DE2212739A1

DE2212739A1 - Vaccine for immunization against dental caries

Info

Publication number: DE2212739A1
Application number: DE19722212739
Authority: DE
Inventors: Kestenbaum Richard Charles; Abdul Gaffar
Original assignee: Colgate Palmolive Co
Current assignee: Colgate Palmolive Co
Priority date: 1971-03-22
Filing date: 1972-03-16
Publication date: 1972-10-05
Also published as: CA990646A; ES400957A1; BE781047A; FR2130412B1; GB1343755A; CH562879A5; AT320848B; AU3998872A; JPS5549571B1; ZA721479B; AU464116B2; FR2130412A1

Description

Colgate Palmolive CompanyColgate Palmolive Company

300 Park Avenue300 Park Avenue

New York N.Y./V.St.A.New York N.Y./V.St.A.

(prio 22. 3. 71 US 126 933-9078) (prio 22.371 US 126 933-9078)

Hamburg, 14. März 1972Hamburg, March 14, 1972

Vaccine zur Immunisation gegen ZahncariesVaccine for immunization against dental caries

Die Erfindung betrifft Vaccine zur Immunisation gegen Zahncaries. The invention relates to vaccines for immunization against dental caries.

Seit ungefähr 10 Jahren ist bekannt, daß die Bildung von Zahncaries auf einem Zusammenwirken von Kohlehydraten, insbesondere Saccharose und spezifischen Bakterien an den Zahnoberflächen beruht. Eine ganze Reihe von Keimen haben sich als Ursache dieser Infektionskrankheit nachweisen lassen,For about 10 years it has been known that the formation of dental caries is due to an interaction of carbohydrates, in particular Sucrose and specific bacteria are based on the tooth surfaces. Quite a number of germs have emerged prove to be the cause of this infectious disease,

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und zwar insbesondere Streptococcen. Zahlreiche Streptococcen sind aus der Mundhöhle isoliert worden und haben nachweislich im Tierexperiment Zahncaries verursacht.and in particular streptococci. Numerous streptococci have been isolated from the oral cavity and have been shown to have caused dental caries in animal experiments.

Schon im Verlauf dieser Forschungen ist versucht worden, auf immunologischem Wege die Bildung von Zahncaries zu verhindern; allerdings ist bisher kein geeignetes Verfahren gefunden worden. So hat beispielsweise M. Wagner, Dissertation 1966, Purdue University, die Immunisation von keimfrei aufgezogenen Ratten gegen Zahncaries mit einer aus einem Stamm von Streptococcus faecalis gewonnenen Vaccine durchgeführt. W.H. Bowen berichtete im Jahre i960 in J. Br. Dent. Res., Band 129, S. I59-I6O» über die Verwendung von Dextran bildenden, Caries verursachenden^lebensfähigen Keimen zur Immunisation von Affen gegen Zahncaries. Die verwendeten Keime entstammten einem Stamm von Streptococcus mutans; dies ist einer von zwei Bakterienarten, die häufig als wesentlichste Keime bei der Entstehung der Zahncaries angesehen werden. Der andere Keim ist ein Streptococcenstamm, der als Streptococcus, Stamm SS2,bezeichnet wird und von Gibbons und Banghart isoliert und im Archives of Oral Biology, 1967, Band 12, S. 11 bis 21, beschrieben wurde. Dieser Stamm ist von zahlreichen Laboratorien in den Vereinigten Staaten, und zwar insbesondere vom Forsyth Dental Center, Boston, Massachusetts, erhältlich. DieserEven in the course of this research, attempts were made to prevent the formation of dental caries by immunological means; however, no suitable method has yet been found. For example, M. Wagner, PhD thesis 1966, Purdue University, the immunization of aseptically raised Rats were carried out against dental caries with a vaccine obtained from a strain of Streptococcus faecalis. W.H. Bowen reported in J. Br. Dent. Res., Vol. 129, pp. 159-160 on the use of dextran-forming caries causing ^ viable germs for the immunization of monkeys against dental caries. The germs used came from a strain of Streptococcus mutans; this is one of two types of bacteria which are often regarded as the most important germs in the development of dental caries. The other germ is a strain of streptococci referred to as Streptococcus, strain SS2 and isolated by Gibbons and Banghart and described in Archives of Oral Biology, 1967, Volume 12, pp. 11-21 became. This strain is from numerous laboratories in the United States, and most notably from Forsyth Dental Center, Boston, Massachusetts. This

Stamm ist allerdings auch ohne Schwierigkeiten aus der Mund-However, the trunk can also be removed from the mouth without difficulty.

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höhle, und zwar insbesondere von durch Caries befallenen Zähnen, in an sich bekannter Weise zu isolieren.Cave, in particular of teeth affected by caries, to be isolated in a manner known per se.

