DE19882657C2 - Massenspektrometrischer Nachweis von Polypeptiden - Google Patents
Massenspektrometrischer Nachweis von PolypeptidenInfo
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Description
Die offenbarten Verfahren und Kits betreffen im
allgemeinen das Gebiet von Proteomics sowie der molekularen
Medizin, und insbesondere Verfahren, die Massenspektrometrie
verwenden, um die Identität eines Targetpolypeptides zu
bestimmen.
In den vergangenen Jahren ist die Molekularbiologie einer
Reihe von humangenetischen Krankheiten durch die Anwendung von
rekombinanten DNA-Technologien erklärt worden. Von mehr als
3000 Krankheiten ist bekannt, daß sie genetischen Ursprungs
sind (Cooper und Krawczak, "Human Genome Mutations" (BIOS Publ.
1993)), einschließlich beispielsweise Hämophilie, Thalassämie,
Duchenne Muskeldystrophie, Huntingtons Krankheit, Alzheimer
Krankheit und zystische Fibrose sowie verschiedener Krebsarten
wie Brustkrebs. Zusätzlich zu mutierten Genen, die zu
genetischen Krankheiten führen, sind bestimmte Geburtsdefekte
das Ergebnis von chromosomalen Anormalitäten, beispielsweise
einschließlich Trisomie 21 (Down-Syndrom), Trisomie 13 (Patau-
Syndrom), Trisomie 18 (Edward-Syndrom), Monosomie X (Turner-
Syndrom) und andere Sexualchromosom-Aneuploidien wie das
Klinefelter-Syndrom (XXY).
Andere genetische Krankheiten werden durch eine anormal
Anzahl von Trinukleotidwiederholungen (trinucleotide repeats)
in einem Gen verursacht. Diese Krankheiten schließen
Huntingtons Krankheit, Prostatakrebs, spinalzerebellare Ataxie
1 (SCA-1), fragiles X-Syndrom (Kremer et al., Science 252: 1711-14
(1991); Fu et al Cell 67: 1047-58 (1991); Hirst et al., J.
Med. Genet. 28: 824-29 (1991)); Myotonische Dystrophie Typ I
(Mahadevan et al., Science 255: 1253-55 (1992); Brook et al.,
Cell 68: 799-808 (1992)), Kennedy Krankheit (die ebenfalls
spinale und bulbäre Muskelatrophie genannt wird (La Spada et
al., Nature 352; 77-79 (1991)), Machado-Joseph-Krankheit sowie
dentatorubrale und pallidolyusiane Atrophie ein. Die anomale
Zahl von Tripletwiederholungen kann in jedem Bereich eines
Genes, einschließlich einer kodierenden Region, einer nicht
kodierenden Region eines Exons, eines Introns oder eines
regulatorischen Elementes wie einen Promoter angeordnet liegen.
Bei einigen dieser Krankheiten, z. B. Prostatakrebs, ist die
Anzahl von Tripletwiederholungen mit der Prognose der Krankheit
positiv korreliert.
Beweise zeigen an, daß die Amplifikation einer
Trinukleotidwiederholung in der molekularen Pathologie in jeder
der oben genannten Krankheiten involviert ist. Obwohl einige
dieser Trinukleotidwiederholungen in nicht kodierender DNA
aufzutreten scheinen, sind sie eindeutig in Störungen von
genomischen Bereichen involviert, die letztendlich die
Genexpression beeinflussen. Störungen von verschiedenen
Dinukleotid- und Trinukleotidwiederholungen, die aus
somatischen Mutationen in Tumorzellen herrühren, können sich
ebenfalls auf die Genexpression oder Genregulation auswirken.
Zusätzliche Beweise zeigen an, daß gewisse DNA-Sequenzen
ein Individuum gegen eine Reihe von anderen Krankheiten,
einschließlich Diabetes, Arteriosklerose, Fettleibigkeit,
verschiedenen Autoimmunkrankheiten und Krebsarten wie
Kolorektal-, Brust-, Gebärmutter- und Lungenkrebs, empfänglich
machen. Das Wissen über genetische Läsionen, die eine
genetische Krankheit verursachen oder dazu beitragen, erlaubt
die Vorhersage, ob eine Person eine Krankheit oder einen
Zustand hat, oder einem Risiko ausgesetzt ist, diese(n) zu
entwickeln sowie ebenfalls, zumindest in einigen Fällen, die
Prognose der Krankheit zu bestimmen.
Zahlreiche Gene haben polymorphe Bereiche. Da Individuen
eine von verschiedenen allelischen Varianten eines polymorphen
Bereiches besitzen, kann jedes auf Grundlage des Typs der
allelischen Variante von polymorphen Regionen von Genen
identifiziert werden. Eine solche Identifikation kann zum
Beispiel für forensische Zwecke verwendet werden. In anderen
Situationen ist es wichtig, die Identität der allelischen
Variante in einem Individuum zu kennen. Zum Beispiel sind
allelische Unterschiede in gewissen Genen wie den Haupt-
Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Genen in der
Transplantatabstoßung oder der Graft-Versus-Host-Disease bei
Knochenmarktransplantationen involviert. Demzufolge ist es
äußerst wünschenswert, schnelle, empfindliche und genaue
Methoden zur Bestimmung der Identität von allelischen Varianten
von polymorphen Bereichen von Genen oder genetischen Läsionen
zu entwickeln.
Verschiedene Verfahren sind verwendet worden, um
allelische Varianten oder genetische Läsionen zu
identifizieren. Zum Beispiel kann die Identität einer
allelischen Variante oder die Gegenwart einer genetischen
Läsion bestimmt werden, indem die Mobilität eines
amplifizierten Nukleinsäurefragments mit einem bekannten
Standard durch Gel-Elektrophorese verglichen wird, oder durch
Hybridisierung mit einer Sonde, die komplementär zu der zu
identifizierenden Sequenz ist. Die Identifikation kann
allerdings nur erreicht werden, wenn das Nukleinsäurefragment
mit einer empfindlichen Reporterfunktion, beispielsweise einem
radioaktiven (32P, 35S), fluoreszierenden oder
chemilumineszenten Reporter, markiert ist. Radioaktive
Markierungen können gefährlich sein und die Signale, die sie
produzieren, können im Verlauf der Zeit substantiell abnehmen.
Nichtradioaktive Markierungen wie Fluoreszenzmarkierungen
können an einer mangelnden Empfindlichkeit und am Verbleichen
des Signals, wenn Hochintensitätslaser verwendet werden,
leiden. Darüber hinaus sind die Markierung, Elektrophorese und
nachfolgende Detektion mühsame, zeitaufwendige und
fehlerzugängliche Verfahren. Die Elektrophorese ist besonders
fehlergeneigt, da die Größe oder das Molekulargewicht der
Nukleinsäure nicht direkt mit seiner Mobilität in der Gelmatrix
korreliert werden kann, da sequenzspezifische Effekte,
Sekundärstrukturen und Interaktionen mit der Gelmatrix
Artefakte bei seiner Wanderung durch das Gel verursachen.
Massenspektrometrie ist für die Sequenzanalyse von
Nukleinsäuren verwendet worden (siehe zum Beispiel Schram, Mass
Spectrometry of Nucleid Acid Components, Biomedical
Applications of Mass Spectrometry 34: 203-287 (1990); Crain,
Mass Spectrom. Rev. 9: 505-554 (1990); Murray, J. Mass Spectrom.
Rev. 31: 1203 (1996); Nordhoff et al., J. Mass Spectrom. 15: 67
(1997)). Im allgemeinen stellt Massenspektrometrie ein Mittel
bereit, individuelle Moleküle "zu wiegen", indem die Moleküle
im Vakuum ionisiert werden, und sie durch Verflüchtigung
"fliegen" gelassen werden. Unter dem Einfluß von elektrischen
und/oder magnetischen Feldern folgen die Ionen Flugbahnen, die
von ihrer individuellen Masse (m) und Ladung (z) abhängen. Für
Moleküle mit niedrigen Molekulargewicht ist die
Massenspektrometrie Teil des physikalisch-organischen
Routinerepertoires zur Analyse und Charakterisierung von
organischen Molekülen durch die Bestimmung der Masse des
zugrundeliegenden molekularen Ions. Indem Kollisionen dieses
zugrundeliegenden molekularen Ions mit anderen Partikeln wie
Argonatomen herbeigeführt werden, wird darüber hinaus das
molekulare Ion fragmentiert, wodurch Sekundär-Ionen durch
kollisionsaktivierte Dissoziation (CAD) gebildet werden. Das
(der) Fragmentierungsmuster/-Weg erlaubt sehr häufig die
Ableitung von detaillierter struktureller Information. Viele
Anwendungen von massenspektrometrischen Verfahren sind im Stand
der Technik bekannt, insbesondere in den Biowissenschaften
(siehe Meth. Enzymol., Vol. 193, "Mass Spectrometry"
(McCloskey, ed.; Academic Press, NY 1990; McLaffery et al.,
Acc. Chem. Res. 27: 297-386 (1994); Chait und Kent, Science
257: 1885-1894 (1992); Siuzdak, Proc. Natl. Acad. Sci., USA
91: 11290-11297 (1994)), einschließlich Verfahren zum Herstellen
und Analysieren von Biopolymerleitern (siehe internationale
PCT-Anmeldung Nr. WO 96/36732; US-Patent Nr. 5,792,664).
