die biokompatibel sind, und zwar insbesondere gegenüber Blut und Gewebeflüssigkeiten, und die somit für verschiedene biomedizinische Anwendungen geeignet sind. Ferner bezweckt die Erfindung, Materialien vorzusehen, die nicht nur biokompatibel sind, sondern die auch biofunktionell sind, d.h. die biologische Aktivität besitzen. Materialien mit Biokornpatibilität und Biofunktionalität können bei einer noch größeren Zahl von Anwendungsfällen benutzt werden.
Gemäß der Erfindung werden die genannten Ziele durch die erfindungsgeiiiäße Erkenntnis erreicht, daß biologisch aktive Moleküle chemisch an eine ausgewählte reagierbare Verbindung bindbär sind, wobei diese Verbindung aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Polymere und Kopolymere, die zuvor auf zähe inerte Polymersubstrate aufgepfropft wurden, um ausgezeichnete biokorapatible/biofunktionelle Oberflächen zu bilden.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung-wurde ein Protein, menschliches Serum Albumin, erfolgreich kovalenagebunöen, und zwar
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mit hydrophilen Hydrogel/Polyäthylen oder Polysiloxan strahlungs-"gepfropften Oberflächen. Gemäß einem.weiteren Ausführungsbeispiel 'dex Erfindung wurde ein Mucopolysaccharid, Heparin, kovalent an den Reaktionsstellen hydrophiler Hydrogel/Polysiloxan-Oberflachen, die strahlungsrreOfronft waren, angeordnet. Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel wurde ein Enzym, Streptokinase, welches plasminogen zur Erzeugung des fibrinolytischen Proteins, Plasmin, aktiviert, erfolgreich kovalenzgebunden, und zwar an die reakti-.ven Stellen von hydrophilen strahlungsqepfropften Hydrogel/Polysiloxan-Oberf lachen, wobei eine signifikante Enzymaktivität aufrechterhalten blieb. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch zweckmäßig für die Bindung von Prostaglandin E-1 (ein biologisch aktives Molekül, welches Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff enthält) an Hydrogele/inerte Polymersubstrate.
Von beträchtlicher Wichtigkeit ist die erfindungsgemäße Erkenntnis, daß biologisch aktive Moleküle chemisch mit hydrophilen Hydrogelen verbunden werden können, und zv/ar über ein kleineres Zwischenmolekül oder einen "Arm", wie beispielsweise fi-Aminokapronsäure, oder andere sowohl -NH2 als auch -CO2H-Gruppen enthaltende Moleküle, und auch 1,4 Diaminbutan und andere Diaminverbindungen, wobei ein völlig unerwarteter synergistischer Effekt auftritt, wenn eine Kupplung mit sich ändernden Hycirogel-Zusammensetzungen erfolgt. Wenn beispielsweise Albumin kovalenzgebunden wurde an reaktive-OH-Gruppen von Polyhydroxyäthylmethacrylat (HEMA) -Ketten in einem strahlungsaufgepfropf ten Hydrogel-Kopolymer von HEMA und N-Vinylpyrolidon auf Silicongummifilmen, mit einem <£-Aminokapronsäurearm dazv/ischen, so stieg ' die imobili-
sierte Albuminmenge mit dem Arm gegenüber ohne Arm um 8,03 ug/cm
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(mit) gegenüber 3,51 ug/cm (ohne) auf 28,21 pg/cm (mit) gegen-
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über 7,06 jig/cm (ohne) an, wenn das N-Vinylpyrolidon/HEMA-Gewichtsverhältnis in der Pfropflösung von 1/19 auf 10/10 (+80% Wasser in jeder Lösung) anstieg.
Wenn das Hydrogel (oder der chemische Arm) eine seitenständige funktioneile CO2H-Gruppe aufweist und mit Carbodiimid aktiviert ist, ist eine schnelle Waschung des dünnen inerten Polymerfilmes in Eiswasser erforderlich, um darauffolgend die chemische Bindung
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des biologisch aktiven Moleküls an der aktivierten Oberflächezn erreichen.
Von beträchtlicher Bedeutung auf dem biomedizinischen Gebiet ist die Erkenntnis, daß die gemäß dem vorliegenden Verfahren behandelten Oberflächen die Herstellung ausgezeichneter Gegenstände für medizinische Einpflanzungen ermöglichen. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugten Oberflächen können, einfach ausgedrückt, als.eine "synthetische" vaskuläre endotheliale Oberfläche betrachtet Vierden, die natürlich die natürliche blutkompatible Oberfläche ist. Der Überzug auf dem inerten Polymersubstrat besteht aus einer stark hydrierten Oberfläche eines aufgepfropften kopolymerisierten Hydrogels, welches an sich hinsichtlich der Biokompatibilität den besten inerten Polymersubstanzen (beispielsweise Siliconen) überlegen ist, wobei die biologisch aktiven Moleküle einen besonderen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens bilden und chemisch mit kleinen Molekülarrnen verbunden sind oder aber dirökt an den reaktiven Plätzen des Hydrogels liegen.
Vorteilhafterweise werden die Oberflächen des natürlichen Biomoleküls niemals der Strahlung ausgesetzt, wodurch die oben erwähnten Nachteile des Standes der Technik vermieden werden, und wobei insbesondere die Aufspaltung derartiger Moleküle durch die Bestrahlung in nicht bekannter Weise vermieden wird.
Strahlungsaufpfropfung
Gemäß einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine reaktive Verbindung, und zwar entweder ein Polymer oder ein Kopolymer, auf ein inertes Polymersubstrat durch Strahlung aufgepfropft. Die Auswahl des inerten PolymerSubstrats kann stark variieren. Viele der bereits bekannten Kunststoffe werden bereits für medizinische Gegenstände und medizinische Einpflanzteile benutzt und sind recht geeignet. Natürlich sind Polysilo-
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xane (Silicone) und Polyurethane einschließlich Polysiloxan-Polyurethan-Blockkopolymeren vielfach in der Biomedizin anwendbar -und sind vorteilhafterweise als Substrate verwendbar. Demgemäß -können im erfindungsgemäßen Verfahren inerte Substrate, wie beispielsweise hydrophobe Polymere, wie beispielsweise die folgenden verwendet werden: Polysiloxane, Polyäthylen, Polyurethan, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyäther, Polyester, Polyamide, fluorierte Silicone und Kohlenwasserstoffpolymere. Zudem können auch andere, weniger hydrophobe Polymere wie Zellulosestoffe benutzt werden, die wegen ihrer weiten Anwendung als DialysemeiEfbrane von Interesse sind.