Streptococcus mutans und Streptococcus, Stamm SS2, unterscheiden sich deutlich voneinander. Einer dieser Unterschiede wird im physiologischen Verhalten dieser Keime in Gegenwart von Saccharose deutlich. Sowohl Streptococcus mutans als auch Streptococcus, Stamm SS2, bilden bei Kultur in Gegenwart von Saccharose extrazellulare, klebrige, gummiähnliche Polysaccharide. Die gebildeten Polysaccharide unterscheiden sich jedoch bei den beiden Keimen, abgesehen davon, daß sie dadurch in die Bildung von Plague verwickelt sind, womit die Cariesentwicklung anfängt. Streptococcus mutans bildet überwiegend ein Dextranpolysaccharid, während Streptococcus, Stamm SS2, überwiegend ein Fructosanpolysaccharid bildet.Differentiate between Streptococcus mutans and Streptococcus, strain SS2 clearly from each other. One of these differences is in the physiological behavior of these germs in the presence of sucrose clearly. Both Streptococcus mutans and Streptococcus strain SS2 produce when grown in the presence of sucrose extracellular, sticky, rubber-like polysaccharides. The polysaccharides formed differ however, with the two germs, apart from the fact that they are thereby involved in the formation of Plague, with which the development of caries begins. Streptococcus mutans predominantly forms a dextran polysaccharide, while Streptococcus, Strain SS2, predominantly forming a fructosan polysaccharide.

überraschenderweise wurde jetzt festgestellt, daß die von Streptococcen, und insbesondere Streptococcus, Stamm SS2, gebildeten Polyfructosane hervorragende Immunisierungseigenschaften gegen Zahncaries aufweisen.Surprisingly, it has now been found that the Streptococci, and in particular Streptococcus, strain SS2, polyfructosans produced excellent immunization properties against dental caries.

Erfindungsgemäß werden also Vaccine zur Immunisation gegen Zahncaries vorgeschlagen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie in einem flüssigen Träger ein bei der anäroben Kultur eines Polyfructosane bildenden Stammes des Genus Strep-According to the invention, vaccines are used for immunization against Dental caries which are characterized in that they are present in a liquid carrier during anaerobic culture of a polyfructosane-forming strain of the genus Strep-

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tococcus gebildetes Polyfructosan enthalten.tococcus contain polyfructosan formed.

Bei Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Vaccine bilden sich immunisierende Antikörper gegen die ursächlich wirksamen Streptococcen, womit eine Abnahme der Cariesbildung verknüpft ist. Der genaue Wirkungsmechanismus zwischen Antikörpern und den Schadkeimen ist nicht bekannt. Auf jeden Fall läßt sich eine bedeutsame Minderung der Cariesbildung feststellen.When using the vaccines produced according to the invention, immunizing antibodies are formed against the causally active streptococci, which is associated with a decrease in the formation of caries. The exact mechanism of action between antibodies and the harmful germs is not known. In any case, a significant reduction in caries formation can be determined.

Erfindungsgemäß wird ein Polyfructosane bildender Stamm von Streptococcen, und zwar insbesondere Streptococcus, Stamm SS2, zur Bildung der extrazellulären Polyfructosane kultiviert. Die Keime werden anärob in einem Nährmedium mit Gehalt an Saccharose solange kultiviert, bis sich ©ine ausreichende Menge an extrazellulären Polyfructosanen bilden kann.According to the invention, a polyfructosane-forming strain of Streptococci, in particular Streptococcus, strain SS2, cultivated for the formation of the extracellular polyfructosans. The germs become anaerobic in a nutrient medium with content Cultivated on sucrose until a sufficient amount of extracellular polyfructosans can be formed.

Als Nährmedium für Streptococcus, Stamm SS2, wird ein Nährmedium mit Gehalt an Saccharose als Kohlenstoffquelle verwendet, wobei andere Kohlenstoffquellen vorzugsweise auf ein Minimum reduziert werden sollten. Der Gehalt an Saccharose beträgt zwischen 2 bis 16 und vorzugsweise 5 bis 8 Gew.%, bezogen auf das Gesamtmedium. Außerdem enthält das Kulturmedium eine geeignete Stickstoffquelle, wie beispielsweise Peptone, Fleischextrakt, Hefeextrakt oder Sojaextrakt. Als anorganische Std ckstoffquellen können beispi elswei se Ammonduin- As a nutrient medium for Streptococcus, strain SS2, a nutrient medium containing sucrose as a carbon source is used, other carbon sources preferably being reduced to a minimum. The sucrose content is between 2 and 16 and preferably between 5 and 8% by weight , based on the total medium. In addition, the culture medium contains a suitable nitrogen source, such as peptones, meat extract, yeast extract or soy extract. Ammonduin-