Allerdings existieren, trotz der Anstrengungen,
Massenspektrometrieverfahren auf die Analyse von
Nukleinsäuremolekülen anzuwenden, Begrenzungen,
einschließlich physikalischer und chemischer Eigenschaften
von Nukleinsäuren. Nukleinsäuren sind sehr polare
Biopolymere, die sich sehr schwierig verflüchtigen lassen.
Demzufolge besteht ein Bedarf an Verfahren, die
Identität eines Nukleinsäuremoleküls, insbesondere
genetischer Läsionen in einem Nukleinsäuremolekül unter
Verwendung von alternativen Methoden zu bestimmen. Demzufolge
ist es hier ein Ziel, Verfahren und Zusammensetzungen
bereitzustellen, die diesen Bedarf erfüllen und zusätzliche
Vorteile bereitstellen.
Es wird ein Verfahren zum Erhalten von Information
betreffend die Sequenz eines Targetnukleinsäuremoleküls
relativ zur Sequenz eines Referenznukleinsäuremoleküls, das
ein Referenz-Polypeptid kodiert, bereitgestellt. Das
Verfahren umfasst die Schritte:
- a) Präparieren des von dem Targetnukleinsäuremolekül kodierten Polypeptids ausgehend von dem Targetnukleinsäuremolekül durch in vitro Translation oder durch in vitro Transkription, gefolgt von Translation, des Targetnukleinsäuremoleküls;
- b) Bestimmen der molekularen Masse des kodierten Polypeptids durch Massenspektrometrie; und
- c) Vergleichen der molekularen Masse des kodierten Polypeptids mit der molekularen Masse des korrespondierenden, bekannten Referenz-Polypeptids, wodurch Information über die Sequenz von Nukleotiden im Targetnukleinsäuremolekül erhalten wird.
Nachfolgend wird das Targetnukleinsäuremolekül auch als
(Target)-Nukleinsäure und das kodierte Polypeptid auch als
Target-Polypeptid bezeichnet. Das Verfahren schließt somit
die Schritte ein: Bestimmen der molekularen Masse des
Targetpolypeptids oder eines Fragmentes oder eines Fragmentes
davon durch Massenspektrometrie, und anschließend Vergleichen
der Masse mit einem Standard, wodurch die Identität des
Polypeptids ermittelt werden kann. Identität schließt ein,
die Sequenz des Polypeptids zu identifizieren, einen
Austausch in einer Sequenz verglichen mit einem bekannten
Polypeptid zu identifizieren, sowie andere Mittel, durch die
Polypeptide und Mutationen davon identifiziert werden können,
ist jedoch nicht darauf begrenzt. Die Auswahl des Standards
wird als Funktion der gewünschten Information bestimmt.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Identität eines
Targetpolypeptids schließt die Schritte ein a) Erhalten eines
Targetpolypeptids; b) Bestimmen der molekularen Masse des
Targetpolypeptids durch Massenspektrometrie und c) durch
Vergleichen der molekularen Masse des Targetpolypeptids mit
der molekularen Masse eines korrespondieren bekannten
Polypeptids. Indem die molekulare Masse des Targets mit einem
bekannten Polypeptid, das eine bekannte Struktur aufweist,
verglichen wird, kann die Identität des Targetpolypeptids
ermittelt werden. Wie hier offenbart wird, wird das
Polypeptid durch Verfahren einschließlich Transkribieren
einer Nukleinsäure, die das Targetpolypeptid kodiert, in RNA
und Übersetzen der RNA in das Targetpolypeptid, erhalten.
Falls gewünscht, kann die Transkription der Nukleinsäure oder
die Translation der RNA oder beide in vitro durchgeführt
werden.
Ein hier offenbartes Verfahren kann ebenfalls einen
Schritt einschließen, eine Nukleinsäure, die das
Targetpolypeptid kodiert, vor dem Schritt a) zu
amplifizieren, zum Beispiel indem eine Polymerase-
Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines Forward-Primers
und eines reversen Primers durchgeführt wird. Der Forward-
Primer oder der reverse Primer kann einen RNA-
Polymerasepromotor wie einen SP6 Promotor, T3 Promotor oder
T7 Promotor enthalten. Darüber hinaus kann ein Primer eine
Nukleotidsequenz für eine Transkriptionsstartstelle
enthalten. Ein Primer kann ebenfalls ein
Translationsstartcodon (ATG) kodieren. Demzufolge kann ein
Targetpolypeptid von einer Nukleinsäure translatiert werden,
die auf natürliche Weise in vivo nicht transkribiert oder
translatiert wird, zum Beispiel indem ein Startcodon in die
zu translatierende Nukleinsäure eingebaut wird, wodurch ein
Translationsleserahmen bereitgestellt wird. Weiterhin kann
ein Primer eine Nukleotidsequenz oder ein Komplement davon
enthalten, die ein zweites Peptid oder Polypeptid kodiert,
zum Beispiel ein Peptidanhängsel wie ein myc-Epitop-
Anhängsel, ein Haemophilus influenza Hemagglutinin-
Peptidanhängsel, eine Polyhistidinsequenz, eine
Polylysinsequenz oder eine Polyargininsequenz. Ein hier
offenbartes Verfahren kann in vivo durchgeführt werden, z. B.
in einer Wirtszelle wie einer bakteriellen Wirtszelle, die
mit einer Nukleinsäure transformiert wird, die ein
Targetpolypeptid kodiert, oder einer eukaryontischen
Wirtszelle wie einer Säugerzelle, die mit einer Nukleinsäure,
die ein Targetpolypeptid kodiert, transfektiert wird.
Ein hier offenbartes Verfahren wird unter Verwendung von
massenspektrometrischer Analyse durchgeführt, einschließlich
z. B. matrixunterstützter Laserdesorbtionsionisation (MALDI),
kontinuierlicher oder gepulster Elektronenspray-Ionisation,
Ion-Spray, Thermospray oder Massive Cluster Impact
Massenspektrometrie und einem Detektionsformat wie lineare
Flugzeit (time-of-flight/TOF), Reflektron Flugzeit, Einfach-
Quadrupol, Mehrfach-Quadrupol, Einfach-Magnetischem Sektor,
Mehrfach-Magnetischem Sektor, Fourier-Transform-
Cyclotronresonanz, Ion-Trap sowie Kombinationen davon wie
MALDI-TOF-Spektrometrie. Ein Vorteil der Verwendung eines
bereitgestellten Verfahrens ist der, daß keine radioaktive
Markierung erforderlich ist. Ein weiterer Vorteil ist, daß
relativ kurze Polypeptide von einer Targetnukleinsäure
synthetisiert werden, wodurch eine genaue Messung des
molekularen Gewichts durch Massenspektrometrie, verglichen
mit der Analyse der Nukleinsäure selbst, bereitgestellt wird.
Ein RNA-Molekül, das ein Targetpolypeptid kodiert, kann in
einem zellfreien Extrakt translatiert werden, der ein
eukaryontischer zellfreier Extrakt wie ein Retikulozyten-
Lysat, ein Weizenkeimextrakt oder einer Kombination davon,
oder ein prokaryontischer zellfreier Extrakt, z. B. ein
bakterieller Zellextrakt wie ein E. coli-S30-Extrakt sein
kann. Falls gewünscht, kann die Translation und Transkription
einer Targetnukleinsäure in demselben zellfreien Extrakt,
beispielweise einem Retikulozyten-Lysat oder einem
prokaryontischen Zellextrakt, durchgeführt werden.
Ein Targetpolypeptid wird im allgemeinen vor dem
Nachweis durch massenspektrometrische Analyse isoliert. Zum
Beispiel kann das Polypeptid von Nukleinsäuren stammen, die
aus einer Zelle oder einem Gewebe, das von einem Individuum
wie einem Menschen erhalten worden ist, isoliert werden. Das
Targetpolypeptid kann unter Verwendung eines Reagenzes
isoliert werden, das spezifisch mit dem Targetpolypeptid
interagiert, beispielsweise einem Antikörper, der spezifisch
mit dem Targetpolypeptid interagiert, oder das
Targetpolypeptid kann an ein Peptidanhängsel fusioniert
werden und unter Verwendung eines Reagenzes isoliert werden,
das spezifisch mit dem Peptidanhängsel, z. B. einem für das
Peptidanhängsel spezifischen Antikörper, interagiert. Ein
Reagenz kann ein anderes Molekül sein, das spezifisch mit dem
Peptidanhängsel interagiert, beispielsweise Metall-Ionen wie
Nickel- oder Cobalt-Ionen, die spezifisch mit einem
Hexahistidin-(His-6)Peptidanhängsel interagieren.
Ein Targetpolypeptid kann auf einen festen Träger wie
einem Kügelchen oder einem Mikrochip immobilisiert werden,
der eine ebene Oberfläche haben kann oder eine Oberfläche mit
Strukturen, die im wesentlichen aus jedem üblicherweise zur
Gestaltung einer solchen Vorrichtung verwendeten Material
hergestellt wird. Ein Mikrochip ist zum Beispiel verwendbar,
um Gruppen in einer adressierbaren Anordnung (Raster, array)
anzuheften. Die Immobilisierung eines Targetpolypeptids
stellt ein Mittel zur Isolierung des Polypeptids bereit,
sowie ein Mittel, das isolierte Targetpolypeptid vor der
Massenspektrometrie zu manipulieren.
