DE2256331A1 - Verfahren zur harnsaeurebestimmung - Google Patents

Description

PA TBNTAN WA'L· TB PATENTANWALTDIPL-INCR-MDLLEr-BDRNER PATENTANWALT DiPL-ING. HANS-H. WEY B E R LI N-DAHLEM 33 · PODBIELSKIAUEE Ä8 8 MO N C H E N 22 · Wl D EN MAYERSTRASS E TEL. 0311 - 762907 · TELEGR. PROPINDUS · TELEX 0184057 TEL. 0811 . 225585 · TELEGR. PRQPINDUS · TELEX 0524244

München, den 16. November 1972

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American'Monitor Corp., Indianapolis, Indiana / USA

Verfahren zur Harnsäurebestimmung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen kolorimetrischen Harnsäurebestimmung in parallelen Test- und Blindproben ohne Eiweissfällung unter Verwendung von Uricase.

Die quantitative Bestimmung der Harnsäure im Blutserum ist sowohl für diagnostische Zwecke als auch zur Beobachtung und Verfolgung des Verlaufs einer Reih© von Krankheiten und Krankneitszuständen unerlässlich«, Diese zen~ trale Bedeutung kommt der Harnsäure insbesondere als Abbauprodukt sowohl der aus der Kost stammenden Purine als auch der vom Körper synthetisierten Purine zu, Der gestände menschliche Körper, enthält etwa 1,1 g Harnsäure _g wobei -won

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dieser Menge nur rund 1/6 Im Blut vorliegt, während der Rest im Gewebe verteilt ist. Die quantitative Bestimmung dieser geringen im Blut vorkommenden Harnsäuremengen ist das spezielle Thema der vorliegenden Erfindung.

Aus dem Blut wird die Harnsäure durch die Nieren herausgefiltert, wobei normalerweise die Ausscheidung von Harnsäure im Urin 250 bis 750 mg pro 24 Stunden beträgt. Der Harnsäurespiegel des Urins ist insbesondere für die Diagnose und die Überwachung von Nierenkrankheiten von Bedeutung, da fast alle Nierenerkrankungen den Harnsäurespiegel . des Urins beeinflussen. So ist der Harnsäurespiegel im Urin als Index für die metabolisierte Purinmenge zu werten, wobei ein Vergleich des Harnsäurespiegeis im Blutserum und des Harnsäurespiegels im Urin wertvolle Information für die diagnostische Unterscheidung einer Reihe von Erkrankungen liefert, die entweder den Purinmetabolismus oder die Nierenfunktion in Mitleidenschaft ziehen.

Der normale Harnsäurespiegel im Blutserum beträgt weniger als 6,5 mg pro 100 ml Serum. Wie gering diese Konzentration der Harnsäure im Vergleich zur Konzentration anderer Körperstoffe ist, zeigt beispielsweise ein Vergleich mit den Glucosekonzentrationen, deren Bestimmung ebenfalls für diagnostische Zwecke herangezogen wird. Die Harnsäurekonzentration im Serum beträgt grössenordnungsmässig etwa nur 1/10 der Konzentration solcher anderen Körpersubstanzen_o

Bei Gichterkrankungen sind zwar die Mengen an Harnsäure im Vergleich zu nichterkrankten Personen im Blutsystem wesentlich höher, jedoch liegen auch diese erhöhten Konzentrationen noch kaum über dem Normalwert, wenn man diesen Absolutwerten das Gesamtvolumen des Blutes des Körpers

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gegenüberstellt. Bei Gichterkrankungen liegt die Harasäurekonzentration des Serums in der Regel etwa zwischen 6,5 und 10 mg pro 100"ml. Nicht selten wird der Erfolg einer Gichtbehandlung durch Messungen des Harnsäurespiegeis verfolgt, 'wobei bereits relativ kleine Änderungen des Spiegels über den Verlauf der Behandlung Aufschluss geben können. Von einer klinischen Verbesserung kann dabei schon bei nur geringen Abnahmen des Harnsäurespiegels gesprochen werden. Eine Erhöhung des Harnsäurespiegels im Serum tritt auch bei erhöhtem Metabolismus, der Nucleoproteine ein,' wie er beispielsweise bei Leukämie und Polycythämie zu beobachten ist. Auch aus dieser Sicht kommt der genauen Bestimmung des Harnsäurespiegeis im Serum eine zentrale diagnostische Bedeutung zu.

