DE2041224A1

DE2041224A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Analyse einer Fluessigkeit,die Makromolekuele enthaelt,welche die Analyse stoeren wuerden

Info

Publication number: DE2041224A1
Application number: DE19702041224
Authority: DE
Inventors: Nadeau Richard George; Luchsinger Wayne W
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1969-08-19
Filing date: 1970-08-19
Publication date: 1971-02-25
Also published as: JPS542870B1; DE2041224B2; FR2058943A5; GB1326923A; US3785771A; SE381933B

Description

Patentanwälte

Dr. Ing. Walter Abite .

Dr. Dieter F. Morf . . ' '

Dr. Hans-A. Brauns 8München86, Phi»Mu*»t

19. August 19ΤΌ CASBt 3XE-116

B.I. DU POHI DE HEMOUES AHD COMPAHT Vilaington, Delaware, USA

Verfahren und Vorrichtung smr Analyse einer Plüseigkeit, die Makromoleküle enthält, welch· die Analyse sturen würden·

Die Ifrfindung betrifft Verfahren und Vorrichtung, vat ein· flüssigkeit auf einen speziellen Bestandteil su analysis«* ren, wobei die ilüeeigkeit geladene Makromoleküle enthält, welche die'Analyse sturen worden·

Die photoaetrisQhe Analyse flüssiger Proben let ein bekannte« und wichtige» Hilf saittel bei der oheaisohen Analyse» insbesonder· auf de* klinieohen Anwendungsgeeiet» wo die

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Notwendigkeit der raschen Untersuchung von Körperflüssigkeit ten zur Entwicklung einer Vielzahl automatischer Instrunente ' geführt hat, die zur rasohen und genauen Durchführung einer Reihe τοη analytischen Tests bestimmt sind· Sie meisten die- - βer Instrunente benutzen gut bekannte biochemische Tests auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines speziellen Bestandteiles in einer flüssigen Probe» wobei ein Reagens, das eint Reaktion in der flüssigen Probe verursacht, wenn der spezielle Bestandteil anwesend ist, zur flüssigen Probe gegeben wird· Sie verursachte Reaktion beeinfluflt die photoaetrisohe Sichte der flüssigen Probt und die Veränderung wird von tinea Phot ob et er angezeigt'· Tests zur Bestimmung dtr Anwesenheit odtr dtr Konzentration dta Harnstoff-Stickstoffs odtr der Blutglucose, wit sit in dta Beispielen dtr USA-Patent schrift 3 476 515 beschrieben- sind, stellen ttbliohe Beispiele dieses Analysentype das?«

In einigen fällen jedoch verlieren diese Tests ihre Wirksamkeit, da die zur Erzeugung dtr gewünschten Reaktion verwendeten Rtagtntien ait den in der flüssigen Probe vorhandenen Makromolekül en reagieren. Diese Reaktionen «türen die Analyst gewöhnlich dadurch, dal sit tint» lied erschlag erzeugen, dtr dit flüssige Probe so **§>· attat, daß die photoaetrisohe Analyse unzuverlässig wird. Sas Problem ist besondere gravierend, wenn dit flüaeift Probt tint Körperflüssigkeit ist, wobei in dieses fallt da» »Wreode Makroaolekül fewöhnlioa ein Protelnattlakttl iat. Xaftlfedessen ist ts bti vielen analytischen Routinetetts nötig, Tor dtr Analyst dit Makromoleküle auf ohtnisehesj Vt«t aus der flüssigen Probt zu entfernen. Wird dit Analyse per Band durchgeführt, so kann dit Entfernung dtr Makromoleküle durch Ausfällen und Zentrifugieren erreioht wtrden, bti dtr Anwendung automatischer Inetrumente ist jedoth ein derartiges Verfahren unpraktisch. Sie lotwendi^keit la Balata eines auto-

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matischen Verfahrens Makromoleküle aus Probefltiseigkeiten ύοχ der Analyse zu entfernen, wurde bei der Entwicklung..auto» matischer Analyseninetrumente früh erkannt· 1»f.SKEGSS nahe ' das Problem in Angriff '{yergl· USA-Patentschrift 2 797 149)» indes er eine Dlalysevorriehtung in sein Instrument -einbaute»*, die dazu diente» das.was er als "kristalloid®"'Bestandteil© bezeichnete ι aus einer Lösung zu entfernen; die aus kristallloiden* und "nicht-kristalloiden" (oder kolloidalen) Bestandteilen, im'.Verhältnis zum Anteil· der krietalloiden Substanz in der Flüssigkeit,bestand. Biese Technik ist fön einoa. ηehr oder weniger kontinuierlichen Fließen der ftrobenfltta- *..*'■ sigkeit abhängig und daher zur Anwendung.bei der iiekontinuierliohen Analyse unpraktisch. Awsetrliü -bat iinee" nik mehrere eindeutige Nachteile«/Ba ·1ηϋ' limlye· τοη diffusion der kristalloiden BestanifeJ.l# iuroii «in· eenipermeable. Membran abhängig ist ₉ laiiielt.ee eiek.un einen langsamen Prozeß, bei dem mehr flüssige Brobe Als für dt* ; Analyse erforderlich 1st, in dme Xnstrates&t eiagebraelit werden muß, damit eine ausreicliemd® M@ng· der fllseigiin Probaf die in einer Ternünftigen 'S*ttdavev amalfeiert wu?- den soll» durch die Membran geht»

Auch die Terwendung bestirnter lonsnauataiisoherharse ■ mir ■■ ..Adsorption von HakroiziOl®Ullen_f iBsbesonder· tob Brotein». Molekülen ,ist bekannt« ®i@B®r'' VorganR stellt iie Grnndlfl·- ge der .Froteinchromatograpliie iar_t wobei BroteinnoleUla . sperst durch'eine lonenauatauBcherkolonne ame der Trägerfltteeigkeit entfernt wordem_v dann in -der XJolonne getrennt. und Bohliefiiich selektiv aus i.@r Kolonne elviert werien# .Xa eine» Artikel im Te.chnicon Synpoeiim über ^wAwtoiiatIoiB im

. Analytic Chemistry¹⁵ _v 1.966 veröffentlicht von Mediad» be— Bchreibt B.L·. B£TTBER eine. ähnliche Anwendung Ton.. lomenaus-'tauaoherhariran. bei der BeetiniTOng YQn'.Seroath^roxtB· Bie- ' MeÄoie. besteht derim_t AaB Aeinoeäurenf einecMießllek . .