Es werden Verfahren zum Sequenzieren eines
immobilisierten Targetpolypeptids bereitgestellt, die das
Sequenzieren vom Carboxyterminus oder vom Aminoterminus
einschließen. Weiterhin werden Verfahren zur Bestimmung der
Identität von jedem der Targetpolypeptide in einer Vielzahl
von Targetpolypeptiden durch Multiplexing bereitgestellt.
In besonderen Ausführungsformen wird ein
posttranslationales Einfangen (capture) und Immobilisieren
eines Targetpolypeptids mittels eines spaltbaren Linkers
bereitgestellt, um ein Polypeptid orthogonal zu sequenzieren.
Diese Verfahren können einschließen: 1) Erhalten des
Targetpolypeptids; 2) Immobilisieren des Targetpolypeptids
auf einer festen Oberfläche; 3) Behandeln des immobilisierten
Targetpolypeptids mit einem Enzym oder chemisch in einer
zeitabhängigen Weise, um eine Reihe von deletierten
Fragmenten zu erzeugen; 4) die gespaltenen
Polypeptidfragmente werden konditioniert; 5) Abspalten des
Linkers und dadurch Freisetzen des immobilisierten
Fragmentes; 6) Bestimmen der Masse des freigesetzten
Fragmentes; und 7) Alignment der Massen von jedem der
Polypeptidfragmente, um die Aminosäuresequenz zu bestimmen.
Variationen dieser Verfahren, in denen ein oder mehrere
Schritte kombiniert oder ausgelassen werden, werden ebenfalls
hier betrachtet.
In einer Ausführungsform schließt der zweite Schritt
ein, den aminoterminalen Bereich des Polypeptids auf einem
festen Träger mittels eines photospaltbaren Linkers zu
immobilisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der
feste Träger wie in Fig. 2 beschrieben aktiviert und mit der
Aminogruppe des Targetpolypeptids reagieren gelassen.
In einer weiteren Ausführungsform schließt der zweite
Schritt ein, den carboxyterminalen Bereich des Polypeptids
auf einem festen Träger über einen photospaltbaren Linker zu
immobilisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der
photospaltbare Linker ein Linker, der von dem festen Träger
mittels Licht abgespalten werden kann. In einer bevorzugten
Ausführungsform wird der feste Träger wie in Fig. 3
beschrieben aktiviert und mit der Carboxygruppe des
Targetpolypeptids reagieren gelassen.
In einer weiteren Ausführungsform schließt der zweite
Schritt ein, entweder den Carboxy- oder den Aminoterminus von
Gruppen von verschiedenen Polypeptiden an einem festen Träger
in einem Raster (Array)-Format mittels eines photospaltbaren
Linkers zu immobilisieren. In einer bevorzugteren
Ausführungsform werden diskrete Bereiche einer
Siliciumoberfläche mittels der in Fig. 2 beschriebenen
Chemie aktiviert und ein Raster (Array) besteht aus 2 bis 999
Positionen.
In einer weiteren Ausführungsform schließt der zweite
Schritt ein, den aminoterminalen Bereich des Polypeptids an
einen festen Träger mittels eines spaltbaren Linkers zu
immobilisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der
spaltbare Linker ein Silyl-Linker, der von dem festen Träger
abgespalten werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird der feste Träger wie in Fig. 2 beschrieben aktiviert
und mit der Aminogruppe des Targetpolypeptids reagieren
gelassen.
In weiteren Ausführungsform schließt der zweite Schritt
ein, den carboxyterminalen Bereich des Polypeptids an einen
festen Träger mittels eines spaltbaren Linkers zu
immobilisieren. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist
der spaltbare Linker ein Silyl-Linker, der von dem festen
Träger abgespalten werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der feste Träger
wie in Fig. 3 beschrieben aktiviert und mit der
Carboxygruppe des Targetpolypeptids reagieren gelassen.
In einer weiteren Ausführungsform schließt der zweite
Schritt ein, entweder den Carboxy- oder den Aminoterminus
einer Gruppe verschiedener Polypeptide an einen festen Träger
in einem Raster-Format mittels eines spaltbaren Linkers zu
immobilisieren. In einer bevorzugteren Ausführungsform werden
diskrete Bereiche einer Siliciumoberfläche mit der in Fig. 2
beschriebenen Chemie aktiviert, wodurch ein Raster, das
vorzugsweise aus 2 bis 999 Positionen besteht, gebildet wird.
In einer weiteren Ausführungsform schließt der dritte
Schritt ein, das aminoterminale Ende des Targetpolypeptides
(der Targetpolypeptide) an den festen Träger zu
immobilisieren und mit einer Exopeptidase zu behandeln. In
einer bevorzugten Ausführungsform wird der Verdau mit
Exopeptidase in einer zeitabhängigen Weise durchgeführt, um
eine ineinandergreifende (nested) Gruppe immobilisierter
Polypeptidfragmente mit variierender Länge zu erzeugen. In
einer bevorzugten Ausführungsform wird die Exopeptidase aus
der Gruppe von einer oder mehrerer Monopeptidasen und
Polypeptidasen einschließlich Carboxypeptidase Y,
Carboxypeptidase P, Carboxypeptidase A, Carboxypeptidase G
und Carboxypeptidase B, ausgewählt.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Exopeptidase
aus der Gruppe von einer oder mehreren Monopeptidasen und
Polypeptidasen, einschließlich Aminopeptidasen,
einschließlich Alanin-Aminopeptidase, Leucin-Aminopeptidase,
Pyroglutamat-Peptidase, Dipeptidylpeptidase, microsomale
Peptidase und anderen Enzymen, die fortschreitend das
aminoterminale Ende einer Polypeptidase verdauen, ausgewählt.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt der dritte
Schritt einen Schritt, bei dem ein Exopeptidaseverdau unter
Reaktionsbedingungen durchgeführt wird, die jede Sekundär-
oder Tertiärstruktur entfernen, wodurch die terminalen Reste
des Polypeptides unzugänglich für Exopeptidasen werden. In
einer bevorzugten Ausführungsform setzen die
Reaktionsbedingungen den Terminus eines Targetpolypeptides
(von Targetpolypeptiden) Temperaturen oberhalb ungefähr 70°C
und unterhalb ungefähr 100°C aus. In einer bevorzugteren
Ausführungsform ist die Exopeptidase eine thermostabile
Carboxypeptidase oder Aminopeptidase. In einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform setzen die Reaktionsbedingungen
den Terminus eines Targetpolypeptides Bedingungen von hoher
Ionenstärke aus. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist
die Exopeptidase eine salztolerante Carboxypeptidase oder
Aminopeptidase.
In einer weiteren Ausführungsform schließt der zweite
Schritt ein, das Polypeptid nach der enzymatischen Behandlung
oder Reinigung zu konditionieren. In einer bevorzugteren
Ausführungsform schließen die Konditionierungsmethoden
Verfahren ein, die das Polypeptid oder Polypeptidfragmente in
einer Weise präparieren, die im allgemeinen die
massenspektrometrische Analyse verbessern. In einer
bevorzugteren Ausführungsform kann die Konditionierung einen
Kationenaustausch einschließen.
Es werden ebenfalls Kits, die Komponenten enthalten, die
für die Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptids auf
der Basis eines hier offenbarten Verfahrens ermöglichen,
bereitgestellt. Ein solches Kit kann Reagenzien für die in
vitro Transkription und/oder Translation der amplifizierten
Nukleinsäure enthalten, um das Targetpolypeptid zu erhalten;
gegebenenfalls ein Reagenz zur Isolierung des
Targetpolypeptides; sowie Anweisungen zur Verwendung bei der
Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptides durch
massenspektrometrische Analyse. Die Kits können ebenfalls zum
Beispiel Forward- oder Reverse-Primers enthalten, die in der
Lage sind, an eine Nukleinsäure, die das Targetpolypeptid
kodiert, zu hybridisieren, und die Nukleinsäure zu
amplifizieren. Solche Kits können auch ein organisches oder
anorganisches Lösungsmittel enthalten, zum Beispiel ein
Ammoniumsalz oder ein Reagenziensystem, um das
Targetpolypeptid vor der massenspektrometrischen Analyse zu
verflüchtigen und zu ionisieren. Darüber hinaus kann ein Kit
eine Kontrollnukleinsäure oder Polypeptid mit bekannter
Identität enthalten. Ein Kit kann ebenfalls beispielsweise
einen festen Träger zur Immobilisierung eines Targetpeptides
bereitstellen, einschließlich, falls gewünscht, Reagenzien,
um eine solche Immobilisierung durchzuführen. Ein Kit kann
weiterhin Reagenzien enthalten, die zur Manipulation eines
Targetpolypeptides verwendbar sind, beispielsweise
Reagenzien, um das Targetpolypeptid vor der
Massenspektrometrie zu konditionieren oder Reagenzien zur
Sequenzierung des Polypeptides. Ein hier offenbartes Kit kann
verwendet werden, um die zahlreichen offenbarten Verfahren
durchzuführen, und kann beispielsweise gestaltet werden für
die Verwendung bei der Bestimmung der Anzahl von
Nukleotidwiederholungen einer Targetnukleinsäure, oder ob
eine Targetnukleinsäure eine unterschiedliche Anzahl von
Nukleotidwiederholungen bezogen auf eine Referenznukleinsäure
enthält.