Die diagnostische Verwertbarkeit der HarhsäurebeStimmungen ist weiterhin durch die Tatsache bestimmt, dass erhöhte Harnsäurespiegel auch ein diagnostischer Befund bei idiopathischen Familienhyperuricaemien sind. Auch deuten erhöhte Harnsäurespiegel im Blutserum auf eine diagnostisch zu beachtende verminderte Nierenfunktion hin. Bei schwereren Nierenschädigungen wurden Harnsäurekonzentrationen im Blutserum bis zu 20 bis 35 mg pro 100 ml beobachtet. Wenn bereits bei den vorstehend beschriebenen Erkrankungen eine genaue Bestimmung der Harnsäure im Blutserum überaus wünschenswert ist, so ist eine überaus genaue Bestimmung der Harnsäurespiegel im Blut gerade für die Grenzfälle beginnender Beeinträchtigung der Nierenfunktion von ausschlaggebender Bedeutung, da hier die Spiegelveränderungen im Vergleich zu den normalen Blutspiegeln ausserordentlich gering ist.

So steht auf der einen Seite die nachdrückliche Forderung

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nach genauen und verlässlichen Bestimmungen des Harnsäurespiegels, und stehen auf der anderen Seite in der Praxis Bestimmungsverfahren zur Verfügung, die nicht ausschliessen können, dass auch andere Stoffe im Blutserum und im Urin fälschlicherweise als Harnsäure bestimmt werden können. Auf diese Weise kommen fehlerhaft überhöhte Harnsäurespiegelbestimmungen zustande, die zu falschen und nicht selten gefährlichen Therapien führen.

Wenn ein Patient beispielsweise einen hohen Ascorbinsäurespiegel im Serum aufweist, so wird man unter Verwendung der herkömmlichen Verfahren zur Bestimmung des Harnsäurespiegels ausserordentlich hohe Harnsäurespiegel feststellen. Um so gravierender wird dieses Problem, als auch wiederholt durchgeführte Kontrollbestimmungen stets zu den gleichen scheinbar hohen Harnsäurespiegeln führen. Neben solchen auch normalerweise im Serum vorkommenden Stoffen, die zu hohe Harnsäurespiegel vortäuschen können, gibt es jedoch in der Nahrung und in den vom Patienten eingenommenen Arzneimitteln eine Reihe von Stoffen, die ebenfalls eine Harnsäurebestimmung beeinflussen können. Zu solchen Stoffen gehören beispielsweise Coffein, das dem Körper aus den coffeinhaltigen Getränken zugeführt wird, und Gentisinsäure, die im Körper nach der Verabreichung von Aspirin gebildet wird. Auch in grösseren Mengen vom Patienten zu sich genommenes Vitamin C führt zu einer beträchtlichen Erhöhung des Ascorbinspiegels im Serum und kann ebenfalls zu hohe Harnsäurespiegel vortäuschen, wenn diese nach herkömmlichen Verfahren bestimmt werden.

