DE20122302U1 - Variante des Modifizierten Vaccinia-Ankara-Virus - Google Patents
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Abstract
Vaccinia
Virus mit wenigstens einer der folgenden Eigenschaften:
(i) Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in Hühnerembryofibroblasten (CEF) jedoch keine Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in der menschlichen Keratinozytenzellinie HaCat,
(ii) Unfähigkeit zur Replikation in ernsthaft immungeschädigten Mäusen,
(iii) Induktion einer höheren Immunisierungswirkung im Vergleich zu dem bekannten Stamm MVA 575 (Hinterlegt bei der ECACC mit der Hinterlegungsnummer V00120707) in einem Modell mit letaler Exposition und/oder
(iv) Induktion von im Wesentlichen dem gleichen Immunitätsgrad in Vacciniavirus-Prime/Vacciniavirus-Boost Systemen verglichen mit DNA Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen.
(i) Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in Hühnerembryofibroblasten (CEF) jedoch keine Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in der menschlichen Keratinozytenzellinie HaCat,
(ii) Unfähigkeit zur Replikation in ernsthaft immungeschädigten Mäusen,
(iii) Induktion einer höheren Immunisierungswirkung im Vergleich zu dem bekannten Stamm MVA 575 (Hinterlegt bei der ECACC mit der Hinterlegungsnummer V00120707) in einem Modell mit letaler Exposition und/oder
(iv) Induktion von im Wesentlichen dem gleichen Immunitätsgrad in Vacciniavirus-Prime/Vacciniavirus-Boost Systemen verglichen mit DNA Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen.
Description
- Die vorliegende Erfindung stellt ein abgeschwächtes Virus bereit, das vom modifizierten Vaccinia-Ankara-Virus abgeleitet und durch den Verlust seiner Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in menschlichen Zelllinen gekennzeichnet ist. Sie beschreibt weiterhin von diesem Virus abgeleitete, rekombinante Viren und die Verwendung des Virus oder seiner Rekombinanten als Medikament oder Impfstoff. Außerdem wird ein Verfahren zum Hervorrufen einer Immunreaktion sogar bei immungeschädigten Patienten, Patienten mit zuvor existierender Immunität gegenüber dem Impfstoffvirus oder Patienten, die sich einer Antivirus-Therapie unterziehen, bereitgestellt.
- Hintergrund der Erfindung
- Das modifizierte Vaccinia-Ankara (MVA)-Virus ist mit dem Vacciniavirus, einem Mitglied der Gattung Orthopoxvirus in der Familie der Poxviridae, verwandt. MVA wurde durch 516 Serienpassagen auf Hühnerembryo-Fibroblasten des Ankara-Stamms des Vacciniavirus (CVA) erzeugt (hinsichtlich eines Überblicks, siehe Mayr, A., et al. Infection 3, 6–14 [1975]). Als Folge dieser Langzeitpassagen verlor das resultierende MVA-Virus etwa 31 Kilobasen seiner Genomsequenz und wurde daher bezüglich der Wirtszellen als stark auf Vogelzellen beschränkt beschrieben (Meyer, N. et al., J.Gen.Virol. 72, 1031–1038 [1991]). Es zeigte sich bei einer Vielzahl von Tiermodellen, dass das resultierende MVA signifikant avirulent war (Mayr, A. & Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41:225–34). Außerdem wurde dieser MVA-Stamm in klinischen Versuchen als Impfstoff für die Immunisierung gegen die menschliche Pockenerkrankung getestet (Mayr, et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375–390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392 [1974]). Diese Studien umfassten über 120.000 Menschen, einschließlich Hochrisikopatienten, und bewiesen, dass MVA verglichen mit Impfstoffen auf Vaccinia-Basis eine verminderte Virulenz oder Infektiosität aufwies und dabei eine gute Immunisierungswirkung bewahrte.
- In den folgenden Jahrzehnten wurde MVA für die Verwendung als Virusvektor zur rekombinanten Genexpression oder als rekombinanter Impfstoff konstruiert. (Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12 :1032–40).
- Diesbezüglich ist es äußerst erstaunlich, dass, obwohl Mayr et al. in den 70er-Jahren nachwiesen, dass MVA bei Menschen und Säugetieren stark abgeschwächt und avirulent ist, manche Beobachtungen, über die jüngst berichtet wurde (Blanchard et al., 1998, J Gen Virol 79, 1159–1167; Carroll & Moss, 1997, Virology 238, 198–211; Altenbergen, US-Patent 5,185,146; Ambrosini et al., 1999, J Neurosci Res 55(5), 569), zeigten, dass MVA in Zelllinien von Säugetieren und Menschen nicht völlig abgeschwächt ist, da in diesen Zellen eine Restreplikation auftreten könnte. Es wird angenommen, dass die Ergebnisse, über die in diesen Veröffentlichungen berichtet wird, bei verschiedenen MVA-Stämmen erzielt wurden, da sich die verwendeten Viren in ihren Eigenschaften, insbesondere ihrem Wachstums-verhalten in verschiedenen Zelllinien, wesentlich unterscheiden.
- Das Wachstumsverhalten wird als Indikator für die Virusabschwächung verstanden. Im Allgemeinen wird ein Virusstamm als abgeschwächt angesehen, wenn er seine Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in Wirtszellen verloren oder bloß verringert hat. Die obenstehend erwähnte Beobachtung, dass MVA in menschlichen Zellen und Säugetierzellen nicht völlig replikationsunfähig ist, stellt die absolute Sicherheit von MVA als Impfstoff für Menschen oder als Vektor für rekombinante Impfstoffe in Frage.
- Das Gleichgewicht zwischen Wirksamkeit und Sicherheit des Impfstoff-Vektorvirus ist insbesondere für einen Impfstoff sowie für einen rekombinanten Impfstoff extrem wichtig.
- Ziel der Erfindung
- Ein Ziel der Erfindung ist somit die Bereitstellung von neuartigen Virusstämmen mit erhöhter Sicherheit für die Entwicklung von sichereren Produkten, wie z.B.
- Impfstoffen oder Pharmazeutika. Ein weiteres Ziel ist überdies die Bereitstellung von Mitteln zur Verbesserung einer bestehenden Impftherapie.
- Detaillierte Beschreibung der Erfindung
- Zur Erreichung der vorhergehenden Ziele werden gemäß einer bevorzugten Ausführungs-form der vorliegenden Erfindung neuartige Vacciniaviren bereitgestellt, welche zur reproduktiven Replikation in nicht menschlichen Zellen und Zelllinien, insbesondere in Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) und in der Nierenzelllinie BHK vom Hamsterjungen (ECACC 85011433), fähig sind, jedoch nicht zur reproduktiven Replikation in menschlichen Zelllinien.
- Die bekannten Vaccinia-Stämme replizieren reproduktiv in zumindest einigen menschlichen Zelllinien, insbesondere in der menschlichen Keratinozytenzelllinie HaCat_(Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3): 761–71 ). Die Replikation in der Zelllinie HaCat lässt die in vivo-Replikation, insbesondere die in vivo-Replikation beim Menschen, vorhersagen. Im Beispielsabschnitt wird in der Tat gezeigt, dass alle getesteten bekannten Vaccinia-Stämme, die in HaCat eine produktive Restreplikation aufweisen, auch in vivo replizieren. Somit bezieht sich die Erfindung vorzugsweise auf Vacciniaviren, die in der menschlichen Zelllinie HaCat nicht reproduktiv replizieren. Am meisten bevorzugt betrifft die Erfindung Vacciniavirus-Stämme, die zur reproduktiven Replikation in irgendeiner der folgenden menschlichen Zelllinien unfähig sind: die menschliche Gebärmutterhals-Adenokarzinom-Zelllinie HeLa (ATCC Nr. CCL-2), die menschliche Embryonen-Nierenzelllinie 293 (ECACC Nr. 85120602), die menschliche Knochensarkom-Zelllinie 143B (ECACC Nr. 91112502) und die Zelllinie HaCat.
- Das Wachstumsverhalten oder die Amplifikation/Replikation eines Virus wird normaler-weise ausgedrückt durch das Verhältnis zwischen dem von einer infizierten Zelle produzierten Virus (Output) und der Menge, die urprünglich überhaupt erst zum Infizieren der Zellen verwendet wurde (Input) („Amplifikationsverhältnis"). Ein Verhältnis von „1" zwischen Output und Input definiert einen Amplifikationszustand, bei dem die von den infizierten Zellen produzierte Virusmenge dieselbe ist wie die Menge, die anfänglich zum Infizieren der Zellen verwendet wurde. Dieser Zustand weist auf die Tatsache hin, dass die infizierten Zellen eine Virusinfektion und Virusreproduktion zufassen.
- Ein Amplifikationsverhältnis von weniger als 1, d.h. ein Absinken der Amplifikation unter den Inputlevel, ist ein Hinweis auf einen Mangel an reproduktiver Replikation und somit ein Hinweis auf eine Abschwächung des Virus. Es lag daher im besonderen Interesse der Erfinder, einen Stamm zu identifizieren und schließlich zu isolieren, welcher in mehreren menschlichen Zelllinien, insbesondere in jeder der menschlichen Zelllinien 143B, HeLa, 293 und HaCat, ein Amplifikationsverhältnis von weniger als 1 aufweist.
- Somit bedeutet der Begriff „zur reproduktiven Replikation unfähig", dass das erfindungs-gemäße Virus in menschlichen Zelllinien, wie z.B. den Zelllinien 293 (ECACC Nr. 85120602), 143B (ECACC Nr. 91112502), HeLa (ATCC Nr. CCL-2) und HaCat (Boukamp et al 1988, J Cell Biol 106(3): 761–71 ), ein Amplifikationsverhältnis von weniger als 1 aufweist, und zwar unter den Bedingungen, die in Beispiel 1 der vorliegenden Beschreibung hinsichtlich einiger spezifischer MVA-Stämme kurz umrissen sind. Vorzugsweise beträgt die Amplifikationsrate des erfindungsgemäßen Virus in jeder der obenstehenden menschlichen Zelllinien HeLa, HaCat und 143B 0,8 oder weniger.
- In Beispiel 1 und Tabelle 1 wird im Detail gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Viren in keiner der Zelllinien 143B, HeLa und HaCat reproduktiv replizieren. Der bestimmte erfindungsgemäße Stamm, welcher in den Beispielen zur Anwendung kam, wurde bei der European Collection of Cell Cultures unter der Nummer V00083008 hinterlegt. Dieser Stamm wird in der Beschreibung durchwegs als „MVA-BN" bezeichnet.
- Die bekannten MVA-Stämme zeigen in zumindest einer der getesteten menschlichen Zelllinien eine Restreplikation (
1 , Beispiel 1). Alle bekannten Vaccinia-Stämme zeigen zumindest eine gewisse Replikation in der Zelllinie HaCat, während die erfindungsgemäßen MVA-Stämme, insbesondere MVA-BN, in HaCat- Zellen nicht produktiv replizieren. Im Detail zeigt MVA-BN in der menschlichen Embryonen-Nierenzelllinie 293 (ECACC Nr. 85120602) ein Amplifikationsverhältnis von 0,05 bis 0,2. Bei der menschlichen Knochen-sarkom-Zelllinie 143B (ECACC Nr. 91112502) liegt das Verhältnis im Bereich von 0,0 bis 0,6. Bei der menschlichen Gebärmutterhals-Adenokarzinom-Zelllinie HeLa (ATCC Nr. CCL-2) und der menschlichen Keratinozytenzelllinie HaCat (Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3): 761–71) liegt das Amplifikationsverhältnis im Bereich von 0,04 bis 0,8 bzw. 0,02 bis 0,8. MVA-BN hat in Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (CV1: ATCC Nr. CCL-70) ein Amplifikationsverhältnis von 0,01 bis 0,06. Somit repliziert MVA-BN, das ein erfindungsgemäßer Prototypstamm ist, in keiner der getesteten menschlichen Zelllinien produktiv. - Das Amplifikationsverhältnis von MVA-BN liegt bei Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF: Primärkulturen) oder bei der Nierenzelllinie BHK vom Hamsterjungen (ATCC Nr. CRL-1632) deutlich über 1. Wie obenstehend kurz dargestellt, weist ein Verhältnis von mehr als „1" auf eine reproduktive Replikation hin, da die von den infizierten Zellen produzierte Virusmenge im Vergleich zur Virusmenge, die zum Infizieren der Zellen verwendet wurde, erhöht ist. Daher kann das Virus in CEF-Primärkulturen mit einem Verhältnis von über 500 oder in BHK-Zellen mit einem Verhältnis von über 50 leicht vermehrt und amplifiziert werden.
- Bei einer bestimmten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Erfindung Derivate des unter ECACC V0003008 hinterlegten Virus. „Derivate" der unter ECACC V00083008 hinterlegten Viren beziehen sich auf Viren, welche im Wesentlichen dieselben Replikationseigenschaften wie der hinterlegte Stamm, jedoch Unterschiede in einem oder mehreren Teilen ihres Genoms aufweisen. Viren mit denselben „Replikationseigenschaften" wie das hinterlegte Virus sind Viren, welche in CEF-Zellen und in den Zelllinien BHK, HeLa, HaCat und 143B mit ähnlichen Amplifikationsverhältnissen wie der hinterlegte Stamm replizieren und welche in vivo eine ähnliche Replikation zeigen, wie im transgenen AGR129-Mausmodell festgestellt (siehe unten).