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sulfat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumnitrat verwendet werden. Außerdem enthält das Nährmedium anorganische Salze, wie Phosphate , Magnesiumsalze, wie Magnesiumsulfat, Metallionen, wie Eisen, Natrium, Kalium, Mangan, Zink und Calcium und Anionen, wie beispielsweise Chlorid und Nitrat. Andere gegebenenfalls für dasWachstum von Streptococcen notwendige .Nährsubstanzen werden, wie üblich, angewendet.sulfate, ammonium chloride or ammonium nitrate can be used. In addition, the nutrient medium contains inorganic salts such as phosphates, magnesium salts such as magnesium sulfate, metal ions such as Iron, sodium, potassium, manganese, zinc and calcium and anions such as chloride and nitrate. Others if necessary Nutrients necessary for the growth of streptococci are used as usual.

Die Kultur wird in üblicher Weise unter anäroben Bedingungen durchgeführt. Die Bebrütungstemperatur beträgt 35 bis 38⁰C und vorzugsweise 37°C, der pH-Wert des Mediums beträgt 6,8 bis 7,4 und vorzugsweise 7»0 bis 7»2. Die Bebrütungszeit beträgt meist 12 bis 72 und vorzugsweise 2¹J bis 48 Stunden; in dieser Zeitspanne bilden sich ausreichende Mengen extrazellulärer Polyfructosane im Kulturmedium.The culture is carried out in the usual manner under anaerobic conditions. The incubation temperature is 35 to 38 ⁰ C and preferably 37 ° C, the pH of the medium is 6.8 to 7.4, and preferably 7 "0 to 7". 2 The incubation is usually 12 to 72 and preferably 2 ¹ J to 48 hours; During this period, sufficient amounts of extracellular polyfructosans are formed in the culture medium.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vaccine können die Polyfructosane in Form des Kulturmediums, vorzugsweise nach Entfernung der gegebenenfalls abgetöteten Keime, verwendet werden. In bevorzugten Ausfürhungsformen werden die Polyfructosane jedoch isoliert gereinigt und in verhältnismäßig reiner Form in den Vaccinen verwendet. Die Polyfructosane können in an sich bekannter Weise aus dem Kulturmedium gewonnen werden. Als besonders günstig hat sich die Ausfällung der Polyfructosane aus den zellfreien Mutterlaugen des Kulturmediums durch ZugabeThe polyfructosans can be used to produce the vaccines according to the invention in the form of the culture medium, preferably after removal any germs that have been killed can be used. In preferred embodiments, however, the polyfructosans are isolated cleaned and used in the vaccines in a relatively pure form. The polyfructosans can in itself can be obtained from the culture medium in a known manner. The precipitation of the polyfructosans has proven to be particularly favorable from the cell-free mother liquors of the culture medium by adding

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Alcanolen, wie beispielsweise Äthanol, erwiesen. Im allgemeinen werden 1,5 bis 2 Volumen Äthanol eingesetzt. Anschließend werden vorzugsweise, wenn auch nicht notwendigerweise, die niedrigmolekulare Fraktion der Polyfructosane, durch Dialyse oder in anderer an sich bekannter Weise, entfernt. Die Polyfructosane haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 16 bis 23 Millionen, nur etwa 0,25 bis 0,5 55 weisen ein niedriges Molekulargewicht von etwa 2000 bis 5000 auf, und diese Fraktion wird vorzugsweise durch Dialyse entfernt.Alcanols, such as ethanol, proved. In general, 1.5 to 2 volumes of ethanol are used. Afterward are preferably, although not necessarily, the low molecular weight fraction of the polyfructosans, by dialysis or in another known manner. The polyfructosans generally have a molecular weight of about 16 to 23 million, only about 0.25 to 0.5 55 have one low molecular weight of about 2000 to 5000, and this fraction is preferably removed by dialysis.

Anschließend an die Dialyse wird vorzugsweise jegliches Protein aus den Polyfructosanen entfernt. Die Abtrennung der Proteine kann nach verschiedenen an sich bekannten Methoden erfolgen, besonders günstig hat sich das Verfahren von Sevag et al, Journal of Biological Chemistry, Band 12*1, SS. 425 bis ^35, (1938) erwiesen. Gemäß dieser Vorschrift werden Chloroform und Butanol oder ein anderes Alcanol, wie Isopropanol oder Hexanol, zum Auflösen des Proteins eingesetzt. Das gereinigte Polyfructosan kann dann beispielsweise mit Äthanol ausgefällt, gewaschen und getrocknet werden.Subsequent to dialysis, any protein is preferably removed from the polyfructosans. The separation of proteins can be carried out by various methods known per se, the method of Sevag et al, Journal of Biological Chemistry, Volume 12 * 1, pp. 425 bis ^ 35, (1938) proved. According to this rule, chloroform and butanol or another alcanol, such as isopropanol or hexanol, is used to dissolve the protein. The cleaned Polyfructosan can then be precipitated with ethanol, for example, washed and dried.

