DE2256331B2 - Verfahren zur quantitativen kolorimetrischen Harnsäurebestimmung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen kolorimetrischen Harnsäurebestimmung in parallelen Test- und Blindproben unter Verwendung von Uricase in der Blindprobe und eines Puffers, der der Blindprobe und der Testprobe in gleicher Menge und Konzentration zugesetzt wird.

Bei diesem aus Chlin. Chem., Vol. 12, No. 1,1966, Seiten 18 bis 24 bekannten Verfahren wird das Eiweiß ausgefüllt und abgetrennt.

Die Eiweißfällung verursacht jedoch bei der Analyse folgende Fehlerquellen:

a) Nicht alle Proben enthalten dieselbe Menge Protein, so daß das Volumen der ausgefällten Feststoffe sehr schwankt. Dies hat den ungünstigen Effekt, daß auch das Volumen der überstehenden Flüssigkeit in dem Reaktionsgefäß sehr unterschiedlich ist, so daß beträchtliche Verdünnungsfehler vorkommen können.

b) Bisher konnte der Verdacht nicht ganz ausgeräumt werden, daß mit dem ausgefällten Eiweiß zusammen auch Harnsäure mit ausfällt, so daß die Analysenwerte zu niedrig ausfallen (vgl. R. J. Henry, BHn. Chem., Principles and Techniques, Seite 68, New York, Harper and Rowe, 1968). Und wenn dieser Effekt auch grob abgeschätzt werden kann, so ist dies doch bei routinemäßigen und automatischen Methoden unanwendbar.

Deshalb ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur quantitativen kolorimetrischen Harnsäurebestimmung anzugeben, bei dem auf die mühevolle, zeitraubende und letztendlich Fehler verursachende Stufe der Eiweißabtrennung verzichtet werden kann.

Diese Aufgabe kann überraschenderweise dadurch gelöst werden, daß man bei dem Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß so vorgeht, daß anstelle einer Eiweißfällung der Blindprobe und der Testprobe zur Löslichmachung des Eiweißes Harnstoff zugesetzt wird.

Hierbei ist der eingesetzte Puffer vorzugsweise Borat, und die Harnsäure wird zweckmäßig kolorimetrisch durch ein Wolframatphosphat-Carbonat-Reagens bestimmt.

Diese Möglichkeit, dank des erfindungsgemäßen Verfahrens völlig auf die Eiweißfällung verzichten zu können, isv von enormer Bedeutung: Automatische Bestimmungsverfahren werden auf diese Weise viel leichter durchführbar. Da die neuzeitliche klinische Chemie darauf gerichtet ist, Methoden anzuwenden, bei denen die mechanische Eiweißfällung unterbleiben kann, ist das erfindungsgemäße Verfahren höchst vorteilhaft. Außerdem wird durch den Verzicht auf die Eiweißfällung die Bestimmung auch abgekürzt, sowohl im Hinblick auf die Zeit als auch auf die Stufenzahl. Dadurch werden Effektivität und Produktivität des Klinikers gesteigert und Fehlerquellen ausgeschaltet.

Bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren werden der Puffer und der Harnstoff parallel und in Kombination eingesetzt. Durch diese Maßnahme wird das vorhandene Eiweiß durch Zusatz von Harnstoff löslich gemacht und somit sein Chromogenitätseffekt neutralisiert.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind zur Verjo deutlichung des Verfahrens nachstehend näher beschrieben.

Puffer: 800 ml destilliertes Wasser werden mit 9,8 g Propandiol, 5,3 g Natriumchlorid, 5,0 g Tetranatriumäthylendiamintetraacetat und 6,2 g Borsäure versetzt. Das Gemisch wird bis zum Erhalt einer klaren Lösung gerührt. Anschließend wird auf 11 mit Wasser aufgefüllt und der pH-Wert mit konzentrierter HCl oder 10 η Natriumhydroxid auf 9,0 ± 0,05 eingestellt.

Carbonatreagenz: 100 g wasserfreies Natriumcarbonat, 200 g Harnstoff und 5 g Tetranatriumäthylendiamintetraacetat werden unter Rühren in Wasser gegeben, wobei ein Endvolumen von 1 leingestellt wird.

Uricaseenzym: Spezifische Aktivität: 25 internationale Einheiten pro mg.

j-> Wolframatophosphorsäurereagenz: 40 g molybdänfreies Natnumwolframat werden in etwa 300 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Anschließend werden 32 ml einer 85%igen o-Phosphorsäure dazugegeben und wird unter mildem Rückfluß 2 h lang erhitzt. Anschließend wird auf Zimmertemperatur abgekühlt und mit destilliertem Wasser auf 1 1 aufgefüllt. Daraufhin werden in dem Reagenz unter Rühren 32 g Li₂SO₄ · H₂O gelöst.

Gepufferte Uricaselösung: Die vorstehend spezifizierte Uricase wird zu dem ebenfalls spezifizierten Puffer in einer Menge gegeben, daß die erhaltene Lösung 0,1 internationale Einheiten Uricase pro ml enthält.