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Vacciniavirus-Stämme, insbesondere MVA-BN und dessen Derivate, durch ihr Unvermögen, in vivo zu replizieren, gekennzeichnet. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich „Unvermögen, in vivo zu replizieren" auf Viren, die in Menschen und im unten erläuterten Mausmodell nicht replizieren. Das „Unvermögen, in vivo zu replizieren" kann vorzugsweise bei Mäusen bestimmt werden, welche unfähig sind, reife B- und T-Zellen zu produzieren. Ein Beispiel für solche Mäuse ist das transgene Mausmodell AGR129 (erhalten von Mark Sutter, Institute of Virology, Universität Zürich, Zürich, Schweiz). Dieser Mäusestamm weist Gen-gezielte Brüche in den IFN-Rezeptor-Genen vom Typ I (IFN-α/β) und Typ II (IFN-γ) und in RAG auf. Aufgrund dieser Brüche besitzen die Mäuse kein IFN-System und sind unfähig zur Produktion von reifen B- und T-Zellen und sind somit ernsthaft immungeschädigt und höchst anfällig für ein replizierendes Virus. Anstelle der AGR129-Mäuse kann jeder andere Mäusestamm verwendet werden, welcher unfähig zur Produktion von reifen B- und T-Zellen und somit ernsthaft immungeschädigt und höchst anfällig für ein replizierendes Virus ist. Insbesondere töten die erfindungsgemäßen Viren AGR129-Mäuse nicht innerhalb eines Zeitraums von zumindest 45 Tagen, bevorzugter innerhalb von zumindest 60 Tagen, am meisten bevorzugt innerhalb von 90 Tagen, nach der Infektion der Mäuse mit 107 pfu Virus, das intraperitoneal verabreicht wurde. Vorzugsweise sind die Viren, die ein „Unvermögen, in vivo zu replizieren" aufweisen, weiterhin dadurch gekenn-zeichnet, dass aus Organen oder Geweben der AGR129-Mäuse 45 Tage, vorzugsweise 60 Tage und am meisten bevorzugt 90 Tage, nach der Infektion der Mäuse mit 107 pfu Virus, das intraperitoneal verabreicht wurde, kein Virus gewonnen werden kann. Detallierte Informationen zu den infektionsanalysen bei AGR129-Mäusen und den Analysen, die angewandt werden, um zu bestimmen, ob aus Organen und Geweben infizierter Mäuse ein Virus gewonnen werden kann, sind im Beispielsabschnitt zu finden.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Vacciniavirus-Stämme, insbesondere MVA-BN und dessen Derivate, durch eine Immunisierungswirkung gekennzeichnet, die verglichen mit jener des bekannten Stamms MVA 575 höher ist, wie in einem Mausmodell mit letaler Exposition festgestellt. Die Details dieses Versuchs sind im unten gezeigten Beispiel 2 grob skizziert. Kurz gesagt, in einem solchen Modell sterben ungeimpfte Mäuse nach der Infektion mit replikationsfähigen Vaccinia-Stämmen, wie z.B. dem Western Reserve-Stamm L929 TK+ oder IHD-J. Die Infektion mit replikationsfähigen Vacciniaviren wird im Kontext der Beschreibung des Modells mit letaler Exposition als „Exposition" bezeichnet. Vier Tage nach der Exposition werden die Mäuse üblicherweise getötet, und durch Standard-Plaqueanalysen wird unter Verwendung von VERO-Zellen der Virustiter in den Eierstöcken bestimmt (hinsichtlich weiterer Details, siehe Beispielsabschnitt). Der Virustiter wird bei ungeimpften Mäusen und bei mit erfindungs-gemäßen Vacciniaviren geimpften Mäusen bestimmt. Genauer sind die erfindungsgemäßen Viren dadurch gekennzeichnet, dass bei diesem Versuch die Eierstock-Virustiter nach der Impfung mit 102 TCID50/ml erfindungsgemäßem Virus im Vergleich zu ungeimpften Mäusen um mindestens 70%, vorzugsweise um mindestens 80%, noch bevorzugter um mindestens 90%, reduziert sind.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Vacciniaviren, insbesondere MVA-BN und dessen Derivate, nützlich für die Immunisierung mit einer Prime/Boost-Verabreichung des Impfstoffs. Es gab zahlreiche Berichte, in denen behauptet wurde, dass Prime/Boost-Systeme, bei denen MVA als Übertragungsvektor eingesetzt wird, unzureichende Immunreaktionen auslösen und DNA-Prime/MVA-Boost-Systemen unterlegen sind (Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4; 397–402). In all diesen Studien wurden MVA-Stämme verwendet, die sich von den erfindungsgemäßen Vacciniaviren unterscheiden. Um die unzureichende Immunreaktion zu erklären, die sich bei Verwendung von MVA für die Prime- und Boost-Verabreichung ergibt, wurde die Hypothese aufgestellt, dass Antikörper, die während der Prime-Verabreichung gegen MVA gebildet werden, das bei der zweiten Immunisierung verabreichte MVA neutralisieren, wodurch eine wirksame Verstärkung der immunreaktion verhindert wird. Im Gegensatz dazu wird über DNA-Prime/MVA-Boost-Systeme berichtet, dass sie hinsichtlich der Erzeugung von Reaktionen mit hoher Avidität überlegen sind, da dieses System die Fähigkeit von DNA, die Immunreaktion wirksam zu stimulieren, mit den Eigenschaften von MVA kombiniert, diese Reaktion bei Fehlen einer zuvor existierenden Immunität gegenüber MVA zu verstärken. Wenn eine zuvor existierende Immunität gegenüber MVA und/oder Vaccinia ein Verstärken der Immunreaktion verhindert, so hätte die Verwendung von MVA als Impfstoff oder Therapeutikum klarerweise eine eingeschränkte Wirksamkeit, insbesondere bei Individuen, die gegen Pocken geimpft wurden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform können das erfindungsgemäße Vacciniavirus, insbesondere MVA-BN und dessen Derivate, sowie entsprechende rekombinante Viren, welche heterologe Sequenzen beherbergen, jedoch dazu verwendet werden, Immunreaktionen bei nativen Tieren sowie bei Tieren mit zuvor existierender Immunität gegenüber Pockenviren zuerst wirksam zu stimulieren und danach zu verstärken. Somit löst das erfindungsgemäße Vacciniavirus in Vacciniavirus-Prime/ Vacciniavirus-Boost-Systemen im Vergleich zu DNA-Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen im Wesentlichen zumindest denselben Immunitätsgrad aus.
- Es wird angenommen, dass ein Vacciniavirus in Vacciniavirus-Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen im Vergleich zu DNA-Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen zumindest im Wesentlichen denselben Immunitätsgrad auslöst, wenn die CTL-Reaktion, die in einer der beiden nachfolgenden Analysen („Analyse 1" und „Analyse 2"), vorzugsweise in beiden Analysen, gemessen wird, in Vacciniavirus-Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen im Vergleich zu DNA-Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen zumindest im Wesentlichen dieselbe ist. Noch bevorzugter ist die CTL-Reaktion nach einer Vacciniavirus-Prime/ Vacciniavirus-Boost-Verabreichung bei zumindest einer der Analysen im Vergleich zu DNA-Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen höher. Am meisten bevorzugt ist die CTL-Reaktion bei beiden nachfolgenden Analysen höher.
- Analyse 1: Für Vacciniavirus-Prime/Vacciniavirus-Boast-Verabreichungen werden 6– 8 Wochen alte BALB/c (H-2d)-Mäuse durch eine intravenöse Verabreichung von 107 TCiD50-erfindungsgemäßem Vacciniavirus, welches das Maus-Polytop exprimiert, so wie bei Thomson et al., 1988, J. Immunol. 160, 1717, beschrieben, Primeimmunisiert und mit derselben Menge desselben Virus, welches drei Wochen später in derselben Art und Weise verabreicht wird, Boost-immunisiert. Zu diesem Zweck ist es notwendig, ein rekombinantes Vacciniavirus zu konstruieren, welches das Polytop exprimiert. Verfahren zum Konstruieren solcher rekombinanter Viren sind dem Fachmann bekannt und werden untenstehend detaillierter beschrieben. Bei DNA-Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen wird die Prime-Impfung durch eine intramuskuläre Injektion der Mäuse mit 50 μg DNA, welche dasselbe Antigen wie das Vacciniavirus exprimiert, bewerkstelligt; die Boost-Verabreichung des Vacciniavirus wird in exakt derselben Art und Weise wie bei der Vacciniavirus-Prime/ Vacciniavirus-Boost-Verabreichung durchgeführt. Das DNA-Plasmid, welches das Polytop exprimiert, ist auch in der obenstehend angeführten Veröffentlichung von Thomson et al. beschrieben. Bei beiden Systemen wird zwei Wochen nach der Boost-Verabreichung die Entwicklung einer CTL-Reaktion gegen die Epitope SYIPSAEKI, RPQASGVYM und/oder YPHFMPTNL bestimmt. Die Bestimmung der CTL-Reaktion wird vorzugsweise unter Anwendung der ELISPOT-Analyse durchgeführt, so wie von Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4, 397–402, beschrieben und im untenstehenden Beispielsabschnitt in Hinblick auf ein spezifisches erfindungsgemäßes Virus kurz dargestellt. Das erfindungsgemäße Virus ist bei diesem Versuch dadurch gekennzeichnet, dass die CTL-Immunreaktion gegen die oben-stehend erwähnten Epitope, welche durch die Vacciniavirus-Prime/Vacciniavirus-Boost-Verabreichung ausgelöst wird, im Wesentlichen dieselbe, vorzugsweise zumindest dieselbe ist wie jene, die durch eine DNA-Prime/Vacciniavirus-Boost-Verabreichung ausgelöst wird, wie durch die Anzahl von IFN-γ-produzierenden Zellen/106 Milzzellen abgeschätzt (siehe auch Versuchsabschnitt).
- Analyse 2: Diese Analyse entspricht im Wesentlichen Analyse 1. Anstelle der Verwendung von 107 TCID50 Vacciniavirus, die wie in Analyse 1 i.v. verabreicht werden, werden bei dieser Analyse allerdings 108 TCID50 erfindungsgemäßes Vacciniavirus subkutan verabreicht, und zwar für eine Prime-Immunisierung und eine Boost-Immunisierung. Das erfindungsgemäße Virus ist bei diesem Versuch dadurch gekennzeichnet, dass die CTL-Immunreaktion gegen die obenstehend erwähnten Epitope, welche durch die Vacciniavirus-Prime/Vacciniavirus-Boost-Verabreichung ausgelöst wird, im Wesentlichen dieselbe, vorzugsweise zumindest dieselbe ist wie jene, die durch eine DNA-Prime/ Vacciniavirus-Boost-Verabreichung ausgelöst wird, wie durch die Anzahl von IFN-γ-produzierenden Zellen/106 Milzzellen abgeschätzt (siehe auch Versuchsabschnitt).
- Die Stärke einer CTL-Reaktion, wie in einer der obenstehend gezeigten Analysen gemessen, entspricht dem Grad des Schutzes.
- Somit sind die erfindungsgemäßen Viren für Impfzwecke besonders geeignet.
- Zusammenfassend ist das erfindungsgemäße Vacciniavirus dadurch gekennzeichnet, dass es zumindest eine der folgenden Eigenschaften aufweist:
- (i) Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) und in der Zelllinie BHK, jedoch keine Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in der menschlichen Zelllinie HaCat,
- (ii) Unvermögen, in vivo zu replizieren,
- (iii) Hervorrufen einer Immunisierungswirkung in einem Modell mit letaler Exposition, welche im Vergleich zum bekannten Stamm MVA 575 (ECACC V00120707) höher ist, und/oder
- (iv) Hervorrufen eines Immunitätsgrads in Vacciniavirus-Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen, welcher im Vergleich zu DNA-Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen zumindest im Wesentlichen derselbe ist.
- Vorzugsweise besitzt das erfindungsgemäße Vacciniavirus zumindest zwei der oben-stehenden Eigenschaften, noch bezorzugter zumindest drei der obenstehenden Eigenschaften. Am meisten werden Vacciniaviren bevorzugt, die alle obenstehenden Eigenschaften aufweisen.
- Bei einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Impfkit, umfassend ein erfindungsgemäßes Virus für die erste Impfung („Priming") in einer ersten Ampulle/einem ersten Behälter und für eine zweite Impfung („Boosting") in einer zweiten Ampulle/einem zweiten Behälter. Das Virus kann ein nicht rekombinantes Vacciniavirus sein, d.h. ein Vacciniavirus, das keine heterologen Nucleotidsequenzen enthält. Ein Beispiel für ein solches Vacciniavirus ist MVA-BN und dessen Derivate. Alternativ kann das Virus ein rekombinantes Vacciniavirus sein, das zusätzliche Nucleotidsequenzen enthält, welche zum Vacciniavirus heterolog sind. Wie in anderen Abschnitten der Beschreibung kurz dargestellt, können die heterologen Sequenzen für Epitope codieren, welche eine Reaktion durch das Immunsystem auslösen. Somit ist es möglich, das rekombinante Vacciniavirus zum Impfen gegen jene Proteine oder Agentien einzusetzen, welche dieses Epitop umfassen. Die Viren können formuliert werden so wie untenstehend detaillierter dargestellt. Die Virusmenge, welche für jede Impfung verwendet werden kann, wurde obenstehend definiert.
- Dem Fachmann ist bekannt, wie er Vacciniaviren erhalten kann, welche zumindest eine der folgenden Eigenschaften aufweisen:
- – Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) und in der Nierenzelllinie BHK vom Hamsterjungen, jedoch keine Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in der menschlichen Keratinozytenzelllinie HaCat,
- – Unvermögen, in vivo zu replizieren,
- – Hervorrufen einer Immunisierungswirkung in einem Modell mit letaler Exposition, welche im Vergleich zum bekannten Stamm MVA 575 höher ist, und/oder
- – Hervorrufen eines Immunitätsgrads in Vacciniavirus-Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen, welcher im Vergleich zu DNA-Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen zumindest im Wesentlichen derselbe ist.