Die so vorbehandelten Polyfructosane, aus denen also die niedrigmolekularen Fraktionen und vorhandene proteinartige Substanzen abgetrennt worden sind, sind besonders zur Herstellung von Vaccinen geeignet. Die Strukturformel dieser PolyfructosaneThe polyfructosans pretreated in this way, i.e. the low molecular weight ones Fractions and proteinaceous substances present have been separated off are particularly useful for production suitable for vaccines. The structural formula of these polyfructosans

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"-· 7 —"- · 7 -

konnte noch nicht festgelegt werden, zur Charakterisierung wurden Elementaranalysen und IR-Spectren herangezogen. Die charakteristischen Peaks im IR-Spectrum liegen bei 920 cm , 875 cm¹ und 805 cm¹.could not yet be determined, elemental analyzes and IR spectra were used for characterization. The characteristic peaks in the IR spectrum are at 920 cm, 875 cm ¹ and 805 cm ¹ .

Die säurehydrolisierten Polyfruetosane lassen in der chromatographischen Analyse nur Fructose als Baustein erkennen. Die nach dem geschilderten Verfahren gewonnenen Polyfruetosane lassen sich durch folgende Eigenschaften charakterisieren: The acid-hydrolyzed polyfruetosans leave in the chromatographic Analysis only recognize fructose as a building block. The polyfruetosans obtained by the process described can be characterized by the following properties:

Intrinsik-Viskosität bei 25°C - 0,15 bis 0,16Intrinsic viscosity at 25 ° C - 0.15 to 0.16

20
spezifische Drehung Γβ*«~]_η - 43 bis 5420th
specific rotation Γβ * «~] _η - 43 to 54

Gesamthexosengehalt - 98,4 % Total hexose content - 98.4 %

Proteinstickstoff - unter 0,5 % Protein nitrogen - less than 0.5 %

Die erfindungsgemäßen Vaccine liegen vorzugsweise als wässrige Lösungen oder Emulsionen mit einem Gehalt an 0,1 bis 1,0 und vorzugsweise 0,4 bis 0,6 g Polyfructosan/1 vor, wobei diese Mengen sich auf die gereinigte Verbindung beziehen. Als flüssige Träger werden vorzugsweise sterile Salzlösungen verwendet, die gegebenenfalls durch Hilfsmittel, wie beispielsweise Freund¹ sehe Hilfsmittel oder ähnliche Zusatzstoffe zu Emulsionen verarbeitet werden können. Die oben erwähnte spezifische Drehung wur^e gemessen in einer 1 #-i.gen wässrigen Lävanlösung. Das Freund'sehe Hilfsmittel enthält 1 ,'5 ml Mannid-monooleat und 8,5 ml Paraffin-The vaccines according to the invention are preferably in the form of aqueous solutions or emulsions containing 0.1 to 1.0 and preferably 0.4 to 0.6 g polyfructosan / l, these amounts being based on the purified compound. The liquid carriers used are preferably sterile saline solutions which, if necessary, can be processed into emulsions ^{by means of auxiliaries such as, for example, Freund 1 see auxiliaries or similar additives.} The above-mentioned specific rotation was measured in a 1% aqueous solution of Lävan. The Freund'sehe aids containing 1, '5 ml mannide monooleate and 8.5 ml paraffin

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öl und 8 mg abgetötetes und getrocknetes mycobacterium cutyricum. Freund'sches Hilfsmittel wird vorzugsweise in Mengen von 1:1 zugegeben. Als Salze können die üblicherweise zur Herstellung von Salzlösungen eingesetzten Salze, wie Natrium- oder Kaliumchlorid, verwendet werden.oil and 8 mg killed and dried mycobacterium cutyricum. Freund's auxiliary is preferably added in amounts of 1: 1. The salts usually used for the preparation Salts used by saline solutions, such as sodium or potassium chloride, can be used.

