DE2262781B2

DE2262781B2 - Verfahren zur bestimmung von anorganischem phosphat in koerperfluessigkeiten

Info

Publication number: DE2262781B2
Application number: DE19722262781
Authority: DE
Inventors: John Anthony Valley Cottage; Ertingshausen Gerhard Riverdale; N.Y. Daly (V.St.A.)
Original assignee: Union Carbide Corp
Current assignee: Union Carbide Corp
Priority date: 1971-12-22
Filing date: 1972-12-21
Publication date: 1977-09-08
Also published as: NL7217457A; CA983359A; BR7209011D0; IL41143A; CH545973A; US3795484A; BE793152A; GB1371459A; SE380629B; JPS4942395A; IL41143A0; FR2165651A5; DE2262781A1

Description

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Der Bedarf für genauere quantitative analytische Verfahren ist in den letzten Jaliren wegen der vielen mikroanalystischen Untersuchungen in der Biochemie und den klinischen Routineuntersuchungen in den Arztpraxen und Krankenhäusern stark gestiegen. Außerdem ist es oft sehr wünschenswert, daß das Verfahren einfach und schnell durchgeführt ist und zuverlässige Ergebnisse liefert. Dies ist vor allem für die klinischen Untersuchungen von Körperflüssigkeiten wichtig, da hier eine Diagnose und die Behandlung oft von den Ergebnissen der Analysen abhängen.

Insbesondere die Bestimmung des anorganischen Phosphats im Blutserum ist für einige Krankheiten, vor allem für die Urämie und die chronischen Nierenerkrankungen, bei denen eine Phosphatretention erfolgt, •wichtig. Es wird nur das anorganische Phosphat bestimmt, da Veränderungen im Phospholipid-, Phosphatester- und Nucleotidphosphat-Gehalt nur schwer mit klinischen Problemen in Verbindung gebracht werden können.

In der GB-PS 12 36 951 und der US-PS 35 47 586 wird ein Überblick über die gängigen Analysenmethoden und ihre Nachteile gegeben. Danach hat man die Methode der UV-Absorption bisher nur bei der sogenannten Enzym-Methode angewendet, die aber wegen des Angriffes auf die organischen Phosphatester zu Ungenauigkeiten führt, was ihre praktische Ausnutzung in Frage stellte.

Die meisten Verfahren zur Bestimmung von anorganischem Phosphat verwenden daher die Molybdän-Blau-Reaktion. Diese Reaktion führt zur Bildung eines Phosphatmolybdat-Komplexes, der anschließend mit Zinn(II)-chlorid, Phenylhydrazin, Acsorbinsäure, Aminonaphtholsulfonsäure oder anderer. Reduktionsmitteln reduziert wird. Die Absorption des gebildeten blauen Komplexes der reduzierten Heteropolysäure wird bei etwa 700 nm gemessen. Für diese Bestimmung muß man jedoch eine proleinfreie Serumprobe herstellen, was die Durchführung der Bestimmung erschwert Außerdem ist die Empfindlichkeit dieses Bestimmungsverfahrens niedrig und um gute Ergebnisse zu erzielen, muß man noch mindestens zwei weitere Mengenanteile der Reagenzien zusetzen.

Die Molybdän-Blau-Methode wird z.B. m den folgenden Li'teraturstellen beschrieben:

l" F F e i g 1 »Spot tests in Organic Analysis« (6.

' Auflage, 1960, S. 99),

2 GB-PS 12 36 951,

3 KolthoffundElving »Treatise on Analytical ' Chemistry«,Bd.5,TeilII, 1961.S.317bis402.

Es wurde nun festgestellt, daß man anorganisches Phosphat leichter und genauer mit einem Rotationsphotometer bestimmen kann, wobei der unreduzierte gelbe Phosphat-Molybdatkomplex verwendet werden kann.

Analytische Rotationsphotometer sind für die schnelle Mikroanalyse einer Vielzahl von Flüssigkeiten, wie Körperflüssigkeiten, insbesondere Blutserum und Nahrungsmittel, geeignet. Da man mit diesen Photometern viele Analysen schnell und gleichzeitig durchführen kann, sind sie vor allem dort besonders geeignet, wo eine große Anzahl von Proben untersucht werden muß oder verschiedene Untersuchungen an einer Probe erwünscht sind. Außerdem genügen bei diesem Verfahren relativ geringe Mengen an Reagenzien, z.B. Mikroliter, so daß die Verwendung von kostspieligen Reagenzien auf ein Minimum gesenkt wird.

