DE2262781A1

DE2262781A1 - Verfahren zur bestimmung von anorganischem phosphat in organischen fluessigkeiten

Info

Publication number: DE2262781A1
Application number: DE2262781A
Authority: DE
Inventors: John Anthony Daly; Gerhard Ertingshausen
Original assignee: Union Carbide Corp
Current assignee: Union Carbide Corp
Priority date: 1971-12-22
Filing date: 1972-12-21
Publication date: 1973-07-05
Also published as: IL41143A0; NL7217457A; GB1371459A; IL41143A; CA983359A; BR7209011D0; DE2262781B2; SE380629B; JPS4942395A; FR2165651A5; US3795484A; BE793152A; CH545973A

Description

OTION CARBIDE C ORPOHATION,'
New York, N.Y., V.St.A.

¹¹ Verfahren zur Bestimmung von anorganischem Phosphat in organischen Flüssigkeiten "

Priorität: 22.Dezember 1971, V.St.A., Nr. 211 075

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von anorganischem Phosphat in organischen Flüssigkeiten, insbesondere Körperflüssigkeiten, wie Blutserum. Die Bestimmung erfolgt mittels eines Rotationsphotometers.

Der Bedarf für genauere quantitative analytische Verfahren ist in den letzten Jahren wegen der vielen mikroanalytischen Untersuchungen in der Biochemie und den klinischen Routineuntersuchungen in den Arztpraxen und Krankenhäusern stark gestiegen. Ausserdem ist es oft sehr wünschenswert, dass das Verfahren einfach und schnell durchführbar ist und zuverlässige Ergebnisse liefert. Dies ist vor allem für die klinischen Untersuchungen

30 9 827/0826

von Körperflüssigkeiten wichtig, da hier eine Diagnose und die Behandlung oft von den Ergebnissen der Analysen abhängen.

Es gibt jedoch nur wenige Verfahren,die schnell und genau dem steigenden Bedarf an verschiedenen klinischen Untersuchungen nachkommen.

So nimmt z.B. die Bestimmung des anorganischen Phosphats in Körperflüssigkeiten, wie Blutserum, einen immer grösseren Anteil an der klinischen Laborarbeit ein. Die Bestimmung des Phosphats im Serum ist für»einige Krankheiten, insbesondere für die Urämie und die chronischen Nierenerkrankungen, bei denen eine Phosphatretention erfolgt, wichtig. Es wird nur das anorganische Phosphat bestimmt, da Veränderungen im Phospholipid-.Phosphatester- und Nucleotidphosphat-Gehalt nur schwer mit klinischen Problemen in Verbindung gebracht v/erden können. Trotz einiger neuer chemischer Verfahren wird die photometrische Bestimmung des anorganischen Phosphats in biologischen Flüssigkeiten immer noch mittels der Molybdän-Blau-Reaktion durchgeführt (vergl. I.M.Kolthoff und P.D. Elving "Treatise on Analytical-Chemistry", Band 5, Teil II, Seiten 317 bis 402 (1961)).

Es wurde nun" festgestellt, dass man anorganisches Phosphat leichter und genauer mit einem Rotationsphotometer bestimmen kann. Analytische Rotationsphotometer sind für die schnelle Mikroanalyse einer Vielzahl von Flüssigkeiten, wie Körperflüssigkeiten, insbesondere Blutserum, und Nahrungsmitteln geeignet.

Da man mit diesen Photometern viele Analysen schnell und gleich- ;

zeitig durchführen kann, sind sie vor allem dort besonders ge- \

; t

309827/0826

' — "3 —

eignet, wo eine grosse Anzahl von Proben untersucht werden muss oder verschiedene Untersuchungen an einer Probe erwünscht sind. Ausserdem genügen bei diesem Verfahren relativ geringe Mengen an Reagentien, z.B. Mikroliter, so dass die Verwendung Von kostspieligen Reagentien auf ein Minimum gesenkt v/ird.