In der Praxis werden dann in all diesen Fällen die routinemässig im Labor bestimmten Harnsäurespiegel des Blutserums oder des Urins aufgrund des Einflusses der vorgenannten

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Stoffe zu hoch ausfallen und dem behandelnden Arzt zu hoch berichtet werden, wobei es andererseits aber durchaus auch vorkommen kann, dass Patienten mit ausserordentlich geringen Spiegeln solcher sekundär beeinflussender Substanzen, aber einem zu hohen Harnsäurespiegel, als scheinbar vollständig gesund angesehen werden, da die Bestimmung des Harnsäurespiegels, die die Bestimmung ^der anderen, im angenommenen Fall ausserordentlich niedrigen Werte miterfasst, in einen scheinbar durchaus normalen Rahmen fällt, wie er aufgrund der Erfahrungen mit der Bestimmungsmethode in der Regel angetroffen wird. Auf diese Weise können bereits bestehende Krankheiten lange Zeit diagnostisch unentdeckt bleiben« ·

In dem Bericht von OFFER, Centr. Physiol. 8:801 (1894), zitiert in R.J. HENRY, MeD., Clinical Chemistry Principles and Techniques, Harper & Row (1967) S. 276, wird mitgeteilt, dass Harnsäure in alkalischen Lösungen mii|iolframatophosphorsäure eine blaue Färbung bzw* blaue Chromophore bildet. Die direkte Anwendung der Wolframatophosphorsäurereaktion auf Urin und proteinfreie Filtrate wurde von S.R. BENEDICT, J. Biol. Chern, 51:187 (1922), zitiert in HENRY, I.e., S. 276, eingeführt und von 0. FOLIN, J₀ Biol. Chem. 86:179 (1930), zitiert in HENRY, I.e. S. 276, modifizierte Spätere Modifizierungen dieser Verfahren hatten eine Verbesserung der Linearität und eine Unterdrückung der Trübung zum Ziel. Allen, auch den modifizierten Verfahren haftet als wesentlicher Nachteil jedoch ihre zu geringe Spezifizität bei der Harnsäurebestimmung an, da andere Stoffe oder Chromogene als Harnsäure, die ebenfalls im Serum auftreten, die blaue Färbung verursachen und damit irrtümlich als Harnsäure angesehen und bestimmt werden. Zu diesen Stoffen gehören u.a.-beispielsweise· Ergothionein, Glutathion, Ascorbinsäure, Glucose, Tyrosin,

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Tryptophan, Cystin, Cystein, Coffein, Gentisinsäure sowie eine Reihe phenolischer Verbindungen, Ausserdem ist zur Durchführung der bekannten Verfahren stets eine Eiweissfällung und ein Abtrennen des gefällten Eiweisses erforderlich, um eine Chromophorenbildung aus dem Protein selbst und damit grobe Fehlbestimmungen zu verhindern. Ausserdem ist die Entfernung von Eiweiss aus den zu untersuchenden Proben erforderlich, um eine Eintrübung der Proben durch Wechselwirkungen des Proteins mit den benutzten Reagenzien zu verhindern. Die dafür erforderlichen Handhabungen verlängern die Dauer der durchgeführten Bestimmung.

Um die Spezifizität der Bestimmungen auf Harnsäure im Blut zu erhöhen, führten H.A. BULGER und H.E. JOHNS, J. Biol. Chem. 140:427 (1941), zitiert in HENRY, I.e., S. 277, die Verwendung des ausserordentlich spezifischen Enzyms Uricase ein, durch das die Harnsäure im Serum oder im Urin spezifisch zerstört wird. Die frühen Verfahren bestanden darin, dass man das Eiweiss fällte, und zwar sowohl in einer Testprobe als auch in einer Blindprobe, anschliessend in beiden Proben die übliche Farbreaktion durchführte, wobei man in der Testprobe die Harnsäure durch Uricase zerstörte. Aus der Differenz beider Farbmessungen wurde die Harnsäurekonzentration berechnet.

Die bald einsetzende Kritik an diesen Verfahren, die die Uricase-Methode mit der Farbreaktion in Kombination verwendeten, führte dann aber praktisch zur vollständigen Aufgabe dieser kombinierten kolorimetrisehen Bestimmungen.