Vorteilhafterweise bestehen praktisch keinerlei Beschränkungen für diese Polymere hinsichtlich deren Größe, Gestalt oder Form, mit der sie verwendet werden können. Einige der Formen, welche gemäß dem Verfahren in einfacher Weise herstellbar sind, sind dünne Filme, Membrane, Rohre,hohle Fasern und Teilchen.
Die verwendete Strahlungsauf ρ fropfung ist für verschiedene Anwendungsfälle ein bekanntes Verfahren, wobei die Strahlungsaufpfropf trag hier zur Herstellung eines Überzugs auf dem Substrat benutzt wird. Dieses Verfahren ist einfach und wirkungsvoll. Die Strahlungsaufpfropfung (oben auch als Strählungsvereinigung bezeichnet) gestattet die Herstellung hoch reiner Oberflächen, wodurch die Verunreinigung durch extrahierbare Katalysatorfragmente verhindert wird, die in chemischen Polymerisationsvorgängen benutzt werden. Geeignete Strahlungsarten für die vorliegende Aufpfropfpolymerisation sind beispielsweise die folgenden: Hochenergieelektronen, Röntgenstrahlen oder Gammastrahlen, wobei letztei
können.
letztere durch eine Co oder Cs -Quelle geliefert'werden
Die zur Strahlungsaufpfropfung erforderliche Belichtung und die benötigten Zeiten hängen von dem als Substrat gewählten inerten Polymer und der monomeren Aufρfropfungslösung ab und können über einen großen Bereich hinweg variieren. Allgemein sind die zur Erreichung einer ausreichenden Aufpfropfung von Hydrogelen erforderlichen Dosen wesentlich geringer als diejenigen, welche eine sig-
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nifikante Vernetzung oder Degradierung der Substratpolymermoleküle hervorrufen.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren kann jedes Monomer'oder Monomere bei dem Strahlungsaufpfropf-Kopolymerisationsverfahren benutzt werden, welches sich einer freien Radikal-Polymerisation unterzieht und wobei mindestens eines drehaktive Stellen für die chemische Bindung biologisch aktiver Moleküle vorsieht. Die in diesem Verfahren erzeugten hydrophilen Hydrogele sind stark mit Wasser angeschwollene (Wassergehalt 25-95%) polymere Gele, die leicht vernetzt werden können und mindestens eine Art einer reaktiven Bindungsstelle aufweisen; beispielsweise sind die folgenden Gruppen für die erfindungsgemäßen Überzüge besonders geeignet und daher bevorzugt: -OH, -NH2, -CO2H, -COCl, -CHCH^Öl Zwar können die Hydrogele durch die Polymerisation ausgewählter Monomere wie beispielsweise Hydroxyathylmethacrylat(HEMA) erzeugt werden, vorzugsweise werden die Hydrogele aber in einem wässrigen System durch Kopolymerisation verschiedener Monomere hergestellt, wobei einige davon bezüglich einer Bindung mit biologisch aktiven Molekülen reaktiver sind als andere. Die Kopolymerisation gestattet die Erzeugung eines weiten Bereiches von Hydrogel-Zusammensetzungen und Wassergehalten. Sie gestattet auch einen höheren Wassergehalt, der infolge des vergrößerten Porenvolumens eine stark verbesserte Zugänglichkeit der Reaktionsstellen liefert. Eine vorteilhafte Komonomer-Kombination ist Vinylpyrrolidon (VP) und Hydroxyathylmethacrylat(HEMA); andere geeignete Komonomer-Kombinationen sind beispielsweise: Acrylamid und HEMA; Glyzerylmethacrylat und HEMA, Acrylamid oder VP; Glycidylmethacrylat und Acrylamid, HEMA oder VP, usw.
Nicht nur die Monomermischungen sind eine wichtige Variable, sondern die Verwendung der Lösungsmittel in der Aufpfropflösung (beispielsweise Alkohole, Glykole, Dioxame, DMSO, usw.) können
-auch benutzt werden, um die Eindringung des aufgepfropften (Ko)-Polymers in das Trägerpolymer zu steuern, und auch die Natur der Wasserverteilung (Poren und Porengrößen) in dem sich ergebenden Hydrogel.
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Obwohl die Kopolymerisation in einem Wassersystem ausgewählter Monomere ausgeführt werden kann, wurde festgestellt, daß Methanol als ein Additiv zu dem System höhere Aufpfropfungspegel an Polyurethanen in HEMA/Methanol/Wasser-Aufpfropflösungen ergibt. Ein Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, kann zwei Haupteinwirkungen auf die' Aufpfropfkinetik des erfindungsgemäßen Verfahrens haben: 1) Die Homo-Polymerisation und der Viskositätsaufbau in der umgebenden Lösung wird verzögert; 2) das inerte Pölymersubstrat hat das Bestreben, mehr anzuschwellen, wenn Wasser in der Aufpfropfzone durch Methanol ersetzt wird. Die beiden Wirkungen führen zu einer größeren Verfügbarkeit des Monomers innerhalb der umgebenden Lösung. Wenn man lediglich HEMA als das Monomer benutzt, so liegt ein geeigneter Methanolbereich zwischen 20 Gewichtsprozent und 100 Gewichtsprozent. Unterhalb ungefähr 20 Gewichtsprozent tritt die Bildung eines harten Gels auf, welches das Aufpfropfen verzögert» und zwar infolge einer Diffusionsreduktion des Restmonome rs'. Der höchste Anstieg beim Aufpfropfgrad tritt bei höheren Methanolgehalten und höheren Monomergehalten auf und ist dem erhöhten Monomereinfluß in das Polymersubstrat zuzuschreiben, wenn die Erhärtung in den Umgebungen vermieden wird.