- Ein Verfahren zum Erhalten eines solchen Virus kann die folgenden Schritte umfassen:
- (i) das Einführen eines bekannten Vacciniavirus-Stamms, vorzugsweise MVA 574 oder MVA 575 (ECACC V00120707), in nicht menschliche Zellen, in weichen das Virus reproduktiv replizieren kann, wobei die nicht menschlichen Zellen vorzugsweise aus CEF-Zellen und der Zelllinie BHK ausgewählt sind,
- (ii) das Isolieren/Anreichern von Viruspartikeln aus diesen Zellen und
- (iii) das Analysieren, ob das erhaltene Virus zumindest eine der obenstehend definierten, gewünschten biologischen Eigenschaften aufweist,
- Beim Anwenden dieses Verfahrens identifizierten und isolierten die Erfinder in mehreren Klonreinigungsrunden einen Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei von der MVA-Isolat-Passage 575 (MVA 575) ausgegangen wurde. Dieser neue Stamm entspricht dem oben erwähnten Stamm mit Zugangsnummer ECACC V0083008.
- Das Wachstumsverhalten der erfindungsgemäßen Vacciniaviren, insbesondere das Wachstumsverhalten von MVA-BN, zeigt, dass die erfindungsgemäßen Stämme jedem anderen bisher gekennzeichneten MVA-Isolat hinsichtlich der Abschwächung in menschlichen Zelllinien und des Unvermögens, in vivo zu replizieren, weit überlegen sind. Die erfindungsgemäßen Stämme sind daher ideale Kandidaten für die Entwicklung von sichereren Produkten, wie z.B. Impfstoffen oder Pharmazeutika, wie untenstehend beschrieben wird.
- Bei einer Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Virus, insbesondere MVA-BN und dessen Derivate, als Impfstoff gegen Pockenviruserkrankungen des Menschen, wie z.B. Pocken, eingesetzt. Bei einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Virus rekombinant sein, d.h. es kann heterologe Gene wie z.B. zum Virus heterologe Antigene oder Epitope exprimieren und kann somit als Impfstoff zum Hervorrufen einer Immun-reaktion gegen heterologe Antigene oder Epitope nützlich sein.
- Der Begriff „Immunreaktion" bedeutet die Reaktion des Immunsystems, wenn eine Fremd-substanz oder ein Mikroorganismus in den Organismus eindringt. Per Definition wird die Immunreaktion in eine spezifische und eine unspezifische Reaktion unterteilt, obwohl beide eng miteinander vernetzt sind. Die unspezifische Immunreaktion ist die unmittelbare Abwehr gegen eine breite Vielfalt von Fremdsubstanzen und infektiösen Mitteln. Die spezifische Immunreaktion ist die nach einer Verzögerungsphase aufgebrachte Abwehr, wenn der Organismus zum ersten Mal mit einer Substanz konfrontiert wird. Die spezifische Immunreaktion ist höchst effizient und verantwortlich für die Tatsache, dass ein Individuum, das sich von einer spezifischen Infektion erholt, vor dieser spezifischen Infektion geschützt ist. Somit bewirkt eine zweite Infizierung mit demselben oder einem sehr ähnlichen infektiösen Mittel mildere Symptome oder überhaupt keine Symptome, da bereits eine „zuvor existierende Immunität" gegen dieses Mittel vorliegt. Eine solche Immunität bzw. das immunologische Gedächtnis bleiben lange Zeit bestehen, in manchen Fällen sogar ein Leben lang. Demgemäß kann das Herbeiführen eines immunologischen Gedächtnisses für eine Impfung angewandt werden.
- Das „Immunsystem" bedeutet ein komplexes Organ, welches bei der Verteidigung des Organismus gegen Fremdsubstanzen und Mikroorganismen eine Rolle spielt. Das Immunsystem umfasst einen zellulären Teil, der mehrere Zelltypen umfasst, z.B. Lymphozyten und andere, von weißen Blutkörperchen abgeleitete Zellen, sowie einen humoralen Teil, der kleine Peptide und Komplementfaktoren umfasst.
- „Impfung" bedeutet, dass ein Organismus mit einem infektiösen Agens konfrontiert wird, wobei das infektiösen Agens z.B. in abgeschwächter oder inaktivierter Form vorliegt, um eine spezifische Immunität auszulösen. Der Begriff Impfung umfasst auch die Konfrontation eines Organismus mit erfindungsgemäßen rekombinanten Vacciniaviren, insbesondere rekombinantem MVA-BN und dessen Derivaten, welche zum Virus heterologe Antigene oder Epitope exprimieren. Beispiele für solche Epitope sind in anderen Teilen der Beschreibung dargelegt und umfassen z.B. Epitope aus Proteinen, die von anderen Viren abgeleitet sind, z.B. vom Dengue-Virus, Hepatitis C-Virus, HIV, oder Epitope, die von Proteinen abgeleitet sind, welche mit der Entwicklung von Tumoren und Krebs zusammen-hängen. Nach der Verabreichung des rekombinanten Vacciniavirus in den Körper werden die Epitope exprimiert und dem Immunsystem dargeboten, und eine spezifische Immunreaktion gegen diese Epitope kann ausgelöst werden. Der Organismus wird somit gegen das Agens/Protein immunisiert, welches das Epitop enthält, das durch das rekombinante Vacciniavirus codiert wird.
- „Immunität" bedeutet einen teilweisen oder vollständigen Schutz eines Organismus vor Krankheiten, die durch ein infektiöses Agens verursacht werden, aufgrund einer erfolg-reichen Beseitigung einer vorhergehenden Infektion mit dem infektiösen Agens oder einem charakteristischen Teil davon. Immunität beruht auf der Existenz, Induktion und Aktvierung von spezialisierten Zellen des Immunsystems.
- Wie obenstehend bei einer Ausführungsform der Erfindung hervorgehoben, enthalten die erfindungsgemäßen rekombinanten Viren, insbesondere rekombinantes MVA-BN und dessen Derivate, zumindest eine heterologe Nucleinsäuresequenz. Der Begriff „heterolog" wird nachfolgend für jedwede Kombination von Nucleinsäuresequenzen verwendet, welche in der Natur normalerweise nicht als eng mit dem Virus verbunden vorgefunden wird, ein solches Virus wird auch „rekombinantes Virus" genannt.
- Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die heterologen Sequenzen vorzugsweise antigene Epitope, die aus irgendeiner Nicht-Vaccinia-Quelle ausgewählt sind. Am meisten bevorzugt exprimiert dieses rekombinante Virus einen oder mehrere antigene Epitope aus Plasmodium falciparum, Mycobacteria, dem Influenzavirus, aus Viren, die ausgewählt sind aus der Familie von Flaviviren, Paramyxoviren, Hepatitis-Viren, menschlichen Immunschwächeviren oder aus Viren, welche hämorrhagisches Fieber bewirken, wie z.B. Hantaviren oder Filoviren, d.h. dem Ebola- oder Marburg-Virus.
- Wiederum gemäß einer weiteren Ausführungsform, jedoch auch zusätzlich zu der oben-stehend ennrähnten Auswahl an antigenen Epitopen, können die heterologen Sequenzen aus einer anderen Pockenvirus- oder einer Vaccinia-Quelle ausgewählt sein. Diese Virus-sequenzen können zum Modifizieren des Wirtspektrums oder der Immunisierungswirkung des Virus eingesetzt werden.
- Bei einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Virus für ein heterologes Genleine heterologe Nucleinsäure codieren, welches bzw. welche eine therapeutische Verbindung exprimiert. Eine „therapeutische Verbindung", die durch die heterologe Nucleinsäure im Virus codiert wird, kann z.B. eine therapeutische Nucleinsäure sein, wie z.B. eine Antisinn-Nucleinsäure oder ein Peptid oder Protein mit einer gewünschten biologischen Aktivität.
- Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform unterliegt die Expression einer heterologen Nucleinsäuresequenz vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, der transcriptionellen Kontrolle eines Pockenvirus-Promotors, noch bevorzugter eines Vacciniavirus-Promotors.
- Wiederum gemäß einer weiteren Ausführungsform erfolgt das Einfügen einer heterologen Nucleinsäuresequenz vorzugsweise in einen nicht essentiellen Bereich des Virusgenoms. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die heterologe Nuclein-säuresequenz an einer natürlich vorkommenden Deletionsstelle des MVA-Genoms eingefügt (geoffenbart in der PCT/EP96/02926). Verfahren zum Einfügen von heterologen Sequenzen in das Pockenvirus-Genom sind dem Fachmann bekannt.
- Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung auch das Genom des Virus, dessen Rekombinanten oder funktionelle Teile davon. Derartige Virussequenzen können zum Identifizieren oder Isolieren des Virus oder von dessen Rekombinanten verwendet werden, z.B. unter Anwendung einer PCR, von Hybridi-sierungstechnologien oder durch Erstellung von ELISA-Analysen. Weiterhin können solche Virussequenzen von einem Expressionsvektor exprimiert werden, um das codierte Protein oder Peptid zu produzieren, welches danach Deletionsmutanten eines Virus ergänzen kann, welchem die im Expressionsvektor enthaltene Virussequenz fehlt.
- „Funktioneller Teil" des Virusgenoms bedeutet einen Teil der vollständigen Genomsequenz, welcher eine physikalische Einheit, wie z.B. ein Protein, eine Proteindomäne, ein Epitop eines Proteins, codiert. Der funktionelle Teil des Virusgenoms beschreibt auch Teile der vollständigen Genomsequenz, welche für Regulationselemente oder Teile solcher Elemente mit individualisierbarer Aktivität codieren, wie z.B. einen Promotor, Enhancer, cis- oder trans-aktive Elemente.
- Das erfindungsgemäße rekombinante Virus kann zum Einführen der heterologen Nucleinsäuresequenz in eine Zielzelle verwendet werden, wobei die Sequenz entweder homolog oder heterolog zur Zielzelle ist. Das Einführen einer heterologen Nucleinsäure-sequenz in eine Zielzelle kann angewandt werden, um heterologe Peptide oder Polypeptide und/oder vollständige Viren, die durch die Sequenz codiert werden, in vitro herzustellen. Dieses Verfahren umfasst das Infizieren einer Wirtszelle mit dem rekombinanten MVA, das Kultivieren der infizierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen und das Isolieren und/oder Anreichern des von der Wirtszelle produzierten Peptids, Proteins und/oder Virus.
- Weiterhin kann das Verfahren zum Einführen einer homologen oder heterologen Sequenz in Zellen für eine in vitro- und vorzugsweise für eine in vivo-Therapie angewandt werden. Bei der in vitro-Therapie werden isolierte Zellen, die zuvor (ex vivo) mit dem Virus infiziert wurden, dem lebenden Tierkörper verabreicht, um eine Immunreaktion auszulösen. Bei der in vivo-Therapie wird bzw. werden das Virus oder dessen Rekombinanten direkt dem lebenden Tierkörper verabreicht, um eine Immunreaktion auszulösen. In diesem Fall werden die Zellen, welche die Impfstelle umgeben, direkt in vivo mit dem erfindungsgemäßen Virus oder dessen Rekombinanten infiziert.
- Da das erfindungsgemäße Virus in menschlichen Zellen und Affenzellen stark wachstums-gehemmt und somit stark abgeschwächt ist, ist es ideal für die Behandlung einer großen Zahl von Säugetieren, einschließlich Menschen. Folglich stellt die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung und einen Impfstoff bereit, z.B. zum Hervorrufen einer Immunreaktion in einem lebenden Tierkörper, einschließlich des Menschen. Das erfindungsgemäße Virus ist weiterhin in allen anderen Gentherapieprotokollen sicher.
- Die pharmazeutische Zusammensetzung kann im Allgemeinen einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable und/oder zugelassene Träger, Zusätze, Antibiotika, Konservierungsmittel, Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel und/oder Stabilisierungsmittel umfassen. Solche Hilfssubstanzen können Wasser, Salzlösung, Glycerin, Ethanol, Benetzungs- oder Emulgierungsmittel, pH-Puffersubstanzen oder dergleichen sein. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam umgewandelte Moleküle, wie z.B. Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäurecopolymere, Lipidaggregate oder dergleichen.
- Zur Herstellung von Impfstoffen wird bzw. werden das erfindungsgemäße Virus oder dessen Rekombinanten in eine physiologisch akzeptable Form umgewandelt. Dies kann auf Basis der Erfahrung mit der Herstellung von zur Pockenimpfung verwendeten Pockenvirus-Impfstoffen bewerkstelligt werden (wie von Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392, beschrieben). Das gereinigte Virus wird beispielsweise bei –80°C mit einem Titer von 5×108 TCID50/ml gelagert, formuliert in etwa 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7,4. Zur Herstellung von Impfstoffinjektionen werden z.B. 102–108 Partikel des Virus in 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% menschlichem Albumin in einer Ampulle, vorzugsweise einer Glasampulle, lyophilisiert. Alternativ können die Impfstoffinjektionen durch stufenweises Gefriertrocknen des Virus in einer Formulierung hergestellt werden. Diese Formulierung kann weitere Zusätze, wie z.B. Mannitol, Dextran, Zucker, Glycin, Lactose oder Polyvinylpyrrolidon, oder andere Zusätze, wie z.B. Antioxidationsmittel oder Inertgas, Stabilisierungsmittel oder rekombinante Proteine (z.B. menschliches Serumalbumin), die zur in vivo-Verabreichung geeignet sind, enthalten. Die Glasampulle wird daraufhin verschlossen und kann mehrere Monate lang bei zwischen 4°C und Raumtemperatur gelagert werden. Solange kein Bedarf besteht, wird die Ampulle jedoch vorzugsweise bei Temperaturen unter –20°C gelagert.
- Für eine Impfung oder Therapie kann das Lyophilisat in 0,1 bis 0,5 m! einer wässrigen Lösung, vorzugsweise physiologischen Salzlösung oder Tris-Puffer, gelöst und entweder systemisch oder örtlich verabreicht werden, z.B. über den parenteralen, intramuskulären oder irgendeinen anderen, dem qualifizierten Anwender bekannten Verabreichungsweg. Verabreichungsmethode, Dosis und Anzahl der Verabreichungen können vom Fachmann in bekannter Weise optimiert werden.
- Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Virus außerdem besonders nützlich, um bei immungeschädigten Tieren, z.B. bei mit SIV infizierten Affen (CD4 < 400/μl Blut), oder bei immungeschädigten Menschen Immunreaktionen hervor-zurufen. Der Begriff „immungeschädigt" beschreibt den Zustand des Immunsystems eines Individuums, das nur unvollständige Immunreaktionen zeigt oder bei der Abwehr gegen infektiöse Agentien eine verringerte Effizienz aufweist. Sogar noch interessanter ist, dass das erfindungsgemäße Virus wiederum gemäß einer weiteren Ausführungsform bei immun-geschädigten Tieren oder Menschen Immunreaktionen verstärken kann, und zwar sogar dann, wenn bei diesen Tieren oder Menschen eine zuvor existierende Immunität gegenüber Pockenviren vorhanden ist. Besonders interessant war, dass das erfindungsgemäße Virus Immunreaktionen auch bei Tieren oder Menschen, die einer Antivirus-, z.B. einer Antiretrovirus-Therapie, unterzogen werden, verstärken kann. „Antivirus-Therapie" umfasst therapeutische Konzepte zum Eliminieren oder Unterdrücken einer Virusinfektion, einschließlich z.B. (i) der Verwendung von Nucleotidanaloga, (ii) der Verwendung von Hemmstoffen für die enzymatische Virusaktivität oder den Viruszusammenbau, oder (iii) der Verwendung von Cytokinen zum Beeinflussen von Immunreaktionen des Wirts.
- Wiederum gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Impfstoff insbesondere, aber nicht ausschließlich, auf tierärztlichem Gebiet anwendbar, z.B. zur Immunisierung gegen eine Tierpockeninfektion. Bei Kleintieren wird die Impfung zur Immunisierung vorzugsweise parenteral oder nasal durchgeführt, während bei größeren Tieren oder Menschen eine subkutane, intramuskuläre oder orale Impfung bevorzugt wird.
- Die Erfinder fanden heraus, dass bereits eine Impfstoffinjektion, die eine wirksame Dosis von nur 102 TCID50 (Gewebekultur-infektiöse Dosis) des erfindungsgemäßen Virus enthält, ausreicht, um bei Mäusen eine vollständige Immunität gegenüber einer Exposition mit dem Wildtyp-Vacciniavirus hervorzurufen. Dies ist besonders überraschend, da zu erwarten gewesen wäre, dass ein so hoher Abschwächungsgrad des erfindungsgemäßen Virus dessen Immunisierungswirkung negativ beeinflusst und daher verringert. Eine solche Erwartung beruht auf der Annahme, dass zum Hervorrufen einer Immunreaktion die antigenen Epitope dem Immunsystem in ausreichender Menge dargeboten werden müssen. Ein Virus, das stark abgeschwächt und somit nicht replizierend ist, kann nur eine sehr geringe Menge von antigenen Epitopen darbieten, d.h., soviel wie es selbst enthält. Diese Menge an Antigen, die von den Viruspartikeln getragen wird, wurde als nicht ausreichend erachtet, um eine starke Immunreaktion hervorzurufen. Das erfindungsgemäße Virus stimuliert jedoch sogar bei einer sehr geringen wirksamen Dosis von nur 102 TCID50 in einem Maus/Vaccinia-Expositionsmodell eine starke und schützende Immunreaktion. Das erfindungsgemäße Virus zeigt somit im Vergleich zu anderen, bisher beschriebenen MVA-Stämmen eine unerwartete und sogar gesteigerte Immunisierungswirkung. Diese hohe Immunisierungswirkung macht das erfindungsgemäße Virus und jeden davon abgeleiteten Impfstoff besonders nützlich für die Verwendung bei immungeschädigten Tieren oder Menschen.
- Wiederum gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Virus als Hilfsstoff verwendet. Ein „Hilfsstoff" bezieht sich im Kontext der vorliegenden Beschreibung auf einen Verstärker der spezifischen Immunreaktion in Impfstoffen. „Das Virus als Hilfsstoff verwenden" bedeutet das Miteinschließen des Virus in einen zuvor existierenden Impfstoff, um zusätzlich das Immunsystem des den Impfstoff erhaltenden Patienten zu stimulieren. Die immunisierende Wirkung eines antigenen Epitops wird in den meisten Impfstoffen häufig durch Hinzufügen eines sogenannten Hilfsstoffs verstärkt. Ein Hilfsstoff kostimuliert das Immunsystem, indem er eine stärkere spezifische Immunreaktion gegen ein antigenes Epitop eines Impfstoffs bewirkt. Diese Stimulation kann durch Faktoren des unspezifischen Immunsystems, wie z.B, Interferon und Interleukin, reguliert werden.
- Folglich wird das Virus bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung bei Säugetieren, einschließlich Menschen, verwendet, um das Immunsystem zu aktivieren, zu unterstützen oder zu unterdrücken und vorzugsweise um die Immunreaktion gegen jegliche antigene Determinante zu aktivieren. Das Virus kann auch verwendet werden, um das Immunsystem in einer Situation gesteigerter Anfälligkeit für Infektionen, wie im Fall von Stress, zu unterstützen.
- Das als Hilfsstoff verwendete Virus kann ein nicht rekombinantes Virus sein, d.h. ein Virus, das keine heterologe DNA in seinem Genom enthält. Ein Beispiel für diese Art von Virus ist MVA-BN. Alternativ ist das als Hilfsstoff verwendete Virus ein rekombinantes Virus, das in seinem Genom heterologe DNA-Sequenzen enthält, welche im Virusgenom von Natur aus nicht vorkommen. Für die Verwendung als Hilfsstoff enthält und exprimiert die rekombinante virale DNA des Virus vorzugsweise Gene, welche für immunstimulierende Peptide oder Proteine, wie z.B. Interleukine, codieren.
- Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird bevorzugt, dass das Virus inaktiviert ist, wenn es als Hilfsstoff verwendet oder zu einem anderen Impfstoff hinzugefügt wird. Die Inaktivierung des Virus kann z.B, durch Hitze oder Chemikalien durchgeführt werden, wie im Stand der Technik bekannt. Vorzugsweise wird das Virus durch β-Propriolacton inaktiviert. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung kann das inaktivierte Virus zu Impfstoffen gegen zahlreiche infektiöse oder proliferative Erkrankungen hinzugefügt werden, um die Immunreaktion des Patienten gegen diese Erkrankung zu verstärken.
- Kurzfassung der Erfindung
- Die Erfindung umfasst unter anderem Folgendes, allein oder in Kombination: Ein Vacciniavirus, welches zumindest eine der folgenden Eigenschaften aufweist:
- – Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) und in der Nierenzelllinie BHK vom Hamsterjungen, jedoch keine Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in der menschlichen Keratinozytenzelllinie HaCat,
- – Unvermögen, in vivo zu replizieren,
- – Hervorrufen einer Immunisierungswirkung in einem Modell mit letaler Exposition, welche im Vergleich zum bekannten Stamm MVA 575 höher ist, und/oder
- – Hervorrufen eines Immunitätsgrads in Vacciniavirus-Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen, welcher im Vergleich zu DNA-Prime/Vacciniavirus-Boost Systemen zumindest im Wesentlichen derselbe ist.
- Das obenstehende Virus, wobei das Virus zur reproduktiven Replikation in irgendeiner der folgenden menschlichen Zelllinien unfähig ist: die menschliche Embryonen-Nierenzelllinie 293, die menschliche Knochensarkom-Zelllinie 143B und die menschliche Gebärmutterhals-Adenokarzinom-Zelllinie HeLa.
- Das obenstehende Virus, das bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK), unter der Nummer V00083008 hinterlegt ist, und Derivate davon.
- Das obenstehende Virus, umfassend zumindest eine heterologe Nucleinsäuresequenz.
- Das obenstehende Virus, wobei die heterologe Nucleinsäuresequenz ausgewählt ist aus einer Sequenz, die für zumindest ein Antigen, ein antigenes Epitop und/oder eine therapeutische Verbindung codiert.
- Ein Genom oder funktionelle Teile davon, die vom obenstehend definierten Virus abgeleitet sind.
- Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das obenstehende Virus und/oder das Genom und/oder einen funktionellen Teil davon, so wie obenstehend definiert, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel und/oder einen pharmazeutisch akzeptablen Zusatz.
- Ein Impfstoff, umfassend das obenstehende Virus und/oder das Genom und/oder einen funktionellen Teil davon, so wie obenstehend definiert.
- Das obenstehende Virus, das Genom und/oder ein funktioneller Teil davon, so wie obenstehend definiert, die obenstehend definierte Zusammensetzung oder der obenstehend definierte Impfstoff als Arzneimittel zum Beeinflussen, vorzugsweise Hervorrufen, einer immunologischen Reaktion bei einem lebenden Tier, einschließlich eines Menschen.
- Das obenstehende Virus, die obenstehend definierte pharmazeutische Zusammensetzung, der obenstehend definierte Impfstoff oder das obenstehend definierte Virus, wobei das Virus, die Zusammensetzung oder der Impfstoff in therapeutisch wirksamen Mengen in einer ersten Impfung („Prime-Impfung") und in einer zweiten Impfung („Boost-Impfung") verabreicht wird.
- Die Verwendung des obenstehenden Virus und/oder des obenstehend definierten Genoms zur Herstellung eines Medikaments oder Impfstoffs.
- Ein Verfahren zum Einführen homologer und/oder heterologer Nucleinsäuresequenzen in Zielzellen, umfassend das Infizieren der Zielzellen mit dem Virus, das heterologe Sequenzen umfasst, so wie obenstehend definiert, oder das Transfizieren der Zielzelle mit dem obenstehend definierten Genom.
- Ein Verfahren zum Herstellen eines Peptids, Proteins und/oder Virus, umfassend
- – das Infizieren einer Wirtszelle mit dem obenstehenden Virus,
- – das Kultivieren der infizierten Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen, und
- – das Isolieren und/oder Anreichern des Peptids und/oder Proteins und/oder von Viren, die von der Wirtszelle produziert werden.
- Ein Verfahren zum Beeinflussen, vorzugsweise Hervorrufen, einer immunologischen Reaktion in einem lebenden Tierkörper, einschließlich eines Menschen, umfassend das Verabreichen des obenstehenden Virus, des Genoms und/oder eines funktionellen Teils davon, so wie obenstehend definiert, der obenstehend definierten Zusammensetzung oder des obenstehend definierten Impfstoffs an das zu behandelnde Tier oder den zu behandelnden Menschen.
- Das obenstehende Verfahren, umfassend das Verabreichen von zumindest 102 TCID50 (Gewebekultur-infektiöse Dosis) des Virus.
- Das obenstehende Verfahren, wobei das Virus, die Zusammensetzung oder der Impfstoff in therapeutisch wirksamen Mengen in einer ersten Impfung („Prime-Impfung") und in einer zweiten Impfung („Boost-Impfung") verabreicht wird.
- Das obenstehende Verfahren, wobei das Tier immungeschädigt ist.
- Das obenstehende Verfahren, wobei das Tier eine zuvor existierende Immunität gegenüber Pockenviren aufweist.
- Das obenstehende Verfahren, wobei das Tier einer Antivirus-Therapie unterzogen wird.
- Das Verfahren, wobei das Tier einer Antivirus-Therapie unterzogen wird, dadurch gekenn-zeichnet, dass die Antivirus-Therapie eine Antiretrovirus-Therapie ist.
- Die Verwendung des obenstehenden Virus, des Genoms und/oder eines funktionellen Teils davon, so wie obenstehend definiert, als Hilfsstoff.
- Ein Verfahren zum Verstärken einer spezifischen Immunreaktion gegen ein Antigen und/oder ein antigenes Epitop, die in einem Impfstoff inkludiert sind, umfassend das Verabreichen des obenstehenden Virus oder des obenstehend definierten Genoms als Hilfsstoff an einen lebenden Tierkörper, einschließlich eines Menschen, der mit dem Impfstoff zu behandeln ist.
- Das obenstehende Virus oder das obenstehend definierte Genom als Hilfsstoff.
- Eine Zelle, vorzugsweise eine menschliche Zelle, enthaltend das obenstehende Virus oder das Genom oder einen funktionellen Teil davon, so wie obenstehend definiert.
- Ein Verfahren zum Erhalten des obenstehenden Vacciniavirus, umfassend die folgenden Schritte:
- – das Einführen eines allgemein erhältlichen Vacciniavirus-Stamms, vorzugsweise MVA 575, in nicht menschliche Zellen, in welchen das Virus reproduktiv replizieren kann, wobei die nicht menschlichen Zellen vorzugsweise aus CEF-Zellen und der Zelllinie BHK ausgewählt sind,
- – das Isolieren/Anreichern von Viruspartikeln aus diesen Zellen und
- – das Analysieren, ob das erhaltene Virus zumindest eine der obenstehend definierten biologischen Eigenschaften aufweist, wobei die obenstehenden Schritte gegebenenfalls wiederholt werden können, bis ein Virus mit den gewünschten Replikationseigenschaften erhalten wird.
- Ein Kit für eine Prime/Boost-Immunisierung, umfassend ein obenstehendes Virus, einen obenstehenden Impfstoff oder das Virus als Arzneimittel, so wie obenstehend definiert, für eine erste Impfung („Prime-Impfung") in einer ersten Ampulle/einem ersten Behälter und für eine zweite Impfung („Boost-Impfung") in einer zweiten Ampulle/einem zweiten Behälter.
- Die Verwendung des obenstehenden Virus, der obenstehend definierten Zusammensetzung und/oder des obenstehend definierten Impfstoffs zur Herstellung eines Impfstoffs, wobei das Virus, die Zusammensetzung oder der Impfstoff in einer Prime-Impfung verabreicht wird und dasselbe Virus oder derselbe Impfstoff in einer Boost-Impfung verabreicht wird.
