DE202004012163U1 - System for hybridizing immobilized nucleic acid samples, in sealed hybridizing chambers, has a pressure assembly to build up the chamber pressures over ambient atmospheric levels to prevent the formation of air bubbles - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 1 ein System mit Hybridisierkammern zum Hybridisieren von auf Objektträgern immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten. Dabei ist jede Hybridisierkammer als ein im wesentlichen spaltförmiger, mit einer Flüssigkeit im wesentlichen befüllbarer Raum zwischen einem dieser Objektträger und einem Deckel definiert. Je ein Deckel ist derart gegenüber einem Objektträger angeordnet, dass die Hybridisierkammer gegenüber der Umgebungsluft abgedichtet ist. Ein solches System umfasst eine Einrichtung zum Verhindern von Luftblasen in den Hybridisierkammern. Die Erfindung betrifft zudem, gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 12, ein entsprechendes Verfahren zum Verhindern von Luftblasen in den Hybridisierkammern eines Systems zum Hybridisieren von auf Objektträgern immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten. Gemäss diesem Verfahren werden alle im wesentlichen spaltförmigen, zwischen einem dieser Objektträger und einem Deckel angeordnete Hybridisierkammern mit einer Flüssigkeit im wesentlichen gefüllt. Dabei wird der Deckel derart gegenüber dem Objektträger angeordnet, dass die Hybridisierkammer gegenüber der Umgebungsluft abgedichtet ist.The According to the invention the generic term of the independent Claim 1 a system with hybridization chambers for hybridization from on slides immobilized nucleic acid samples, Proteins or tissue sections. Every hybridization chamber is there as an essentially gap-shaped, with a liquid in the essentially fillable Space defined between one of these slides and a lid. A cover is opposite each other a slide arranged that the hybridization chamber sealed from the ambient air is. Such a system includes a preventive device of air bubbles in the hybridization chambers. The invention relates moreover, according to the generic term of the independent Claim 12, a corresponding method for preventing air bubbles in the hybridization chambers of a system for hybridizing on slides immobilized nucleic acid samples, Proteins or tissue sections. According to this procedure all essentially slit-shaped, between one of these slides and Hybridization chambers with a liquid arranged on a cover essentially filled. The lid is placed opposite the slide in such a way that the hybridization chamber opposite the ambient air is sealed.
Die Verwendung von DNA-Proben (DNA = Desoxyribosenukleinsäure) und insbesondere von Mikroarrays solcher Proben stellt der Forschung eine wichtige Technik zur gleichzeitigen bzw. simultanen Analyse von Tausenden von Genen zur Verfügung. Diese Technik umfasst die Immobilisierung von DNA-Proben aus vielen Genen auf einer festen Substrat-Oberfläche, wie z.B. auf einem gläsernen Objektträger für ein Lichtmikroskop. Die DNA-Proben werden bevorzugt in einem Array von Probenflecken oder "spots", d.h. in einem zweidimensionalen Gitter auf dem Substrat angeordnet und man kann später – ausgehend von einer bestimmten Position innerhalb eines solchen Arrays auf den Ursprung der entsprechenden DNA-Probe zurückschliessen. Die Technik umfasst typischerweise die Kontaktierung des DNA-Proben-Arrays mit RNA-Muster-Suspensionen bzw. -Lösungen (RNA = Ribosenukleinsäure) um damit spezifische Nukleotidsequenzen in den DNA-Proben nachzuweisen. Typischerweise werden auch Muster-Suspensionen verwendet, welche DNA, cDNA und/oder Proteine bzw. Polypeptide enthalten.The Use of DNA samples (DNA = deoxyribose nucleic acid) and research in particular of microarrays of such samples an important technique for simultaneous or simultaneous analysis of thousands of genes available. This technique involves the immobilization of DNA samples from many genes on a solid substrate surface, such as. on a glass slides for a Light microscope. The DNA samples are preferably in an array of Sample spots or "spots", i.e. in a two-dimensional Grid arranged on the substrate and you can later - starting from a certain position within such an array infer the origin of the corresponding DNA sample. The technology includes typically contacting the DNA sample array with RNA sample suspensions or solutions (RNA = ribose nucleic acid) to detect specific nucleotide sequences in the DNA samples. Typically, sample suspensions are also used, which Contain DNA, cDNA and / or proteins or polypeptides.