Anstelle der vorzugsweise gereinigten Polyfructosane können auch abgetötete Keime des Streptococcus, Stamm SS2, eingesetzt werden. Besonders geeignet sind mit Formalin abgetötete Keime; auch in diesen Fällen können Freund'sehe Hilfsstoffe eingesetzt werden. Bei Verwendung abgetöteter Keime muß eine ausreichende Menge eingesetzt werden, damit die beschriebenen Mengen an Dextran vorliegen. Die Keimzahl entspricht damitInstead of the preferably purified polyfructosans, killed germs of Streptococcus, strain SS2, can also be used will. Germs killed with formalin are particularly suitable; Even in these cases, Freund'shee can use auxiliaries can be used. When using killed germs, a sufficient amount must be used to ensure that the described Amounts of dextran are present. The number of germs thus corresponds

7 7 77 7 7

etwa 0,5 χ 10' bis Ί χ 10 und vorzugsweise 1 χ 10 bis 2 χabout 0.5 χ 10 'to Ί χ 10 and preferably 1 χ 10 to 2 χ

10' Keime je Milliliter Lösung. Geringere Keimzahlen sollten nur dann eingesetzt werden, wenn nach der ersten Impfung Auffrischungsimpfungen verabfolgt werden. Auch bei Verwendung von nichtgereinigten Polyfructosanen müssen diese in ausreichenden Mengen zur Erzielung der beschriebenen Gehalte eingesetzt werden.10 'germs per milliliter of solution. Lower bacterial counts should only be used if booster vaccinations after the first vaccination administered. Even if non-purified polyfructosans are used, these must be sufficient Quantities are used to achieve the levels described.

Die Impfung mit den erfindungsgemäßen Vaccinen kann in bekannter Weise, beispielsweise subkutan, intramuskulär oder intravenös erfolgen. Die Einzeldosen enthalten 1 bis 20 ,ug und vorzugsweise 5 bis 10,ug Polyfructosane je kg Körpergewicht. Auffrischungsimpfungen können von Zeit zu "eit durchgeführt werden.Vaccination with the vaccines according to the invention can be carried out in a known manner, for example subcutaneously, intramuscularly or intravenously. The single doses contain 1 to 20 µg and preferably 5 to 10 µg of polyfructosans per kg of body weight. Booster vaccinations can be given from time to time.

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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.The following examples are intended to explain the invention in more detail.

example 1

Anzahl Diät vorherige Streptococcen- Immuni-Number of diets previous streptococcal immunity

Antibiotica-beimpfung sierung behandlung mit abgeAntibiotic inoculation treatment with ab

töteten Keimenkilled germs

Gruppegroup II. 1010 MitchellMitchell Gruppegroup IIII 1010 MitchellMitchell Gruppegroup IIIIII 1010 MitchellMitchell

Dreißig neugeborene Goldhamster aus dem gleichen Wurf und aus der Züchtung der National Institutes of Health stammend wurden in drei ausgewogene Gruppen eingeteilt. Alle Tiere wurden mit der Caries erzeugenden Mitchell-Diät und entionisiertem Wasser versorgt. Die Gruppe I erhielt als Kontrollgruppe nur die Mitchell-Diät. Thirty newborn golden hamsters were obtained from the same litter and bred by the National Institutes of Health divided into three balanced groups. All animals were fed the Mitchell diet and deionized water provided. Group I received only the Mitchell diet as a control group.

Die normalerweise gram-positive Flora der Goldhamster in den Gruppen II und III wurde nach der Geburt durch Gabe von 100 Einheiten Penicillin je gramm Mitchell-Diät an vier aufeinanderfolgenden Tagen unterdrückt. Am fünften Tag wurde die Antibioticabehandlung abgebrochen und die Tiere in den Gruppen II und III im Bereich der Hamstertaschen mit 0,1 ml einer 18 Stunden alten Kultur eines streptornycinresistenten Mutanten des Polyfructosane bildenden Streptocuccus, Stamm SS2₃ beirapft. Die VerwendungThe normally gram-positive flora of golden hamsters in groups II and III was suppressed after birth by administering 100 units of penicillin per gram of the Mitchell diet on four consecutive days. On the fifth day the antibiotic treatment was discontinued and the animals in groups II and III were inoculated with 0.1 ml of an 18-hour-old culture of a streptornycin-resistant mutant of the polyfructosane-forming Streptocuccus, strain SS2 _{3, in the} hamster pockets. The usage

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einer streptomycinresxstenten Mutante erfolgte aus rein experimentellen Gründen, damit nämlich das Angehen der Beimpfung durch Weiterzüchtung der Keime auf einen Mitus Salivarius Streptomycinagar verifiziert werden konnte.a streptomycin-resistant mutant was carried out from purely experimental ones Reasons, namely starting the inoculation by further breeding the germs on a Mitus Salivarius Streptomycin agar could be verified.

Der in diesen Experimenten verwendete Streptococcus, Stamm SS2, wurde von Dr. R. J. Gibbons im Porsyth Dental Center, Boston, Massachusetts, erhalten. Der Stamm ist in der American TypeThe Streptococcus used in these experiments, strain SS2, was founded by Dr. R. J. Gibbons at the Porsyth Dental Center, Boston, Massachusetts. The trunk is in the American type

Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und trägt die ATCC-Zugangsnummer 27006.Culture Collection, Rockville, Maryland, deposited and carries the ATCC accession number 27006.