Ein Targetpolypeptid kann von einer allelischen Variante
einer polymorphen Region eines Genes eines Individuums
kodiert werden, oder von einer allelischen Veriante einer
polymorphen Region, die sich in einem chromosomalen Bereich
befindet, der nicht in einem Gen liegt. Ein hier offenbartes
Verfahren kann den Schritt einschließen, zu bestimmen, ob die
allelische Variante identisch mit einer allelischen Variante
einer polymorphen Region ist, die mit einer Krankheit oder
einem Zustand assoziiert ist, wodurch angezeigt wird, ob ein
Individuum eine Krankheit oder einen Zustand, die/der mit der
spezifischen allelischen Variante des polymorphen Bereiches
des Genes assoziiert ist, hat oder ein Risiko besitzt,
diese(n) zu entwickeln. Die Krankheit oder der Zustand kann
beispielsweise mit einer anormalen Zahl von
Nukleotidwiederholungen (nucleotide repeats), beispielsweise
Dinukleotid-, Trinukleotid-, Tetranukleotid- oder
Pentanukleotid-wiederholungen assoziiert sein. Da
Trinukleotidwiederholungen beispielsweise sehr lang sein
können, ist die Bestimmung der Anzahl von
Trinukleotidwiederholungen direkt durch Analyse der DNA nicht
einfach. Da ein hier offenbartes Verfahren zur Bestimmung der
Identität eines Targetpolypeptides auf der Analyse eines
Polypeptides, insbesondere eines Polypeptides, das im
wesentlichen durch Trinukleotidwiederholungen kodiert wird,
basiert, ist die Bestimmung der Anzahl von
Trinukleotidwiederholungen unter Verwendung der offenbarten
Verfahren und Kits genauer. Eine Krankheit oder ein Zustand,
der unter Verwendung eines offenbarten Verfahrens oder Kits
identifiziert werden kann, schließt zum Beispiel ein:
Huntingtons Krankheit, Prostatakrebs, fragiles X-Syndrom Typ A, Myotonische Dystrophie Typ I, Kennedys Krankheit, Machado- Joseph-Krankheit, dentatorubrale und pallidolyusiane Atrophie sowie spinobulbäre muskuläre Atrophie; gleichwohl Alterung, die identifiziert werden kann, indem die Anzahl von Nukleotidwiederholungen in telomeren Nukleinsäuren aus einem Individuum untersucht wird. Die Krankheit oder der Zustand kann ebenfalls mit einem Gen wie einem Gen, das BRCA1, BRCA2, APC kodiert; einem Gen, das Dystrophin, β-Globin, Faktor IX, Faktor VIIc, Ornithin-d-Aminotransferase, Hypoxanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase oder dem Transmembranrezeptor der cystischen Fibrose (CFTR) oder ein Proto-Oncogen kodiert, assoziiert sein.
Huntingtons Krankheit, Prostatakrebs, fragiles X-Syndrom Typ A, Myotonische Dystrophie Typ I, Kennedys Krankheit, Machado- Joseph-Krankheit, dentatorubrale und pallidolyusiane Atrophie sowie spinobulbäre muskuläre Atrophie; gleichwohl Alterung, die identifiziert werden kann, indem die Anzahl von Nukleotidwiederholungen in telomeren Nukleinsäuren aus einem Individuum untersucht wird. Die Krankheit oder der Zustand kann ebenfalls mit einem Gen wie einem Gen, das BRCA1, BRCA2, APC kodiert; einem Gen, das Dystrophin, β-Globin, Faktor IX, Faktor VIIc, Ornithin-d-Aminotransferase, Hypoxanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase oder dem Transmembranrezeptor der cystischen Fibrose (CFTR) oder ein Proto-Oncogen kodiert, assoziiert sein.
Ein hier offenbartes Verfahren oder Kit kann verwendet
werden, um den Genotyp eines Individuums zu ermitteln, indem
die Identität von einer oder mehreren allelischen Varianten
von einer oder mehreren polymorphen Regionen in einem oder
mehreren Genen oder Chromosomen des Individuums bestimmt
wird. Beispielsweise kann das eine oder die mehreren Gene mit
Transplantatabstoßung verbunden sein, und das Verfahren kann
verwendet werden, um die Kompatibilität zwischen einem
Spender und einem Empfänger eines Transplantates zu
bestimmen. Solche Gene können beispielsweise MHC-Gene sein.
Die Ermittlung des Genotyps eines Individuums mittels eines
hier bereitgestellten Verfahrens kann für forensische oder
für Identitätsbestimmungs-Zwecke verwendet werden, und die
polymorphen Bereiche können in mitochondrialen Genen
vorliegen oder können kurze Tandemrepeats sein.
Ein offenbartes Verfahren oder Kit kann ebenfalls
verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Individuum einen
pathogenen Organismus wie ein Virus, Bakterium, Pilz oder
Protisten trägt. Ein Verfahren zur Bestimmung des Isotyps
eines pathogenen Organismus wird ebenfalls bereitgestellt.
Abhängig von der zu detektierenden Sequenz können die hier
offenbarten Verfahren und Kits daher verwendet werden, um
beispielsweise eine genetische Krankheit oder eine
chromosomale Anormalität zu diagnostizieren; eine
Prädisposition gegenüber oder eine Frühindikation einer Gen
beeinflußten Krankheit oder eines Zustandes, beispielsweise
Fettleibigkeit, Arteriosklerosis, Diabetes oder Krebs; oder
eine Infektion durch einen pathogenen Organismus,
beispielsweise einem Virus, Bakterium, Parasit oder Pilz;
oder um Informationen bezüglich der Identität, Vererbung oder
Verträglichkeit bereitzustellen, beispielsweise unter
Verwendung von Minisatelliten- oder Mikrosatelliten-Sequenzen
oder HLA-Phenotyping.
Ein hier offenbartes Verfahren stellt ein Mittel zum
Erhalten von Information über die Sequenz eines
Targetnukleinsäuremoleküls mittels Bestimmung der
Aminosäuresequenz eines Polypeptids von Interesse bereit.
Solch ein Verfahren kann beispielsweise unter Verwendung von
Massenspektrometrie durchgeführt werden, um die Identität
eines Aminosäurerestes zu bestimmen, der vom Aminoterminus
oder dem Carboxyterminus des interessierenden Polypeptides
freigesetzt wird. Ein solcher Prozeß kann ebenfalls
beispielsweise durchgeführt werden, indem ein
ineinandergreifender (nested) Satz von carboxylterminalen
oder aminoterminalen Deletionsfragmenten des interessierenden
Polypeptides oder Peptidfragmente davon hergestellt werden,
und den ineinandergreifende Satz von Deletionsfragmenten der
Massenspektrometrie zu unterwerfen, wodurch die
Aminosäuresequenz des Polypeptides bestimmt wird.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz eines
interessierenden Polypeptides kann beispielsweise
durchgeführt mittels eines Polypeptides durchgeführt, das auf
einen festen Träger, immobilisiert wird, falls gewünscht
reversibel. Darüber hinaus kann ein solches Verfahren mit
einer Vielzahl solcher Polypeptiden durchgeführt werden, die
beispielsweise eine Vielzahl von Targetpolypeptiden sind, die
in einem adressierbaren Raster auf einen festen Träger wie
einem Microchip immobilisiert sind, der z. B. zumindest zwei
Positionen und sowie soviele wie 999 Positionen oder 1096
Positionen oder 9999 Positionen oder mehr enthalten kann. Im
allgemeinen wird ein Targetpolypeptid oder die Aminosäuren,
die davon abgespalten werden, vor der Massenspektrometrie
konditioniert, wodurch die Auflösung des Massenspektrums
erhöht wird. Beispielsweise kann ein Targetpolypeptid durch
Massenmodifikation konditioniert werden. Weiterhin können die
Aminosäuresequenzen einer Vielzahl von massenmodifizierten
Targetpolypeptiden durch Massenspektrometrie unter Verwendung
eines Multiplexingformates bestimmt werden.
Fig. 1A zeigt die Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure
(SEQ ID NO: 8), die durch PCR-Amplifikation von DNA erhalten
werden kann, die einen nicht variablen Bereich von 12 CAG-
Wiederholungen enthält (ohne Kursivschrift dargestellt) und
eine variable Wiederholung von 10 CAG-Repeat-Einheiten (Kursiv
dargestellt) mit Primer (unterstrichen), die die Sequenz
(Forward-Primer) oder das Komplement der Sequenz (Reverse-
Primer) aufweisen. Die T7 Promotorsequenz und die für ein
Hexahistidinpeptid (His-6) kodierenden Sequenz sind fett
dargestellt.
Fig. 1B zeigt die Sequenz (SEQ ID NO: 9) des 71 Aminosäure
Polypeptides, das von der in Fig. 1A gezeigten
Nukleinsäuresequenz kodiert ist. Der Bereich von 10 Variablen
Glutamin (Q) Resten, die durch die Trinukleotidwiederholungen
kodiert wird, ist kursiv dargestellt. Das His-6 Peptid ist in
Fettdruck dargestellt.