RNA-Muster können mit einem sogenannten "tag" oder "label", d.h. einem Molekül versehen sein, welches z.B. ein Fluoreszenzlicht mit einer spezifischen Wellenlänge aussendet. Immobilisierte Proben können auch aminosäurehaltige (z.B. Proteine, Peptide) oder nukleinsäurehaltige (z.B. cDNA, RNA) Proben umfassen. Zu den immobilisierten Proben zugegebene Muster können beliebige Moleküle bzw. chemische Verbindungen umfassen, welche mit den immobilisierten Proben hybridisieren oder sich sonstwie mit diesen verbinden.RNA samples can with a so-called "tag" or "label", i.e. provided with a molecule which e.g. emits a fluorescent light with a specific wavelength. Immobilized samples can also amino acid-containing (e.g. proteins, peptides) or nucleic acid (e.g. cDNA, RNA) Include samples. Patterns added to the immobilized samples can any molecules or chemical compounds, which with the immobilized Hybridize samples or otherwise connect to them.
Unter guten experimentellen Bedingungen hybridisieren bzw. binden die RNA-Muster an die immobilisierten DNA-Proben und bilden mit diesen zusammen hybride DNA-RNA-Stränge. Für jede der immobilisierten DNA-Proben und für spezielle RNA-Muster kann man Unterschiede in der Hybridisierung unter den DNA-Proben durch die Messung der Intensität und der Wellenlängenabhängigkeit der Fluoreszenz jedes einzelnen Mikroarray-Elements feststellen und so herausfinden, ob der Grad der Genexpression in den untersuchten DNA-Proben variiert. Mit der Verwendung von DNA-Mikroarrays können somit über die Expression von grossen Mengen von Genen und über deren Expressionsmuster umfassende Aussagen gemacht werden, obwohl nur geringe Mengen an biologischem Material eingesetzt werden müssen.Under good experimental conditions hybridize or bind the RNA patterns to the immobilized DNA samples and together form hybrid ones DNA-RNA strands. For every of the immobilized DNA samples and for special RNA patterns differences in hybridization among DNA samples due to the Measurement of the intensity and the wavelength dependency the fluorescence of each individual microarray element and so find out whether the level of gene expression in the examined DNA samples varied. With the use of DNA microarrays you can use the Expression of large amounts of genes and their expression pattern Comprehensive statements are made, although only small amounts of biological material must be used.
DNA-Mikroarrays
haben sich als erfolgreiche Werkzeuge etabliert und die Geräte zur Durchführung der
DNA-Hybridisierung wurden laufend verbessert (vgl. z.B.
Es
kommt einerseits immer wieder vor, dass Luftblasen beim Einfüllen von
Flüssigkeiten
oder auch später
in der Hybridisierkammer entstehen. Andererseits wurde versucht
(vgl. z.B.
Aus
dem Stand der Technik sind zudem zahlreiche Methoden bekannt, um
das spontane Auftreten von Luftblasen oder das Verbleiben derselben
in der Kammer zu behindern. So wurde z.B. ein nichtparalleles Anordnen
der die Hybridisierkammer definierenden Objektträger und Deckel vorgeschlagen
(vgl.
Aus
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft das Bereitstellen eines alternativen Systems, mit welchem das Ausbilden von Luftblasen in einer Hybridisierkammer auf einfache Art und Weise verhindert werden kann.The The object of the present invention relates to the provision of a alternative system with which the formation of air bubbles in a hybridization chamber can be prevented in a simple manner.