Die Keime wurde auf einem Trypticase Sojaextrakt-Medium ohne Traubenzucker (BBL), aber unter Zusatz von 0,5 % Saccharose bei einer Temperatur von 37 C und einem pH-Wert von 7,2 gehalten. Die Saccharose wurde vorher im Autoklaven sterilisiert und unter antiseptischen Bedingungen zu dem Medium zugegeben. Die Keime wurden anärob in einem BBL-Anärobierkolben (BBL anaerobic jar) bei 37°C in einer Atmosphäre aus 90 % Wasserstoff und 10 % Kohlendioxid gehalten.The germs were kept on a trypticase soy extract medium without grape sugar (BBL) but with the addition of 0.5 % sucrose at a temperature of 37 ° C. and a pH of 7.2. The sucrose was previously sterilized in the autoclave and added to the medium under antiseptic conditions. The germs were kept anaerobically in a BBL anaerobic jar at 37 ° C. in an atmosphere of 90 % hydrogen and 10 % carbon dioxide.

Am Tage der Beimpfung wurden die Tiere in Gruppe III durch intraperitoniale Injektion von 0,5 ml einer Vaccine mit einem Gehalt an Formalin getöteten Keimen in einem im Verhältnis 1:1 eingesetzten, vollständigen Freund'sehen Hilfsmittel immunisiert. Die für die Immunisation benötigte Vaccine wurde wie folgt hergestellt Nach l8-stündigem anäroben Wachstum der Keime auf einem Trypti-On the day of inoculation, the animals in Group III were injected intraperitoneally Injection of 0.5 ml of a vaccine with a content of formalin killed germs in a ratio of 1: 1, complete friend's view aids immunized. the Vaccine required for immunization was prepared as follows. After 18 hours of anaerobic growth of the germs on a tryptic

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case-So j aextrakt-Medium mit einem Gehalt an 0,5 /5 Saccharose und 100,ug Streptomycin je ml wurde die mit Salzlösung gewaschene Zellsuspension zum Aufbrechen der Ketten mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde vor dem Abtöten der Keime mit einem Raytheon-Ultraschallgerät mit O₃65 amps 5 Minuten lang durchgeführt. Die Suspension wurde dann mit Salzlösung auf eine optische Dichte von 0,22, gemessen bei 610 m,u in einem Bausch und Lomb-Colorimeter, eingestellt. Anschließend wurden die Keime über Nacht in einer 0,6 #-igen Formalinlösung suspendiert, um vollständige Abtötung sicherzustellen. case soya extract medium with a content of 0.5 / 5 sucrose and 100 μg streptomycin per ml, the cell suspension washed with saline was treated with ultrasound to break the chains. The ultrasound treatment was carried out for 5 minutes with a Raytheon ultrasound device with O _{3 65 amps before the germs were killed.} The suspension was then adjusted with saline solution to an optical density of 0.22, measured at 610 μm, in a Bausch and Lomb colorimeter. The germs were then suspended in a 0.6 # formalin solution overnight in order to ensure complete destruction.

Die Versuchstiere erhielten in etwa zweiwöchigem Abstand vier zusätzliche Injektionen mit jeweils abnehmender KonzentrationThe test animals received four at an interval of about two weeks additional injections, each with a decreasing concentration

6 ¹J der Keime in der Zubereitung, nämlich von 1 χ 10 bis 2 χ 10 . Nach 12 Wochen wurden die Versuchstiere getötet und in jeder Gruppe Speichel und Serum auf den Antikörpertiter untersucht. Der Antikörpertiter aus Speichel und Serum wurde gegen einen mit Salzlösung hergestellten Extrakt aus Streptococcus, Stamm SS2, und daraus hergestellten Polyfructosanen verglichen, wobei sich ergab, daß eine entsprechende Antikörperreaktxon in Speichel und Serum bei den immunisierten Tieren aufgetreten war.6 ¹ J of the germs in the preparation, namely from 1 χ 10 to 2 χ 10. After 12 weeks, the test animals were sacrificed and the antibody titer of saliva and serum in each group was examined. The antibody titers from saliva and serum were compared against an extract prepared with saline from Streptococcus, strain SS2, and polyfructosans prepared therefrom, and it was found that a corresponding antibody reaction had occurred in saliva and serum in the immunized animals.