Ein Verfahren, ;Ln dem ein Rotations-Spektrophotometer für mikroanalytische Untersuchungen verwendet wird, ist in der OS 1 962 267.4 beschrieben. In diesem Verfahren werden die Absorption einer flüssigen Probe und die Absorption einer Bezugslösung in einem 2-Strahlen-Spektrophotometer gemessen und miteinander verglichen. Das System beruht auf einer Anzahl von Küvetten, die am Rand eines Rotors angeordnet sind. Beim Drehen des Rotors werden die Reagentien und die Proben durch· die Z'entrifugalkraft zu den Küvetten transportiert, wo die Konzentration spektrophotometrisch gemessen wird. Auf einem Probenteller, auf dem Reihen von Vertiefungen konzentrisch angeordnet sind, werden die Reagentien in die innersten Vertiefungen und die Serumproben in die mittleren Vertiefungen eingefüllt JDer Teller wird dann gekennzeichnet und so in den Rotor eingepaßt, dass jedes Reagens und die entsprechende Serumprobe eine eigene Küvette haben. Beim Beschleunigen des Rotors wandern die Reagentien und die Proben in die äusserste Vertiefung, wo sie durch einen kleinen Kanal zur Küvette transportiert werden. Während des Transports vermischen sich das Reagens und die Probe, Die gefüllten :Küvetten passieren schnell den fixierten Lichtstrahl, wo die Lichtdurchlässigkeit gemessen wird.

.30 9 827/0 826

Die meisten Verfahren zur Bestimmung von anorganischem Phosphat verwenden die Molybdän-Blau-Resktion. Diese Reaktion führt zur Bildung eins Phosphatmolybdat-Komplexes, der anschliessend mit Zinn(II)-ohlorid , Phenylhydrazin, Ascorbinsäure, Aminonaphtholsulfonsäure oder anderen Reduktionsmitteln reduziert wird. Die Absorption des gebildeten blauen Komplexes der reduzierten Heteropolysäure wird bei etwa 700 nm gemessen. Pur diese Bestimmung muss man jedoch eine proteinfreie Serumprobe herstellen, was die Durchführung der Bestimmung erschwert. Ausserdem ist die Empfindlichkeit dieses Bestimmungsverfahrens niedrig.und um gute Ergebnisse zu erzielen.muss man noch mindestens zwei weitere Mengenanteile der Reagentien zusetzen.

Es wurde vorgeschlagen, das anorganische Phosphat mittels der gelben Molybdovanadophosphat-heteropolysäure zu bestimmen. Dieses Verfahren ist bis jetzt jedoch kein Routineverfahren geworden. Es wurde auch vorgeschlagen, die Absorption des nicht reduzierten Phosphomolybdat-Komplexes zu bestimmen. Das Absorptionsmaximum dieses Heteropolysäure-Komplexes liegt jedoch im ultravioletten Bereich, so dass hohe Proben- und Reagens-Blindwerte vermieden werden müssen.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Bestimmung von anorganischem Phosphat anzugeben, durch das die beschriebenen Schwierigkeiten beseitigt oder vermindert werden. Das Verfahren soll genau sein, die Zugabe nur eines einzigen Reagens benötigen und im Rotationsphotometer durchführbar sein. Ausserdem sollen die Grundabsorptionen der Probe und des Reagens

309827/0826

automatisch vermieden werden.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung von anorganischem Phosphat in organischen Flüssigkeiten, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man

a) die Flüssigkeit mit einer Ammoniummolybdatlösung vermischt,

b) mittels eines Rotationsphotometers die Absorption bei 340 nm /innerhalb,

/zwei Seltunden sowie binnen 10 Minuten nach dem Mischen, bestimmt,

c) die so erhaltene Absorptionsdifferenz mit mindestens einer gleichzeitig unter gleichen Bedingungen bestimmten Absorptionsdifferenz einer Lösung mit bekanntem Phosphatgehalt vergleicht,

d) den Phosphatgehalt in der Flüssigkeit berechnet.

Das erfindungsgemässe Verfahren gewährleistet eine genaue und schnelle quantitative Bestimmung des anorganischen Phosphats in Körperflüssigkeiten. Da eine lineare Beziehung zwischen der Absorptionsänderung und der Phosphatkonzentration besteht, können bis zu mindestens 10 mg Phosphat je 100 ml Flüssigkeit bestimmt werden. Genauigkeitsuntersuchungen und der Vergleich mit einem bekannten Verfahren zeigen, dass das erfindungsgemässe Verfahren vergleichbar genau ist.

Im erfindungsgemässen Verfahren wird nur die in der ersten Reaktion gebildete Farbe gemessen. Die Absorption des nicht reduzierten Phosphomolybdat-Komplexes erfolgt im Ultraviolett- _:

bereich und kann bei 340 nm quantitativ bestimmt werden. :

309827/0826

Ausserdem muss das Protein aus der Probe nicht entfernt werden und bleibt in Lösung.