Fig. 2 erläutert ein beispielhaftes Schema für das
orthogonale Einfangen, Spalten und die MALDI-Analyse eines
Polypeptides. Das Peptid ist an eine feste Oberfläche die ein
Mikrochip sein kann, durch die Verwendung eines säurespaltbaren
Diisopropylsilyl-Linkers konjugiert. Das Peptid ist an seinem
Aminoterminus mit den Linker durch die Bildung einer
Amidbindung konjugiert. Das immobilisierte Polypeptid kann
beispielsweise unter Verwendung einer Carboxypeptidase verkürzt
werden oder kann unter Verwendung einer Endopeptidase wie
Trypsin gespalten werden, wird anschließend von dem festen
Träger durch Exposition zu sauren Bedingungen wie die 3-HPA (3-
Hydroxypicolinsäure) Matrix-Lösung. Das abgespaltene Polypeptid
wird dann einer Massenspektrometrie, beispielsweise MALDI,
unterworfen.
Fig. 3 veranschaulicht weitere Linker und
Einfangstrategien, um ein Polypeptid auf einer festen
Oberfläche reversibel zu immobilisieren. Fig. 3 stellt
Reaktionsbedingungen bereit, um ein Polypeptid mittels seines
Carboxyterminus an einen festen Träger unter Verwendung von 1-
Ethyl-3-(3-Dimethylamino-propyl) carbodiimid-hydrochlorid
(EDC)/N-Hydroxysuccinimidyl (NHS) zu konjugieren.
Soweit nicht anderweitig definiert, besitzen alle hier
verwendeten Techniken und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe
Bedeutung wie sie gewöhnlicherweise vom Fachmann auf dem
Gebiet, zu dem die Erfindung gehört, verstanden wird. Alle
Patente, Anmeldungen und Publikationen, auf die Bezug genommen
wird, werden durch Referenz hier mit aufgenommen. Zum besseren
Verständnis wird hier die Bedeutung von bestimmten Begriffen
und Ausdrücken, die in der Beschreibung und den Ansprüchen
verwendet werden, bereitgestellt.
Der hier verwendete Begriff "Allel" bezieht sich auf eine
alternative Form einer Nukleotidsequenz in einem Chromosom.
Bezugnahme auf ein "Allel" schließt eine Nukleotidsequenz in
einem Gen oder einem Bereich davon sowie eine Nukleotidsequenz,
die keine Gensequenz ist, ein. Allele besetzen denselben Locus
oder dieselbe Position auf homologen Chromosomen. Ein
Individuum, das zwei identische Allele eines Genes besitzt,
wird als "homozygot" für das Allel betrachtet, wohingegen ein
Individuum, das zwei unterschiedliche Allele besitzt, als
"heterozygot" betrachtet wird. Allele von spezifischen
Nukleotidsequenzen, beispielsweise eines Genes, können sich
voneinander in einem einzigen Nukleotid oder in verschiedenen
Nukleotiden unterscheiden, wobei der Unterschied auf eine
Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehreren
Nukleotiden zurückzuführen sein kann. Eine Form eines Genes,
das eine Mutation enthält, ist ein Beispiel für ein Allel. Im
Vergleich dazu ist ein Wildtyp-Allel ein Allel, das, wenn es in
zwei Kopien in einem Individuum vorliegt, zu einem Wildtyp-
Phänotyp führt. Es können verschiedene unterschiedliche
Wildtyp-Allele eines speziellen Genes vorkommen, da bestimmte
Nukleotidaustausche in einem Gen den Phänotyp eines
Individuums, das zwei Kopien des Genes mit den
Nukleotidaustauschen besitzt, nicht berührt.
Der Begriff "allelische Variante" bezieht sich auf einen
Bereich eines Allels, der eine polymorphe Region in einer
chromosomalen Nukleinsäure enthält. Der Begriff "allelische
Variante" einer polymorphen Region eines Genes bezieht sich auf
eine Region eines Genes, die eine von verschiedenen
Nukleotidsequenzen, die in der Region des Genes in
verschiedenen Individuen gefunden wird, aufweist. Der Begriff
"Bestimmung der Indentität einer allelischen Variante einer
polymorphen Region" bezieht sich auf die Bestimmung der
Nukleotidsequenz oder der kodierten Aminosäuresequenz einer
polymorphen Region, wodurch bestimmt wird, zu welcher der
möglichen allelischen Varianten der polymorphen Region die
besondere allelische Variante korrespondiert.
Der Begriff "Polymorphismus" bezieht sich auf die
Coexistenz von mehr als einer Form eines Alleles in einer
Population. Ein Polymorphismus kann in einer Region eines
Chromosoms auftreten, die nicht mit einem Gen verbunden ist,
oder kann beispielsweise als eine allelische Variante oder
einen Teil davon eines Genes auftreten. Ein Teil eines Genes,
der in zumindest zwei unterschiedlichen Formen existiert,
beispielsweise zwei unterschiedlichen Nukleotidsequenzen, wird
als eine "polymorphe Region eines Genes" bezeichnet. Eine
polymorphe Region eines Genes kann auf ein einzelnes Nukleotid
lokalisiert werden, dessen Identität in unterschiedlichen
Allelen abweicht, oder kann verschiedene Nukleotide lang sein.
Der hier verwendete Begriff "biologische Probe" bezieht
sich auf jedes Material, das von einer lebenden Quelle erhalten
wird, beispielsweise einem Tier wie einem Menschen oder anderen
Säugetieren, einer Pflanze, einem Bakterium, einem Pilz, einem
Protisten oder einem Virus. Die biologische Probe kann in jeder
Form vorliegen, einschließlich eines festen Material wie einem
Gewebe, Zellen, einem Zellpellet, einem Zellextrakt, oder einer
Biopsie, oder einer biologischen Flüssigkeit wie Urin, Blut,
Speichel, Fruchtwasser, Exudat aus einem Infektions- oder
Entzündungsbereich oder einer Mundspülung, die buccale Zellen
enthält.
Der hier verwendete Begriff "Polypeptid" bedeutet zumindest
zwei Aminosäuren oder Aminosäurederivate, einschließlich
massenmodifizierter Aminosäuren, die durch eine
Peptidbindung, die eine modifizierte Peptidbindung sein kann,
verbunden sind. Ein Polypeptid kann von einer
Nukleotidsequenz translatiert werden, die zumindest einen
Bereich einer kodierenden Sequenz darstellt, oder von einer
Nukleotidsequenz, die nicht auf natürliche Weise translatiert
wird, was beispielsweise darauf zurückzuführen ist, daß sie
sich in einem anderen Leserahmen als dem kodierenden Rahmen
befindet oder daß es eine Intronsequenz, eine 3' oder 5'
nichttranslatierte Sequenz oder eine regulatorische Sequenz
wie ein Promotor ist. Ein Polypeptid kann ebenfalls chemisch
synthetisiert werden und kann durch chemische oder
enzymatische Methoden nach der Translation oder chemischen
Synthese modifiziert werden. Die Begriffe " Protein",
"Polypeptid" und "Peptid" werden hier miteinander
austauschbar verwendet, wenn sie sich auf eine translatierte
Nukleinsäure, beispielsweise ein Genprodukt, beziehen.
Der hier verwendete Ausdruck "Bestimmung der Identität
eines Targetpolypeptids" bezieht sich auf die Bestimmung von
zumindest einem Charakteristikum des Polypeptids durch
Massenspektrometrie, beispielsweise die Identität von
zumindest einer Aminosäure, oder auf die Identifikation eines
besonderen Patterns von Peptidfragmenten des
Targetpolypeptides. Die Bestimmung der Identität eines
Targetpolypeptides kann beispielsweise unter Verwendung von
Massenspektrometrie durchgeführt werden, um die
Aminosäuresequenz von zumindest einem Teil des Polypeptides
zu bestimmen, oder um das Pattern von Peptidfragmenten des
Targetpolypeptides zu bestimmen, die beispielsweise durch
Behandlung des Polypeptides mit einer oder mehrerer
Endopeptidasen erzeugt worden sind.
Bei der Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptides
kann die Anzahl der Nukleotidwiederholungen, die das
Targetpolypeptid kodiert, quantifiziert werde. Der hier
verwendete Begriff "Quantifizieren", bedeutet, in bezug auf
Nukleotidwiederholungen, die ein Targetpolypeptid kodieren,
eine Bestimmung der exakten Anzahl von Nukleotidwiederholungen,
die in der Nukleotidsequenz, die das Targetpolypeptid kodiert,
vorkommen. Wie hier offenbart kann die Anzahl von
Nukleotidwiederholungen, beispielsweise Trinukleotid
wiederholungen, quantifiziert werden, indem Massenspektrometrie
verwendet wird, um die Anzahl von Aminosäuren, die durch die
Wiederholung kodiert werden, die in dem Targetpolypeptid
vorkommen, zu bestimmen. Es sollte allerdings erkannt werden,
daß die Anzahl von Nukleotidwiederholungen, die ein
Targetpolypeptid kodieren, nicht quantifiziert werden muß, um
die Identität eines Targetpolypeptides zu bestimmen, da eine
Messung der relativen Anzahl von Aminosäuren, die durch eine
Region von Nukleotidwiederholungen kodiert werden, ebenfalls
verwendet werden kann, um die Identität des Targetpolypeptides
zu bestimmen, indem das Massenspektrum des Targetpolypeptides
mit dem eines entsprechenden bekannten Polypeptides verglichen
wird.