- Kurze Beschreibung der Figuren
-
1 : Wachstumskinetiken verschiedener MVA-Stämme in verschiedenen Zelllinien. In Teil A) sind die Ergebnisse gemäß den getesteten MVA-Stämmen gruppiert, während in Teil B) die Ergebnisse gemäß den getesteten Zelllinien gruppiert sind. B) Die nach vier Tagen (D4) der Kultivierung aus einer Zelllinie gewonnene Virusmenge wurde durch eine Plaqueanalyse bestimmt und als Verhältnis zwischen dem nach 4 Tagen gewonnenen Virus und dem anfänglichen Inokulum am Tag 1 (D1) ausgedrückt. -
2 : Schutz gegen eine letale Vaccinia-Exposition, der nach Impfungen mit entweder MVA-BN oder MVA 575 vorliegt. Der Schutz wird durch die 4 Tage nach der Exposition durch eine Standard-Plaqueanalyse festgestellte Verringerung der Eierstock-Titer gemessen. -
3 : Hervorrufen von CTL und Schutz gegen eine Influenza-Exposition unter Anwendung verschiedener Prime/Boost-Systeme. -
3A : Hervorrufen von CTL-Reaktionen gegen 4 verschiedene H-2d-eingeschränkte Epitope nach Impfungen mit verschiedenen Kombinationen von DNA- oder MVA-BN-Impfstofen, welche ein Maus-Polytop codieren. BALB/c-Mäuse (5 pro Gruppe) wurden entweder mit DNA (intramuskulär) oder mit MVA-BN (subkutan) geimpf und erhielten drei Wochen später Booster-Immunisierungen. CTL-Reaktionen gegen 4 verschiedene Epitope, welche durch die Impfstoffe codiert wurden (TYQRTRALV, Influenza; SYIPSAEKI, P. Berghei; YPHFMPTNL, Cytomegalovirus; RPQASGVYM, LCV), wurden 2 Wochen nach den Booster-Immunisierungen unter Anwendung einer ELISPOT-Analyse bestimmt. -
3B : Hervorrufen von CTL-Reaktionen gegen 4 verschiedene Epitope nach Impfungen mit verschiedenen Kombinationen von DNA- oder MVA-BN-Impfstoffen, welche ein Maus-Polytop codieren. BALB/c-Mäuse (5 pro Gruppe) wurden entweder mit DNA (intra-muskulär) oder mit MVA-BN (intravenös) geimpft und erhielten drei Wochen später Booster-Immunisierungen. CTL-Reaktionen gegen 4 verschiedene Epitope, welche durch die Impfstoffe codiert wurden (TYQRTRALV, Influenza; SYIPSAEKI, P. Berghei; YPHFMPTNL, Cytomegalovirus; RPQASGVYM, LCV), wurden 2 Wochen nach den Booster-Immunisierungen unter Anwendung einer ELISPOT-Analyse bestimmt. -
3C : Frequenz von Peptid- und MVA-spezifischen T-Zellen nach einem homologen Prime/Boost unter Anwendung einer optimalen Dosis (1×108 TCID50) von rekombinantem MVA-BN, subkutan verabreicht. Gruppen von 8 Mäusen wurden mit zwei Injektionen der in der Figur gezeigten Kombinationen geimpft. Zwei Wochen nach der letzten Impfung wurde die Anzahl der Peptid-spezifischen Splenozyten unter Anwendung einer IFN-gamma-ELISPOT-Analyse gemessen. Die Balken stellen die durchschnittliche Anzahl spezifischer Stellen plus/minus der Standardabweichung vom Mittelwert dar. -
4 : SIV-Belastung von mit MVA-BN nef oder MVA-BN geimpften Affen. -
5 : Überleben der geimpften Affen nach einer Infizierung mit SIV. -
6 : Affenserum-Antikörpertiter gegenüber MVA-BN. Die Antikörpertiter sind für jedes Tier in unterschiedlicher Form dargestellt, während der mittlere Titer als ausgefülltes Rechteck dargestellt ist. -
7 : SIV-Pegel bei immungeschädigten Affen (CD4 < 400 ml Blut) nach Impfungen mit tat codierendem MVA-BN. Die Affen hatten zuvor drei Impfungen mit entweder MVA-BN oder MVA-BN nef erhalten (Woche 0, 8, 16) und waren mit einem pathogenen SIV-Isolat infiziert worden (Woche 22). In Woche 100, 102 und 106 (durch Pfeile angezeigt) wurden die Affen mit MVA-BN tat geimpft. -
8 : SIV-Pegel bei Affen, die einer Antiretrovirus-Therapie und therapeutischen Impfungen unter Verwendung von MVA-BN unterzogen wurden. Drei Gruppen von Affen (n = 6) wurden mit SIV infiziert und täglich mit PMPA behandelt (durch eine schwarze Linie angezeigt). In Woche 10 und 16 wurden die Tiere entweder mit Mischungen aus rekombinantem MVA oder mit einer Salzlösung geimpft (durch Pfeile angezeigt). -
9 : Humorale Reaktion gegen SIV, die nach einer Infizierung und Impfungen mit rekombinantem MVA erzeugt wird. Drei Gruppen (n = 6) von Affen wurden mit einem pathogenen SIV-Isolat infiziert (Woche 0) und danach mit der Antiretrovirus-Therapie behandelt (PMPA; durch eine fettgedruckte Linie angezeigt). Die Affen wurden in Woche 10 und 16 mit Mischungen aus rekombinantem MVA oder mit einer Salzlösung geimpft. In einer Standard-ELISA wurden Antikörper gegen SIV bestimmt, und zwar unter Verwendung infizierter T-Zelllysate als Antigen. -
10 : Humorale Reaktion gegen MVA, die bei SIV-infizierten Affen, welche einer Antiretrovirus-Therapie unterzogen werden, erzeugt wird. Drei Gruppen (n = 6) von Affen wurden mit einem pathogenen SIV-Isolat infiziert (Woche 0) und danach mit der Antiretro-virus-Therapie behandelt (PMPA; durch eine fettgedruckte Linie angezeigt). Die Affen wurden in Woche 10 und 16 mit Mischungen aus rekombinantem MVA oder mit einer Salzlösung geimpft. Unter Anwendung einer Standard-Einfang-ELISA für MVA wurden Antikörper gegen MVA bestimmt. -
11 : Hervorrufen von Antikörpern gegen MVA nach einer Impfung von Mäusen mit verschiedenen Pockenimpfstoffen. Die Pegel an Antikörper gegen MVA, die nach Impfungen mit MVA-BN erzeugt wurden (Woche 0 und 4), wurden verglichen mit her-kömmlichen Vaccinia-Stämmen, Elstree und Wyeth, verabreicht über eine Schwanz-einkerbung (Woche 0), mit MVA 572 (Woche 0 und 4) sowie mit MVA-BN und MVA 572, verabreicht als prä-Elstree-Impfstoff. MVA 572 wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures als ECACC V94012707 hinterlegt. Die Titer wurden unter Anwendung einer Einfang-ELISA bestimmt und unter Verwendung des linearen Teils der Kurve durch lineare Regression berechnet und als jene Verdünnung definiert, die zu einer optischen Dichte von 0,3 führte. * MVA-BN : MVA-BN ist signifikant (p > 0,05) verschieden von MVA 572 : MVA 572. - Beispiele
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, dass die vorliegenden Beispiele keinesfalls in einer Weise interpretiert werden dürfen, welche die Anwendbarkeit der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Technologie auf diese Beispiele beschränkt.
- Beispiel 1
- Wachstumskinetik eines neuen MVA-Stamms in ausgewählten Zelllinien und Replikation in vivo
- (i) Wachstumskinetik in Zelllinien:
- Zur Charakterisierung eines neu isolierten, erfindungsgemäßen Stamms (weiterhin als MVA-BN bezeichnet) wurde die Wachstumskinetik dieses neuen Stamms mit jener anderer MVA-Stämme verglichen, welche bereits beschrieben wurden.
- Der Versuch wurde durchgeführt, indem die Wachstumskinetiken der folgenden Viren in den anschließend aufgelisteten Primärzellen und Zelllinien verglichen wurden:
- MVA-BN (Virus-Ausgangsmaterial #23, 18.02.99 roh, titriert bei 2,0 × 107 TCID50/ml);
- MVA, beschrieben von Altenburger (US-Patent 5, 185, 146) und weiterhin als MVA-HLR bezeichnet;
- MVA (Passage 575), beschrieben von Anton Mayr (Mayr, A., et al. [1975] Infection 3; 6–14) und weiterhin als MVA-575 (ECACC V00120707) bezeichnet; und
- MVA-Vero, beschrieben in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP01/02703 (WO 01/68820) (Virus-Ausgangsmaterial, Passage 49, #20, 22.03.99 roh, titriert bei 4,2 × 107 TCID50/ml).
- Die Primärzellen und Zelllinien, die verwendet wurden, waren:
- CEF
- Hühnerembryo-Fibroblasten (frisch hergestellt aus SPF-Eiern);
- HeLa
- menschliches Gebärmutterhals-Adenokarzinom (epithelial), ATCC Nr. CCL-2;
- 143B
- menschliches Knochensarkom TK-, ECACC Nr. 91112502;
- HaCaT
- menschliche Keratinozytenzelllinie, Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3): 761–771);
- BHK
- Niere vom Hamsterjungen, ECACC 85011433;
- Vero
- Nieren-Fibroblasten der afrikanischen grünen Meerkatze, ECACC 85020299;
- CV1
- Nieren-Fibroblasten der afrikanischen grünen Meerkatze, ECACC 87032605.
- Zur Infizierung wurden die verschiedenen Zellen in einer Konzentration von 5 × 105 Zellen/Mulde in 6-Mulden-Platten geimpft und über Nacht bei 37°C, 5% CO2, in DMEM (Gibco, Kat.Nr. 61965-026) plus 2% FCS inkubiert. Das Zellkulturmedium wurde entfernt, und die Zellen wurden bei ungefähr moi 0,05 eine Stunde lang bei 37°C, 5% CO2, infiziert (für die Infektion wird angenommen, dass sich die Zellzahlen über Nacht verdoppeln). Die Virusmenge, die für jede Infizierung der verschiedenen Zelltypen zur Anwendung kam, betrug 5 × 104 TCID50, und dies wird als Input bezeichnet. Die Zellen wurden danach 3mal mit DMEM gewaschen, und schließlich wurde 1 ml DMEM, 2% FCS, hinzugefügt, und die Platten wurden bei 37°C, 5% CO2, 96 Stunden lang (4 Tage lang) inkubieren gelassen. Diese Infektionen wurden gestoppt, indem die Platten bei –80°C gefroren wurden, bereit für eine Titrationsanalyse.
- Titrationsanalyse (Immunfärbung mit einem Vacciniavirus-spezifischen Antikörper)
- Für eine Titration der Virusmenge wurden Testzellen (CEF) in einer Konzentration von 1 × 104 Zellen/Mulde in 96-Mulden-Platten in RPMI (Gibco, Kat.Nr. 61870-010), 7% FCS, 1% Antibiotikum/Antimykotikum (Gibco, Kat.Nr. 15240-062) geimpft und über Nacht bei 37°C, 5% CO2, inkubiert. Die 6-Mulden-Platten, welche die Infektionsversuche enthielten, wurden 3mal gefroren/aufgetaut, und unter Verwendung eines RPMI-Wachstumsmediums wurden Verdünnungen von 101 bis 1012 hergestellt. Virusverdünnungen wurden auf Testzellen aufgeteilt und bei 37°C, 5% CO2, fünf Tage lang inkubiert, um die Entwicklung einer CPE (cytopathischen Wirkung) zu ermöglichen. Die Testzellen wurden 10 Minuten lang fixiert (Aceton/Methanol 1:1), mit PBS gewaschen und mit einem polyklonalen Vacciniavirus-spezifischen Antikörper (Quartett Berlin, Kat.Nr. 9503-2057) in einer 1:1000-Verdünnung in einem Inkubationspuffer eine Stunde lang bei RT inkubiert.
- Nach zweimaligem Waschen mit PBS (Gibco, Kat.Nr. 20012-019) wurde der HPR gekoppelte anti-Kaninchen-Antikörper (Promega Mannheim, Kat.Nr. W4011) in einer 1:1000-Verdünnung in einem Inkubations-puffer (PBS, enthaltend 3% FCS) eine Stunde lang bei RT hinzugefügt. Die Zellen wurden wiederum zweimal mit PBS gewaschen und mit einer Färbelösung (10 ml PBS + 200 μl gesättigte Lösung von o-Dianisidin in 100% Ethanol + 15 μl H2O2, frisch zubereitet) inkubiert, bis braune Stellen sichtbar wurden (zwei Stunden). Die Färbelösung wurde entfernt, und PBS wurde hinzugefügt, um die Färbungsreaktion zu stoppen. Jede Mulde, die eine braune Stelle aufwies, wurde als CPE-positiv markiert, und unter Anwendung der Formel von Kaerber (Analyse auf Basis von TCID50) wurde der Titer berechnet (Kaerber, G. 1931. Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 162, 480).
- Die Viren wurden verwendet, um doppelte Sets von einerseits CEF und BHK, von denen erwartet wurde, dass sie für MVA permissiv sind, und andererseits CV-1, Vero, Hela, 143B und HaCat, von denen erwartet wurde, dass sie für MVA nicht permissiv sind, zu infizieren, und zwar bei einer niedrigen Infektionsmultiplizität, d.h. 0,05 infektiösen Einheiten pro Zelle (5 × 104 TCID50). Danach wurde das Virus-Inokulum entfernt, und die Zellen wurden dreimal gewaschen, um alle restlichen nicht absorbierten Viren zu entfernen. Die Infektionen wurden insgesamt 4 Tage lang belassen, wonach Virusextrakte hergestellt und danach auf CEF-Zellen titriert wurden. Tabelle 1 und
1 zeigen die Ergebnisse der Titrationsanalysen, wobei die Werte als Gesamtmenge der nach 4-tägiger Infektion produzierten Viren angegeben sind. - Es zeigte sich, dass alle Viren in CEF-Zellen (Hühnerembryo-Fibroblasten) erwartungs-gemäß gut amplifizierten, da dies eine für alle MVAs permissive Zelllinie ist. Außerdem zeigte sich, dass alle Viren in BHK (Hamsternieren-Zelllinie) gut amplifizierten. MVA-Vero funktionierte am besten, da BHK eine permissive Zelllinie ist.