Die nach dem bekannten Verfahren von Russell freipräparierten Tierschädel wurden mit Hilfe einer modifizierten Keyes-Methode auf Zahncaries untersucht. Dae Untersuchung auf Caries wurde mitThe animal skulls exposed according to the well-known method of Russell were prepared with the help of a modified Keyes method examined for dental caries. Dae examination for caries was done with

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BAD ORIGINALBATH ORIGINAL

zweiten und dritten Maxillarmolaren durchgeführt. Ein Tier aus Gruppe I, der Kontrollgruppe, und zwei Tiere aus Gruppe II starben während des Versuches aus anderweitigen Gründen.second and third maxillary molars performed. One animal from group I, the control group, and two animals from group II died during the attempt for other reasons.

Die Versuchsführung ist aus der Tabelle auf Seite 9 ersichtlich,The experiment can be seen in the table on page 9,

Die Untersuchung auf Zahncaries ergab in den drei Gruppen folgende Resultate:The examination for dental caries in the three groups showed the following Results:

Häufigkeit des
CariesbefallsFrequency of
Caries infection % Änderung % Change Gruppe IGroup I. 26,89-26.89- Gruppe IIGroup II 37,6637.66 + 40,05$+ $ 40.05 Gruppe IIIGroup III 12,1812.18 - 67,662- 67.662

Aus diesen Resultaten ergibt sich, daß die erfindungsgemäßen Vaccine zu einer hervorragenden Reduzierung der Bildung von Zahncaries führen. Bei den mit Caries bildenden Keimen geimpften Tieren der Gruppe II zeigte sich eine über HO #-ige Vergrößerung der Cariesbildung im Vergleich zu den nicht mit Caries erzeugenden Keimen geimpften Tieren der Kontrollgruppe I, Alle drei Gruppen wurden ständig bei Cariesfördernder Diät gehalten. These results show that the vaccines according to the invention lead to an outstanding reduction in the formation of dental caries. The animals of group II vaccinated with caries-producing germs showed an increase in caries formation over HO # compared to the animals of control group I not vaccinated with caries-producing germs. All three groups were constantly kept on a caries-promoting diet.

Die immunisierte Gruppe III zeigte eine 67 /S-ige Verringerung des Cariesbefalles im Vergleich zu Gruppe II, so daß die Wirk-The immunized group III showed a 67 / S reduction of caries infestation compared to group II, so that the effective

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samkeit der Immunisierung sehr deutlich wird. Die -Resultate weisen eine statistische Sicherheit von etwa 99 % auf.immunization becomes very clear. The results show a statistical certainty of about 99 % .

Example 2 Representation of the polyfructosans

Streptococcus, Stamm SS2, wurde anärob in einem Trypticase-Sojaextrakt-Medium ohne Glucose (Baltimore Biological Laboratories - BBL) mit Zusatz von 8 % Saccharose bei einer Temperatur von 37°C und einem pH-Wert von 7,2 in einer Atmosphäre aus 90 % Wasserstoff und 10 % Kohlendioxid -48 Stunden bebrütet. Die Keime wurden dann in einer Sorvall-Gefrierzentrifuge 10 Minuten mit einem SS^^-Kopf bei 10.000 U/min abzentrifugiert. Aus der klaren überstehenden Flüssigkeit wurden die Polyfructosane durch Zugabe von 2,5 Volumina 95 #-igen Äthanols ausgefällt. Die ausgefällte gummiartige Masse wurde in Wasser wieder aufgelöst und dann wiederholt durch Zugabe von 0,25 Volumina Chloroform und 0,1 Volumina Amylalkohols zur Abtrennung der Proteine behandelt. Die Mischung wurde dann 15 Minuten geschüttelt, und die wässrige Schicht, die die Polyfructosane enthielt, wurde anschließend 2*1 Stunden gegen destilliertes Wasser dialysiert, um die Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen.Streptococcus, strain SS2, became anaerobic in a trypticase soy extract medium without glucose (Baltimore Biological Laboratories - BBL) with the addition of 8 % sucrose at a temperature of 37 ° C. and a pH of 7.2 in an atmosphere of 90 % Hydrogen and 10 % carbon dioxide -48 hours incubated. The germs were then centrifuged off in a Sorvall freezing centrifuge for 10 minutes with an SS ^^ head at 10,000 rpm. The polyfructosans were precipitated from the clear supernatant liquid by adding 2.5 volumes of 95 # ethanol. The precipitated gummy mass was redissolved in water and then repeatedly treated by adding 0.25 volumes of chloroform and 0.1 volumes of amyl alcohol to separate the proteins. The mixture was then shaken for 15 minutes and the aqueous layer containing the polyfructosans was then dialyzed against distilled water for 2 * 1 hours to remove the low molecular weight fractions.