■ Zhgreozla. und- Sbyroiiiaf auf dee Utes adaoTRtert vesden_v Ianm'

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die ProteinmolekUle und andere Verunreinigungen unter Vervendung einer Reihe von Acetatlösungen aus dem Harz eluiert werden und schließlich das Thyroxin und Thyronim unter Anwendung einer Essigsäurewäsche aus dem Harz eluiert werden. Bas Sohlußeluat, welches das zu analysierende Material enthält» wird aufgefangen und automatisch auf Jodgehalt analysiert. . . -

Diese bekannte Methode ist daher durch die Tatsache gekennzeichnet, das das zu analysierende Material zuerst vollständig aus einer TrägerflUssigkeit durch Adsorption auf des Harz entfernt wird und dann durch EIuieren aus dem Harz gewonnen wird. Sie TrägerflUssigkeit wird verworfen und wenn das zu analysierende Material schließlich zur Analyse gebracht wird, befindet es sich in einer Flüssigkeit, die tob ursprünglichen Medium verschieden ist.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines verbesserten Verfahrene und einer Vorrichtung zur Analyeierung einer flüssigkeit, die geladene Makromolekül· enthält, welche dl· Analyse stören wurden, wenn man sie nicht entfernte.

Ausserdea betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung für derartige Analysen, wobei eine extren geringe Menge an flüssiger Probe benötigt wird und der unerwünschte Typ geladener Makromoleküle selektiv auegefiltert werden kann, ohne daß Probeflüssigkeit oder eine wesentliche Menge des erwünschten Makromolekülgehaltes entfernt wird.

Bas erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß in wesentlichen die gesamte flüssige Probe durch ein selektive· lonenaiaetausehenaedivn geschickt wird, das be-

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fähigt ist, zumindest einen Typ geladener Makromoleküle in wesentlichen vollständig aus der flüssigen Probe zu entfer- ; ηen, die flüssige Probe aus der der unerwünschte Mskromölekülgehalt entfernt worden ist, in eine Reaktlonskamaer ■ ; überführt wird und die Anwesenheit des speziellen Bestand- . ^: teils bestimmt wird. Gewöhnlich müssen vor der Bestimmung . ! Reagentien in die Flüssigkeit eingebracht werden, die eine ,' Umsetzung in der flüssigen Probe verursachen. Wenn die ! Umsetzung die photometrische Dichte der flüssigen Probe i bei Anwesenheit des speziellen Bestandteiles beeinflußt, j kann die Bestimmung photbmetrisch vorgenommen werden'-und . ■ ■ ! üblicherweise wird sie dann auch photometrisch durchgeführt· Je nach den Analysenerfordernissen können verschieden® geladene Makromoleküle entfernt werden, Indem man das Ionen- j austauscherharz so wählt, daß es selektiv, gewöhnlich aufgrund der Ladung, das gewünschte Makromolekül entfernt -iindden Rest der flüssigen Probe unbeeinflußt liflty In einer bevorzugten Ausführungsform, die brauchbar 1st, wenn das Makromolekül ein Proteinmolekül oder ein anderes Zwitterion ist,, dessen Ladung vom pH des Mediums abhängig ist, in welchem es vorliegt, wird der pH oder die flüssige Brabe so eingestellt, daß das Makromolekül für die selektive Entfernung aus der flüssigen Probe die richtige Ladung besitst«

Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt eine lonenaustata-8chorvorrichtung, die ein selektives lonenaustauschmedium enthält, das so beschaffen ist, daß es im wesentlichen; alle geladenen Makromoleküle wenigstens eines Typs aus d'er flüssigen Probe entfernt; eine Probeentnahmevorrichtung,* 'die a© beschaffen 1st, daß sie die flüssige Probe aus ihrem ursprünglichen Behälter entnimmt und praktisch vollständig durch das Ionenaustauschermedium in ein Beaktionsgefäß drückt} und eine Vorrichtung zum Analysieren der iPlÜeeigkeitiiprobe. Heaktionaauslösende Maßnahmen gehören ebenfßlla g®-

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wohnlich dazu. Die Ionenaustauscherkolonne kann entweder positiv oder negativ geladene Ionenaustauscherharze oder beide enthalten, so dafi entweder positiv oder negativ geladene Makromoleküle oder beide entfernt werden können. Verschiedene Typen von Ionenaustauscherhafzen, wie Celluloseionenaustauscherharze oder Sextranionenaustausoherharze sind geeignet. In einer Aueführungeform wird das Ionenaustauschermedium mit einer ersten Menge Verdünnungsmittel gesättigt und die flüssige Probe wird durch das Ionenaustauechermediua gedrückt, indem man eine zweite Menge von entweder dem gleichen oder einem anderen Verdünnungsmittel hinter der flüssigen Probe in das Ionenaustauschermedium einführt» so dafi es im wesentlichen die gesamte flüssig· Probe verdrängt und eine der zweiten VerdUnnungsmittelmenge äquivalente Menge Verdünnungsmittel in·, das Reaktlonegeflfi gelangt. Ba im wesentlichen die gesamte flüssig· Prob· - nicht nur «in Teil davon - durch das Ionenaustausohcni&dium in das Analysenstadium gelangt, kann eine kleider· Ausgaugemenge an flüssiger Probe verwendet werden. Da .dme lonenaustauschermedium selektiv sein kann, können entweder die positiven oder negativen Makromoleküle oder beide entfernt werden, je nach den selektiven Erfordern!»tu der Analyse; und da schließlich die Ionenauetauechervorriohtung in form einer kleinen billigen Patrone vorliegen kann, kann die flüssig· Probe durch ein· austauschbare Patron· in da· automatisch· Instrument eingeführt werden, woduroh da· Problem der Verunreinigung umgangen wird.