- Bezüglich einer Replikation in Vero-Zellen (Affennieren-Zelllinie) amplifizierte MVA-Vero erwartungsgemäß gut, nämlich 1000-fach über den Input. MVA-HLR und auch MVA-575 amplifizierten gut, und zwar mit einem 33-fachen bzw. 10-fachen Anstieg über den Input. Es stellte sich heraus, dass nur MVA-BN im Vergleich zu den anderen nicht so gut in diesen Zellen amplifizierte, nämlich nur mit einem 2-fachen Anstieg über den Input.
- Auch bezüglich einer Replikation in CV1-Zellen (Affennieren-Zelllinie) stellte sich heraus, dass in dieser Zelllinie MVA-BN stark abgeschwächt ist. Es zeigte ein 200-faches Absinken unter den Input. Auch MVA-575 amplifizierte nicht über den Inputlevel und zeigte ebenso eine leicht negative Amplifikation, nämlich ein 16-faches Absinken unter den Input. MVA-HLR amplifizierte am besten mit einem 30-fachen Anstieg über den Input, gefolgt von MVA-Vero mit einem 5-fachen Anstieg über den Input.
- Ein Vergleich der Wachstumskinetiken der verschiedenen Viren in menschlichen Zelllinien ist äußerst interessant. Bezüglich einer reproduktiven Replikation in 143B-Zellen (menschliche Knochenkrebs-Zelllinie) zeigte sich, dass MVA-Vero das einzige war, welches eine Amplifikation über den Input zeigte (einen 3-fachen Anstieg). Alle anderen Viren amplifizierten nicht über den Input, es bestand jedoch ein großer Unterschied zwischen dem MVA-HLR und sowohl MVA-BN als auch MVA-575. MVA-HLR war „borderline" (1-faches Absinken unter den Input), während MVA-BN die größte Abschwächung (300-faches Absinken unter den Input) zeigt, gefolgt von MVA-575 (59-faches Absinken unter den Input). Zusammenfassend ist zu sagen, dass MVA-BN hinsichtlich der Abschwächung in menschlichen 143B-Zellen überlegen ist.
- Bezüglich einer Replikation in HeLa-Zellen (menschlichen Gebärmutterhalskrebszellen) zeigte sich überdies, dass MVA-HLR in dieser Zelllinie gut amplifizierte, und zwar sogar besser als in den permissiven BHK-Zellen (Hela = 125-facher Anstieg über den Input; BHK = 88-facher Anstieg über den Input). MVA-Vero amplifizierte ebenfalls in dieser Zelllinie (27-facher Anstieg über den Input). MVA-BN und in einem geringeren Ausmaß auch MVA-575 waren in diesen Zelllinien jedoch abgeschwächt (MVA-BN = 29-faches Absinken unter den Input und MVA-575 = 6-faches Absinken unter den Input).
- Bezüglich der Replikation in HaCat-Zellen (menschliche Keratinozytenzelllinie) zeigte sich, dass MVA-HLR in dieser Zelllinie gut amplifizierte (55-facher Anstieg über den Input). Sowohl das angepasste MVA-Vero als auch MVA-575 zeigten in dieser Zelllinie eine Amplifikation (1, 2- bzw. 1,1-facher Anstieg über den Input). MVA-BN war jedoch das einzige, welches eine Abschwächung aufwies (5-faches Absinken unter den Input).
- Abschließend kann festgehalten werden, dass MVA-BN in dieser Virusgruppe der am stärksten abgeschwächte Virusstamm ist: MVA-BN erweist sich als extrem abgeschwächt in menschlichen Zelllinien, wobei es in menschlichen Embryonen-Nierenzellen (293: ECACC Nr. 85120602) ein Amplifikationsverhältnis von 0,05 bis 0,2 zeigt (Daten nicht in Tabelle 1 aufgenommen), weiterhin in 143B-Zellen ein Amplifikationsverhältnis von etwa 0,0 zeigt; in HeLa-Zellen ein Amplifikationsverhältnis von etwa 0,04; in HaCat-Zellen ein Amplifi-kationsverhältnis von etwa 0,22. Außerdem zeigt MVA-BN in CV1-Zellen ein Amplifi-kationsverhältnis von etwa 0,0. Nur in Vero-Zellen kann eine Amplifikation beobachtet werden (Verhältnis von 2,33), allerdings nicht in demselben Ausmaß wie in den permissiven Zelllinien, wie z.B. BHK und CEF (vergl. Tabelle 1). Somit ist MVA-BN der einzige bekannte MVA-Stamm, der in jeder der menschlichen Zelllinien 143B, Hela, HaCat und 293 ein Amplifikationsverhältnis von weniger als 1 aufweist.
- MVA-575 zeigt ein ähnliches Profil wie MVA-BN, ist jedoch nicht so abgeschwächt wie MVA-BN.
- MVA-HLR amplifizierte gut in allen getesteten Zelllinien (mit Ausnahme von 143B-Zellen), somit kann es in allen getesteten Zelllinien, mit Ausnahme von 143B-Zellen, als replikationsfähig angesehen werden. In einem Fall amplifizierte es in einer menschlichen Zelllinie (HeLa) sogar besser als in einer permissiven Zelllinie (BHK).
- MVA-Vero zeigt in allen Zelllinien eine Amplifikation, jedoch in einem geringeren Ausmaß als von MVA-HLR gezeigt (wobei die 143B-Resultate ignoriert werden). Dennoch kann es hinsichtlich der Abschwächung nicht als zur selben „Klasse" wie MVA-BN oder MVA-575 gehörig betrachtet werden.
- 2. Replikation in vivo
- Angesichts der Tatsache, dass manche MVA-Stämme klar in vitro replizieren, wurde unter Verwendung eines transgenen Maus-Modells AGR129 die Fähigkeit verschiedener MVA-Stämme zur in vivo-Replikation untersucht. Dieser Mäusestamm weist Gen-gezielte Brüche in den IFN-Rezeptor-Genen vom Typ I (IFN-α/β) und Typ II (IFN-γ) und in RAG auf. Auf-grund dieser Brüche besitzen die Mäuse kein IFN-System und sind unfähig zur Produktion von reifen B- und T-Zellen und sind somit ernsthaft immungeschädigt und höchst anfällig für ein replizierendes Virus. Gruppen von sechs Mäusen wurden mit 107 pfu von entweder MVA-BN, MVA-HLR oder MVA 572 (bei 120.000 Menschen in Deutschland angewandt) (i.p.) immunisiert und täglich auf klinische Anzeichen überwacht. Alle mit MVA-HLR oder MVA 572 geimpften Mäuse starben innerhalb von 28 bzw. 60 Tagen. Bei einer Nekropsie zeigten sich in den meisten Organen allgemeine Anzeichen einer schweren Virusinfektion, und durch eine Standard-Plaqueanalyse wurde MVA (108 pfu) aus den Eierstöcken gewonnen. Im Gegensatz dazu überlebten Mäuse, die mit derselben Dosis von MVA-BN geimpft waren (entsprechend dem hinterlegten Stamm ECACC V00083008), mehr als 90 Tage lang, und aus Organen oder Geweben konnte kein MVA gewonnen werden.
- Zusammengenommen zeigen die Daten aus der in vitro- und der in vivo-Studie deutlich, dass MVA-BN stärker abgeschwächt ist als der elterliche und handelsübliche MVA-HLR-Stamm.
- Beispiel 2
- Immunologische und in vivo-Daten
- Diese Versuche wurden erstellt, um verschiedene Dosierungs- und Impfsysteme von MVA-BN mit jenen anderer MVAs zu vergleichen.
- 2.1. Verschiedene MVA-Stämme unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit zur Stimulation der Immunreaktion.
- Replikationsfähige Vaccinia-Stämme rufen bei Mäusen starke Immunreaktionen hervor und sind in hohen Dosierungen tödlich. Obwohl MVA stark abgeschwächt ist und eine verringerte Fähigkeit zur Replikation in Säugetierzellen aufweist, bestehen zwischen verschiedenen MVA-Stämmen Unterschiede in der Abschwächung. In der Tat scheint MVA BN mehr abgeschwächt zu sein als andere MVA-Stämme, sogar als der elterliche Stamm MVA 575. Um festzustellen, ob dieser Unterschied in der Abschwächung die Wirksamkeit von MVA in Hinblick auf das Hervorrufen von schützenden Immunreaktionen beeinflusst, wurden verschiedene Dosierungen von MVA BN und MVA 575 in einem Modell mit letaler Vaccinia-Exposition verglichen. Die Schutzgrade wurden durch eine 4 Tage nach der Exposition bestimmte Verringerung der Eierstock-Vaccinia-Titer gemessen, da dies eine quantitative Bewertung verschiedener MVA-Dosierungen und -Stämme ermöglichte.
- Modell einer letalen Exposition
- Spezifische krankheitserregerfreie 6–8 Wochen alte weibliche BALB/c (H-2d)-Mäuse (n=5) wurden mit verschiedenen Dosierungen (102, 104 oder 106 TCID50/ml) von entweder MVA BN oder MVA 575 (i.p.) immunisiert. MVA-BN und MVA-575 waren auf CEF-Zellen vermehrt, Sucrose-gereinigt und in Tris pH 7,4 formuliert worden. Drei Wochen später erhielten die Mäuse eine Auffrischung mit derselben Dosierung und demselben Stamm von MVA, zwei Wochen darauf gefolgt von einer letalen Exposition (i.p.) mit einem replikationsfähigen Vaccinia-Stamm. Als replikationsfähiges Vaccinia-Virus (abgekürzt als „rVV") wurde entweder der Stamm WR-L929 TK+ oder der Stamm IHD-J eingesetzt. Kontrollmäuse erhielten einen Placeboimpfstoff. Der Schutz wurde durch die 4 Tage nach der Exposition durch eine Standard-Plaqueanalyse bestimmte Verringerung der Eierstock-Titer gemessen. Dafür wurden die Mäuse am 4. Tag nach der Exposition getötet und die Eierstöcke entfernt, in PBS (1 ml) homogenisiert, und durch eine Standard-Plaqueanalyse wurden unter Verwendung von VERO-Zellen die Virustiter bestimmt (Thomson et al., 1998, J. Immunol. 160:1717).
- Mäuse, die mit zwei Immunisierungen von entweder 104 oder 106 TCID50/ml MVA-BN oder MVA-575 geimpft wurden, waren vollständig geschützt, wie durch eine 100%ige Verringerung der Eierstock-rVV-Titer 4 Tage nach der Exposition beurteilt (
2 ). Das Expositionsvirus war beseitigt. Bei niedrigeren Dosierungen wurden jedoch Unterschiede in den von MVA-BN oder MVA-575 ermöglichten Schutzgraden beobachtet. Mäuse, die zwei Immunisierungen von 102 TCID50/ml MVA-575 erhielten, waren nicht geschützt, wie durch die hohen Eierstock-rVV-Titer (durchschnittlich 3,7 × 107 pfu +/- 2,11 × 107) beurteilt. Im Gegensatz dazu induzierten mit derselben Dosis MVA-BN geimpfte Mäuse eine erhebliche Verringerung (96%) der Eierstock-rVV-Titer (durchschnittlich 0,21 × 107 pfu +/- 0,287 × 107). Die Kontrollmäuse, welche einen Placeboimpfstoff erhielten, hatten einen mittleren Virustiter von 5,11 × 107 pfu (+/- 3,59 × 107) (2 ). - Beide MVA-Stämme lösen bei Mäusen schützende Immunreaktionen gegen eine letale rVV-Exposition aus. Obwohl beide MVA-Stämme bei höheren Dosierungen gleichermaßen wirksam sind, sind bei Dosierungen, die geringer als optimal sind, Unterschiede in ihrer Wirksamkeit klar zu erkennen. MVA-BN ist hinsichtlich des Hervorrufens einer schützenden Immunreaktion gegen eine letale rVV-Exposition wirksamer als sein Elternstamm MVA-575, was mit der Abschwächung von MVA-BN, die verglichen mit jener von MVA-575 erhöht ist, zusammenhängen kann.
- 2.2 MVA-BN in Prime-Boost-Impfsystemen
- 2.2.1.: Hervorrufen von Antikörpern gegen MVA nach einer Impfung von Mäusen mit verschiedenen Pockenimpfstoffen
- Die Wirksamkeit von MVA-BN wurde mit jener von anderen MVA- und Vaccinia-Stämmen, die zuvor zur Ausrottung von Pocken eingesetzt wurden, verglichen. Diese umfassten Einzelimmunisierungen unter Verwendung der Elstree- und Wyeth-Vaccinia-Stämme, die in CEF-Zellen produziert wurden und über eine Schwanzeinkerbung verabreicht wurden, sowie Immunisierungen unter Verwendung von MVA 572, das früher beim Programm zur Ausrottung von Pocken in Deutschland eingesetzt wurde. Außerdem wurden sowohl MVA-BN als auch MVA 572 als Vorimpfstoff verglichen, gefolgt von Elstree über eine Einkerbung. Für jede Gruppe wurden acht BALB/c-Mäuse verwendet, und alle MVA-Impfungen (1 × 107 TCID50) wurden in Woche 0 und Woche 3 subkutan verabreicht. Zwei Wochen nach der Boost-Immunisierung wurden die Mäuse mit Vaccinia (IHD-J) konfrontiert, und die Titer in den Eierstöcken wurden 4 Tage nach der Exposition bestimmt. Alle Impfstoffe und Therapien lösten einen 100%igen Schutz aus.