Der hier verwendete Ausdruck "Nukleotidwiederholungen"
bezieht sich auf jede Nukleotidsequenz, die sich tandemartig
wiederholende Nukleotide enthält. Solche sich tandemartig
wiederholenden Necleotide können Dinukleotid-, Trinukleotid-,
Tetranukleotid- oder Tentanukleotidsequenzen oder jede
tandemartige Anordnung von sich wiederholenden Einheiten sein.
Wie hier verwendet, bedeutet ein Referenzpolypeptid ein
Polypeptid, mit dem das Targetpolypeptid verglichen wird, um
das Polypeptid mit Methoden zu identifizieren, die das
Sequenzieren des Polypeptides nicht einschließen.
Referenzpolypeptide sind üblicherweise bekannte Polypeptide.
Der hier verwendete Ausdruck "konditioniert" oder
"Konditionieren" in bezug auf ein Polypeptid, insbesondere ein
Targetpolypeptid bedeutet, daß das Polypeptid so modifiziert
ist, daß die Laserenergie, die erforderlich ist, um das
Polypeptid zu verflüchtigen, erniedrigt wird, die
Wahrscheinlichkeit der Fragmentierung des Polypeptides
minimiert wird, oder die Auflösung eines Massenspektrums des
Polypeptides oder der Komponente Aminosäuren erhöht wird. Die
Auflösung eines Massenspektrums eines Targetpolypeptides kann
erhöht werden, indem das Polypeptid vor der Durchführung der
Massenspektrometrie konditioniert wird. Die Konditionierung
kann zu jeder Phase vor der Massenspektrometrie durchgeführt
werden, und kann insbesondere während der Immobilisierung des
Polypeptides durchgeführt werden. Ein Polypeptid kann
konditioniert werden, indem das Polypeptid beispielsweise mit
einem Kationen-Austauschmaterial oder einem Anionen-
Austauschmaterial behandelt wird, das die Ladungsheterogenität
des Polypeptides verringert, wodurch eine Verbreiterung des
Peaks aufgrund von Heterogenitäten in der Anzahl von Kationen
(oder Anionen), die an die verschiedenen Polypeptide in einer
Population gebunden sind, eliminiert werden. Indem ein
Polypeptid mit einem Alkylierungsmittel wie Alkyliodid,
Iodacetamid, Iodethanol oder 2,3-Epoxy-1-propanol in Kontakt
gebracht wird, kann beispielsweise die Bildung von
Disulfidbrücken in einem Polypeptid verhindert werden. Auf
ähnliche Weise können geladene Aminosäure-Seitenketten in
ungeladene Derivate durch den Einsatz von
Trialkylsilylchloriden umgewandelt werden.
Das Konditionieren von Proteinen ist im allgemeinen nicht
notwendig, da Proteine relativ stabil unter sauren,
hochenergetischen Bedingungen sind, so daß Proteine keine
Konditionierung für die massenspektrometrische Analyse
erfordern. Es gibt allerdings Mittel zur Verbesserung der
Auflösung, insbesondere für kürzere Peptide, wie den Einbau von
modifizierten Aminosäuren, die basischer sind als die
korrespondierenden nicht modifizierten Reste. Solche
Modifikationen erhöhen im allgemeinen die Stabilität des
Polypeptides während der massenspektrometrischen Analyse.
Ebenfalls können Kationenaustausch-Chromatographie sowie
allgemeine Wasch- und Reinigungsprozeduren, die Proteine und
andere Komponenten von Reaktionsmischungen von dem
Targetpolypeptid entfernen, verwendet werden, um das Peptid
nach einer in vitro Translation zu reinigen und dadurch die
Auflösung des Spektrums, das von der massenspektrometrischen
Analyse des Targetpolypeptides stammt, zu erhöhen.
Wie hier verwendet bezieht sich verzögerte Extraktion auf
Verfahren, bei denen Bedingungen ausgewählt werden, daß sie
eine längere optimale Extraktionsverzögerung und damit eine
längere Verweilzeit erlauben, was zu einer verbesserter
Auflösung führt (siehe z. B. Jahusz et al. (1996) Analysis,
Anal. Chem. 68: 941-946; und Vestal et al. (1995) Rapid
Communications in Mass Spectrometry 9: 1044-1050; siehe
ebenfalls zum Beispiel US-Patent Nr. 5,777,325,
US-Patent Nr. 5,742,049, US-Patent Nr. 5,654,545,
US-Patent Nr. 5,641,959, US-Patent Nr. 5,654,545 sowie
US-Patent Nr. 5,760,393 für Beschreibungen von MALDI und Protokollen zur
verzögerten Extraktion). Insbesondere ist die verzögerte
Ionenextraktion eine Technik, wodurch eine Zeitverzögerung
zwischen der Bildung der Ionen und der Anwendung des
Beschleunigungsfeldes eingeführt wird. Während der
Zeitverschiebung bewegen sich die Ionen an neue Positionen
gemäß ihrer anfänglichen Geschwindigkeiten. Indem die
Verzögerungszeit und die Beschleunigungsfelder in der
Beschleunigungsregion sorgfältig ausgewählt werden, kann die
Flugzeit der Ionen angepaßt werden, um die Flugzeit unabhängig
von der Anfangsgeschwindigkeit zur ersten Ordnung zu machen.
Zum Beispiel schließt ein besonderes Verfahren die Exposition
der Targetpolypeptid-Probe gegenüber einem elektrischen Feld
vor und während des Ionisationsprozesses ein, was zu einer
Reduktion des Hintergrundsignals aufgrund der Matrix führt,
eine schnelle Fragmentierung induziert und den Energietransfer
vor der Ionenextraktion steuert.
Der hier verwendete Begriff "Multiplexing" bezieht sich
auf die simultane Bestimmung der Identität von zumindest zwei
Targetpolypeptiden durch Massenspektrometrie. Wenn zum Beispiel
eine Population von verschiedenen Targetpolypeptiden in einem
Raster auf einem Mikrochip vorkommt, oder auf einer anderen Art
von festem Träger vorkommt, kann Multiplexing verwendet werden,
um die Identität einer Vielzahl von Targetpolypeptiden zu
bestimmen. Multiplexing kann beispielsweise durchgeführt
werden, indem die Masse von jedem der unterschiedlichen
interessierenden Polypeptiden differenziell modifiziert wird,
anschließend Massenspektrometrie verwendet wird, um die
Identität von jedem unterschiedlichen Polypeptid zu bestimmen.
Multiplexing stellt den Vorteil bereit, daß eine Vielzahl von
Targetpolypeptiden durch ein einziges Massenspektrum
identifiziert werden kann, verglichen damit, daß eine separate
massenspektrometrische Analyse für jedes individuelle
Targetpolypeptid durchgeführt werden muß.
Der hier verwendete Begriff "Vielzahl" in bezug auf ein
Polynukleotid oder ein Polypeptid verwendet, bedeutet zwei oder
mehr Polynukleotide oder Polypeptide, von denen jedes eine
unterschiedliche Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenz aufweist.
Eine solche Differenz kann auf natürlich vorkommende
Variationen zwischen den Sequenzen, beispielsweise auf eine
allelische Variation in einem Nukleotid oder in einer kodierten
Aminosäure zurückzuführen sein, oder kann auf die Einführung
von besonderen Modifikationen in verschiedene Sequenzen,
beispielsweise den differentiellen Einbau von
massenmodifizierten Aminosäuren in jedes Polypeptid in einer
Vielzahl, zurückzuführen sein.
Wie hier verwendet, bezieht sich "in vitro
Transkriptionssystem" auf ein zellfreies System, das eine RNA-
Polymerase und andere Faktoren und Reagenzien enthält, die für
die Transkription eines DNA-Moleküls notwendig sind, das auf
operable Weise mit einem Promotor verbunden ist, der spezifisch
eine RNA-Polymerase bindet. Ein in vitro Transkriptionssystem
kann ein Zellextrakt, beispielsweise ein eukaryontischer
Zellextrakt sein. Der hier verwendete Begriff "Transkription"
bedeutet im allgemeinen den Prozeß, durch den die Produktion
von RNA-Molekülen auf Basis eines DNA-Templates initiiert,
verlängert und terminiert wird. Darüber hinaus wird das
Verfahren der "reversen Transkription", das im Stand der
Technik wohl bekannt ist, so verstanden, daß es in der
Bedeutung des hier verwendeten Begriffes "Transkription"
eingeschlossen ist. Transkription ist eine
Polymerisationsreaktion, die durch DNA-abhängige oder RNA-
abhängige RNA-Polymerasen katalysiert wird. Beispiele von RNA-
Polymerase schließen die bakteriellen RNA-Polymerasen, SP6-RNA-
Polymerase, T3-RNA-Polymerase, T3-RNA-Polymerase sowie T7-RNA-
Polymerase ein.