Für die meisten biomedizinischen Anwendungsfälle sollte der Wassergehalt des Hydrogels oberhalb 50 Gewichtsprozent, vorzugsweise zwischen 50 und 95 Gewichtsprozent, liegen. Ferner wurde festgestellt, daß die meisten Hydrogele im allgemeinen 2 5 bis 40% Wasser bei Eintauchen in Wasser absorbieren. Damit man höhere Wassergehalte erreicht, können die Monomere und ihre Konzentrationen geändert werden oder ausgewählte Lösungsmittel, wie beispielsweise Alkohole, Glykole/ Äther, Sulfoxyde, usw., können während des Auf pfropf Vorgangs benutzt v/erden, um die Molekularstruktur des durch Wasser angeschwollenen Hydrogels zu stetiern. Wenn beispielsweise Komonomere aus Vinylpyrrolidon und Hydroxyäthylmethacrylat verwendet werden, so steigt der Wassergehalt des sich ergebenden Hydrogels von 33,5% auf 64,2% an, wenn die Monomerverhältnisse (VP/HEMA) zwischen 0/20 und 1Ό/10 (in 80% variieren.
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-S-
Es sei betont, daß die Erfindung erkannt hat, daß ein höherer Wassergehalt des Hydrogels in Kombination mit der Bindung des •biologisch aktiven Moleküls an das Hydrogel über einen chemischen Arm (oder eine Brücke) einen synergistischen Effekt erzeugt. Der minimale Wassergehalt für ein ausgewähltes System hängt abhängig von der Größe des biologisch aktiven Moleküls von der Größe des den chemischen Arm bildenden Moleküls und der Größe der biologischen Spezies ab, die mit den imobilisierten Molekülen reagiert. Während somit Streptokinase über einen chemischen Arm an ein Hydrogel mit einem Wassergehalt von ungefähr 55% gebunden werden kann und eine signifikante biologische Aktivität beibehält, benötigt Heparin einen höheren Wassergehalt, um eine signifikante biologische Aktivität zu-erreichen, und zwar trotz der Tatsache, daß signifikante Heparinmengen über einen chemischen Arm an Hydrogele .mit einem Wassergehalt von 55% gebunden werden, können. Heparin benötigt zwei biologisch aktive Moleküle, damit es biologisch aktiv gemacht wird, während vergleichsweise dazu Streptokinase nur eines benötigt.
Der Verfahrens schritt der Strahlungsaufpfropfung kann zweckrnäßigerweise durch verschiedene Verfahren ausgeführt werden. Bei einem Verfahren wird ein ausgewähltes inertes Polymersubstrat in eine Lösung aus ausgewählten Monomeren und Lösungsmitteln in speziellen Reaktionsgefäßen eingetaucht.
Bei einem anderen geeigneten Strahlungsaufpfropfverfahren läßt man das inerte Polymersubstrat in der Aufpfropflösung zunächst vor-anschwellen* entfernt dann die Lösung (beispielsweise durch Pumpen), entfernt schließlich die Luft durch Evakuierung und bestrahlt das angeschwollene Polymersubstrat. Dieses Verfahren wird bei der Aufpfropfung an der Innenseite hohler Faservorrichtungen bevorzugt, wo es nicht erwünscht ist, die Fasern mit strahlungspolymerisierten Hydrogelen zu verstopfen. Der Vorgang kann mehreremale wiederholt werden, um eine Aufpfropfschicht aufzubauen .
Ein weiterer Strahlungsaufpfropfprozess besteht darin, daß man
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das inerte Polymersubstrat in Luft vorbestrahlt, um thermisch labile Peroxy- und Hydroperoxy-Gruppen zu bilden, worauf man dann 'das Polymersubstrat mit der Monomerlösung in Kontakt bringt, und zwar vorzugsweise unter Erwärmen und in Abwesenheit von Sauerstoff, wobei dann der AufpfropfVorgang Platz greift. Dieses Verfahren wird jedoch nicht vorgezogen.
Es sollte mit Sorgfalt sichergestellt werden, daß das Polymer-Substrat nicht mit den Gefäßwänden in Berührung kommt; obwohl die Aufpfropfreaktion bei Anwesenheit von Luft stattfindet, so ist es doch vorzuziehen, das Gefäß zur Entfernung jeglichen verbleibenden Sauerstoffs zu evakuieren (beispielsweise auf einen Druck von 0,1-1 Torr).
Nachdem im wesentlichen der gesamte Sauerstoff entfernt wurde, wird das Gefäß als nächstes vorzugsweise bei Raumtemperatur zur Bewirkung der Aufpfropf-Kopolymerisation bestrahlt; dabei können höhere Temperaturen benutzt werden, um die Bestrahlungszeit zu vermindern. Eine zweckmäßige Strahlungsquelle sind die Gammastrahlen einer Kobalt-60-Quelle. Zufriedenstellende Strahlungsauf pfropfpolymersiationen können mit einem großen Bereich von Strahlungsdosisraten und auch Quellen erreicht werden? es wurde eine durchschnittliche Dosisrate von 0^25 Mrad/h (20 0OO Curie Co Quelle für ungefähr T Stunde) verwendet. Bei Nichtvorhandensein eines guten Lösungsmittels ergibt sich im allgemeinen ein schneller Anstieg des Aufpfropfpegels während der ersten halben Stunde.
Wenn die Bestrahlungstemperatur für eine gegebene Dosis und ein wässriges Monomersystem ansteigt, so steigt auch der Prozentsatz der Aufpfropfung an, um bei Temperaturen oberhalb 75°C auf einem Niveau auszulaufen. In ähnlicher Weise gilt, daß bei ansteigendem Prozentsatz irgendeines Monomers für eine gegebene Dosis der Prozentsatz der Aufpfropfung annähernd proportional ansteigt, obwohl die Verwendung gemischter Monomere und Lösungsmittel allgemeine Aussagen auf diesem Gebiet erschweren.
Nach der Bestrahlung wird das Polymersubstrat in Lösungsmittel/Was-
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s er-Mischungen gewaschen und schließlich wird es noch in gereinigtem Wasser gewaschen; die Aufbewahrung in Waschwasser ist vorzuziehen , da das Trocknen des Polymersubstrats bestrebt ist, den Wassergehalt des wieder angeschwollenen Hydrogels relativ zu dem niemals getrockneten Hydrogel abzusenken.