- Die Immunreaktionen, die unter Verwendung dieser verschiedenen Impfstoffe oder Therapien hervorgerufen wurden, wurden vor der Exposition bei Tieren gemessen. Es wurden Analysen zur Messung der Spiegel von neutralisierenden Antikörpern, der T-Zell-proliferation, der Cytokinproduktion (IFN-γ versus IL-4) und der IFN-γ-Produktion durch T-Zellen angewandt. Der durch ELIspot gemessene Grad der T-Zellen-Reaktionen, welche durch MVA-BN hervorgerufen wurden, war im Allgemeinen äquivalent mit jenem anderer MVA- und Vaccinia-Viren, was eine Bioäquivalenz zeigt. Eine wöchentliche Analyse der Antikörpertiter gegenüber MVA im Anschluss an die verschiedenen Impfsysteme machte deutlich, dass Impfungen mit MVA-BN die Geschwindigkeit und den Umfang der Antikörperreaktion im Vergleich zu anderen Impfsystemen beträchtlich steigerte (
11 ). Tatsächlich waren die Antikörpertiter gegenüber MVA bei einer Impfung mit MVA-BN in Woche 2, 4 und 5 (1 Woche nach der Auffrischung in Woche 4) erheblich höher (p>0,05), im Vergleich zu Mäusen, die mit MVA 572 geimpft wurden. Nach der Boost-Impfung in Woche 4 waren die Antikörpertiter ebenfalls bei der MVA-BN-Gruppe erheblich höher, im Vergleich zu den Mäusen, die eine einzige Impfung entweder mit dem Vaccinia-Stamm Elstree oder mit dem Vaccinia-Stamm Wyeth erhielten. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass 2 Impfungen mit MVA-BN eine Antikörperreaktion auslösten, die im Vergleich zur klassischen Einzelimpfung mit traditionellen Vaccinia-Stämmen (Elstree und Wyeth) überlegen war, und bestätigen die Erkenntnisse aus Abschnitt 1.5, dass MVA-BN stärker immunisierend ist als andere MVA-Stämme. - 2.2.2.: MVA-Prime- und Boost-Systeme erzeugen denselben Schutzgrad wie DNA-Prime/MVA-Boost-Systeme in einem Influenza-Expositionsmodell
- Die Wirksamkeit von MVA-Prime-Boost-Systemen zur Erzeugung von CTL-Reaktionen mit hoher Avidität wurde bewertet und mit jener von DNA-Prime/MVA- Boost-Systemen verglichen, von denen berichtet wurde, dass sie überlegen sind. Die verschiedenen Systeme wurden unter Verwendung eines Maus-Polytop-Konstrukts, das entweder von einem DNA-Vektor oder von MVA-BN codiert wurde, bewertet, und die Pegel der CTL-Induktion wurden mittels ELISPOT verglichen, während die Avidität der Reaktion als jener Schutzgrad gemessen wurde, der nach einer Exposition mit Influenza erreicht wurde.
- Konstrukte
- Das DNA-Plasmid, welches das Maus-Polytop (10 CTL-Epitope, einschließlich Influenza, Ovalbumin) codierte, wurde zuvor beschrieben (Thomson et al., 1998, J. Immunol. 160:1717). Dieses Maus-Polytop wurde an der Deletionsstelle II von MVA-BN eingefügt, auf CEF-Zellen vermehrt, Sucrose-gereinigt und in Tris pH 7,4 formuliert.
- Impfprotokolle
- Bei der vorliegenden Studie wurden spezifische krankheitserregerfreie 6–8 Wochen alte weibliche BALB/c (H-2d)-Mäuse verwendet. Gruppen von 5 Mäusen wurden für die ELISPOT-Analyse verwendet, während 6 Mäuse pro Gruppe für die Versuche einer Influenza-Exposition herangezogen wurden. Die Mäuse wurden mit verschiedenen Prime-Boost-Systemen geimpft, wobei MVA oder DNA verwendet wurde, welches bzw. welche das Maus-Polytop codierte, wie in den Ergebnissen detailliert angeführt. Für Immuni-sierungen mit DNA wurden die Mäuse anästhetisiert und erhielten danach unter Anästhesie eine Einzelinjektion von 50 μg Endotoxin-freier Plasmid-DNA (in 50 μl PBS) in den Quadriceps-Muskel. Primäre Immunisierungen unter Verwendung von MVA wurden entweder durch intravenöse Verabreichung von 107 pfu MVA-BN pro Maus oder durch subkutane Verabreichung von 107 pfu oder 108 pfu MVA-BN pro Maus durchgeführt. Boost-Immunisierungen wurden drei Wochen nach den primären Immunisierungen verabreicht. Das Auffrischen mit Plasmid-DNA wurde in derselben Weise durchgeführt wie die primäre Immunisierung mit DNA (siehe oben). Zur Erstellung von CTL-Reaktionen wurden 2 Wochen nach der letzten Booster-Immunisierung Standard-ELISPOT-Analysen (Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4; 397-402) an Splenozyten durchgeführt, wobei das Influenza-CTL-Epitop-Peptid (TYQRTRALV), das P.Berghei-Epitop-Peptid (SYIPSAEKI), das Cyto-megalovirus-Peptid-Epitop (YPHFMPTNL) und/oder das LCV-Peptid-Epitop (RPQASGVYM) verwendet wurde bzw. wurden. Für die Expositionsversuche wurden die Mäuse anästhetisiert und i.n. mit einer subletalen Dosis des ressortanten Influenzavirus, Mem71 (4,5 × 105 pfu in 50 ml PBS), infiziert. Am Tag 5 nach der Infizierung wurden die Lungen entfernt und die Virustiter zweifach an einer Madin-Darby-Hundenieren-Zelllinie unter Anwendung einer Standard-Influenza-Plaqueanalyse bestimmt.
- Ergebnisse
- Bei alleiniger Verwendung des DNA-Impfstoffs war die Induktion von CTL gegenüber den vom Maus-Polytop codierten 4 H-2d-Epitopen schlecht, und es konnten nur schwache Reaktionen gegen zwei der Epitope für P.Berghei (SYIPSAEKI) und das lymphozytäre Choriomeningitisvirus (RPQASGVYM) nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurde bei Anwendung eines DNA-Prime/MVA-Boost-Systems (107 pfu MVA-BN, subkutan verabreicht) erheblich mehr CTL gegenüber SLY (8-facher Anstieg) und RPQ (3-facher Anstieg) hervorgerufen, und es wurden auch Reaktionen gegen ein drittes Epitop für das Maus-Cytomegalovirus (YPHFMPTNL) beobachtet (
3A ). Die Verwendung von 107 pfu MVA-BN, welches in einem homologen Prime-Boost-System subkutan verabreicht wurde, rief jedoch denselben Reaktionsgrad wie DNA, gefolgt von MVA-BN, hervor (3A ). Überraschenderweise gab es bei Anwendung einer MVA-BN-Immunisierung (107 TCID50) keinen erheblichen Unterschied in der Anzahl von CTLs, die gegenüber den drei Epitopen hervorgerufen wurden, was darauf hinweist, dass eine sekundäre Immunisierung mit MVA-BN die CTL-Reaktionen nicht signifikant verstärkte. - Früher hatte sich gezeigt, dass die subkutane Verabreichung von 107 pfu MVA den ineffizientesten Weg und die ineffizienteste Viruskonzentration für eine Impfung darstellt, bei der andere MVA-Stämme verwendet werden, insbesondere im Vergleich zu intravenösen Immunisierungen (Schneider et al 1998). Um optimale Immunisierungssysteme zu definieren, wurde der obige Versuch wiederholt, wobei entweder die Virusmenge oder die Verabreichungsmethode verändert wurde. Bei einem Versuch wurden 107 pfu MVA-BN-Impfungen intravenös verabreicht (
3B ). Bei einem weiteren Versuch wurden 108 pfu MVA-BN subkutan verabreicht (3C ). Bei diesen Versuchen induzierten MVA-BN-Prime-Boost-Immunisierungen mittlere CTL-Zahlen gegenüber allen drei CTL-Epitopen, welche im Vergleich zu DNA-Prime/MVA-Boost-Systemen höher waren. Ebenso im Gegensatz zu 107 pfu MVA-BN, das subkutan verabreicht wurde, verstärkten die Immuni-sierung mit 107 pfu MVA-BN, das intravenös verabreicht wurde, und die Immunisierung mit 108 pfu, die subkutan verabreicht wurde, erheblich die CTL-Reaktionen, was klar darauf hinweist, dass MVA-BN zum Verstärken von CTL-Reaktionen bei Vorhandensein einer zuvor existierenden Immunität gegenüber dem Vektor eingesetzt werden kann. - 2.2.3. Wirksamkeit eines MVA-BN nef-Impfstoffs bei SIV-infizierten Rhesusaffen
- Zur Bestimmung der Wirksamkeit eines MVA-BN nef-Impfstoffs durch Bewertung der Virusbelastung und der Krankheitsverzögerung nach Exposition mit einem virulenten primären SIV-Isolat. Die Studie bestimmt überdies, ob MVA-BN zum sicheren Verstärken von Immunreaktionen bei immungeschädigten Affen mit zuvor existierender Immunität gegenüber MVA verwendet werden kann.
- Impfprotokolle
- Zwei Gruppen (n = 6) von Rhesusaffen (Macaca mulalta) wurden in Woche 0, 8 und 16 durch eine intramuskuläre Bolusinjektion von entweder nur MVA-BN oder von rekombinantem MVA-BN nef geimpft. In Woche 22 wurden alle Affen über den intravenösen Weg mit 50 MID50 eines pathogenen zellassoziierten SIV-Ausgangsmaterials (1XC) aus primären, nicht kultivierten Rhesusaffen-PBMC konfrontiert. Der klinische Zustand der Tiere wurde häufig überwacht, und zur Messung der Virämie, der Immun-parameter und des vollen Umfangs einer Hämatologie sowie der klinischen Blutchemie-parameter wurden regelmäßig Blutproben entnommen. Tiere, die eine AIDs-artige Erkrankung entwickelten, wurden getötet, und die überlebenden Affen wurden nach der Impfung 99 Wochen lang überwacht. In Woche 100 wurden alle überlebenden Affen mit MVA-BN tat i.m. immunisiert und erhielten weitere Immunisierungen mit demselben MVA-BN tat in Woche 102 und 106.
- Nach keiner der Impfungen mit entweder MVA-BN oder MVA-BN nef wurden irgendwelche nachteiligen Wirkungen beobachtet. Nach der Infizierung der Affen mit SIV stiegen die Virämiegrade stark an und kulminierten zwei Wochen nach der Infektion (
4 ). Aufgrund der großen Standardabweichungen innerhalb der Gruppen bestand zwischen den Gruppen, die entweder mit MVA-BN nef oder mit MVA-BN geimpft waren, kein signifikanter Unterschied in den mittleren SIV-Pegeln. Es gab jedoch in der mit MVA-BN nef geimpften Gruppe im Vergleich zur Kontroll (MVA-BN)-Gruppe eine allgemein 10-fach niedrigere SIV-Belastung. Überdies musste nach 35 Wochen nach der Infektion (der anfängliche Beobachtungszeitraum) nur 1 von den sechs mit MVA-BN nef geimpften Affen aufgrund der Schwere der Erkrankung eingeschläfert werden, verglichen mit 4 von den 6 Tieren in der Kontrollgruppe (5 ). Die Krankheitsentwicklung korrelierte klar mit einer höheren Virusbelastung, und somit wurden die Tiere für zusätzliche 29 Wochen nach der Infizierung beobachtet. Der MVA-BN nef-Impfstoff schien verglichen mit der Kontrollgruppe das Fortschreiten der Erkrankung zu verzögern, und sogar in der 46. Woche nach der Infizierung überlebten 5 von den 6 MVA-BN nef-Tieren (5 ). Bis zur 59. Woche nach der Infizierung wurden jedoch zwei weitere Tiere in der nefgeimpften Gruppe eingeschläfert, wodurch fünf überlebende Tiere zurückblieben (drei aus der MVA-BN nef-Gruppe und zwei, die mit MVA-BN geimpft waren). Eine Untersuchung der Antikörpertiter, die in diesen 12 Affen gegenüber MVA-BN gebildet wurden, zeigte deutlich, dass MVA-BN die Immunreaktion sogar bei Vorhandensein einer zuvor existierenden Immunität gegenüber MVA verstärken konnte (6 ). Nach der primären Immunisierung mit entweder MVA-BN oder MVA-BN nef erzeugten alle Affen eine Antikörperreaktion gegenüber MVA mit einem mittleren Titer von 1000. Diese Antikörperreaktion wurde nach der sekundären Immuni-sierung erheblich verstärkt, was deutlich zeigte, dass MVA zum Stimulieren/Verstärken einer Immunreaktion bei gesunden Affen verwendet werden kann. Diese Antikörpertiter nahmen allmählich ab, obwohl die Titer bis zur 49. Woche nach der Immunisierung ein Plateau erreichten, so dass in Woche 99 die mittleren Titer gegenüber MVA 2000 betrugen. - Die fünf überlebenden Affen waren SIF-infiziert und mit CD4-Zahlen, die unter 400/μl Blut lagen, immungeschädigt. Um die Auswirkung der Verwendung von MVA-BN bei immungeschädigten Affen zu untersuchen, wurden die fünf Tiere nach der Anfangsimpfung in Woche 100, 102 und 106 dreimal mit MVA-BN tat geimpft. Die erste Immunisierung mit MVA-BN tat verstärkte bei diesen immungeschädigten Affen die Antikörperreaktion gegenüber MVA erheblich, welche sechs Wochen später mit der dritten Immunisierung weiter verstärkt wurde (
6 ). Diese Ergebnisse zeigen weiterhin, dass MVA-BN Immunreaktionen bei Vorhandensein einer zuvor existierenden, erheblichen Immunität gegenüber MVA verstärken kann, und zwar sogar bei immungeschädigten Affen. Obwohl die Immunreaktion der Affen nach den Immunisierungen mit MVA-BN tat verstärkt wurde, blieben die SIV-Pegel stabil, was zeigt, dass Immunisierungen mit MVA-BN sicher sind und die SIV-Pegel bei immungeschädigten Affen nicht beeinflussen (7 ). - Diese Studie zeigte, dass MVA-BN Immunreaktionen bei immungeschädigten Rhesusaffen stimulieren/verstärken kann und dass MVA-BN-Immunisierungen sicher sind und die Virämiegrade bei SIV-infizierten Tieren nicht beeinflussen. Die Verzögerung des Fort-schreitens einer AIDS-artigen Erkrankung bei den mit dem MVA-BN nef-Impfstoff ge-impften Tieren zeigt, dass erfolgreich eine Immunreaktion gegenüber nef geschaffen wurde.