Sie vorliegende Method· besitzt einen Vorteil gegenüber der von BSTTSEE beschriebenen bekannten Method·, insbesondere wenn sie in Verbindung mit einem automatischen Instrument angewendet werden soll, insofern al· kein· intermediären Beaeiti'gungs- und Gewinnungsstufen erforderlich sind. Si· flüssig· Prob· wird direkt duroh da« Ionen&ustausohermediua,

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welches die unerwünschten Makromoleküle entfernt» in die Reaktionekaamer geschickt. Trots dieses Vorteiles waS jeden Verfahren, das ein Xonenaustauschermediwa rar Entfernung geladener M&kroBoleküle aus einer flüssigen Probe nenntet, das in ein autOBatisehes Instrument .integriert werden sollt wenigstens «wei Prohleae lösen, 'die @@ nicht gibt_f wenn Si· Entfernung iror der Binf Uhning der flüssigen Probe in das Xnatruaent vorgenommen wird. Vor allem MiS die - Methode ie wesentlichen alle unerwünschten Makroaolekül® beseitigen® und sie maß es in den von dem Instrument .gearteten. 0v«neen von Zeit und Raub erledigen. Das Mediua, iwH>eli weiches-'die': flüssige Probe geht, kann nur einige Zentiaotar lang nein,; wenn es .ein integrierter. Beetanitell I©o lao-SnsBeiatee eeia •oll und die Zeit* welch«'die fltteelgo fest»· benötigt, /«a. durch das MediuB en. gthtn, kann einigo Miiraton nicht ttbe]> steigen, ohnt^^ die. LelstwagefHM^eit' floa inetniiieBte· iignifikant su beeinträehfigem. Bsio sueito fr©bleni_f tee die ▼orliegtQde Erfindung beiÄltigea .amB_f ief iae ProlbleB» vi·.. -nan die flüssig· 'Prob® in ein·*-'. Worm'- «ir BeaktionekaaBer ■

■ bringt, .die 'für -We. Aaitly«·' mach" etaen' amtoinatieieirteii fwr^

■ ffthrea 'geeignet 'iat_v. toe auf grand-''B'eliiea Ohaxokteve' alt .■ ■ genauen ¥orbeetinüt©ii Volusiaa isl 'Xonsentrationen' ier η -

. analysierenden-Probe.'und der bei ier Amalye· fernfenietea '..: Reagentien fertig verlern sau« Xoxnalerweise wird die Β?©-... "benflttssigkeit alt einea YeriiBiaiiiBgiBBlttel versioeht, l>e~ _. ▼er nan 4i· Seftgentiea angibt« «ai %feam das ear Brntfenrang ■ ier etöreniei HakronolekUle Yerwemiete fiilfeaittol die ""fOBontration ier flftoelgea Bcolbe in 4er MeetaÄg in-eines* ■ alclit· Torhersagbaren Weio· ändert, kann lie Analyse -nickt". ait Genauigkeit oatonatiBOA. dorehgefUhrt .verden·-. Bieh,er 'wm=- τβη iie Faciileute ier Ansieht, iaB eine weitgehende Be-'ooitlpimg Ton 'HBfctoaelotHeiaf wie Proteinaolekulan, - aus eiaer fliselgoa Beobo slofet amtor TenfjemiiiBg- von-' ioaemanato^cseherharsen im iem vt^Qh, β^ο - Automation'geäogenen-. seit« «el sfinBliolMii tteemeea

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die Eigenschaften oder die Konzentration der flüssigen Probe wesentlich zu verändern.

Durch die vorliegende Erfindung wird eine wesentliche Entfernung der störenden Makromoleküle durch die Verwendung eines Ionenaustauscheraedluzne erreicht, das so angepaßt ist, daß es nur auf die gewünschten Makromoleküle einwirkt, so daß die verbleibende flüssige Probe unangegriffen durch das Ionenaustauschermedium geschickt werden kann. Eine kurze Kolonne des richtigen Ionenaustausohermediums beseitigt wirkungsvoll in wesentlichen das gesamte makromolekulare Material und man fand, daß die flüssige Probe in weniger als 2 Minuten vollständig durch die Kolonne geschickt werden kann, wenn man die flüssige Probe unter Druck durch die kurze Ionenaustauecherkolonne preßt. Die flüssige Probe wird gewöhnlich durch die Kolonne gepreßt, indem man ' unter Druck hinter der Probe ein Verdünnungsmittel verwendet und in einer AusfUhrungsform wird die Kolonne zuerst ■it dem gleichen oder einem anderen Verdünnungsmittel als demjenigen, das zum Durchdrücken der flüssigen Probe durch die Kolonne verwendet wird, gesättigt· Wenn die richtige Menge Verdünnungsmittel verwendet wird, geht die ganze flüssige Probe und eine bekannte Menge Verdünnungsmittel in die Reaktionskaamer, so daß keine Unsicherheit über die Konzentration oder die Eigenschaften der Mischung in der Reaktlonskaaner besteht.