In dem Standardlehrbuch der klinischen Chemie von HENRY, I.e., S. 277 ff., wird diese Kritik aufgenommen, bestätigt

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und bekräftigtj was endgültig' zur Folge hatte, dass die Uricase-Verfahren im Rahmen der kolorimetrisehen Bestimmungsverfahren als unzuverlässig verworfen wurden.

Unter den vorerwähnten Kritikern befanden sich beispielsweise EoJ. BIEN und W. TROLL, Proc. Soc. Exp. Biol. Med« 73:370 (1950), zitiert in HENRY, l.o_o, S. 278, die die nicht ausreichende Berücksichtigung des Glucoseeinflusses geltend machten,und T_eF. YU und A₀B. GUTMAN, Federation Proc, 8:267 (1949), zitiert in HENRY, I.e., S. 278, die insbesondere die Nichtbeachtung des Einflusses der Gentisinsäure betonten. Diese gesamte Kritik wurde im Jahre 1964 von der anerkannten Autorität HENRY aufgenommen, geprüft und bestätigt und bekräftigt.

So heisst· es beispielsweise bei HENRY im Zusammenhang der Zitierung von BIEN und des Kommentars zum Glucoseeffekt, dass "die hohe Speziflzität eines Enzyms leicht zu falschen Vorstellungen über die Verlässlichkeit solcher Verfahren führen kann, wofür Berichte als Beweis stehen können, dass Glucose in Gegenwart von Harnsäure Wolframatoarsenato-phosphorsäure weit stärker verringert als wenn sie allein vorliegt."

Mit anderen Worten heisst das also, dass man auch in den Fällen, in denen man annehmen könnte, dass der Glucoseeinfluss vernachlässigt werden könnte, da er sowohl in der mit Uricase behandelten Probe als auch in der nicht mit Uricase behandelten Blindprobe gleich sein sollte, sich auf die Spezifität der Uricase nicht vollständig verlassen kann_o Der als anerkannte Autorität geltende HENRY lehrt ausdrücklich, dass die Glucose in den nicht mit Uricase behandelten Proben anders reagiert als in den

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mit Uricase behandelten Proben. Die Schlussfolgerung, die HENRY aus diesem Befund zieht, lautet, dass diese Bestimmungsverfahren und Tests nicht die erwartete Genauigkeit aufweisen und man daher auch keine verlässlichen Ergebnisse von ihnen erwarten könne.

Weiterhin zitiert HENRY die Ergebnisse von YU et al. und versichert, dass "die Gentisinsäure, ein metabolisches Abbauprodukt der Acetylsalicylsäure, in der Wolframatoarsenato-phosphorsäure-Cyanid-Reaktion ebenfalls mit reagiert und in dem alkalischen Medium, das bei der Uricasebehandlung eingestellt wird, zerstört wird." HENRY lehrt auf diese Weise also ausdrücklich und in einer Weise, wie sie seiner Kritik an der Unzuverlässigkeit des Uricaseverfahrens aufgrund des Glucoseeinflusses entspricht, dass der Einfluss der Gentisinsäure nicht vernachlässigt werden kann und dass man aus diesem Grund, bzw. aus diesem weiteren Grund, von dem Verfahren keine Genauigkeit und Verlässlichkeit erwarten kann.

Durch diese Art der Berichte ist die Kombination der Uricaseverfahren mit den kolorimetrischen Verfahren praktisch vollständig ausser Gebrauch gekommen.