Der hier verwendete Begriff "Translation" beschreibt den
Prozeß, durch den die Produktion eines Polypeptides auf Basis
eines RNA-Templates initiiert, verlängert und terminiert wird.
Damit ein Polypeptid auch ausgehend von DNA hergestellt wird,
muß die DNA in RNA umgeschrieben werden, anschließend wird die
RNA aufgrund von Wechselwirkungen von verschiedenen zellulären
Komponenten in das Polypeptid translatiert. In prokaryontischen
Zellen sind die Transkriptionen und Translationen "gekoppelt",
was bedeutet, daß RNA in ein Polypeptid zu dem Zeitpunkt
translatiert wird, zu dem sie aus der DNA transkribiert wird.
In eukaryontischen Zellen, einschließlich Pflanzen- und
Tierzellen, wird DNA in RNA im Zellkern transkribiert,
anschließend die RNA in mRNA prozessiert, die in das Cytoplasma
transportiert wird, wo sie in ein Polypeptid translatiert wird.
Der Ausdruck "Translationssystem" bezieht sich auf ein
zelluläres oder zellfreies System zur Durchführung einer
Translationsreaktion. Der Begriff "zelluläres
Translationssystem" bezieht sich auf ein Translationssystem auf
Basis einer permeabilisierten Zelle; der Begriff "zellfreies
Translationssystem" oder "in vitro Translationssystem" bezieht
sich auf ein Zellextrakt oder ein rekonstituiertes
Translationssystem. Der Begriff "rekonstituiertes
Translationssystem" bezieht sich auf ein System, das gereinigte
oder teilweise gereinigte Translationsfaktoren wie
Elongationsfaktoren enthält. Ein in vitro Translationssystem
enthält zumindest die minimalen Elemente, die für die
Translation eines RNA-Moleküls in ein Polypeptid notwendig
sind. Ein in vitro Translationssystem, das ein eukaryontisches
oder prokaryontisches System sein kann, enthält üblicherweise
Ribosomen, tRNA-Moleküle, rRNA, eine Initiator-Methionyl-
tRNAMet, Proteine oder Komplexe, die an der Translation
beteiligt sind, beispielsweise eukaryontischer
Initiationsfaktor 2 (elF2), elF3 und elF4F, sowie den Cap-
Bindungs-Komplex, einschließlich des Cap-binding-Proteins.
Der hier in Bezug auf eine Nukleinsäure, einschließlich
DNA und RNA, verwendete Begriff "isoliert" bezieht sich auf
Nukleinsäuremoleküle, die im wesentlichen von anderen
Makromolekülen separiert sind, die normalerweise mit der
Nukleinsäure in ihrem natürlichen Zustand assoziert sind. Ein
isoliertes Nukleinsäuremolekül ist im wesentlichen von dem
zellulären Material, das mit ihr normalerweise in einer Zelle
assoziert ist, getrennt, oder kann, wenn dies relevant ist, im
wesentlichen von bakteriellem oder viralem Material getrennt
sein; oder bei Produktion durch rekombinante DNA-Techniken vom
Kulturmedium; oder von chemischen Vorläufern oder anderen
Chemikalien, wenn die Nukleinsäure chemisch synthetisiert wird.
Im allgemeinen ist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül
mindestens ungefähr 50% angereichert verglichen mit seinem
natürlichen Zustand; und üblicherweise von ungefähr 70% bis
ungefähr 80%, insbesondere ungefähr 90% oder 95% oder mehr
angereichert. Vorzugsweise macht eine isolierte Nukleinsäure
mindestens 50% einer die Nukleinsäure enthaltenden Probe aus
und kann mindestens ungefähr 70% oder 80% des Materials in
einer Probe sein, insbesondere mindestens ungefähr 90% bis 95%
oder mehr der Probe. Eine isolierte Nukleinsäure kann ein
Nukleinsäurefragment sein, das in der Natur nicht vorkommt, und
daher nicht in einem natürlichen Zustand gefunden wird.
Der Begriff "isoliert" wird ebenfalls hier verwendet, um
sich auf Polypeptide zu beziehen, die im wesentlichen von
anderen Makromolekülen, die üblicherweise mit dem Polypeptid in
seinem natürlichen Zustand assoziert sind, getrennt sind. Ein
isoliertes Polypeptid kann identifiziert auf der Basis werden,
das es bezogen auf die Materialien angereichert ist, mit denen
es natürlicherweise assoziert ist, oder das es eine Fraktion
einer Probe aufbaut, die das Polypeptid in demselben Grad
enthält wie oben für eine "isolierte" Nukleinsäure definiert
enthält, d. h., mindestens ungefähr 50% verglichen mit seinem
natürlichen Zustand angereichert ist, oder mindestens ungefähr
50% der das Polypeptid enthaltenen Probe ausmacht. Ein
isoliertes Polypeptid kann zum Beispiel aus einer Zelle
gereinigt werden, die üblicherweise das Polypeptid exprimiert
oder kann unter Verwendung rekombinanter DNA-Methoden
hergestellt werden.
Der hier verwendete Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich
auf ein Polynukleotid, einschließlich einer
Desoxyribonukleinsäure (DNA), eine Ribonukleinsäure (RNA) sowie
einem Analogon von DNA oder RNA, das zum Beispiel ein
Nukleotidanalogon oder eine andere "Rückgrat"-Bindung als eine
Phosphordiesterbindung enthält, zum Beispiel eine
Phosphortriesterbindung, eine Thioesterbindung oder eine
Peptidbindung (Peptidnukleinsäure). Eine Nukleinsäure kann
einzelsträngig oder doppelsträngig sein und kann zum Beispiel
ein DNA-RNA-Hybrid sein. Eine Nukleinsäure kann ebenfalls ein
Teil eines längeren Nukleinsäuremoleküls sein, beispielsweise
ein Teil eines Genes, das eine polymorphe Region enthält. Die
molekulare Struktur einer Nukleotidsequenz, zum Beispiel eines
Genes oder eines Teiles davon, wird durch ihren Nukleotidgehalt
definiert, einschließlich Deletionen, Substitutionen oder
Hinzufügungen von einem oder mehreren Nukleotiden; die
Nukleotidsequenz, dem Methylierungszustand; oder anderen
Modifikationen der Nukleotidsequenz.
Die Bezugnahme auf eine Nukleinsäure als ein
"Polynukleotid" ist in ihren breitesten Sinne gemeint, um ein
oder zwei Nukleotide oder Nukleotidanaloga, die durch eine
kovalente Bindung verbunden sind, zu bezeichnen, einschließlich
einzelsträngiger und doppelsträngiger Moleküle. Der Begriff
"Oligonukleotide" wird ebenfalls hier verwendet, um zwei oder
mehr Nukleotide oder Nukleotidanaloga, die durch eine kovalente
Bindung verbunden sind, zu bezeichnen, obwohl der Fachmann
erkennt, daß Oligonukleotide wie PCR-Primer im allgemeinen eine
Länge von weniger als ungefähr 50 bis 100 Nukleotide aufweisen.
Wenn im Bezug auf eine Nukleinsäure verwendet, bedeutet der
Begriff "Amplifizieren" das wiederholte Kopieren einer DNA-
Sequenz oder einer RNA-Sequenz durch die Verwendung von
spezifischen oder nicht spezifischen Mitteln, was zu einer
Zunahme der Menge der spezifischen DNA- oder RNA-Sequenzen, die
kopiert werden sollen, führt.
Ein hier offenbartes Verfahren kann verwendet werden, um
eine Nukleotidsequenz eines unbekannten Polynukleotid zu
ermitteln, indem die Aminosäuresequenz eines Polypeptides, das
von dem unbekannten Polynukleotid kodiert wird, mit der
Aminosäuresequenz des Polypeptides, das durch ein
korrespondierendes bekanntes Polynukleotid kodiert wird,
verglichen wird. Die ermittelte Nukleotidsequenz des
unbekannten Polynukleotids kann dieselbe sein wie eine
natürlich vorkommende Nukleotidsequenz, die das Polypeptid
kodiert, oder kann sich von der natürlich vorkommenden Sequenz
aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes
unterscheiden.
Der hier verwendete Begriff "unbekanntes Polynukleotid"
bezieht sich auf ein Polynukleotid, dessen dadurch kodiertes
Polypeptid durch Massenspektrometrie untersucht wird. Im
allgemeinen wird ein unbekanntes Polynukleotid aus einer
biologischen Probe erhalten. Der Begriff "korrespondierendes
bekanntes Polynukleotid" bedeutet ein definiertes Gegenstück
des Polynukleotids. Ein korrespondierendes bekanntes
Polynukleotid wird im allgemeinen als eine Kontrolle zum
Vergleich des unbekannten Polynukleotids verwendet und kann
beispielsweise die Nukleotidsequenz eines Allels des
unbekannten Polynukleotids sein, das bei der Mehrzahl von
Individuen in einer Population vorliegt. Zum Beispiel kann ein
"unbekanntes Polynukleotid" eine DNA-Sequenz sein, die aus
einem Patienten mit Prostatakrebs erhalten wird und die
polymorphe Region einschließt, die die Amplifikation einer mit
Prostatakrebs assoziierten Trinukleotidsequenz zeigt, und das
"korrespondierende bekannte Polynukleotid" kann dieselbe
polymorphe Region aus einem Individuum sein, das keinen
Prostatakrebs hat, zum Beispiel aus einem weiblichen
Individuum. Ein unbekanntes Polynukleotid kann ebenfalls ein
mutiertes Gen sein, das den Phänotyp eines Individuums im
Vergleich zu einem Individuum, das das mutierte Gen nicht
besitzt, verändert. Ein mutiertes Gen kann rezessiv, dominant
oder codominant sein, wie im Stand der Technik wohl bekannt
ist.