Andere Vorteile und die Arbeitsweise der vorliegenden Erfindung werden anhand der beiliegenden Figuren dargelegt:

figur 1 ist eine schematische Darstellung einer einfachen Aueführungsform eines automatischen Analyseninstru-■entes*, das zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann;

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?igur 2 1st ein Schnittbild einer Ionenauatauscherkolonne, die als Ionenaue tariervorrichtung in einem automatischen Analyseninstrument, wie es in Pig. 1 dargestellt ist, verwendet werden kann; und

figur 3 ist eine Sarstellung einer analytischen !Pestpackung für die Verwendung in einem automatischen Analyseninstrument _f die eine Ionenaustauecherkolonae, eine Reaktionskammer und'Reagentien, die aur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden V können, umfaßt· '

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN: -

In Pig. 1 ist die zu analysierende !Flüssigkeit anfangs in dem Probenbehälter 11 enthalten. Ein Seil der flüssigen Probe wird mit Hilfe der Pumpe 13 aus diesem Behälter in die Sonde 12 hochgezogen und unter so viel Druck in die lonenaustauscherkQlonne 14 entleert, daß sie ganz durch das in der Kolonne enthaltene lonenaustauschermedium 21 geht und in kurzer Zeit in die Reaktionskammer 15 austritt· Ein Weg, der gewährleistet, daß die gesamte.flüssige Probe durch die Kolonne geht, ist der, daß die Pumpe genügend Verdünnungsmittel einsaugt, bevor die flüssige Probe eingesaugt wird, so daß die flüssige Probe durch den Druck des hinter ihr eintretenden Verdünnungsmittels durch die Kolonne gedrückt wird. Wenn das in der Kolonne enthaltene lonenaustauschermedium trocken ist, kann es etwas schwierig sein, sicherzustellen, daß alles von der flüssigen Probe durch die Kolonne geht, da etwas von der Probe in einer Weise durch das Medium absorbiert werden kann, die eine Verdrängung schwer macht· Vermutlich wird, falls genügend Verdünnungsmittel verwendet wird, im wesentlichen die geeaate flüssige Probe aus der Kolonne gewonnen, es gibt je-

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dooh einen einfacheren Weg zur Erreichung des gleiohen Ergebnisses, wobei aan nur eine geringe Menge Verdünnungsmittel benutzt. Die Kolonne wird zuerst Bit einer ersten Menge Verdünnungsmittel gesättigt. Die Pumpe 13 sieht eine zweite Menge des gleiohen oder eines anderen Verdünnungsmittels in die Sonde hinein und zieht dann die gewünschte Menge flüssige Probe hinter den Verdünnungsmittel in die Sonde. Sobald der Inhalt der Sonde in die Ionenaustauscherkolonne injiziert wird, tritt zuerst die flüssige Probe in die Kolonne aus und danach das Verdünnungsmittel. Sowie die flüssigkeit in der Sonde in die Kolonne eingeführt wird, Yerdrängt sie die bereits in der Kolonne vorhandene flüssigkeit · Venn die zweite Menge an in die Sonde gezogenem Verdünnungsmittel gröfier als die erste Verdünnungsmittelmenge ist, die ursprünglich-in der Kolonne enthalten war» wird mit dem Eintreten des Sondeninhalte in die Kolonne die erste Verdünnungsmittelmenge zuerst aus der Kolonne verdrängt, dann wird die flüssige Probe Yerdrängt und es folgt der Teil der zweiten Verdünnungsmittelmenge, der die Sättigungskapazität der Kolonne übersteigt. Am Ende der Pumpwirkung ist praktisch die gesamte flüssige Probe und eine Verdünnungsmittelmenge, die der zweiten Verdünnungemi ttelmenge äquivalent ist, in die Beaktionskammer ausgelaufen, so daß die genaue in die Beaktionekammer eingebrachte Flüssigkeitsmenge und die Konzentration der Probe in der Flüssigkeit in der Reaktionskammer gesteuert werden können. Sann werden verschiedene Eeagentien aus den Reagentienkammern 16, 17 und 18 in die Reaktionskammer eingeführt, um eine Reaktion zu verursachen und nach einer bestimmten Zeit wird die Lichtdurchlässigkeit der Flüssigkeit in der Reaktipnskammer oder die Änderung der Lichtdurchlässigkeit über einen bestimmten Zeitraum photometrisoh gemessen, indem*man die Flüssigkeit mit der Lichtquelle bestrahlt und die Intensität des durchgetretenen Lichtes mit

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dem Photometer 19 Bisst.

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Flg. 1 stellt eine einfache automatisierte Analysenkvorrichtung dar. Die Variationen an diesem Instrument sind zu zahlreich für eine Erörterung· Sie umfassen Variationen der· Überführungsmethode, der Flüssigkeit aus dem Probenbehälter in die Reaktionskammer» Variationen der Methode zur Einführung der Reagentlen» Variationen bei der photometrischen Analyse der Flüssigkeit und viele Zwisohenschritte, die nicht dargestellt sind. Zwei Variationen am oben beschriebenen Verfahren sind jedoch erwähnenswert· In einigen Fällen kann die Veränderung der Flüssigkeit» die überwacht wird» um die Anwesenheit des speziellen Bestandteiles zu -bestimmen» automatisch stattfinden» und muß nicht ausgelöst werden. In diesem Falle ist der*Schritt der Einführung eines Reagensee in die Reaktionskammer unnötig· Obwohl die photometrische Analyse das normale Verfahren jBur · Bestimmung der Konzentration des speziellen Bestandteiles ist» können auch andere analytische Verfahren» wie die ' kolor!metrische Analyse ins Auge gefaßt werden· Es sei betont» daß hier keine Beschränkung auf ceaktionsinduzierte Veränderungen und photometrische Analysen stattfinden soll. Ea 1st klar» daß der Kern der vorliegenden Erfindung die Entfernung geladener Makromoleküle aus der flüssigen Probe mit Hilfe einer Ioß^naustauschervorrlchtung» wie einer Ionenaustauecherkolcfme» 1st und daß die besonderen Maßnahmen zur Einführung der Probe in die Ionenaustauscher-Vorrichtung und das Analysieren der Flüssigkeit» nachdem aie durch die Ionenaustauschervorrichtung gegangen ist» nur zusätzliche Merkmale der vorliegenden Erfindung sind.