Demzufolge führte H.M. KALCKAR, J. Biol. Chem. 167:429 (1947), zitiert in HENRY, I.e., S. 278, ein Verfahren auf der Grundlage der Uricase-Enzymreaktion ein, das sich zur Bestimmung der Harnsäure der Anwendung der differenziellen Spektrophotometrie bediente. Bei dieser Bestimmung wird von der Tatsache Gebrauch gemacht, dass die Harnsäure ein Absorptionsmaximum im Bereich von 290 bis 293 nm hat, während die Probe nach. Zerstörung der Harnsäure durch die Uricase in diesem Bereich kein Absorptionsmaximum zeigt. Dieses

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; " 225633T

Verfahren ist zwar für die Harnsäure relativ spezifisch, hat jedoch insofern praktische und wirtschaftliche Nachteile, da es zu seiner Durchführung spezielle UV-Instrumente und im UV nicht absorbierende Gefässe, beispielsweise aus Quarz, zur Durchführung der Messungen erfordert. Dieses Verfahren hat sich daher für die Routinebestimmungen in den Laboratorien der Krankenhäuser nicht durchsetzen können. "

Zusammenfassend muss also festgestellt -werden, dass sich die Verwendung des Enzyms Uricase zur Harnsäurebestimmung nicht hat durchsetzen können, und zwar sowohl nicht in Verwendung mit, den UV-Messungen als auch nicht in Verbindung mit den üblichen kolorimetrischen Messungen, da diese Verfahren entweder nach herrschender Lehrmeinung unzuverlässig oder für die Praxis zu unhandlich sind*

Ferner musste bei den Verfahren nach dem Stand ässr Technik, bei dem die Uricase in Kombination mit der üblichen WoI-framato-phosphorsäure-Farbreaktion durchgeführt wurde, stets die Ausfällung und Entfernung des Eiweisses vorgeschaltet werden, so dass diese Verfahren, wo sie beibehalten wurden, im Endeffekt nur komplizierter als die üblichen Methoden waren.

Diese Umstände haben schliesslich dazu geführt, dass Verfahren auf der Grundlage der WOs-¹Iframato-phosphorsäure- ; Reaktion, wie beispielsweise das FOLIN-Verfahren und seine Modifizierungen, unter Ausschluss der Enzymbehandlung noch heute weit verbreitet sind, und zwar trotz der bekannten Tatsache, dass sie aufgrund der oben erörterten Einflüsse in hohem Mass« fehleranfällig sind«,

Darüber hinaus sind eine Reihe weiterer Verfahren, bekannt

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geworden, die zwar die erforderliche Spezifität erreichten, dabei aber auf eine Behandlung mit Uricase verzichten mussten und sich schliesslich auch in der Praxis nicht durchsetzen konnten» Bei diesen Verfahren sind u.a. eine Reihe anderer Farbreagenzien, eine Vorbehandlung der Probe mit stark alkalischen Reagenzien und eine vorläufige Isolierung der Harnsäure auf Ionenaustauschersäulen versucht worden.

Aufgabe der Erfindung ist es dementsprechend, ein praktisches, verlässliches, genaues, schnelles und einfaches Verfahren zur Bestimmung von Harnsäurespiegeln, d.h. zur Bestimmung von Harnsäurekonzentrationen anzugeben, bei dem die vorstehend geschilderten Nachteile der bekannten Verfahren vermieden werden können und gleichzeitig nicht auf die Verwendung von Uricase verzichtet zu werden braucht.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäss ein Verfahren zur quantitativen kolorimetrischen Harnsäurebestimmung in parallelen Test- und Blindproben ohne eine zuvor erforderliche Eiweissfällung und unter Verwendung von Uricase vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Testprobe Puffer in der gleichen Menge und Konzentration wie der Blindprobe zur Suspendierung der Uricase zugesetzt wird.

Das Serum wird also in einer Blindprobe bzw. Leerprobe des Serums mit einem Puffer versetzt, der das Enzym Uricase enthält, und wird in einer Testprobe des Serums mit dem gleichen Puffer versetzt, wobei der Puffer jedoch keine Uricase enthält. Anschliessend wird dann die Farbreaktion zur Ausbildung der Farbe von der Harnsäure durchgeführt, die in der Testprobe verblieben ist. Eingreifende Substanzen, wie beispielsweise Glutathion, Glucose, Ascorbin-

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säure, Coffein oder Phenole, die in die meisten farbbildenden Reaktionen eingreifen, bilden unter diesen Bedingungen sowohl in der Testprobe als auch in der Blindprobe Farbanteile und ihr Einfluss wird so durch Subtraktion bzw. Subtraktion ihrer effektiven Anteile ausgeschaltet, so dass eine spezifische Bestimmungsmethode für die Harnsäure selbst auf diese Weise erhalten wird.