Diese Aufgabe wird gemäss dem kennzeichnenden Teil des unabhängigen Anspruchs 1 dadurch gelöst, dass ein eingangs beschriebenes System eine Druckeinrichtung zum Aufbauen eines Drucks in der Hybridisierkammer umfasst, der über dem in der Umgebungsluft herrschenden, normalen atmosphärischen Druck liegt. Zusätzliche, bevorzugte erfinderische Merkmale ergeben sich jeweils aus den abhängigen Ansprüchen.This Task is according to the characterizing part of independent claim 1 thereby solved, that a system described in the introduction a printing device for Build up a pressure in the hybridization chamber that over the normal atmospheric conditions prevailing in the ambient air There is pressure. additional, preferred inventive features result from the dependent claims.
Das erfindungsgemässe System wird nun an Hand von schematischen, den Umfang der Erfindung nicht beschränkenden Zeichnungen von beispielhaften Ausführungsformen im Detail erläutert. Dabei zeigen:The invention System is now based on schematic, not the scope of the invention restrictive Drawings of exemplary embodiments explained in detail. there demonstrate:
Zum
besseren Verteilen der Hybridisiermedien in den Hybridisierkammern
Die
Anordnung umfasst eine medientrennende Agitationseinrichtung 32
zum Bewegen von Flüssigkeiten
gegenüber
auf der Oberfläche
Diese
Querströmkanäle
Vorzugsweise
ist ein zweiter, ebenfalls mit einer Membran
Alle
Leitungen
Die
Druckleitungen
Der
Inertgasbehälter
Werden
nur das Gasventil
Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass mittels Erzeugen
eines Überdrucks
in den Hybridisierkammern
Tatsächlich treten
unter diesen Druckverhältnissen
während
der Hybridisierung keine Luftblasen mehr auf. Der diesem Phänomen zu
Grunde liegende Funktionsmechanismus ist nicht restlos aufgeklärt. Es wird jedoch
angenommen, dass der erhöhte
Druck einerseits die Diffusionsrichtung im Bereich der O-Ring-Dichtung
Erfindungsgemäss kann
der verlangte Überdruck
in den Hybridisierkammern
Alternativ
dazu kann auch Inertgas aus dem Behälter
Eine
weitere Alternative (in den Figuren nicht dargestellt) besteht darin,
eine Druckpumpe und einen Druckbehälter (ähnlich wie die mit
Wird
ein System
Typischerweise wird eine Hybridisierung wie folgt durchgeführt:typically, hybridization is carried out as follows:
-
a) Ausspülen
von Luftblasen und Flüssigkeitsresten
aus der Verteilleitung
10 und der Sammelleitung15 . Zu diesem Zweck werden nur die Ventile4 (A.D.),19 und17 geöffnet und es wird mit der Förderpumpe8 destilliertes Wasser aus dem Gefäss2 (A.D.) über das Ventil4 (A.D.) in die Verteilleitung10 gepumpt. Das destillierte Wasser strömt durch das Verbindungsventil19 in die Sammelleitung15 und von dort über das Abfallventil17 in die Abfallleitung16 . Gleichzeitig werden die Hybridisierkammern5 aufgebaut. Dies geschieht durch das Auflegen von (vorzugsweise in einem Transportrahmen52 gehaltenen) Objektträgern27 mit darauf immobilisierten Proben auf die Kontaktplatte53 eines Thermostats, durch das Einsetzen von Deckeln26 in den Klapprahmen54 des Systems1 zum Hybridisieren von auf Objektträgern27 immobilisierten Nukleinsäureproben, Proteinen oder Gewebeschnitten und durch das Verschliessen der Hybridisierkammern5 mittels Herunterklappen der Deckel26 auf die Objektträger24 (vgl.4 und5 ). Dieses Herunterklappen verbindet die Enden der Einlassleitungen11 , der Auslassleitungen12 und der Druckleitungen35 der Agitationseinrichtung32 jeder einzelnen Hybridisierkammer5 mit den entsprechenden Leitungsenden des Systems1 . Vorzugsweise werden – entsprechend den vier in einem Transportrahmen52 aufgenommenen Objektträgern27 – vier Deckel26 in einen Klapprahmen54 eingesetzt.a) Rinsing out air bubbles and liquid residues from the distribution line10 and the manifold15 , For this purpose only the valves4 (AD),19 and17 opened and it is with the feed pump8th distilled water from the vessel2 (AD) via the valve4 (AD) into the distribution line10 pumped. The distilled water flows through the connection valve19 into the manifold15 and from there through the waste valve17 into the waste line16 , At the same time, the hybridization chambers5 built up. This is done by placing (preferably in a transport frame52 held) slides27 with samples immobilized on the contact plate53 a thermostat by inserting lids26 in the snap frame54 of the system1 for hybridizing slides27 immobilized nucleic acid samples, proteins or tissue sections and by closing the hybridization chambers5 by folding down the lid26 on the slides24 (see.4 and5 ). This flip down connects the ends of the inlet lines11 , the exhaust pipes12 and the pressure lines35 the agitation facility32 every single hybridization chamber5 with the corresponding line ends of the system1 , Preferably - according to the four in a transport frame52 recorded slides27 - four lids26 in a snap frame54 used. -