Ein Instrument» das besondere gut der oben beschriebenen Methode angepaßt ist» ist in der deutschen Patentanmeldung P 19 41 506 beschrieben. Eine spezielle Probenübertragungsvorrlohtung» die ebenfalls besonders gut der oben besehrie-

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benen Methode angepaßt ist, beschreibt die deutsche Patentanmeldung P 19 41 481.

Da die. Ionenauetauschervorrichtung in einem automatischen Instrument verwendet werden soll, muß das Instrument so konzipiert sein, daß in einem Zeitraum, der genügend kurz ' ist, daß er mit den anderen Arbeitsschritten des Instrumentes im Einklang steht, die flüssige Probe durch das Ionenaustauschern^ ium geht und praktisch alle gewünschten Makromoleküle entfernt werden. Da die meisten analytischen Instrumente dazu bestimmt sind, Ihre Analysen in einer Zeit im Bereich von 10 bis 20 Minuten durchzuführen, nuß die vorliegende Erfindung so geplant sein, daß die flüssige Probe nicht mehr als einige Minuten un'd vorzugsweise weniger als 1 Minute im Ionenaustauschermedium verbringt. Eine Ausdehnung dieses Zeitraumes wird die zeitsparenden Merkmale des automatisierten Instrumentes wesentlich beeinträchtigen. In der Ionenaustauscherchromatographie dauert es gewöhnlich mehr als 2 Stunden, bis die flüssigkeit durch die Kolonne gegangen ist. Um diesen Zeitraum su verkürzen wurde die in der vorliegenden Erfindung verwendete Kolonne erheblich gekürzt und die flüssige Probe wird unter Druck, vorzugsweise im Bereich von 0,07 bie 7 kg/cm (1 bis 100 pel) durch die Kolonne gedrückt· Dies bedeutet, daß eine Pumpe verwendet werden muß, um die Flüssigkeit direkt in die Ionenaustauscherkolonne zu drücken und die Ionenaustauscherkolonne muß so gebaut sein, daß der Weg von der Pumpe zur Ausflußstelle und in die Beaktionskammer praktisch dicht ist, so daß die von der Pumpe entwickelte Druckkraft dazu verwendet wird, die Flüssigkeit durch die Kolonne zu drücken und nicht durch Löcher la System verloren geht. Wie in Fig. 1 dargestellt ist, 1st die Ionenaustauscherkolonne ein Rohr mit einer Eintrittsstelle 22, die so gebaut ist, daß sie eich dicht mit der Sonde 12 verbindet. Weiter unten ist ein bevorzugter

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Weg beschrieben, wie'man dies erreicht. .

Die in der vorliegenden Erfindung verwendete lonenaustauschervorriohtung kann in jeder Form vorliegen, die bei spezieller Instrumentenausführung für den Gebrauch geeignet ist. Wie in den Figuren dargestellt ist es eine Ionenaus tausoherkolonne 14, die mit einem Ionenaustauschermedium 21 gefüllt ist. Das Ionenaustauschermedium kann ifg end ein Ionenaustauscherharz sein, das die Fähigkeit- besitzt, die gewünschten geladenen Makromoleküle zu entfern hen. Dies stellt im allgemeinen ein Ionenaustauscherbara dar mit einer Ladung, die derjenigen des zu entfernenden Makromoleküles entgegengerichtet ist« Unter gewissen Umständen jedoch besitzt das Makromolekül eine Ladung, welche die gleiche ist wie diejenige eines Probebestandteiles, der nicht entfernt werden kann. In diesem Falle ist das Verfahren nicht länger geeignet. Aus diesem Grunde ist das Verfahren besonders brauchbar in einer Situation, wo das zu entfernende Makromolekül eindipolares Ion oder Zwitterion ist, dessen Ladung vom pH des Mediums, in dem es °. vorliegt, abhängt. In diesem Falle kann der pH der flüssigen Probe oder der Mischung aus flüssiger Probe und Verdünnungsmittel bis zu dem Punkt verändert werden, wo die effektive Ladung des dipolaren Ions von derjenigen der gewünschten' Bestandteile verschieden ist, so daß ein Ionen- ^l austauschermedium gefunden werden kann, das die Makromoleküle entfernt, ohne die gewünschten Bestandteile zu entfernen, Da Körperflüssigkeiten im allgemeinen Proteinmoleküle enthalten, 'die eine Art dipolares Ion sind, findet das Verfahren seine brauchbarste Nutzanwendung in der Entfernung von Proteinmolekülen aus der flüssigen Probe vor der Analyse. Dann wählt man'das Ionenaustauscherharz,nach seiner Fähigkeit aus, Proteinmoleküle aus der Flüssigkeit au entfernen. Nicht alle Ionenaustauscherharze tuen dies oder sie tun es wenigstens in einem umfang, der sie l«i-

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stungsfähig genug nacht» um in dem automatisierten Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden. Um das Problem der Wechselwirkung, der ProteinmolekUle mit den in der Analyse verwendeten Beagentien auszuschalten, müssen wesentlichen alle störenden ProteinmolekUle aus der flüssigen Probe entfernt werden. In einigen fällen genügt es, wenn 80 i» der ProteinmolekUle entfernt werden, in anderen nüssen alle störenden Proteinmoleküle beseitigt werden.