Ausserdem wird bei dem Verfahren gemäss der Erfindung die mühsame Stufe der Eiweissentfernung ausgelassen, die für die Durchführung der Verfahren nach dem Stand der Technik erforderlich war, da die Eiweissanteile ebenfalls Farbanteile lieferten, die fälschlicherweise ebenfalls auf die Harnsäure rückbezogen wurden,und da die Eiweissanteile ferner zu Trübungen führten, die eine genaue spektrophotometrische Messung unmöglich machten. Die Trübung, die in den Verfahren nach dem Stand der Technik durch Eiweissentfernung ausgeschaltet wurde, wird bei dem Verfahren gemäss der Erfindung durch die Verwendung von Harnstoff eliminiert. Ausserdem wird der Proteinanteil an der gemessenen Farbe noch dadurch korrigiert, dass er in der Testprobe und in der Blindprobe gleichermassen berücksichtigt wird. In Abwesenheit von Harnstoff im Reagenz führt der Zusatz der Reagenzien zu der zu untersuchenden Probe zu starken Trübungen.

Zufolge der Lehre nach dem Stand der Technik führt Glucose, die stets im Serum vorliegt, in Gegenwart von Harnsäure in wesentlich stärkerem Ausmass zu einer Reduktion des die Farbe erzeugenden Wolframatophosphats,als wenn die Glucose allein, d.h. in Abwesenheit von Harnsäure, vorliegt. Man sollte also erwarten, dass nach der Zerstörung der Harnsäure, die gemäss der Erfindung durch die Uricase in der Blindprobe vorgenommen wird, die mit dem Serum eingeführte

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Glucose in der Blindprobe die Wolframatophosphorsäure weniger stark reduziert und damit vermindert als in der Testprobe, in der die Glucose in Gegenwart der Harnsäure vorliegt. Es wäre also anzunehmen, dass die Glucose bei der Kombination der Uricasebehandlung mit der Wolframatophosphatreaktion in das Bestimmungsergebnis eingreift und auf diese Art und Weise jeden Versuch zunichte machen müsste, die Uricase zur Erzielung einer Spezifität der Harnsäurebestimmung heranzuziehen, wenn es nicht gelänge, die Glucose sowohl aus der Testprobe als auch aus der Blindprobe zu entfernen. Dem Stand der Technik zufolge ist zu erwarten, dass bei Entfernung der Harnsäure eine entsprechende und entgegengesetzte Zunahme des Glucoseeinflusses in der Vergleichsprobe bzw» in der Probe, die die Harnsäure enthält, im Vergleich zu der Probe, in der die Harnsäure zerstört wurde, auftreten sollte.

Entsprechend den oben genannten Ausführungen von HENRY unter Bezugnahme auf die Untersuchungen von BIEN wäre zu erwarten, dass die Harnsäure die farbbildende Eigenschaft der Glucose unterstützt und dass die Entfernung der Harnsäure durch Uricase oder andere Mittel, ja durch Verfahren, an die derzeit noch nicht gedacht ist, zu einer Herabsetzung des auf die Glucose zurückzuführenden Färbungsanteils führt.