Im erfindungsgemässen Verfahren zur Bestimmung von anorganischem Phosphat wird ein Rotat-ionsphotometer verwendet, in dem ein Probenteller aus Polytetrafluoräthylen, der Proben und Reagentien enthält, in einen Rotor mit 30 radial angeordneten KUvetten eingepasst wird. Beim Beschleunigen des Rotors gelangt das Reagens aus der jeweiligen Reagensvertiefung zur entsprechenden Probenvertiefung. Das Gemisch aus Probe und Reagens wird dann innerhalb 1,5 Sekunden in die entr-pro-ihende Küvette übergeführt. Eine Küvette mit Wasser wird als Bezugslösung mitgeführt. Die Küvetten passieren den fixierten Lichtstrahl eines Spektrophotometers, der die Absorption misst und auf einem Oscilloskop festhält. Von jeder Küvette können gleieh-

^zahlenmäGsig gespeichert oder notiert^ zeitig zwei Absorptionsbestimmungen ~] werden, so dass die Absorptionsdifferenz einem Computer zugeführt werden kann. Die erste Absorption wird nach dem Start abgelesen, die Zeit zwischen dieser und der zweiten Bestimmung wird notiert. Nach der ersten Ablesung kann man weitere Bestimmungen durchführen und entweder die Absorptionsänderung je Intervall mit £\A/min -angeben oder die Absorptionsdifferenz zwischen der ersten und jeder weiteren Bestimmung messen. Diese AusführuiTgsfonn erlaubt eine Kompensation für Küvettenänderungen und für die HLindwerte von Serum und Reagens, wenn die Ablesungen erfolgen, bevor die Reaktion messbar ist. Ein in einem vorhergehenden Lauf bestimmter Blindwert kann als erste Ablesung in einem folgenden Lauf verwendet werden. Nach einer bestimmten Zeit

309827/0826

werden die Ablesungen ausgedruckt. Die letzten Daten werden gespeichert und können im Computer multipliziert werden, wodurch die Konzentration direkt in Konzentrationseinheiten ausgedruckt wird. Der Rotor wird in einem Luftbad auf j_ 0,1 °.C thermostatisiert»

Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens ist die Tatsache, dass das Protein, das normalerweise die Reaktion stört, nicht entfernt werden muss. Es wurde festgestellt, dass das Serumprotein durch Zugabe einer geringen Menge eines Netzmrttels in Lösung gehalten und die Trübung auf ein Minimum vermindert werden kanu. Obwohl man eine grosse Anzahl von Hetzmitteln verwenden kann, werden nichtionische Netzmittel, wie Sorbitanmonooleate, bevorzugt. Das Netzmittel soll in einer solchen Menge verwendet werden, dass eine Ausfällung des Proteins und eine Trübung der Lösung vermieden werden. Im allgemeinen genügen etwa 0,1 bis etwa 1,0 Gewichtsprozent, um eine Interferenz des Proteins zu unterbinden.

Als einziges aktives Reagens wird im- erfindungsgemässen Verfahren eine Ammoniummolybdatlösung verwendet. Die Lösung wird durch Lösen-von 2,0 g Ammoniummolybdat ( (ΝΗ,)₆Μ0γ0_2/, ^#4H₂0 )" in 1 Liter 1,2n Schwefelsäure hergestellt. Die Lösung iat äusserst stabil. Das Netzmittel kann man der Molybdatlösung zugeben, z.B. kann man 100 ml Molybdatlösung mit 0,9 ml einer Lösung, die 1 Gewichtsteil Netzmittel auf 2 Gewichtsteile Wasser enthält, versetzen. f

Eine Standard-Phosphorbezugslösung wird durch Lösen von 439 mg

309827/0826

KH2PO4 in 100 ml Wasser hergestellt. Man kann einige Tropfen Chloroform als Konserviermittel zusetzen. 5,0 ml dieser Lösung werden dann mit Wasser auf 100 ml verdünnt.

Zur Durchführung der Bestimmung werden 400 Mikroliter der Molybdatlösung in die innerste Vertiefung und 10 Mikroliter Serum in die mittlere Vertiefung des Probentellers pipettiert. Nach Einschalten des Rotationsphotometers wird eine erste Absorption nach 2,0 Sekunden und die Endabsorption nach 10 Minuten abgelesen. Das Instrument ist mit einem Filter ausgerüstet, das Ablesungen bei 340 nm gestattet.