- 2.2.4.: Therapeutische Impfung von SIV-infizierten Affen, welche einer Antiretrovirus-Behandlung unterzogen werden
- sEin therapeutischer HIV-Impfstoff auf MVA-BN-Basis kann wahrscheinlich bei Individuen, die sich einer Antiretrovirus-Therapie unterziehen, eingesetzt werden. Daher untersuchte diese Studie die Sicherheit (Wirkung auf SIV-Pegel) und Wirksamkeit von rekombinanten MVAs, die eine Vielfalt von SIV-Antigenen (gas, pol, env, rev, tat und nef) codieren, bei SIV-infizierten Affen, welche mit PMPA behandelt werden. PMPA ist ein Nucleosid-analogon und wirkt gegen HIV und SIV (Rosenwirth, B. et al., 2000, J Virol 74, 1704–11).
- Konstrukte
- sAlle rekombinanten MVA-Konstrukte wurden auf CEF-Zellen vermehrt, Sucrosegereinigt und in Tris pH 7,4 formuliert.
- Impfprotokoll
- Drei Gruppen (n = 6) von Rhesusaffen (Macaca mulatta) wurden mit 50 MID50 eines pathogenen primären SIV-Isolats (1XC) infiziert und daraufhin 19 Wochen lang täglich mit PMPA (60 mg/kg, s.k. verabreicht) behandelt. In Woche 10 wurden die Tiere mit rekombinantem MVA-BN (i.m.) oder mit einer Salzlösung geimpft und erhielten 6 Wochen später identische Impfungen. Gruppe 1 erhielt eine Mischung aus MVA gag-pol und MVA-env, Gruppe 2 erhielt MVA-tat, MVA-rev und MVA-nef, während Gruppe 3 eine Salzlösung erhielt. Der klinische Zustand der Tiere wurde häufig überwacht, und zur Messung der Virämie, der Immunparameter und des vollen Umfangs einer Hämatologie sowie der klinischen Blutchemieparameter wurden regelmäßig Blutproben entnommen.
- Alle Tiere entwickelten hohe SIV-Belastungen, die 2 Wochen nach der Infizierung kulminierten (
8 ). Nach täglicher Behandlung mit PMPA nahmen die SIV-Pegel ab und stabilisierten sich bis zur 9. Woche auf niedrigem Niveau. Wie bei der vorherigen Studie hatten Impfungen mit MVA in Woche 10 und 16 keinerlei Wirkung auf die SIV-Pegel, was zeigt, dass MVA-BN ein sicherer Impfstoffvektor für immungeschädigte Tiere ist. Sobald die Tiere von der PMPA-Behandlung abgesetzt wurden (Woche 21), stiegen die SIV-Pegel an. Obwohl drei Tiere in Gruppe 1 im Vergleich zur Kontrollgruppe 3 verringerte SIV-Pegel aufwiesen, bestand nach dem Ende der PMPA-Behandlung kein erheblicher Unterschied in der mittleren SIV-Belastung zwischen irgendwelchen dieser Gruppen (8 ). Bei Anwendung einer ELISA auf SIV-infizierte T-Zelllysate bildeten Tiere in allen Gruppen bis zur 4. Woche nach der Infektion eine Antikörperreaktion gegenüber SIV (9 ). Der SIV-Antikörpertiter in der Kontrollgruppe (Salzlösung) sank während der PMPA-Behandlung ab und stieg beim Stoppen der PMPA-Behandlung rasch an, was den Abfall und anschließen-den Anstieg der SIV-Pegel während einer Antiretrovirus-Therapie wiederspiegelt (9 ). Ein ähnliches Muster beim SIV-Antikörpertiter wurde in Gruppe 2 beobachtet, welche MVA-tat, MVA-ref und MVA-nef erhielt, was möglicherweise die Unterexpression dieser Regulationsproteine in den bei der ELISA verwendeten SIV-infizierten T-Zelllysaten wiederspiegelt. Im Gegensatz dazu stiegen die anti-SIV-Antikörpertiter in Gruppe 1 jedoch nach den Impfungen mit MVA gag-pol und MVA-env in Woche 10 an, was zeigt, dass rekombinantes MVA-BN die Immunreaktion gegenüber SIV bei (SIV)-infizierten Tieren, die einer Antiretrovirus-Therapie unterzogen werden, verstärken kann. Wichtig ist, dass die anti-SIV-Antikörpertiter nach der sekundären Immunisierung in Woche 16 verstärkt wurden, was wiederum beweist, dass MVA Immunreaktionen bei immungeschädigten Tieren sogar bei Vorhandensein einer zuvor existierenden Immunität gegenüber MVA verstärken kann (8 ). Die anti-MVA-Antikörpertiter in Gruppe 1 spiegelten ebenfalls dieses Muster wieder, und zwar mit der Erzeugung einer Antikörperreaktion nach der primären Immunisierung, welche nach der sekundären Impfung erheblich verstärkt wurde (10 ). - Literaturhinweise
-
- Schneider, J., Gilbert, SC., Blanchard, TJ., Hanke, T., Robson, KJ., Hannan, CM., Becker, M., Sinden, R., Smith, GL., und Hill, AVS. 1998. Enhanced immunogenicity for CD8+ T cell induction and complete efficacy of malaria DNA vaccination by boosting with modified vaccinia virus Ankara. Nat Med. 4; 397–402.
- Thomson, SA., Sherritt, MA., Medveczky, J., Elliott, SL., Moss, DJ., Fernando, GJP., Brown, LE., und Suhrbier, A. 1998. Delivery of multiple CD8 cytotoxic T cell epitopes by DNA vaccination. J. Immunol. 160:1717.
- Tabelle 1:
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- Virusamplifikation über den Inputlevel nach 4 Tagen Infektion
- Amplifikationsverhältnis = Output TCID50 – Input TCID50.
- Werte sind in TCID50.
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Claims (30)
- Vaccinia Virus mit wenigstens einer der folgenden Eigenschaften: (i) Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in Hühnerembryofibroblasten (CEF) jedoch keine Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in der menschlichen Keratinozytenzellinie HaCat, (ii) Unfähigkeit zur Replikation in ernsthaft immungeschädigten Mäusen, (iii) Induktion einer höheren Immunisierungswirkung im Vergleich zu dem bekannten Stamm MVA 575 (Hinterlegt bei der ECACC mit der Hinterlegungsnummer V00120707) in einem Modell mit letaler Exposition und/oder (iv) Induktion von im Wesentlichen dem gleichen Immunitätsgrad in Vacciniavirus-Prime/Vacciniavirus-Boost Systemen verglichen mit DNA Prime/Vacciniavirus-Boost-Systemen.
- Vaccinia Virus nach Anspruch 1, wobei das Merkmal (iii) erfüllt ist, wenn in dem in der Beschreibung offenbarten Modell mit letaler Exposition nach der Impfung der Mäuse mit 102 TCID50 („tissue culture infectious dose") des Vaccinia Viruses der Eierstock Virustiter eines replikationskompetenten Expositionsvirus („challenging virus") im Vergleich zu ungeimpften Mäusen um 70% reduziert ist.
- Vaccinia Virus nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei der im Wesentlichen gleiche Immunitätsgrad nach Merkmal (iv), eine im Wesentlichen gleiche CTL-Antwort in wenigstens einer der in der Beschreibung offenbarten Analysen 1 oder 2 ist.
- Vaccinia Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, mit wenigstens zwei, drei oder mit allen Eigenschaften (i) bis (iv).
- Vaccinia Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Vacciniavirus zur reproduktiven Replikation in einer, mehreren oder allen der folgenden menschlichen Zelllinien unfähig ist: die menschliche Knochensarkom-Zelllinie 143B, die humane Keratinozytenzellinie HaCat und die menschliche Gebärmutterhals-Adenokarzinom-Zelllinie HeLa.
- Vaccinia Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die ernsthaft immungeschädigten Mäuse unfähig zur Produktion von reifen B- und T-Zellen sind.
- Vaccinia Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die ernsthaft immungeschädigten Mäuse transgene AGR129-Mäuse sind.
- Vaccinia Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Vacciniavirus klongereinigt ist.
- Vaccinia Virus nach einem der Ansprüche 1 to 8, wobei es sich bei dem Vacciniavirus um ein modifiziertes Vacciniavirus Ankara (MVA) handelt.
- Vacciniavirus nach Anspruch 9, nämlich MVA-BN, hinterlegt am 30. August 2000 bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK), unter der Nummer V00083008 oder ein Derivat davon.
- Vacciniavirus nach Anspruch 10, wobei das Derivat (a) durch die Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) und in der Nierenzelllinie BHK vom Hamsterjungen und durch die Unfähigkeit zur reproduktiven Replikation in menschlichen Zelllinien, und (b) durch ein Unvermögen zur in-vivo-Replikation in ernsthaft immungeschädigten Mäusen gekennzeichnet ist.
- Vacciniavirus nach Anspruch 11, wobei die menschlichen Zellinien die menschliche Knochensarkom-Zelllinie 143B, die humane Keratinozytenzellinie HaCat und die menschliche Gebärmutterhals-Adenokarzinom-Zelllinie HeLa sind.
- Vaccinia virus nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Vacciniavirus zumindest eine heterologe Nucleinsäuresequenz umfasst.
- Vaccinia Virus nach Anspruch 13, wobei die heterologe Nucleinsäuresequenz ausgewählt ist aus einer Sequenz, die für zumindest ein Antigen, ein antigenes Epitop und/oder eine therapeutische Verbindung codiert.
- Vaccinia Virus nach Anspruch 14, wobei die antigenen Epitope (i) von Viren, ausgewählt aus der der Familie der Influenzaviren, Flaviviren, Paramyxoviren, Hepatitisviren, dem Humanen Immundefizienzvirus oder von Viren, die Hemorrhagisches Fieber verursachen oder (ii) von Proteinen, die im Zusammenhang mit der Entwicklung von Tumoren oder Krebs stehen, abgeleitet sind.
- Vacciniavirus nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei es sich bei dem MVA um MVA-BN, enthaltend das nef-Gen handelt.
- Genom des Vacciniavirus nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
- Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend das Vacciniavirus nach einem der Ansprüche 1 bis 16 oder das Genom nach Anspruch 17 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein pharmazeutische annehmbares Verdünnungsmittel und/oder Additiv.
- Impfstoff enthaltend das Vacciniavirus nach einem der Ansprüche 1 bis 16 und/oder das Genom nach Anspruch 17.
- Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder Impfstoff nach Anspruch 19, enthaltend wenigstens 102 TCID50 des Virus.
- Vacciniavirus nach einem der Ansprüche 1 bis 16, Genom nach Anspruch 17, pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 18 oder 20 oder Impfstoff nach einem der Ansprüche 19 oder 20, um eine Immunantwort in einem lebenden Tier einschließlich des Menschen zu beeinflussen, vorzugsweise hervorzurufen.
- Vacciniavirus nach einem der Ansprüche 1 bis 16, pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 18 oder 20 oder Impfstoff nach einem der Ansprüche 19 oder 20, wobei das Vacciniavirus, die pharmazeutische Zusammensetzung oder der Impfstoff in therapeutisch wirksamen Mengen in einer ersten Verabreichung („priming inoculation") und in einer zweiten Verabreichung („boosting inoculation") verabreicht wird.
- Vacciniavirus nach einem der Ansprüche 1 bis 16, Genom nach Anspruch 17, pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 18 oder 20 oder Impfstoff nach einem der Ansprüche 19 oder 20, zur Impfung eines lebenden Tieres, einschließlich des Menschen, gegen eine human Pockenerkrankung.
- Vacciniavirus, Genom, pharmazeutische Zusammensetzung oder Impfstoff nach Anspruch 23, wobei die humane Pockenerkrankung die Pocken sind.
- Vacciniavirus, Genom, pharmazeutische Zusammensetzung oder Impfstoff nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei das Tier, einschließlich des Menschen, immunsupprimiert ist.
- Vacciniavirus, Genom, pharmazeutische Zusammensetzung oder Impfstoff nach einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei das Tier, einschließlich des Menschen, eine bereits existierende Immunität gegenüber Pockeviren hat.
- Vacciniavirus, Genom, pharmazeutische Zusammensetzung oder Impfstoff nach einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei das Tier, einschließlich des Menschen, eine anti-retrovirale Therapie erhält.
- Vacciniavirus, Genom, pharmazeutische Zusammensetzung oder Impfstoff nach Anspruch 27, wobei die anti-virale Therapie eine anti-retrovirale Therapie ist.
- Vaccinia Virus nach einem der Ansprüche 13 bis 16 oder Genom nach Anspruch 17 zum Einführen einer homologen oder heterologen Nukleinsäuresequenz in Zielzellen.
- Vacciniavirus nach einem der Ansprüche 1 bis 16 oder Genom nach Anspruch 17 als Adjuvans.
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