Die Polyfructosane wurden dann aus der wässrigen Schicht durch Zugabe von Äthanol wieder ausgefällt, wobei sich eine Suspension eines feinen Pulvers ergab. Die gereinigten Polyfructosane wurdenThe polyfructosans were then reprecipitated from the aqueous layer by adding ethanol, forming a suspension of a fine powder. The purified polyfructosans were

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auf einem mit Säure gewaschenen Filtrierpapier (Whatman 52) in einem Buchner Trichter gesammelt, mit absolutem Äthanol, Aceton und Petroläther gewaschen und sofort in einen Exekator überführt.collected on an acid washed filter paper (Whatman 52) in a Buchner funnel, washed with absolute ethanol, Washed acetone and petroleum ether and immediately transferred to an executor.

Example 3

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, außer daß in diesem Fall die Tiere der Gruppe III anstelle der Immunisierung mit mit Formal abgetöteten Keimen des Streptococcus, Stamm SS2, eine Immunisierung mit 0,5 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 500,ug Polyfructosanen je ml in einer Salzlösung mit einem Gehalt an Freund 'schein Hilfsmittel im Verhältnis 1:1 enthielten. Die verwendeten Polyfructosane waren gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt worden. Nach der ersten Impfung mit der Vaccine wurden vier weitere Injektionen im Abstand von je zwei Wochen nach der ersten Injektion unter Verwendung der anfangs benutzten Polyfructosanlösung gegeben. Die Häufigkeit des Cariesbefalles wurde mit zwei anderen Gruppen, wie in Beispiel 1, festgestellt und gemäß dem dort beschriebenen Verfahren ausgewertet. Dabei ergaben sich folgende Resultate für die Tiere der Gruppe III:The procedure described in Example 1 was repeated, except that in this case Group III animals were used instead of immunization with germs of Streptococcus, strain SS2 killed with formal, an immunization with 0.5 ml of a solution with a Content of 500 µg polyfructosans per ml in a salt solution with a content of Freund's Schein aids in a ratio of 1: 1. The polyfructosans used had been prepared according to the method described in Example 2. After first vaccination with the vaccine were taking four more injections at an interval of two weeks after the first injection Use of the initially used polyfructosan solution given. The frequency of caries infestation was determined with two other groups, as in Example 1, determined and evaluated according to the method described there. The following results were obtained for the animals of group III:

Häufigkeit des % ÄnderungFrequency of % change

CariesbefallesCaries infection

Gruppe III 11,2 - 70 % Group III 11.2 - 70 %

209841/1126209841/1126

Die mit den gereinigten Polyfructosanen immunisierten Tiere zeigen eine Reduktion von 70 % bezüglich des Cariesbefalles im Vergleich zu den Tieren der Gruppe II in Beispiel 1. Dies zeigt, daß die Immunisation mit den erfindungsgemäßen Vaccinen tatsächlich sehr wirksam ist. Vom statistischen Standpunkt haben diese Resultate eine Wahrscheinlichkeit von 99 %· The animals immunized with the purified polyfructosans show a reduction of 70 % with regard to the caries infestation compared to the animals of group II in Example 1. This shows that the immunization with the vaccines according to the invention is actually very effective. From a statistical point of view, these results have a probability of 99 %

2098A1/112 62098A1 / 112 6

Claims

- 16 claims

1. Vaccine for 'immunization against dental caries, characterized in that that in a liquid carrier a strain of the genus which forms by anaerobic culture of a polyfructosane Contains polyfructosan formed by streptocuccus.

2. Vaccine according to claim 1, characterized in that the carrier is an aqueous salt solution.

3. Vaccine according to claim 1 or 2, characterized in that it contains the polyfructosans from Streptococcus, strain SS2.

4. Vaccine according to claim 3, characterized in that it the Contains polyfructosans in the killed cells of the Streptococcus, strain SS2.

5. Vaccine according to claim 3 and 4, characterized in that the polyfructosan has a molecular weight of 16 to 23 million.

6. Vaccine according to claim 5, characterized in that it contains 0.1 to 1 g of polyfructosans per liter of solution contains.

2098Λ1/11262098-1 / 1126

7, vaccine according to claim 5, characterized in that it contains 0.4 to 0.6 g of polyfructosans per liter of solution.

8. Vaccine according to claim 3 and 7 _9, characterized in that the polyfructosan contained characteristic IR absorption peaks at 920 cm, 875 and 805 cm, an intrinsic viscosity at 25 ° C of 0.15 to 0.16 and a specific rotation fr η ^{20 has} from 43 ° to 54 °.

9. Vaccine according to claim 3 to 8, characterized in that a by incubation of Streptococcus, strain SS2, under anaerobic conditions in the presence of sucrose at temperatures of 35 to 38 ⁰ C and a pH of 6.8 to 7.4 formed polyfructosan is included.

2 0 9841/11262 0 9841/1126