Ein Verfahren, in dem ein Rotations-Spektrophotometer für mikroanalytische Untersuchungen verwendet wird, ist in der OS 19 62 267.4 beschrieben. In diesem Verfahren werden die Absorption einer flüssigen Probe und die Absorption einer Bezugslösung in einem 2-Strahlen-Spektrophotometer gemessen und miteinander verglichen. Das System beruht auf einer Anzahl von Küvetten, die am Rand eines Rotors angeordnet sind. Beim Drehen des Rotors werden die Reagenzien und die Proben durch die Zentrifugalkraft zu den Küvetten transportiert, wo die Konzentration spektrophotometrisch gemessen wird. Auf einem Probenteller, auf dem Reihen von Vertiefungen konzentrisch angeordnet sind, werden die Reagenzien in die innersten Vertiefungen und die Serumprobe in die mittleren Vertiefungen eingefüllt. Der Teller wird dann gekennzeichnet und so in den Rotor eingepaßt, daß jedes Reagens und die entsprechende Serumprobe eine eigene Küvette haben. Beim Beschleunigen des Rotors wandern die Reagenzien und die Proben in die äußerste Vertiefung, wo sie durch einen kleinen Kanal zur Küvette transportiert werden. Während des Transports vermischen sich das Reagens und die Probe. Die gefüllten Küvetten passieren schnell den fixierten Lichtstrahl, wo die Lichtdurchlässigkeit gemessen wird.

Der erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von anorganischem Phosphat in Körperflüssigkeiten durch Vermischen einer Probe der Körperflüssigkeit mit einer Ammoniummolybdatlösung ist dadurch gekennzeichnet, daß man

a) der Probe ferner 0,1 bis 1 Gewichtsprozent eines Netzmittels zusetzt,

b) anschließend mittels eines Rotationsphotometers die Absorptionswerte bei 340 nm innerhalb von 2 Sekunden und innerhalb von 10 Minuten nach dem Mischen bestimmt

c) und den so erhaltenen Absorptioiisdifferenzwert mit mindestens einem gleichzeitig und unter gleichen Bedingungen bestimmten Wert einer

Lösung mit bekanntem Phosphatgehalt vergleicht, wodurch sich der Phosphatgehalt der Körperflüssigkeit ergibt

Das erfindungsgemäße Verfahren gewährleistet eine genaue und schnelle quantitative Bestimmung des anorganischen Phosphats in Körperflüssigkeiten. Da eine lineare Beziehung zwischen der Absorptionsänderung und der Phosphatkonzentration besteht, können noch 10 mg Phosphat je 100 ml Flüssigkeit bestimmt werden. Genauigkeitsuntersuchungen und der Vergleich mit einem bekannten Verfahren zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren vergleichbar genau ist.

Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß das Protein, das normalerweise die Reaktion stört, nicht entfernt werden muß. Das Serumprotein wird durch die Zugabe des Netzmittels in Lösung gehalten und die Trübung auf ein Minimum vermindert. Nichtionische Netzmittel, wie Sorbitanmonooleate, werden bevorzugt Das Netzmittel soll in einer solchen Menge verwendet werden, daß eine Ausfällung des Proteins und eine Trübung der Lösung vermieden werden.

Als einziges aktives Reagens wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine Ammoniummolybdatlösung verwendet. Die Lösung wird durch Lösen von 2,0 g Ammoniummolybdat

[(NH₄J₆Mo₇O₂₄ · 4 H₂O]

in 1 Liter 1,2 η-Schwefelsäure hergestellt. Diese Lösung ist äußerst stabil. Das Netzmittel kann man direkt der Molybdatlösung zugeben, z.B. kann man 100ml Molybdatlösung mit 0,9 ml einer Lösung, die 1 Gewichtsteil Netzmittel auf 2 Gewichtsteile Wasser enthält, versetzen.

Eine Standard-Phosphorbezugslösung kann durch Lösen von 439 mg KH₂PO₄ in 100 ml V/asser hergestellt werden. Man kann einige Tropfen Chloroform als Konservierungsmittel zusetzen. 5,0 ml dieser Lösung werden dann mit Wasser auf 100 ml verdünnt.

Zur Durchführung der Bestimmung werden beispielsweise 400 Mikroliter der Molybdatlösung in die innerste Vertiefung und 10 Mikroliter Serum in die mittlere Vertiefung des Probentellers des Rotalionsphotometers pipettiert Nach Einschalten des Rotalionsphotometers wird eine erste Absorption nach 2,0 Siekunden und die Endabsorption nach 10 Minuten abgelesen. Das Instrument ist mit einem Filter ausgerüstet, das Ablesungen bei 340 nm gestattet.

Da die UV-Absorptionsfähigkeit der sich bildenden gelben Lösungen der Phosphat-Molybdatkomplexe in dem interessierenden Konzentrationsbereich (bis zu 10 mg Phosphat je 100 ml Körperflüssigkeit) streng dem Beersehen Gesetz gehorcht und außerdem die Empfindlichkeit der Methode sehr gut ist, kann die Konzentration an anorganischem Phosphat sehr schnell und mit hoher Genauigkeit bestimmt werden.