Im Verfahren gemäss der Erfindung wird das Serum jedoch in der Testprobe mit dem Puffer behandelt, der zur Suspendierung der Uricase, die in der Blindprobe verwendet wird, erforderlich ist; die Glucose reduziert und vermindert damit das Wo1framatophosphat sowohl in der Testprobe als auch in der Blindprobe in gleichem Mass und verursacht daher bei allen in den zu bestimmenden Seren angetrof-

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fenen Glucosespiegeln keinerlei Verfahrensstörende Beeinflussungen, und zwar selbst dann nicht, wenn es sich um hohe Glucosespiegel handelt, wie sie in pathologischen Seren anzutreffen sind«,

Darüber hinaus wird durch den Zusatz des Puffers sowohl zur Testprobe als auch zur Blindprobe der zu Fehlern führende Einfluss der Gentisinsäure ausgeschaltet, der bei den Versuchen der Durchführung von Uricasebestimmungsverfahren nach dem Stand der Technik immer wieder kritisiert wurde, wie beispielsweise vorstehend mit dem Zitat nach HENRY belegt wurde. Durch die gleiche Pufferzugabe wird sowohl in der Testprobe als auch in der Blindprobe der Gentisinsäureeinfluss gleich gehalten.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind zur Verdeutlichung des Verfahrens nachstehend näher beschrieben»

Puffer; 800 ml destilliertes Wasser werden mit 9*8 -g Propandiol, 5,3 g Natriumchlorid, 5,0 g Tetranatriumäthylendiamintetraacetat und 6,2 g Borsäure versetzt» Das Gemisch wird bis zum Erhalt einer klaren Lösung gerührt. Anschliessend wird auf 1 1 mit Wasser aufgefüllt und der pH-Wert mit konzentrierter HCl oder 10 η Natriumhydroxid auf 9,0 + 0,05 eingestellt«,

Carbonatreagenz; 100 g wasserfreies Natriumcarbonat, 200 g Harnstoff und 5 g Tetranatriumäthylendiamintetraacetat werden unter Rühren in Wasser gegeben, wobei ein Endvolumen von 1 1 eingestellt wirdi

Uricaseenzym: Spezifische Aktivität: 25 internationale Einheiten pro mg.

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Wolframatophosphorsäurereagenz; 40 g molybdänfreies Natriumwolframat werden in etwa 300 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Anschliessend werden 32 ml einer 85 %igen o-Phosphorsäure dazu gegeben und wird unter mildem Rückfluss 2 h lang erhitzt. Anschliessend wird auf Zimmertem-. peratur abgekühlt und mit destilliertem Wasser auf 1 1 aufgefüllt. Daraufhin werden in dem Reagenz unter Rühren 32 g Li₂SO^H₂O gelöst.

Gepufferte Uricaselösung: Die vorstehend spezifizierte Uricase wird zu dem ebenfalls spezifizierten Puffer in einer Menge gegeben, dass die erhaltene Lösung 0,1 internationale Einheiten Uricase pro ml enthält.

Verfahrenι Es werden zwei 12 χ 75 mm-Teströhrchen verwendet. Das eine wird als Testprobe, das andere als Blindprobe gekennzeichnet. In das als Blindprobe gekennzeichnete Röhrchen werden 0,2 ml gepufferter Uricaselösung gegeben. In das als Testprobe gezeichnete Röhrchen werden 0,2 ml Pufferlösung gegeben. Zu beiden Proberöhrchen werden je 0,1 ml Serum gegeben. Die Lösungen in den Proberöhrchen werden gut vermischt und 10 min lang bei 37 bis 45 ⁰C gereift. Jede der beiden Proben wird mit 1,0 ml Carbonatreagenz versetzt und wiederum gut durchmischt. Anschliessend werden 1,0 ml Wolframatophosphorsäurereagenz zu jeder der Proben gefügt. Nach dem Mischen lässt man anschliessend 5 min stehen und misst dann die Absorption der Testprobe gegen die Absorption der Blindprobe bei 650 nm auf einem Spektrophotometer mit einer 1 cm-Küvette. Mit der gemessenen Absorption geht man dann in eine Eichkurve, die in der Weise aufgenommen wurde, dass man das vorstehend beschriebene Verfahren mit Lösungen durchführte, die einen bekannten Harnsäuregehalt

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hatten.