Chemische Bindung
Nachdem das reaktive oder reagierbare Polymer oder Kopolymer durch Strahlung auf das inerte Polymersubstrat aufgepfropft ist, werden ausgewählte Moleküle chemisch an den aktivierten Reaktionsplätzen oder Stellen längs der aufgepfropften Polymerketten chemisch gebunden, um eine biologisch aktive Oberfläche zu bilden. Beispiele für eine biologische Aktivität aufweisende Moleküle sind Proteine (beispielsweise Enzyme, Hormone)Mucopolysaccharide, Nukleinsäuren, Prostaglandine, Steroide, Aminosäuren, usw., und auch Mischungen daraus.
Die Hydrogeloberfläche wird vorzugsweise durch ein geeignetes Reagenz "aktiviert", was von den reaktiven seitenständigen funktioneilen Gruppen abhängt. Wenn beispielsweise die reaktive
funktioneile Gruppe -OH ist, dann ist Cyanogenbromid ein geeigneter Aktivator; für -NH9 ist Thiophosgen geeignet und für -CO2H ist Carbodiimid geeignet. Jeder dieser Aktivatoren erzeugt eine aktivierte Stelle für das darauffolgende Anbringen - beispielsweise für die drei oben erwähnten funktionellen Gruppen der -NH9-Gruppe oder Gruppen an einem Molekül als ein Protein.
Ein weiteres Verfahren zur chemischen Bindung der biologisch aktiven Moleküle ist die einstufige direkte Kopplung unter Verwendung bifunktioneller Kopplungsagenzien, wie beispielsweise Glutaraldehyd (für -OH, -NH2 oder -COCl-Oberflächen), oder
Diepoxyde (für -0HP -NH9, -CO9H oder -CHCHTö^-Oberflachen) oder
Δ ++ Δ Δ r—■ 1
schließlich Diacidchloride (mit -OH, -NH2 oder -CHCH2 Cr-Ober-
flachen).
d. h. Bromcvan Disäurechloride
3üH«51/1064
Wenn das Hydrogel eine -OH-Gruppe aufweist und die Aktivierung mit Cyanogenbromid durchgeführt wird, so ist die Reaktion für das Anbringen eines Proteinmoleküls mit einer -NH„ seitenständigen funktionellen Gruppe (beispielsweise menschliches Serum Albumin) ~ die folgende:
- OH
/-0H
BrCN
-0
-0
C = NH
Prot - NH.
C=N- Prot
Es wurde festgestellt, daß ein synergistischer Effekt bei Änderung der Hydrogelzusammensetzung zur Bewirkung erhöhter Wassergehalte durch Verwendung eines kleinen Zwischenmoleküls oder chemischen "Arms" erreicht werden kann, welcher zuerst mit dem strahlungsauf gepfropften Polymer oder Kopolymer verbunden wird. Dies wird darauf zurückgeführt, daß der chemische Arm eine größere Akzessibilität für die biologisch aktiven Moleküle der aktiven Bindungsgruppe in dem Polymersubstrat und der sich ändernden Hydrogelzusammensetzung erzeugt, wobei zusätzlich synergistisch ein größeres Porenvolumen für die Bindung biologisch aktiver Moleküle zum Eindringen erzeugt wird. Im folgenden ist eine Gleichung angegeben, welche die Verwendung eines chemischen Arms,, c--Aminokapronsäure (ε-ACA), zeigt, der an eine BrCN-aktivierte -OH-Gruppe gebunden ist und selbst mit einem Carbodiimid aktiviert ist, um ein Protein (Albumin) an einem Hydrogel anzubringen.
BrCN
-OH
-0χ
-0/
-ο,
-0'
1.
ov
;c-C0?H (2)
-0
-ο.
C-CO2H .hProt_Co2 η
C - CO2 ~ Prot (3)
Weitere geeignete kleine Zwischenmoleküle können als chemischer
30985 1/1064
"Arm" oder andere Aminosäuren sowie Diamine oder Polyamine wie beispielsweise Putricine verwendet werden. Abhängig von der benötigten Reaktion und dem gewünschten Endprodukt kann die Auswahl des Hydrogels, des Aktivators, des chemischen Arms und/oder der biologisch aktiven Moleküle stark variieren.
Wenn eine Aminosäure wie S-Aminokapronsäure als chemischer Arm verwendet wird, oder wenn allgemein ein Hydrogel als eine -CO2H reagierbare.Oberfläche benutzt wird, wobei an dem -CO2H- Ende des Armes die biologisch aktiven Moleküle befestigt werden sollen, so bewirkt die Verwendung eines Carbodiimid als wasserlösliches Carbodiimid (1-Cyelohexyl-3 C2 Morpholinoäthyl] Carhodiimid) als Aktivator die Bildung einer äußerst unstabilen Form. Die Erfindung erkannte, daß eine sehr schnelle (wenige Sekunden) Waschung in Eiswasser des aktivierten hydrogelüberzogenen Polymers wesentlich ist, um überschüssiges Carbodiimid zu entfernen und die Bindung von Proteinen, MucopoIysacchariden oder dergleichen zu gestatten, wenn eine Inkubation*in der Kälte für eine Zeitdauer von 10-15 Stunden erfolgte.
Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Materialien sind sowohl biokompatibel als auch biofunktionell und können in zahlreichen biomedizinischen Anwendungsfällen benutzt werden. Ein wichtiger Anwendungsfall der Erfindung ist beispielsweise die Behandlung von Enzymmangelerkrankungen, wie beispielsweise Leukämie, wo die Blutzirkulation durch beispielsweise hohle Faservorrichtungen, auf denen ein Enzym wie Asparaguinase oder Glutaminase, immobilisiert ist, Krebszellennährstoffe wie Asparagin und Glutamin entfernt, ohne signifikante Gegenkörperreaktionen gegen die "fremden" Enzyme zu entwickeln, weil sie immobilisiert sind. Ein weiterer Anwendungsfall ist die Behandlung bestimmter Blutkrankheiten, in solchen Fällen sind Anti-Körperchen für den antihämophilen Faktor VIII vorhanden, wobei das Gerinnen verhindert wird; wenn eine Operation am offenen Herz durchgeführt werden soll, wird der Patient zuerst dadurch behandelt, daß man sein Blut durch eine Kontaktvorrichtung (beispielsweise eine Membran oder eine Hohlfaservorrichtung} zirkuliert, auf welcher
3.0985 T/106-4
Faktor VIII immobilisiert ist, um die Gerinnungs-Verhinderungsstoffe zu entfernen, so daß sich das Blut während und nach der Operation normal verhält.