b) Füllen
und Thermostatisieren der Hybridisierkammern
5 mit Prähybridisier-Puffer. Zu diesem Zweck werden nur die Ventile4 (V-P),12 ,14 und17 geöffnet und es wird mit der Förderpumpe8 Prähybridisier-Puffer aus dem Gefäss2 (V-P) über das Ventil4 (V-P) in die Verteilleitung10 und von dort über die Einlassventile12 in die Hybridisierkammern5 gepumpt. Ein Teil des Prähybridisier-Puffers verlässt die Hybridisierkammern5 über die Auslassventile14 und die Sammelleitung15 und gelangt über das Abfallventil17 in die Abfallleitung16 . Dieser Vorgang verlangt besondere Beachtung, weil hier zum ersten Mal Luftblasen in die Hybridisierkammern5 eingeschleppt werden können.b) filling and thermostatting of the hybridization chambers5 with prehybridization buffer. For this purpose only the valves4 (VP)12 .14 and17 opened and it is with the feed pump8th Prehybridization buffer from the vessel2 (VP) via the valve4 (VP) in the distribution line10 and from there through the intake valves12 into the hybridization chambers5 pumped. Part of the prehybridization buffer leaves the hybridization chambers5 via the exhaust valves14 and the manifold15 and gets through the waste valve17 into the waste line16 , This process requires special attention because this is the first time that air bubbles have entered the hybridization chambers5 can be introduced. -
c) Ausblasen der Verteilleitung
10 und der Sammelleitung15 . Zu diesem Zweck werden nur die Ventile9 ,19 und17 geöffnet und es wird mit der Förderpumpe8 Luft über das Belüftungsventil9 angesaugt und über die Verteilleitung10 , das Verbindungsventil19 in die Sammelleitung15 und von dort über das Abfallventil17 in die Abfallleitung16 gepumpt.c) blowing out the distribution line10 and the manifold15 , For this purpose only the valves9 .19 and17 opened and it is with the feed pump8th Air through the ventilation valve9 sucked in and over the distribution line10 , the connection valve19 into the manifold15 and from there through the waste valve17 into the waste line16 pumped. -
d) Probenzugabe in die Hybridisierkammern
5 . Zu diesem Zweck werden nur die Ventile14 und21 geöffnet. Die Proben werden mit einer Pipette über die Musterzuführung31 im Deckel26 in die Hybridisierkammern5 gepresst. Dadurch wird ein entsprechendes Volumen Prähybridisier-Puffer aus den Hybridisierkammern5 in die Auslassleitung13 mit den geöffneten Auslassventilen14 verdrängt. Dies wiederum verdrängt ein entsprechende Volumen Luft aus der Sammelleitung15 . Diese verdrängte Luft strömt durch das geöffnete Entlastungsventil21 in die Entlastungsleitung20 und gelangt in den Sammelbehälter22 , den sie über die Entlüftungsöffnung23 verlässt. Dieser Vorgang verlangt besondere Beachtung, weil hier zum zweiten Mal Luftblasen in die Hybridisierkammern5 eingeschleppt werden können.d) Sample addition into the hybridization chambers5 , For this purpose only the valves14 and21 open. The samples are pipetted over the sample feeder31 in the lid26 into the hybridization chambers5 pressed. As a result, a corresponding volume of prehybridization buffer is obtained from the hybridization chambers5 into the outlet pipe13 with the exhaust valves open14 repressed. This in turn displaces a corresponding volume of air from the manifold15 , This displaced air flows through the open relief valve21 into the discharge line20 and gets into the collection container22 that they have through the vent23 leaves. This process requires special attention because it is the second time that air bubbles have entered the hybridization chambers5 can be introduced. -
e) Gleichmässiges
Verteilen der Hybridisiermedien in den Hybridisierkammern