Auf diese Weise stellt das Verfahren gemäss der Erfindung eine fortschrittliche und effektive Bestimmungsmethode für Harnsäure dar, bei der Uricase im Rahmen einer kolorimetrischen Bestimmung verwendet wird, wobei die Umstände und die Kosten der Eiweissfällung und anderer Vorbereitungsstufen sowie die anderen Nachteile der bekannten Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure vermieden werden«.

Wie dem ausgeführten Beispiel für das Verfahren gemäss der Erfindung deutlich zu entnehmen ist, stellt dieses Verfahren eine äusserst einfache Bestimmungsmethode dar, die keineüber das üblicherweise in Kliniklaboratorien vorhandene Gerät hinausgehende Ausrüstung erfordert und störend eingreifende Stoffe, wie beispielsweise Glutathion, Glucose, Ascorbinsäure, Coffein oder Phenole, nicht in die eigentliche Bestimmung mit einbezieht.

Die mit diesem Verfahren erreichte Kombination angestrebter Vorzüge, zu der die allgemeine Brauchbarkeit, die Genauigkeitj die Verlässlichkeit, die Kostenersparnis an Ausrüstung und Arbeitszeit sowie die Spezifität zählen, ist nach keinem der bekannt gewordenen Verfahren erreicht worden. Auf diese Weise wird erstmals ein praktikables Harnsäurebestimmungsverfahren vorgeschlagen, das Uricaseenzym verwendet und dennoch auf einer einfachen kolorimetrischen Harnsäurebestimmung beruht» Es versteht sich dabei von selbst, dass die hier im Detail beschriebenen Ausführungsbeispiele vom Fachmann nach Kenntnisnahme der Beschreibung abgeändert werden können, ohne dass der Erfindungsgedanke durch solche Modifizierungen im Detail berührt

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wird» So sollte beispielsweise die spezifische Aktivität der verwendeten Uricase vorzugsweise so gewählt werden, dass der Anteil des in ihr enthaltenen Eiweisses nicht so hoch ist, dass er nur zu einer Absorption führt, die nicht grosser als diejenige Absorption ist, die ein Milligramm Harnsäure in 100 mg Testprobenlösung verursacht. Andererseits sollte aber die Aktivität so gewählt werden, dass sie hoch genug ist, um die Harnsäure in der Blindprobe während der für die Reifung bzw. Inkubation der Proben gewählten Zeit vollkommen zu zerstören. Als allgemeine Regel kann dabei gelten, dass die höchste spezifische Aktivität des Enzyms,die im Rahmen der Wirtschaftlichkeit erhalten werden kann, auch die wünschenswerteste ist. Ferner kann die spektrophotometrische Beobachtung auch bei jeder beliebigen Wellenlänge im Bereich von 600 bis 800 nm durchgeführt werden. Ebenso kann das Verfahren und können die dazu erforderlichen und vorstehend beschriebenen Reagenzien auch in automatischen Bestimmungssystemen verwendet werden, wobei Standardverfahren und an sich bekannte Methoden zur Anpassung und Übertragung manueller Verfahren auf automatische Vorrichtungen verwendet werden können.

Patentansprüche

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Claims (4)

1. Patentansprüche

   Verfahren zur quantitativen kolorimetrisehen Harnsäurebestimmung in parallelen Test- "und Blindproben ohne . Eiweissfällung unter Verwendung von Uricase, dadurch gekennzeichnet, dass der Testprobe Puffer in gleicher Menge und Konzentration wie der Blindprobe zur Suspendierung der Uricase zugesetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch'gekennzeichnet, dass den Test- und Blindproben Harnstoff zugesetzt wird»
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dem Puffer Borat zugesetzt wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass die Färbung durch ein Wolframatphosphat-Carbonat-Reagenz erzeugt wird.

   JR/er

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