Verfahren: Es werden zwei 12 X 75-mm-Teströhr^r)i) chen verwendet. Das eine wird als Testprobe, das andere als Blindprobe gekennzeichnet. In das als Blindprobe gekennzeichnete Röhrchen werden 0,2 ml gepufferter Uricaselösung gegeben. In das als Testprobe gezeichnete Röhrchen werden 0,2 ml Pufferlö- >^r> sung gegeben. Zu beiden Proberöhrchen werden je 0,1 ml Serum gegeben. Die Lösungen in den Proberöhrchen werden gut vermischt und 10 min lang bei 37 bis 45 ° C gereift. Jede der beiden Proben wird mit 1,0 ml Carbonatreagenz versetzt und wiederum gut w) durchmischt. Anschließend werden 1,0 ml Wolframatophosphorsäurereagenz zu jeder der Proben gefügt. Nach dem Mischen läßt man anschließend 5 min stehen und mißt dann die Absorption der Testprobe gegen die Absorption der Blindprobe bei 650 nm auf h^r) einem Spektrophotometer mit einer 1-cm-Küvette. Mit der gemessenen Absorption geht man dann in eine Eichkurve, die in der Weise aufgenommen wurde, daß man das vorstehend beschriebene Verfahren mit Lö-

sungen durchführte, die einen bekannten Harnsäuregehalt hatten.

Auf diese Weise stellt das Verfahren gemäß der Erfindung eine fortschrittliche und effektive Bestimmungsmethode für Harnsäure dar, bei der Uricase im Rahmen einer kolorimetrischen Bestimmung verwendet wird, wobei die Umstände und die Kosten der Eiweißfällung und anderer Vorbereitungsstufen sowie die anderen Nachteile der bekannten Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure vermieden werden.

Wie dem ausgeführten Beispiel für das Verfahren gemäß der Erfindung deutlich zu entnehmen ist, stellt dieses Verfahren eine äußerst einfache Bestimmungsmethode dar, die keine über das üblicherweise in Kliniklaboratorien vorhandene Gerät hinausgehende Ausrüstung erfordert und störend eingreifende Stoffe, wie beispielsweise Glutathion, Glucose, Ascorbinsäure, Coffein oder Phenole, nicht in die eigentliche Bestimmung mit einbezieht.

Die mit diesem Verfahren erreichte Kombination angestrebter Vorzüge, zu der die allgemeine Brauchbarkeit, die Genauigkeit, die Verläßlichkeit, die Kostenersparnis an Ausrüstung und Arbeitszeit sowie die Spezifität zählen, ist nach keinem der bekanntgewordenen Verfahren erreicht worden. Auf diese Weise wird erstmals ein praktikables Harnsäurebestimmungsverfahren vorgeschlagen, das Uricaseenzym verwendet und dennoch auf einer einfachen kolorimetrischen Harnsäurebestimmung beruht. Es versteht

sich dabei von selbst, daß die hier im Detail beschriebenen Ausführungsbeispiele vom Fachmann nach Kenntnisnahme der Beschreibung abgeändert werden können, ohne daß der Erfindungsgedanke durch solche Modifizierungen im Detail berührt wird. So sollte beispielsweise die spezifische Aktivität der verwendeten Uricase vorzugsweise so gewählt werden, daß der Anteil des in ihr enthaltenen Eiweißes nicht so hoch ist, daß er nur zu einer Absorption führt, die nicht größer als diejenige Absorption ist, die ein Milligramm Harnsäure in 100 mg Testprobenlösung verursacht. Andererseits sollte aber die Aktivität so gewählt werden, daß sie hoch genug ist, um die Harnsäure in der Blindprobe während der für die Reifung bzw. Inkubation der Proben gewählten Zeit vollkommen zu zerstören. Als allgemeine Regel kann dabei gelten, daß die höchste spezifische Aktivität des Enzyms, die im Rahmen der Wirtschaftlichkeit erhalten werden kann, auch die wünschenswerteste ist. Ferner kann die spektrophotometrische Beobachtung auch bei jeder beliebigen Wellenlänge im Bereich von 600 bis 800 nm durchgeführt werden. Ebenso kann das Verfahren und können die dazu erforderlichen und vorstehend beschriebenen Reagenzien auch in automatischen Bestimmungssystemen verwendet werden, wobei Standardverfahren und an sich bekannte Methoden zur Anpassung und Übertragung manueller Verfahren auf automatische Vorrichtungen verwendet werden können.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur quantitativen kolorimetrischen Harnsäurebestimmung in parallelen Test- und Blindproben unter Verwendung von Uricase in der Blindprobe und eines Puffers, der der Blindprobe und der Testprobe in gleicher Menge und Konzentration zugesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle einer Eiweißfällung der Blindprobe und der Testprobe zur Löslichmachung des Eiweißes Harnstoff zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer Borat ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Harnsäure kolorimetrisch durch ein Wolframatphosphat-Carbonat-Reagens bestimmt wird.