5 und gegenüber den auf den Objektträgern27 immobilisierten Proben. Zu diesem Zweck sind zuerst alle Ventile geschlossen. Dann wird der Kammerdruck wie schon beschrieben erhöht und die Agitationseinrichtung32 in Betrieb genommen. Alle eventuell in den Hybridisierkammern5 vorhandenen Luftblasen werden bei diesem Druckaufbau eliminiert.e) Even distribution of the hybridization media in the hybridization chambers5 and versus those on the slides27 immobilized samples. For this purpose, all valves are closed first. Then the chamber pressure is increased as already described and the agitation device32 put into operation. All possibly in the hybridization chambers5 existing air bubbles are eliminated with this pressure build-up. -
f) Hybridisieren der Proben während beispielsweise 17 Stunden.
Währen
der Hybridisierung können
die Medien in den Hybridisierkammern
5 konstant oder intermittierend agitiert werden. Dieser Vorgang verlangt besondere Beachtung, weil hier Luftblasen spontan in den Hybridisierkammern5 entstehen können. Um dies zu verhindern, kann der Kammerdruck während der Hybridisierung korrigierend angepasst und konstant gehalten bzw. gemäss einem individuellen Programm verändert werden. Ein solches Programm kann das Erhöhen und Erniedrigen des Kammerdruckes in bestimmten Druck- und Zeitschritten definieren, so dass ein schonendes Hybridisieren der Proben gewährleistet ist, die eine solch spezielle Behandlung verlangen.f) Hybridizing the samples for 17 hours, for example. During hybridization, the Media in the hybridization chambers5 be agitated constantly or intermittently. This process requires special attention because here air bubbles spontaneously in the hybridization chambers5 can arise. To prevent this, the chamber pressure can be corrected during the hybridization and kept constant or changed according to an individual program. Such a program can define the increase and decrease of the chamber pressure in certain pressure and time steps, so that a gentle hybridization of the samples is guaranteed, which require such special treatment. -
g) Waschen der hybridisierten Proben mit Puffern. Zu diesem
Zweck wird zuerst der Kammerdruck auf Normaldruck reguliert, indem
die Auslassventile
14 und das Abfallventil17 geöffnet werden. Darauf werden Waschflüssigkeiten mittels der Förderpumpe8 sequentiell und je nach Bedarf aus den Gefässen2 durch die entsprechend geöffneten Ventile4 in die Verteilleitung10 und von da über die geöffneten Einlassventile12 und die Einlassleitungen11 in die Hybridisierkammern5 gepumpt. Die Waschflüssigkeiten und Waschabfälle verlassen die Hybridisierkammern5 über die Auslassleitungen13 und die bereits geöffneten Auslassventile14 , werden in der Sammelleitung15 zusammengeführt und durch das geöffnete Abfallventil17 in die Abfallleitung16 abgeführt.g) washing the hybridized samples with buffers. For this purpose the chamber pressure is first regulated to normal pressure by the exhaust valves14 and the waste valve17 be opened. Washing liquids are then pumped on8th sequentially and as required from the vessels2 through the correspondingly opened valves4 into the distribution line10 and from there through the open intake valves12 and the inlet pipes11 into the hybridization chambers5 pumped. The washing liquids and washing waste leave the hybridization chambers5 via the outlet lines13 and the exhaust valves already open14 , are in the manifold15 merged and through the open waste valve17 into the waste line16 dissipated. -
h) Trocknen der hybridisierten Proben auf den Objektträgern
27 . Zu diesem Zweck werden nur die Ventile12 ,14 und17 geöffnet. Darauf wird das Inertgasventil50 geöffnet und die Verteilleitung10 , die Einlassleitungen11 , die Hybridisierkammern5 , die Auslassleitungen13 und die Sammelleitung15 über das geöffnete Abfallventil17 und die Abfallleitung16 mit Inertgas durchgespült bis die Proben trocken sind. Anschliessend könne die fertigen Proben entnommen werden.h) drying the hybridized samples on the slides27 , For this purpose only the valves12 .14 and17 open. Then the inert gas valve50 opened and the distribution line10 who have favourited Inlet Pipes11 , the hybridization chambers5 , the exhaust pipes13 and the manifold15 via the open waste valve17 and the waste line16 flushed with inert gas until the samples are dry. The finished samples can then be taken.