Eine klinische oder industrielle Versuchsanwendung ist beispielsweisedie Synthese von Polypeptiden (Proteinen) auf strahlurigsgepfropften Hydrogel/inerten Polymersubstraten. Gegenwärtig
trennen und speichern Biutsairaneistelien (Blut)Körperchen, wobei das Aufpfropfen von Verhinderungsinitteln'für die Körperchenan^samialung (beispielsweise Albumin, Prostaglandin E-1 ,
Theophyllin, usw.) auf die Innenseite des Speichersacks als ein Mittel dient, um die Lebensdauer der Speicherung zu erhöhen und um dem Einwand der Federal Drug Administration in den USA Rechnung zu tragen, daß derartige Agenzien nicht direkt den Dispersionen aus den Körperchen zugefügt werden sollen. Allgemein ict in Tabelle I eine große Anzahl von Vorrichtungen dargestellt,
und auch die gemäß dieser Erfindung möglichen Verwendungszwecke.
TABELLE I
Zweckmäßige Anwendungen immobilisierter biologisch aktiver Moleküle/Hydrogel-Oberflächen
Als Materialien
1) Nicht-thrombogen Z) Gewebekompatibel 3) Spezielle Biofunktion
für die Therapie
in Vorrichtungen
1) Membrane
2) Rohre, hohle Fasern
3) Tei lchen lagen (gepackt oder fluidisiert)
4) Mikrokapseln (überzogen oder eingekapselt)
bei der
Künstliche Niere Künstliches Herz Blutsauerstoffvorrichtung Weiche und harte Gewebeersatzstoffe
überzüge für medizinische Nähmaterialien Detoxi f ikati'on Enzymmangelerkrankungen
Instrumentierung
Enymelektroden Reinigung von Biomolekülen Fraktionierung von Zellen Überzüge für Katheder
3 09851/10 6 4 ·
für die Industrie
Produktion
Reinigung von Erzeugnissen und
Abwasserströmen
Die Aspekte und Verfahren der vorliegenden Erfindung seien im folgenden an Hand von Beispielen quantitativ weiter erläutert.
Beispiel I
Die Durchführbarkeit der Strahlungsaufpfropfung von Hydrogel auf eine Polyurethanoberfläche und die Bedeutung oder Signifikanz der Verwendung eines hinzugefügten Lösungsmittels wie Methanol wurde wie folgt demonstriert:
Fünftausendstel Zoll starke Polyurethanfilme(die im Handel von der Firma B.F. Goodrich Co. unter dem Warenzeichen "Tuftane" erhältlich sind) wurden in 0,1% "Ivory" Seifenlösungen 2 Stunden lang gewaschen; darauf erfolgte eine 24 Stunden dauernde Waschung in destilliertem Wasser (welches oft gewechselt wurde), wobei dies alles bei Raumtemperatur geschah.
Sodann wurde Hydroxyathylmethacrylat (HEMA)Monomer (im Handel von der Monomer-Polymer Division of orden Chemical Co.erhältlich) durch eine Siliciumoxydgelsäule geleitet, um Methacrylsäureverunreinigungen zu entfernen, um sodann ohne weitere Reinigung benutzt zu werden.
Verschiedene Monomerlösungen, einige mit Methanol (Reagenzreinheit oder Reagenzgrad) und/oder (destilliertem) Wasser wurden hergestellt, worauf dann die dünnen Filme in die Monomerlösungen in einem speziellen Reaktionsgefäß eingetaucht wurden; dabei wurden die Filmeauf speziellen Haltern befestigt, um die Filme außer Kontakt mit den Ge'fäßwänden zu halten.
309851/1064
Die die Filme enthaltenden Gefäße wurden gefroren und sodann auf ein Vakuum von ungefähr 1 Torr evakuiert, um den Sauerstoff zu ' entfernen; sodann wurden die Gefäße aufgetaut, um das Entgasen zu beobachten. Der Vorgang wurde solange wiederholt, bis im wesentlichen keine Bläschen mehr an der Oberfläche der Filme unter Vakuum beim Auftauen gebildet wurden.
Sodann wurden die Gefäße benachbart zu einer 20 000 Curie Kobalt~60-Quelle bei Raumtemperatur für unterschiedliche Zeitdauern angeordnet; die durchschnittliche Dosisrate betrug ungefähr 0,25 Mrad/h.
Nach der Bestrahlung wurden die aufgepfropften Filme aus dem. Reaktionsgefäß entfernt und 2 Stunden lang mit reinem Methanol (welches mehrmals gewechselt wurde) gewaschen, worauf dann ein 24 Stunden dauernder Waschvorgang mit (häufig gewechseltem) destilliertem Wasser folgte. Daraufhin wurden die Filme im nassen Zustand gewogen (nachdem man zunächst die Oberfläche leicht unter einem festliegenden Druck mit trocknern Filterpapier abgetupft hatte) und sodann bei 0% und bei 52% relativer Feuchtigkeit. Die Monomersorption in die unbehandelten Filme wurde chromatographiscl'· gemessen, und zwar nach einem mehrtägigen Eintauchen der Filme in verschiedene HEMÄ/Methanol/Wasser-Lösungen.
Die Ergebnisse sind in-der unten stehenden Tabelle. II als % HEMA in dem trocknen Film angegeben, wobei das sorbierte Methanol und Wasser vernachläßigt werden.
3üb«51/1064
TABELLE II
Aufpfropfen auf Polyurethan-Filme Dosis (Mrad) Beispiel II Angenäherte
%-Aufpfropfung
Monomer-Pfropflösung 0.25 13%
20% HEMA 0.50 10%
10% Methanol 1 .00 11 %
70% Wasser 0.25 16%
20% HEMA 0.50 17%
20% Methanol 1 .00 14%
60% Wasser 0.25 20%
20% HEMA 0.50 38%
35% Methanol 1.00 43%
45% Wasser
Hydrogele aus Homopolymeren von Hydroxyäthylmethacrylat (HEMA) und Kopolymeren von HEMA mit N-Vinylpyrrolidon (VP) wurden auf dünne Silicongummi-Filme (5/1000 Zoll stark) durch Strahlung aufgepfropft und zwar gemäß dem gleichen Verfahren wie bei Beispiel I, mit der Ausnahme allerdings, daß kein Lösungsmittel benutzt wurde (die erwähnten Silicongummi-Filme sind von der Medical Products, Division der Dow· Corning Co. in den USA unter dem Warenzeichen "Medical Grade Silastic" erhältlich).
Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle III dargestellt:
309851/1064
"~ ίο
TABELLE III
Der Effekt der Hinzufügung von N-VP auf das Ausmaß des Aufpfropfens und auf die Wassersoprtion des Hydrogels.
Aufpfropflösung
% N-VP %HEMA
(+80% H2O)		 2O.0 *
Durchschnittl.
% (Trocken) Auf-
pfropfung		 Durchschnittl.
% Wasser sor-
biert im Hydro-
gel
0 17.5 17.5 33.5
2.5 15.0 21.0 34.2
5.0 12.5 27.3 55.5
7.5 10.0 - 40.5 61 .3
10.0 45.3 64.2
Nach einer 0,25 Mrad-Dosis
III
Sodann wurde eine Anzahl der strahiungsaufgepfropften Hydrogel/ Silicon-Gummifilme, die gemäß Beispiels II hergestellt waren, verwendet, um zu demonstrieren, daß es möglich ist, biologisch aktive Moleküle des menschlichen Serums Albumin (Merck Pharm. Co., Rahway, N.J., U.S.A.) mit der Bezeichnung I mit und ohne einen chemischen Arm, £.-Aminokapronsäure (£-ACA, Sigma Chemicals) chemisch daran zu binden.
Die -OH-Gruppen der Poly-HEMA-Ketten in dem aufgepfropften Hydrogel-Kopolymer wurden durch Reaktion mit einer 10%-igen Lösung von BrCN in 0,2M Na3CO3, pH 11,3, 15 Minuten lang bei 15°C aktiviert. Die Filme wurden gewaschen und in einer 10-20% Lösung des Albumin oder chemischen Arms in 0,2M NaHCOo/Na2CO-, bei pH 9,0 24 Stunden lang in einem kalten Raum bei 4-7°C angeordnet.
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Wenn die Albumin-Moleküle an den -CO2H funktioneIlen Gruppen des chemischen Armes angebracht waren, wurde diese Gruppe zunächst mit einem wasserlöslichen Carbodiimid (I-Cyclohoxyl-S- f2 Morpho· linoäthyl] Carbodiimid der Aldrich Labs) durch Inkubation für 30 Minuten bei Zimmertemperatur in einer 10%-igen Lösung des Carbodiiinids bei pH 4,75 (0,1 M MES Puffer) aktiviert.
Die Filme wurden sodann schnell.in Eiswasser gewaschen und mit einer 5-20 % Lösung des Albumins in 0,1 M MES, pH 4,75 in Berührung gebracht. Die Reaktion konnte 12 Stunden lang in der Kälte fortschreiten. Sodann erfolgte eine einstündige Waschung bei 37°C in 1,0 N NaCl.
Das gebundene Albumin wurde direkt in einem Gamma-Scintillations-Spectrometer (Packard, Modell 3002). gemessen, wobei die Ergebnisse in Tabelle IV unten angegeben sind:
Tabelle IV
Einwirkung der I-Iydrogelzusammensetzung und des chemischen Armes auf die Menge des gebundenen Albumins
Gebundenes Albumin (pg/cia )
Oberfläche Bindungsart (HEMA/N-VP).: 19/1 18/2 15/5 10/10
Hydrogel Phys. Ads'n. 0.31 0.39 0.33 4.08
Hydrogel + direkt gebunden 3.51 3.94 4.93 -7.06
BrCN
Hydrogel Phys. ads'n. am Arm
BrCN +
ε-ACA 1.08 0.97 5.89 4.02
Hydrogel + gebunden über Arm 8.03 8.58 18.43 28.21
BrCN +
ε-ACA +
CDI+
+Carbodiimid
Aus der Tabelle IV wird der synergistische Effekt deutlich, der durch die Verwendung des chemischen Armes und des erhöhten N-VP/HEMA-Verhältnisses (und somit des Wassergehalts im
3 0 y H b 1 / 1 0 6 4
Hydrogel) zustandekommt. Es sei bemerkt, daß alle Freistellen ("blanks") niedrig lagen bezüglich des kovalenzgebundenen Albumins.
Beispiel IV
Durch die gleichen Verfahrensschritte wie in Beispiel III wurde die Durchführbarkeit der chemischen Bindung von
35
Heparin (Sigma Chemicals; S Heparin (CaI. Atomic), 6 mc/g) an strahlungsgepfropften Ilydrogel/SilikongummifiInten mit und ohne einen chemischen Arm, ^-aminocapronsäure, demonstriert,
Die Messung der Heparinaktivität erfolgte wie folgt: Zitriertes zusammengefaßtes Plasma wurde in Wärme defibriniert, und zwar bei 56°C drei Minuten lang. Unter diesen Bedingungen wurde kein Verlust der Heparin-Kofaktor-Aktivität beobachtet. Die das immobilisierte Heparin enthaltenden Filme wurden in diesem Plasma bei 37°C 10 Minuten lang geschüttelt, um den Heparin-Heparin-Kofaktor-Komplex zu bilden. Sodann wurden die Filme in 0,15 M NaCl gewaschen und mit einer affinitätsgereinigten Thrombinlösung. 2 Minuten lang bei 37°C in Berührung gebracht, Vier ml einer Thrombinlösung wurden verwendet, die 10 NIH Einheiten/ml enthielt. 0,1 ml dieser Lösung kann 0,2 ml einer 5 mg/ml Fibrinogenlösung in 15 Sekunden bei 28°C gerinnen lassen oder zur Klumpenbildung bringen. Sodann wurde der Film entfernt und die Gerinnzeit der restlichen Thrombinlösung wurde gemessen und mit der 15 Sekunden Standardgerinnzeit verglichen.