Das optische System des Rotationsphotometers gestattet eine Ablesung der Absorption in einem dynamischen Linearbereich von 0 bis 2,5 bei 340 nm. Da die Reaktion bis zu 10 mg Phosphat je 100 ml Flüssigkeit linear ist und der nicht reduzierte Phosphomolybdat-Komplex verwendet werden kann, kann das anorganische Phosphat schnell und genau bestimmt werden. Durch Vergleich der erhaltenen Absorptionsdifferenz mit der Absorptionsdifferenz einer Lösung mit bekanntem Phosphatgehalt kann die Phosphatkonzentration der Probe leicht bestimmt werden. Die Genauigkeit -des erfindungsgemässen Verfahrens wird durch Vergleich mit herkömmlichen Literatur-Verfahren bestätigt.

Das Beispiel erläutert die Erfindung. ■ ■ ·

Ausführungsbeispiel

In die meisten Probenvertiefungen eines Probentöllers aus Polytetrafluoräthylen eines Rotationsphotometers werden

309827/0826

10 Mikroliter Humanblutserum gefüllt. Die Bezugslösung besteht aus 400 Mikroliter. destilliertem Wasser und befindet sich in der innersten Vertiefung des Probentellers. In die restlichen Vertiefungen v/erden 10 Mikroliter verschiedener Phosphor-Standardlösungen, die 2 bis 10 mg Phosphat je 100 ml enthalten, eingefüllt. Durch Lösen von 2 g (NH.)^MO₇O₂₄.4H₂O und 3 ml eines nichtionischen Netzmittels, wie Sorbitanmonooleat, in 1 Liter 1,2n Schwefelsäure wird eine Ammoniummolybdatlösung hergestellt. 400 Mikroliter dieser Lösung werden in die innerste Vertiefung des. Probentellers gefüllt.

Die erste Ablesung aller 30 Küvetten erfolgt Sekunden nach Einschalten des Rotors. Die zweite Ablesung wird nach 10 Minuten vorgenommen. Die Absorptionsänderung wird dazu verwendet, die auf die Standardlösung bezogenen Phosphorkonzentrationen zu bestimmen. Der.Versuch wird mit einem 340 nm Interferenzfilter durchgeführt *

Gemäss dem Beer¹sehen Gesetz ist die Absorption einer Lösung der Konzentration des in der Lösung vorhandenen Chromophors proportional, vorausgesetzt, die Konzentration ist niedrig. Dementsprechend ist die Konzentration des in der Reaktion gebildeten Phosphomolybdats jederzeit der Absorption proportional Das heisst ; ·

Absorption χ F = Konzentration.

Um die Absorption in die Konzentration zu verwandeln, muss die Absorption mit einem Faktor F multipliziert werden. Dieser Faktor F wird im Analysengerät gespeichert und multipliziert,

. - " ' 309 82 7/08 26

■¹⁰~ 2267781

somit automatisch die Absorption. Die Konzentrationseinheiten werden dann direkt ausgedruckt.

Während der Bestimmung wird immer eine Standardlösung mit bekanntem Phosphorgehalt mitgeführt. Zeigen die Ergebnisse der Standardlösung leichte Abweichungen von den korrigierten Konzentrationen, so v/ird der Paktor F so lange geändert, bis die richtigen Werte ausgedruckt werden. Die gleiche Korrektur wird dann automatisch auf die Ergebnisse der unbekannten Probe angewendet.

309827/0826

Claims

Patentansprüche

;" 1 .' Verfahren zur Bestimmung von anorganischem Phosphat in organischen Flüssigkeiten, .dadurch gekennzeichnet, dass man

a) die Flüssigkeit mit einer AmmoniummolybdatlÖsung vermischt,

b) mittels eines Rotationsphotometers die Absorption bei 540 nm innerhalb 2 Sekunden sowie binnen 10 Minuten nach dem Mischen bestimmt,

c) die so erhaltene Absorptionsdifferenz mit mindestens einer gleichzeitig und unter gleichen Bedingungen bestimmten Absorptionsdifferenz einer Lösung mit bekanntem Phosphatgehalt vergleicht,

d) den Phosphatgehalt-der Flüssigkeit berechnet.

2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als organische Flüssigkeit eine Körperflüssigkeit einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Körperflüssigkeit Blutserum einsetzt»

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man der Messlösu'ng ein Netzmittel, vorzugsweise Sorbitanmonooleat, zusetzt.

■ 309827/0826*"