Alternativ
zum eben beschriebenen Verfahrensschritt h) erfolgt das Trocknen
der hybridisierten Proben auf den Objektträgern
Bevorzugt
wird auch eine alternative Ausführungsform
des erfindungsgemässen
Verfahrens, bei der auf die zweite Membran
Alternativ kann der Schritt c) mit einem Inertgas (z.B. N2) ausgeführt werden: In diesem Fall können chemische Wechselwirkungen zwischen dem gasförmigen Federelement N2 und den Proben ausgeschlossen werden.Alternatively, step c) can be carried out with an inert gas (eg N 2 ): In this case, chemical interactions between the gaseous spring element N 2 and the samples can be excluded.
Physikalisches AusführungsbeispielPhysical embodiment
In
einer ersten Versuchsreihe wurde die physikalischen Grundlagen untersucht.
Dazu wurden mehrere 100 Objektträger
ohne Proben bearbeitet. Die vorzugsweise aus einem Elastomer bestehenden
O-Ring-Dichtungen
Während beim Standardgerät SN22 im Laufe des Bearbeitens von Slides bzw. Objektträgern mit hydrophoben Oberflächen regelmässig Luftblasen zu beobachten waren, wurden beim erfindungsgemässen Prototypen keinerlei Luftblasen festgestellt.While at standard equipment SN22 during the processing of slides or slides with hydrophobic surfaces regularly Air bubbles were observed in the prototype according to the invention no air bubbles found.
Biologisches AusführungsbeispielBiological embodiment
Zum
Durchführen
eines Beispiels einer erfindungsgemäss unter erhöhtem Druck
durchgeführten
Hybridisierung wurden zwei Systeme zeitparallel und unabhängig voneinander
eingesetzt. Es handelt sich dabei um ein Standardgerät des Anmelders
(Tecan HS 400, Seriennummer
Die
Hybridisierungsprozedur (Pufferzubereitung, Musterinjektion, Programmdefinierung
an den verwendeten Hybridisier-Systemen) wurde gemäss den techni schen
Instruktionen von Alopex (ALOPEX GmbH, Fritz-Hornschuch-Str. 9,
D-95326 Kulmbach,
Bundesrepublik Deutschland) durchgeführt. In die Hybridisier-Systeme SN22 und
PT3 wurden jeweils je zwei Objektträger
Verwendet
wurde ein Testkit „HybCheck" von Alopex mit der
Kit-Chargennummer: 040524). Dieser Testkit dient zur Überprüfung der
Hybridisier-Systeme und ist so ausgelegt, dass die Hybridisiertemperaturen vordefiniert
sind und dass die „OK" Signale nur bei
exaktem Einhalten der vorgesehenen Temperaturen sowie der relevanten
Testparameter in Bezug auf Waschen, Agitieren und Trocknen abgegeben
werden. Bei den auf den Objektträgern
Das ausgeführte Programm für jeden Probelauf lautet im Detail:The executed Program for every test run is in detail:
- a) Zubereitung der „HybCheck Waschpuffer 1 und 2 lt. Herstellerangaben;a) Preparation of the "HybCheck Wash Buffer 1 and 2 according to manufacturer's instructions;
- b) Lösen von lyophilisierten, fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden in 250 μl auf eine Hybridisiertemperatur (43 °C bzw. 61 °C) vorgewärmtem HybCheck Puffer für die Hybridisierung;b) Loosen of lyophilized, fluorescence-labeled oligonucleotides in 250 μl to one Hybridization temperature (43 ° C or 61 ° C) preheated HybCheck buffer for the hybridization;
- c) Einlegen von je 2 Objektträgern (mit je 6 Sub Arrays) auf Position 1 und 2 in das Hybridisier-System, Verwendung der grossen Hybridisierungskammern (63,5 mm × 20 mm);c) Insert 2 slides each (with 6 sub arrays each) at positions 1 and 2 in the hybridization system, use of the large ones Hybridization chambers (63.5 mm × 20 mm);
- d) Schliessen der Hybridisierungskammern und Starten des Hybridisierungsprogrammes;d) closing the hybridization chambers and starting the hybridization program;