Ein Rotationsphotometer umfaßt normalerweise einen Probenteller aus z. B. Polytetrafluorethylen, der Proben und Reagenzien enthält, und der in einen Rotor mit z. B. 30 radial angeordneten Küvetten eingepaßt ist. Beim Beschleunigen des Rotors gelangt des Reagens aus der jeweiligen Reagensvertiefung zur entsprechenden Probenvertiefung. Das Gemisch aus Probe und Reagens v/ird dann innerhalb 1,5 Sekunden in die entsprechende Küvette übergeführt. Eine Küvette mit Wasser wird als Bezugslösung mitgeführt. Die Küvetten passieren den fixierten Lichtsrahl eines Spektrophotometers, der die Absorption mißt und auf einem Oscilloskop festhält Von jeder Küvette können gleichzeitig zwei Absorptionsbestimmungen zahlenmäßig gespeichert oder notiert werden, so daß die Absorptionsdifferenz einem Computer zugeführt werden kann. Die erste Absorption wird nach dem Start abgelesen, die Zeit zwischen dieser und der zweiten Bestimmung wird notiert Nach der ersten Ablesung kann man weitere Bestimmungen durchführen und entweder die Absorptionsänderung je Intervall mit zlA/min angeben oder die Absorptionsdifferenz zwischen der ersten und jeder weiteren Bestimmung messen. Zweckmäßig sind Rotationsphotometer, die eine Kompensation für Küvettenänderungen und für die Blindwerte von Serum und Reagens erlauben, wenn die Ablesungen erfolgen, bevor die Reaktion meßbar ist Ein in einem vorhergehenden Lauf bestimmter Blindwert kann als erste Ablesung in einem folgenden Lauf verwendet werden. Nach einer bestimmten Zeit werden die Ablesungen ausgedruckt Die letzten Daten werden gespeichert und können im Computer multipliziert werden, wodurch die Konzeniration direkt in Konzentrationseinheiten ausgedruckt wird. Der Rotor wird in einem Luftbad auf ±0,1° C thermostatisiert.

Das folgende spezielle Beispiel erläutert die Erfindung noch näher.

Ausführungsbeispiel

In die meisten Probenvertiefungen eines Probentellers aus Polytetrafluorethylen eines Rotationsphotometers werden 10 Mikroliter Humanblutserum gefüllt. Die Bezugslösung besteht aus 400 Mikroliter destilliertem Wasser und befindet sich in der innersten Vertiefung des Probentellers. In die restlichen Vertiefungen werden 10 Mikroliter verschiedener Phosphor-Standardlösungen, die 2 bis 10 mg Phosphat je 100 ml enthalten, eingefüllt Durch Lösen von 2 g

(NH₄J₆MO₂₄ · 4H₂O

und 3 ml eines nichtionischen Netzmittels, wie Sorbitanmonooleat, in 1 Liter l,2n-Schwefelsäure wird eine Ammoniummolybdatlösung hergestellt. 400 Mikroliter dieser Lösung werden in die innerste Vertiefung des Probentellers gefüllt.

Die erste Ablesung aller 30 Küvetten erfolgt Sekunden nach Einschalten des Rotors. Die zweite Ablesung wird nach 10 Minuten vorgenommen. Die Absorptionsänderung wird dazu verwendet, die auf die Standartlösung bezogenen Phosphorkonzentrationen zu bestimmen. Der Versuch wird mit einem 340 nm Interferenzfilter durchgeführt.

Gemäß dem Beerschen Gesetz ist die Absorption einer Lösung der Konzentration des in der Lösung vorhandenen Chromophors proportional, vorausgesetzt, die Konzentration ist niedrig. Dementsprechend ist die Konzentration des in der Reaktion gebildeten Phosphomolybdats jederzeit der Absorption proportional. Das heißt:

Absorption · F ■-

Konzentration,
die Konzentration

Um die Absorption in die Konzentration zu verwandeln, muß die Absorption mit einem Faktor F multipliziert werden. Dieser Faktor F wird im Analysengerät gespeichert und multipliziert somit automatisch die Absorption. Die Konzentrationseinheilen werden dann direkt ausgedruckt.

Während der Bestimmung wird immer eine Standardlösung mit bekanntem Phosphorgehait mitgeführt. Zeigen die Ergebnisse der Standardlösung leichte

Abweichungen von den korrigierten Konzentrationen, so wird der Faktor Fso lange geändert, bis die richtigen Werte ausgedruckt werden. Die gleiche Korrektur wird dann automatisch auf die Ergebnisse der unbekannten Probe angewendet

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von anorganischem Phosphat in Körperflüssigkeiten durch Vermischen einer Probe der Körperflüssigkeit mit einer Ammoniummolybdatlösung, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) der Probe ferner 0,1 bis 1 Gewichtspro2:ent eines Netzmittels zusetzt,

b) anschließend mittels eines Rotationsphotometers die Absorptionswerte bei 340 nm innerhalb von 2 Sekunden und innerhalb von 10 Minuten nach dem Mischen bestimmt,

c) und den so erhaltenen Absorptionsdifferenzwert mit mindestens einem gleichzeitig und unter gleichen Bedingungen bestimmten V/ert einer Lösung mit bekanntem Phosphatgehalt vergleicht, wodurch sich der Phosphatgehalt der Körperflüssigkeit ergibt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Körperflüssigkeit Blutserum einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man der Meßlösung ein nichtionisches Netzmittel, vorzugsweise Sorbkanmonooleat, zusetzt