Sie folgenden Ionenaustauseherharse haben sich als die leistungsfähigeten für die Entfernung von positiv geladenen Proteinmolekülen erwiesen:

1« Carboxymethylcellulose (vertrieben unter der Bezeichnung Whatman(5) CH 23 vpn der Reeyes Angle Co. und CellexQy CH von den Bio«-Rad laboratories);

2. Carboxymethyldextran (vertrieben unter der Bezeichnung SephadexvS) C-50 [CH] von der Pharmacia Fine Chemicals, Ine.);

3· Sulfoäthylcellulose (vertrieben unter der Bezeichnung Ceilex09 SE von der Bio-Rad laboratories); und

4. Styrol-divinylbenzolsulfonsäure (vertrieben unter der Bezeichnung CGr 120 von der Rohm und Haas Co.).

Die folgenden Ionenaustauscherharze haben sich als die Leistungsfähigsten für die Beseitigung von negativ geladenen Proteinmolekülen erwiesen:

1.· Diäthylaminoäthylcellulose (vertrieben unter der Bezeichnung Whatman® DS 23 von der Reeves Angle Co. und Cellex® Ώ von der Bio-Rad Laboratories); und

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2. Diäthylaminoäthyldextran (vertrieben unter der Bezeichnung Sephadex® A-50 [DEAE] von der Pharmacia Pine Chemicals Inc.)·

Die folgenden Ionenaustauscherharze sind nicht getestet worden, es wird jedoch angenommen, daß sie für die Entfernung * von Proteinmolekülen geeignet sind:

"1. Cellulosephosphat; ' · * · * 2· Ecteolacellulose; und

3. SuIfoäthy!dextran (vertrieben unter der Bezeichnung Sephadex® C-50 [SE] von der Pharmacia Fine'Chemicals, Inc)· . ' *

Es sei darauf hingewiesen, daß diese Austauscher nur Beispiele für die Ionenaustauscher harztypen sind, die Proteinmoleküle wirkungsvoll beseitigen und im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht die einzigen wirkungsvollen Materialien darstellen sollen. Die meisten der obigen Ionenaustauscherharze können ganz allgemein als Cellulose-Ionenaustauscherharze oder Deztran-Ionenaustauscherharze beschrieben werden· Ea ist zu erwarten, daß alle derartigen Harze ingewissem Umfang ProteinmolekUle entfernen, daß aber einige, unterSenen die getesteten sind, leistungsfähiger sind als -andere.

In einigen Fällen müssen sowohl positive als auch negative Proteinmoleküle aus der flüssigen Probe entfernt werden·.In diesem Falle kann eine Zweikomponentenkolonne verwendet werden, wobei sie an einem Ende positive Ionenaustauscherharze und am anderen Ende negative Ionenaustauscherharze enthält. Die folgend« Kombination hat sich als leistungsfähig ~ •rwieseni .

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2/3 Oellex^ SE und 1/3 CQ 120.

Eb ist auch denkbar, daß auch integrale Gemische der beiden Harztypen eher als separate Regionen wirksam sein würden·

Fig; 2 veranschaulicht eine einfache Ionenaustauscherkolonne, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. In Fig. 2A enthält die Ionenaustauscherkolonne 14 ein einziges Ionenaustauscherharz 21. In Fig. 2B enthält die Ionenaustauscherkolonne 14 ein positives Ionenaustauscherharz 21 und ein negatives Ionenaustauscherharz 27. In beiden Fällen wird das Rohr 14 durch zwei Kautschukkappen 24 und 25 abgeschlossen, von denen eine eine Austrittsetelle 26 besitzt. Di» Sonde 12» wie sie in .dieser Anordnung dargestellt ist, ist eine Injektionsnadel, wel- ' ehe durch die Kautsohukwand 24 unter Bildung einer dichten -Verbindung zwischen der Sonde und der Kolonne eingeführt werden kann. Durch die Sonde gedrückte Flüssigkeit wird direkt durch die Kolonne und aus dem Ausgang 26 heraus in die Reaktionskammer gedrückt.

Fig. 3 veranschaulicht eine analytische Testpackung, wobei eine Ionenaustauscherkolonne, eine Reaktionskammer und die in die Reaktionskammer einzuführenden Reagentien allesamt in der gleichen Packung enthalten sind. Die Packung ist in der USA-Patentschrift 2 476 515 beschrieben. Sie besteht aus eine» festen Oberteil 30, an dem eine Tasche 31 aus transparentem Kunststoff material befestigt ist. Das Oberteil enthält eine Ionenaustauscherkolonne 32 mit einer Eintrittestelle 33 am einen Ende und einem Ausgang 35 am anderen Ende. Die Ionenaustauscherkolonne ist durch Kautschukkappen 51 und 52 verschlossen, so daß eine Injektionsnadel in den Eingang 33 eingeführt werden kann, und die Kolonne wird so betrieben, wie ·β in Verbindung mit Fig. 2 beschrieben worden

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ist. In diesem Falle jedoch geht die Ausgangsöffnung 35 ⁱⁿ eine Reaktionskammer 36» die im transparenten Plastikbeutel durch einen Verschluß 53, der sich entlang der Peripherie des Beutels erstreckt, gebildet wird, wie es in der Zeichnung dargestellt ist· Die Reagentien in Form von Featsubstanz en oder Flüssigkeiten befinden sich in den Beuteln, die in der Reaktionskammer von zerbrechbaren Verschlüssen 3? und 42 gebildet werden· Die Reaktion wird eingeleitet» indem man die Reaktionskammer 36'bis zu dem Punkt zusammen- , drückt, wo die in ihr enthaltene flüssige Probe gegen die zerbrechlichen Verschlüsse gepreßt wird, wobei deren Zerbrechen verursacht wird und sich ihr Inhalt in die Reaktionskammer entleert. Indem man einerseits bestimmte zerbrechliche Verschlüsse schützt und andere austauscht, können die richtigen Reagentien zur richtigen Zeit in die Reaktionskammer eingeführt werden. Wenn die Reaktion erst einmal ausgelöst worden ist, kann der Inhalt der Eeaktionskammer nach dem in der deutschen Patentanmeldung P 1 941 572 beschriebenen Verfahren analysiert werden·