- e) Hybridisierungsprogramm: 1. Erstes Waschen bei 43 °C bzw. 61 °C, Dauer 30 sec; 2. Injektion von 105 μl der Oligonukleotidlösung bei 43 °C bzw. 61 °C in jede Kammer; 3. Hybridisierung bei 43 °C bzw. 61 °C; bei starker Agitation und während 60 min; 4. Waschschritt 1 bei 23 °C (Kanal 1) während 30 sec; Absaugen während 30 sec; 2 Wiederholungen; 5. Waschschritt 2 bei 23 °C (Kanal 2) während 30 sec; Absaugen während 30 sec; 2 Wiederholungen; 6. Trocknen der objektträger während 3 min bei 23 °C;e) Hybridization program: 1. First wash at 43 ° C or 61 ° C, duration 30 sec; 2. Inject 105 μl of the oligonucleotide solution 43 ° C or 61 ° C in every chamber; 3. Hybridization at 43 ° C or 61 ° C; with strong agitation and while 60 min; 4. Wash step 1 at 23 ° C (channel 1) for 30 sec; Suction during 30 sec; 2 repetitions; 5. Washing step 2 at 23 ° C (channel 2) during 30 sec; Suction during 30 sec; 2 repetitions; 6. Dry the slides during 3 min at 23 ° C;
- f) Nach Beendigung der Hybridisierung wurden beide Objektträger herausgenommen und in einen Laser Scanner (Tecan LS400) eingelegt;f) After completion of the hybridization, both slides were removed and placed in a laser scanner (Tecan LS400);
- g) Messeinstellung des Laser Scanners: 1. Scan Mode: einzelne Wellenlänge 2. Laserwellenlänge: 543 nm (grün) 3. Filterwellenlänge: 590 nm 4. Gain: 165 5. Autofokus Modus: NS Autofokus, Ebene 1 6. Scan Resolution: 10 μm 7. Pinhole: klein 8. Oversampling Faktor: 1g) Measurement setting of the laser scanner: 1. Scan mode: single wavelength Second Laser wavelength: 543 nm (green) Third Filter wavelength: 590 nm 4. Gain: 165 5.Autofocus mode: NS autofocus, level 1 6. Scan resolution: 10 μm 7. Pinhole: small 8th. Oversampling factor: 1
- h) Nach Messung im Laser Scanner wurden die erhaltenen Rohdaten ausgewertet wie folgt:h) After measurement in the laser scanner, the raw data obtained evaluated as follows:
Hybridisierung bei 43 °C:Hybridization at 43 ° C:
- 1. 6 Sub Arrays (6×9 Spots) auf einem Objektträger (Microslide)1. 6 sub arrays (6 × 9 spots) on a slide (microslide)
- 2. Perfect Match (PM) bei 43 °C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array)2. Perfect Match (PM) at 43 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
- 3. Mismatch 1 (MM1) bei 43 °C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array)3. Mismatch 1 (MM1) at 43 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
- 4. Mismatch 2 (MM2) bei 43 °C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array)4. Mismatch 2 (MM2) at 43 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
- 5. Negative Controls: 36 Spots pro Slide (6 pro Sub Array)5. Negative controls: 36 spots per slide (6 per sub array)
- 6. Von allen PM's und MM1's pro Microslide (24 Einzelwerte) wurde der Mittelwert, die Standartabweichung und der CV berechnet. Dabei gilt: CV = (Standartabweichung/Mittelwert) × 1006. Of all PM's and MM1's per microslide (24 individual values) became the mean, the standard deviation and the CV calculated. The following applies: CV = (standard deviation / mean) × 100
- 7. Diskriminierung PM:MM1 (1:5) sowie Diskriminierung PM:MM2 (1:20) berechnet7. Discrimination PM: MM1 (1: 5) and discrimination PM: MM2 (1:20) calculated
- 8. Die CV-Wert und die Diskriminierungs-Werte als „OK" (falls CV über ein ganzes Slide < 18%) oder „failed" angegeben.8. The CV value and the discrimination values as "OK" (if CV over a whole slide <18%) or "failed" is specified.