Das gebundene Heparin wurde in einem Beta-Scintillationszähler (Packard, Tri-Card, Modell 3320) in einer Bray-Lösung gemessen. Die Resultate sind in der untenstehenden Tabelle V angegeben:
3ÜÜÖ51/106
Tabelle V 16.5 μg Heparin'cm/2
Bindung von Heparin an Hydrogele* 1 .32
Oberfläche 27.1
Hydrogel . · 2.05
Hydrogel Bindungsart μg Heparin am Film 5.7
+ BrCN Phys. ads'n. 0.44
Hydrogel
+ BrCN + direkt gebunden 173.0
ε-ACA + CDI 12.60
Hydrogel Phys. ads'n.
+ BrCN
+ f-ACA +
CDI gebunden über
einen ehem. Arm
+Hydrogel; 5 Tausendstel Zoll Silastic in 15 % HEFiA + 5 % N-VP"+ 80 % H2O;
0,25 Mrad Dosis? 27 %*Aufpfropfung (trocken) + 55 % H9O in Aufpfropfung.
Man erkennt hier wiederum wie im Falle des Albumin, daß ein signifikanter Anstieg des immöilisierten Heparins auftritt, wenn ein chemischer Zwischenarm, ί -Aminocapronsäure, vorhanden ist» Die "blanks"lagen auch niedrig relativ zu dem kovalenzgebundenen Heparin. Es sei bemerkt, daß für dasjenige «blank" in welchem zugelassen wurde, daß ein Carbodiimid -aktivierter
ε-ACA chemischer Arm in die inaktiven Nebenprodukte umgewandelt und die physikalische Absorbtion von Heparin an dieser Oberfläche gemessen wurde, diese wesentlich niedriger lag als das gesamte Heparin, welches während des kovalenten Bindeschrittes
9 2
(0,44 ug/cm^ gegenüber 12,60 pg/cm ) aufgenommen wurde, und es ist daher wahrscheinlich, daß über 90 % der gemessenen Werte für die Heparinbindung an der Oberfläche eines einen aktivierten Arm aufweisenden Hydrogels tatsächlich am £-ACA-Arm kovalenzgebunden ist.
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Ein Film wurde auf Biokömpatibilität untersucht; er hatte 95 pg Heparin, welches daran über einen t -ACA Arm immobilisiert war. Da 12 pg Heparin (2 Einheiten) gemischt mit 1 ml Plasma 90 NIH Einheiten von Thrombin neutralisieren können, ist es klar, daß die 95 pg, wenn sie aktiv sind, mehr als genug wären, um die Gerinnzeit der 40 NIH Einheiten des Thrombins zu bewirken, welches in der Prüfung benutzt wird. Es wurde jedoch festgestellt, daß die Gerinnzeit nur um 20 % (von 15 auf Sekunden) relativ zu dem Leerstück anstieg,, was als kein signifikanter· Anstieg betrachtet wix"d«
Es wird angenommen, daß die biologische Aktivität des immobilisierten Heparins ein besser zugängliches Heparinmolekül benötigt, als ein 55 % Wassergehalt + £-ÄCA chemischer Arm vorsieht, da das Heparin einen Komplex bilden muß, und zwar sowohl mit dem Heparin-Kofaktor (Antithrombin II) und Thrombin, wobei dieses die Moleküle mit Molekulargewichten von 64=000 bzw. 34.000 sind. Heparin ist ein aktives Antikoagulationsmittel wenn es über einen £-ACA chemischen Arm an einem Agarosegel mit 96 % Wassergehalt immobilisiert ist (was wahrscheinlich den Eintritt sämtlicher kugelförmiger Moleküle unter ungefähr 1.000.000 Molekulargewicht gestattet).
Es kann somit festgestellt werden, daß sowohl der Hydrogel-Wassergehalt (Porosität) als auch der chemische Arm wichtig sind, um eine hohe biologische Aktivität eines immobilisierten Moleküls zu erhalten.
Beispiel V
Die Möglichkeit der chemischen Bindung von Streptokinase ("Varidase", Lederle Labs.) an Hydrogel/Silikongummifilmen mit und ohne chemischen Arm (£-Aminocapronsäure) wurde durch die gleichen Verfahrensschritte wie bei Beispiel III demonstriert.
Die Messung der- Streptokinaseaktivitat wurde wie folgt durchgeführt: Die die immobilisierte Streptokinase enthaltenden Filme wurden geschüttelt und zwar in einem Überschuß von affinitätsge-
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reinigten Plasminogen (10 CTA Einheiten in 10 ml von 0,3 -M ImidazolsHCL, pH 7,35) und zwar bei 37°C. Alle 30 Minuten wurde ein Anteil aus der Lösung entfernt und gewaschen und zwar durch eine immobilisierte mit einer
125'
Strahlungskennzeichnung (I ) versehenen Kasein-Agarose-Säule, Die Radioaktivitätsfreigabe dieser Säule wurde als ein Maß für Δ±& Piasminaktivität in dem herausgenommenen Anteil gewertet. Die caseolytischen.und fibrinolytischen Aktionen des Plasmins wurden direkt in Beziehung gesetzt. Die Resultate sind unten in Tabelle VI angegeben:
Tabelle VI
Radioaktivitätsabgabe einer strahlungsgekennzeichneten Kasein-Separose-Säule infolge der Plasminogenciktivierung durch immobilisierte Streptokinase
Radioaktive Freigabe der Säule
Streptokinase auf Bindungsart (in cpm) nach (Min.)
der Oberfläche von: 30 60 90 180 300
Hydrogel Phys. ads'n. 194 402
Hydrogel + BrCN direkt ■· 607 1254 -
■* gebunden
Hydrogel + BrCN Phys. ads'n. 323 688 1005 2143 2107 + £-ACA
Hydrogel + BrCN gebunden über
+ L-ACA + CDI einen Arm 1287 2573 3659 3667 3670
Aus Tabelle VI erkennt man, daß eine signifikante fibrinolytische Aktivität durch dieses immobilisierte Enzym aufrechterhalten bleibt, insbesondere, wenn es über einen chemischen Arm gebunden ist. Die Maximalmenge des aktivierten Plasmins ist äquivalent zu derjenigen, die in ungefähr 10 - 15ml Plasma enthalten ist. Im Hinblick auf die Heparinergebnisse sei bemerkt, daß obwohl Plasminogen und Plasmin große Moleküle (Molekulargewichte von 143.000 bzw. 140.000) sind, die biologische Aktivität der Streptokinase zu seiner enzymätisehen Wirkung in Beziehving steht und daher in seiner Natur recht verschieden von dem Heparin/Heparin-Kofaktor/Thrombin-Komplex
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ist, der mit einem biologisch aktiven Heparin-Molekül gebildet wird.