Das in Fig. 3 veranschaulichte System ist ein in vieler Hinsicht bevorzugtes System, da eine separate Ionenaustauscherkolonne mit jeder Testprobe verbunden ist und das ganze System, einschließlich der Ionenaustauscherkolonne, nach beendeter Analyse beseitigt werden kann.

Das folgende Beispiel gehört zu einer analytischen Bestimmung» die ohne die Beseitigung bestimmter makromolekularer. Bestandteile, insbesondere die Beseitigung von Proteinmolekülen unmöglich ist, es dient zur Veranschauliehung der Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung.

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BESTItMPNG VON SERUM-PHOSPHAT

Ein 6,35 mo χ 7»62 cm Rohr (i/4 ζ 3 inch) wurde zu 3/4 mit Cellex SS gefüllt, das zuerst mit Wasser äquilibriert worden war und von dem die Peinstbestandteile abdekantiert worden waren. Das restliche Viertel des Rohres wurde dann mit CG 120 II gefüllt, das ebenfalls mit Wasser äquilibriert, von dem die Feinstbestandteile entfernt und das in einer 10 5iigen HgSO^-Lösung gewaschen Worden war. Die saure Wäsche überführt daa CG 120 II aus der Natriumsalzform in eine Wasserstoffionenform, so daß dieser Teil des Rohres sehr sauer ist und einen pH von 0,55- besitzt.

Eine 5 λ-Probe eines Bezugsserums (Versatol^-'), das eine bekannte Phosphatkonzentration enthielt, wurde durch die Kolonne titriert, wobei man 2,0 ml H₀O als Eluierungsmittel verwendet. Es wurde ein Druck von etwa 1,76 kg/cm (25 psi) angewendet und man schickte 2,0 ml Probeflüssigkeit in 0,7 Minuten durch die Kolonne. Die Testreaktion ist eine gut bekannte Analyse, bei der 0,8 ml der FrobeflUseigkeit anschließend mit den folgenden Beagentien kombiniert wurden:

0,8 ml 25 £ige Trichloressigsäurelösung, 200 A Ascorbinsäure,

0,5 ml Ammoniummolybdat und

1,0 ml Arsenitcitrat.

Dann wurde die Absorption der ProbeflUssigkeit bei 600 Ä gemessen. Wird die Absorption einer Blindprobe (H₂O), die durch eine gleiche Kolonne geschickt worden ist, von dem Vert der Probenflüssigkeit subtrahiert, so liegt das Ergebnis dicht bei dem Absorptionswert, der für eine Vergleiche-Probe aufgezeichnet wird, die die gleiche Meng· an Phosphat enthält, wie ee unten gezeigt wird. Di· Absorption 1st nicht absolut· Kons·ηtrationen ungerechnet «orden·

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Vergleich

Probe

Blindprob·

pH Absorption bei 600 £

6,38 1,26 1,20

0,10 0,113 0,017

Ohne di· Proteinentfernung konnte der Test nicht durongeführt werden.

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ORlGlNALlNSPECTgD

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Claims

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19. August I97O OASE DE-116

£.1. StJ FONT DE NEMOURS AITD COMPANY

.PATENTANSPRÜCHE :

Verfahren zur automatischen Analyse einer flüssigen Probe auf einen speziellen Bestandteil, wenn die flüssige Probe geladene Makromoleküle enthält, die die Analyse stören * würden, dadurch gekennzeichnet, daß

(α) die flüssige Probe so durch ein Ionenaustauschermedium gedrückt wird, daß im wesentlichen die ganze Plüssigkeiteprobe durch das Ionenauetauschermedium in eine Reaktionskammer geht, das Ionenaustauschermedium bo beschaffen ist, daß im wesentlichen alle geladenen Makromoleküle wenigstens einer Art aus der flüssigen Probe entfernt werden, wobei im wesentlichen nichts γόη dem besonderen Bestandteil entfernt wird; · und

(b) die Anwesenheit des besonderen Bestandteile festgestellt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die feststellung der Anwesenheit des besonderen Bestandteils photometrisch durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß darüberhinaus wenigstens ein Reagens in die Reaktionekaeaer eingeführt wird, wobei das Reagens ait de«

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besonderen Bestandteil so umgesetzt wird, daß die. physikalischen Eigenschaften der flüssigen Probe geändert werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ausserdem zumindest ein Reagens in .die Reaktionskammer eingeführt wird, wobei das Reagens mit dem besonderen Bestandteil so umgesetzt wird, daß die photometrische Dichte der flüssigen Probe geändert wird und die Bestimmung der Anwesenheit des besonderen Bestandteils photometrisch durchgeführt wird·

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das geladene Makromolekül ein dipolares Ion ist, dessen effektive ' Ladung vom pH des Mediums abhängig is,t, in welchem es vorliegt, wobei das Verfahren weiterhin dadurch gekennzeichnet 1st, daß der pH der flüssigen Probe anfangs auf einen Wert eingestellt wird, bei dem die effektive Ladung des dipolaren Ions einen solchen Wert annimmt, daß das lonenaustauschermedium selektiv im wesentlichen alle dipolaren Zwitterionen entfernt, ohne daß von dem besonderen Bestandteil praktisch etwas entfernt wird. -