Hybridisierung bei 61 °C:Hybridization at 61 ° C:
- 1. 6 Sub Arrays (6×9 Spots) auf einem Objektträger (Microslide)1. 6 sub arrays (6 × 9 spots) on a slide (microslide)
- 2. Perfect Match (PM) bei 61°C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array)2. Perfect Match (PM) at 61 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
- 3. Mismatch 1 (MM1) bei 61°C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array)3. Mismatch 1 (MM1) at 61 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
- 4. Mismatch 2 (MM2) bei 61°C: 24 Spots pro Slide (4 pro Sub Array)4. Mismatch 2 (MM2) at 61 ° C: 24 spots per slide (4 per sub array)
- 5. Negativkontrollen: 36 Spots pro Slide (6 pro Sub Array)5. Negative controls: 36 spots per slide (6 per sub array)
- 6. Von allen PM's und MM1's pro Microslide (24 Einzelwerte) wurde der Mittelwert, die Standartabweichung und der CV berechnet. Dabei gilt: CV =(Standartabweichung/Mittelwert) × 1006. Of all PM's and MM1's per microslide (24 individual values) became the mean, the standard deviation and the CV calculated. The following applies: CV = (standard deviation / mean) × 100
- 7. Diskriminierung PM:MM1 (1:5) sowie Diskriminierung PM:MM2 (1:20) berechnet7. Discrimination PM: MM1 (1: 5) and discrimination PM: MM2 (1:20) calculated
- 8. Die CV-Werte und die Diskriminierungs-Werte als „Ok" (falls CV über ein ganzes Slide < 18%) oder „failed" angegeben.8. The CV values and the discrimination values as "Ok" (if CV over a whole slide <18%) or "failed" is specified.
Die
folgenden Ergebnisse wurden erzielt: 43 °C / HS 400
SN22
Die gezeigten Resultate belegen nicht nur, dass beide verwendeten Geräte sehr brauchbare Resultate liefern. Vielmehr sind die in den beiden Geräten SN22 und PT3 erzielten Resultate (nach Temperaturen geordnet) einander so ähnlich, dass ein Einfluss des erhöhten Druckes auf die Hybridisierung ausgeschlossen werden kann.The The results shown not only prove that both devices used a lot deliver useful results. Rather, they are in the two devices SN22 and PT3 achieved results (ordered by temperature) so similar, that an influence of the heightened Pressure on the hybridization can be excluded.
Das erfindungsgemässe Verhindern von Luftblasen ist nicht auf den Einsatz in Hybridisierkammern beschränkt. Auch andere Geräte können so ausgebildet sein, dass in ihnen das Auftreten von unerwünschten Luftblasen verhindert werden kann. Solche Geräte oder Instrumente können z.B. aus dem Bereich der Microfluidics-Technologie stammen, wie etwa „Lab on a Chip" – Systeme.The invention Preventing air bubbles is not limited to use in hybridization chambers. Also other devices can be designed so that the occurrence of unwanted air bubbles in them can be prevented. Such devices or instruments can e.g. come from the field of microfluidics technology, such as “Lab on a chip "systems.
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