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Claims (1)

  1. Ansprüche einaeqanoen
    χ/Λ
    1. Verfahren zur Herstellung biokompatibler und biofunktioneller Oberflächen/dadurch gekennzeichnet, daß man eine reagierbare Verbindung, ein Polymer oder ein Kopolymer durch Strahlung auf ein inertes Polymersubstrat aufpfropft, und sodann ein biologisch aktives Molekül chemisch an die reagierbare (reaktive) Verbindung bindet.
    2. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß· die reagierbare Verbindung ein hydrophyles Hydrogel ist.
    3. Verfahren nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrogel-OH, -NH3, -CO3H, -COCl und -CHCH3O-1 seitenständige funktioneile Gruppen besitzt.
    4. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß das inerte Polymersubstrat ein aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Polymer ist: Polyäthylen, Polyurethan, Polysiloxan, Polysiloxan-Polyurethan-Blockkopolymere, Zellulosestoffe und fluorierte Silikone und Kohlenwasserstoffpolymere.
    5. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Bindung dadurch bewirkt wird, daß man zuerst die strahlungsaufgepfropfte reaktive Verbindung chemisch aktiviert und sodann die sich ergebende aktivierte Oberfläche mit einer wässerigen Lösung eines biologisch aktiven Moleküls in Kontakt bringt.
    6. Verfahren nach Anspruch 5,dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch aktive Molekül aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Menschliches Serum Albumin, Heparin, Streptokinase, Prostaglandin E-1 und Mischungen aus diesen Stoffen.
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    7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Aktivierungsschritt mit einer Verbindung durchgeführt wird, 'die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Cyanogenbromid, Thiophosgen und Carbodiimide
    8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die strahlungsaufgepfropfte reaktive Verbindung ein Hydrogel aufweist, welches einen Wassergehalt größer als ungefähr 55% besitzt, und wobei der chemische Bindungsschritt durch chemische Aktivierung der strahlungsaufgepfropften reaktiven Verbindung erfolgt, und zv/ar durch Inkontaktbringen der sich e3rgebenden aktivierten Oberfläche mit einer Lösung aus einer zweiten reaktiven~ Verbindung, die einen chemischen Zwischen-arm liefert, wenn er mit der aktiven Oberfläche der strahlungsaufgepfropften reaktiven Verbindung verbunden ist, und wobei schließlich die zweite reaktive Verbindung aktiviert und sodann chemisch mit einem biologisch aktiven Molekül verbunden wird, und zwar zu der sich ergebenden aktivierten Oberfläche der zweiten reaktiven Verbindung.
    9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung der strahlungsaufgepfropften reaktiven Verbindung durch Cyanogenbromid bewirkt wird, wobei die zv/eite reaktive Verbindung eine Verbindung aufweist, die aus der -CO3H seitenständigen funktioneilen Gruppe ausgewählt ist, und wobei die Aktivierung der zweiten reaktiven Verbindung mit Carbodiimid bewirkt wird f und wobei schließlich das biologisch aktive Molekül aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Menschliches Serum Albumin, Heparin, Streptokinase, · Prostaglandin E-1 und Mischungen daraus.
    10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die strahlungsaufgepfropfte reaktive Verbindung mit einem dünnen inerten Polymerfilm verbunden ist und eine -CO5H seitenständige funktionelle Gruppe aufweist, wobei die zweite reaktive Verbindung eine £-Aminokapronsäure ist, und wobei die Aktivierung der. zweiten reaktiven Verbindung
    309851/1064
    durch Inkubation bei Raumtemperatur in einer 10%-Lösung von Carbodiimid für eine Zeitdauer von 30 Minuten erfolgt, worauf dann der behandelte Film schnell in Eiswasser gewaschen wird, und wobei dann schließlich der chemische Bindungsschritt dadurch ausgeführt wird, daß man den Film mit einer 5-2OT-Lösung des biologisch aktiven Moleküls in 0,1 M MES bei einem pH-Wert von 4,75 in Kontakt bringt.
    11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch aktive Molekül aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Menschliches Serum Albumin, Heparin, Streptokinase und Mischungen daraus.
    12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die strahlungsaufgepfropfte reaktive Verbindung ein Hydrogel aufweist und der chemische Bindevorgang dadurch bewirkt wird, daß man die Hydrogel-Oberflache mit einer Lösung in Kontakt bringt, welche ein biologisch aktives Molekül und ein bifunktionelles Kupplungsagens enthält, wodurch die Hydrogel-Oberflache aktiviert wird und das biologisch aktive Molekül chemisch daran gebunden wird, und zwar in einem einzigen direkten Kupplungsschritt.
    13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrogel -OH, -NH„, -CO2H und -CHCH2OJ seitenständige funktionelle Gruppen besitzt.
    14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung ein biologisch aktives Molekül enthält, welches aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Menschliches Sei~um Albumin, Heparin, Streptokinase und Mischungen daraus, und wobei ein bifuntionelles Kupplungs- oder Kopplungsagens aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Glutaraldehyd, Diepoxyd und Diacidchloride.
    303651/ 1064
    2376863
    15. Gegenstand für biomedizinische Anwendungen mit einer nov/ohü
    biokoinpatiblen als auch biofunktionellen Oberfläche, gekcnn-
    ■i
    zeichnet durch eine Oberfläche aus einem strahlungsaufgcpfropften, star}; hydriertem Hydrogele an welchem biologisch aktive· Moleküle chemisch gebunden sind, und wobei der Gegenstand nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellt ist,
    16. "Gegenstand nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktiven Moleküle an einen chemischen Arm gebunden sind, der seinerseits an das Hydrogel gebunden ist.
    17. Gegenstand nach /Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der chemische Arm eine i-Aminokapronsäure aufweist.
    30.9851/106 4
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