6. Verfahren nach Anspruch 5 > dadurch gekennzeichnet, daß das geladene Makromolekül ein Proteinmolekül ist·

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Drücken der flüssigen Probe durch das lonettaustauschermedium , wobei praktisch die gesamte · flüssige Probe durch das Ionenaustauschermedium geht, so

.durchgeführt wird, daß man zuerst das IonenaustauschermediuB mit einer ersten Menge Verdünnungsmittel sättigt, dann die flüssige Probe in das Ionenaustauschernedium einführt und sohlieSllch eine zweite Menge Verdünnungsmittel hinter d»r

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flUsaigen Probe durch das Ionenaustauschernediun drückt, so daß die zweite Verdünnungemitteinenge zumindest vollständig

! die erste Verdünnungsnittelnenge und die flüssige Probe

IonenaustauecherinedIum verdrängt.

Θ. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dafl die flüssige Protre unter einen Druck zwischen 0,07 und 7 kg/cn (1 und 100 psi) duroh das Ionenaustauechemediun gedrückt wird, wodurch in wesentlichen die gesante flüssige Probe in weniger als 2 Minuten durch das Ionenauβtauschernediun in die Reaktionskanner geht.

9. Vorrichtung zur automatischen Analyse einer flüssigen Probe auf einen speziellen Bestandteil, wenn die flüssige Probe geladene Makromoleküle enthält, welche die Analyse stören würden, gekennzeichnet durch j

(a) eine Ionenaustauschervorrichtung, die ein Ionenaustauschernediun enthält, das so angeordnet ist, daß es in wesentlichen alle geladenen Makromoleküle wenigstens einer Art aus der flüssigen Probe entfernt ;

(b) eine Reaktionskanner;

(o) Vorrichtungen zur Handhabung von Flüssigkeit, die so eingerichtet sind, daß sie eine bestimmte Menge FlUs-' sigkeitsprobe aus einem Probenbehälter entnehmen und die flüssige Probe so durch die Ionenaustauo !heilvorrichtung in die Reaktionskammer drücken, daß im wesentlichen die gesamte flüssige Probe durch α Le Ionsn austauschervorrichtung geht;

(d) Vorrichtungen, uua zumindest ein Buugens in Ii) in 4ar RH&ktLonukaamer enthaltet!«» Flüssigkeit elatvt Ihreu.

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bei das Reagens so Bit dem speziellen Bestandteil reagiert, daß sieh¹ die flüssige Probe verändert; und

(β) Vorrichtungen zur Feststellung der Anwesenheit des speziellen Bestandteils.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeich-. net, daß die Vorrichtung zur Pestetellung der Anwesenheit dee speziellen Bestandteils eine photometrisohe Vorrichtung

ist. :' ■ : ■ -

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei das geladene Makromolekül ein dipolares Ion ist, dessen effektive ladung vom pH des Mediums abhängig.ist, in welchen ee vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausaerdem Vorrichtungen besitzt, um am Anfang den pH der flüssigen Probe auf einen Wert einzustellen, bei dem die effektive Ladung des dipοleren Ions einen solchen Wert annimmt, daß das Ionenaus- tau schemed ium selektiv im wesentlichen alle dipolaren Ionen entfernt, ohne daß dabei von dem speziellen Bestandteil im wesentlichen etwas entfernt wird.

12. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeiohnet, daß das loneneustauschermedium ursprünglich mit einer ersten Menge Verdünnungsmittel gesättigt worden ist und die Vorrichtung zur Handhabung der Flüssigkeit so angepaßt ist, daß die flüssige Probe durch das Ionenaustauschermedium gedrückt wird, dadurch daß eine zweite Menge Verdünnungsmittel in das Ionenaustauschermedium hinter der flüssigen Probe so eingeführt wird, daß die zweite VerdUnnungsmittelmenge BUBisdest die erst· Menge Verdünnungsmittel und die flüssige Prob· Im lonenaustaueehemedium vollständig verdrängt·

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BAD ORSQiNAL

13· Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Handhabung der Flüssigkeit eine Pumpe einschließt, um die flüssige Probe unter einem Druck zwischen 0,07 bis 7 kg/cm² (1 bis 100 psi) durch das Ionenaustauschermedium zu drücken, wodurch im wesentlichen die ganze flüssige Probe in weniger als 2 Minuten durch das lonenaustauschermedium in die Reaktionskammer geht.

14· Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Ionenaustauschermedium ein positiv geladenes lonenauetauschermedium ist, das so angepaßt ist, daß es·, praktisch alle negativ geladenen Makromoleküle auβ der flüssigen Probe entfernt.

15· Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das lonenauetauschermedium ein negativ geladenes Ionenaustauschermedium ist, das so angepaßt ist, daß es praktisch alle positiv geladenen Makromoleküle aus der flüssigen Probe entfernt.

16. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenaustauscherkolonne sowohl positive als auch negative Ionenaustauschermedien enthält und das Ionenaustauschermedluffl so angepaßt ist, daß es praktisch alle Makromoleküle aus der flüssigen Probe entfernt·

17· Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Makromolekül ein« ProteinmolekUl ist, und das lonenauetauschermedium eine Ionenauetausohercellulose oder •in Ionenaustauscherdeztran ist·

18· Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekenneeich-

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net, daß das Makromolekül ein Proteinraolekül let, -und das .Ionenaustauschermedium Carboxymethylcellulose? Carboxymethyldextran; SuIfoäthylcellulosö; Sulfoäthyldextran; Sulfatoellulose; Mäthylaminöäthyloellulosej DiäthylaalBO-äthyIdextran; Cellulosephosphat oder Eotdolaoellulose darstellt·

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