Der Begriff "Plasmid" bezieht sich im allgemeinen auf eine
zirkuläre DNA-Sequenz, die in ihrer Vektorform nicht an ein
Chromosom gebunden ist. Die Begriffe "Plasmid" und "Vektor"
werden hier gegeneinander austauschbar verwendet, da das
Plasmid die am häufigsten gebrauchte Form eines Vektors ist.
Vektoren wie ein Lambda-Vektor können linear sein,
nichtsdestotrotz sind sie in der Bedeutung des hier verwendeten
Begriffes "Plasmid" oder "Vektor" eingeschlossen.
Expressionsvektoren und andere Vektoren, die äquivalenten
Funktionen dienen, und die hiernach im Stand der Technik
bekannt werden, sind ebenfalls in die Bedeutung des hier
verwendeten Begriffes "Plasmid" oder "Vektor" eingeschlossen.
Im allgemeinen wird eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid
von Interesse, zum Beispiel ein Targetpolypeptid kodiert, in
ein Plasmid kloniert und mit regulatorischen Elementen, die für
die Transkription oder Translation der klonierten Nukleinsäure
erforderlich sind, auf operable Weise verknüpft. Der hier
verwendete Begriff "auf operable Weise verknüpft" bedeutet, daß
eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, mit einem
regulatorischen Element, insbesondere einem Promotor, in der
Art verbunden wird, daß das regulatorische Element seine
Funktion bezüglich des Nukleinsäuremoleküls, mit dem es
verbunden ist, erfüllt. Zum Beispiel erlaubt ein
Promotorelement, das auf operable Weise mit einer Nukleinsäure
verknüpft ist, die Transkription der Nukleinsäure, wenn das
Konstrukt unter Bedingungen gestellt wird, die dafür geeignet
sind, daß eine Transkription stattfindet. Es sollte klar sein,
daß der Begriff "regulatorisches Element" hier so breit
verwendet wird, um eine Nukleotidsequenz, entweder DNA oder RNA
einzuschließen, die für Transkription oder Translation
erforderlich ist, beispielsweise eine Nukleotidsequenz, die ein
Stopcodon oder einer ribosomale Bindestelle kodiert.
Der Begriff "Targetnukleinsäure" bezieht sich auf jede
Nukleinsäure von Interesse, einschließlich eines Bereiches
einer größeren Nukleinsäure wie einem Gen oder einer mRNA. Eine
Targetnukleinsäure kann eine polymorphe Region einer
chromosomalen Nukleinsäure sein, beispielsweise ein Gen, oder
eine Region eines Genes, das potentiell eine Mutation aufweist.
Targetnukleinsäure schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt,
Nukleotidsequenzmotive oder Patterns, die für eine besondere
Krankheit spezifisch und ursächlich dafür sind, sowie
Nukleotidsequenzen, die als ein Marker für eine Krankheit
spezifisch, jedoch nicht notwendigerweise ursächlich für die
Krankheit oder den Zustand sind. Eine Targetnukleinsäure kann
ebenfalls eine Nukleotidsequenz sein, die für Forschungszwecke
von Interesse ist, die jedoch keine direkte Verbindung zu einer
Krankheit aufweist, oder die mit einer Krankheit oder einem
Zustand assoziert ist, obwohl dies nur nicht bewiesen ist. Eine
Targetnukleinsäure kann jede Region von aufeinanderfolgenden
Nukleotiden sein, die ein Polypeptid von zumindest 2
Aminosäuren, im allgemeinen zumindest 3 oder 4 Aminosäuren,
insbesondere zumindest 5 Aminosäuren kodiert. Eine
Targetnukleinsäure kodiert ein Targetpolypeptid.
Der Begriff "Targetpolypeptid" bezieht sich auf jedes
Polypeptid von Interesse, daß der Massenspektrometrie für die
hier offenbarten Zwecke unterworfen wird, zum Beispiel um die
Anwesenheit eines Polymorphismus oder einer Mutation zu
identifizieren. Ein Targetpolypeptid enthält zumindest 2
Aminosäuren, üblicherweise zumindest 3 oder 4 Aminosäuren, und
insbesondere zumindest 5 Aminosäuren. Ein Targetpolypeptid kann
durch eine Nukleotidsequenz kodiert sein, die ein Protein
kodiert, das mit einer spezifischen Krankheit oder einem
Zustand assoziert ist, oder ein Bereich eines Proteins. Ein
Targetpolypeptid kann ebenfalls von eine Nukleotidsequenz
kodiert sein, die normalerweise kein translatiertes Polypeptid
kodiert. Ein Targetpolypeptid kann beispielsweise von einer
Sequenz von Dinukleotidwiederholungen oder
Trinukleotidwiederholungen oder dergleichen kodiert sein, die
in chromosomalen Nukleinsäuren vorkommen, beispielsweise einer
kodierenden oder einer nicht kodierenden Region eines Genes,
beispielsweise in der telomeren Region eines Chromosoms.
Ein hier offenbartes Verfahren stellt ebenfalls ein Mittel
bereit, ein Targetpolypeptid durch massenspektrometrische
Analyse von Peptidfragmenten des Targetpolypeptids zu
identifizieren. Der hier verwendete Begriff "Peptidfragmente
eines Targetpolypeptids" betrifft Spaltungsfragmente, die durch
spezifischen chemischen oder enzymatischen Abbau des
Polypeptids hergestellt werden. Die Erzeugung solcher
Polypeptidfragmente eines Targetpolypeptids wird durch die
primäre Aminosäuresequenz des Polypeptids definiert, da
chemische und enzymatische Spaltung in einer
sequenzspezifischen Weise geschehen. Peptidfragmente eines
Targetpolypeptides können hergestellt werden, indem
beispielsweise das Polypeptid, das auf einem festen Träger
immobilisiert sein kann, mit einem chemischen Reagenz wie
Cyanbromid in Kontakt gebracht wird, das ein Polypeptid an
Methioninresten spaltet, oder Hydroxylamin bei hohem pH, das
eine Asp-Gly-Peptidbindung spalten kann; oder mit einer
Endopeptidase wie Trypsin, die ein Polypeptid bei Lys oder Arg
Resten spaltet.
Die Identität eines Targetpolypeptids kann bestimmt
werden, indem die molekulare Masse oder Sequenz mit der einer
Referenz oder eines bekannten Polypeptides verglichen wird. Zum
Beispiel können die Massenspektren des Target- und des
bekannten Polypeptids verglichen werden.
Der hier verwendete Begriff "korrespondierendes oder
bekanntes Polypeptids" ist ein bekanntes Polypeptid, das im
allgemeinen als Kontrolle verwendet wird, um beispielsweise zu
bestimmen, ob ein Targetpolypeptid eine allelische Variante des
korrespondierenden bekannten Polypeptides ist. Es sollte
deutlich sein, daß ein korrespondierendes bekanntes Protein im
wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie das
Targetpolypeptid haben kann, oder im wesentlichen
unterschiedlich sein kann. Wenn zum Beispiel ein
Targetpolypeptid eine allelische Variante ist, die sich von
einem korrespondierenden bekannten Protein durch einen
einzelnen Aminosäureunterschied unterscheidet, sind die
Aminosäuresequenzen der Polypeptide mit Ausnahme der einzigen
Differenz dieselben. Wo eine Mutation in einer Nukleinsäure,
die das Targetpolypeptid kodiert, zum Beispiel den Leserahmen
der kodierenden Nukleinsäure verändert oder ein Stopcodon
einführt oder deletiert, kann die Sequenz des Targetpolypeptids
sich wesentlich von der des korrespondierenden bekannten
Polypeptides unterscheiden.
Wie hier offenbart, kann ein Targetpolypeptid unter
Verwendung eines Reagenzes isoliert werden, das spezifisch mit
dem Targetpolypeptid interagiert, mit einem Peptidanhängsel,
das mit dem Targetpolypeptid fusioniert wird, oder mit einem
Anhängsel, das mit dem Targetpolypeptid verbunden wird. Der
hier verwendete Begriff "Reagenz" bedeutet einen Liganden oder
ein Liganden bindendes Molekül, das spezifisch mit einem
besonderen Liganden bindenden Molekül bzw. Liganden
interagiert. Der hier verwendete Begriff "Peptidanhängsel"
bedeutet ein Peptid, das spezifisch durch ein Reagenz gebunden
wird. Der Begriff "Anhängsel" bezieht sich allgemeiner gesagt
auf jedes Molekül, das spezifisch durch ein Reagenz gebunden
wird, und schließt daher ein Peptidanhängsel ein. Ein Reagenz
kann beispielsweise ein Antikörper sein, der spezifisch mit
einem Epitop eines Targetpolypeptides oder einem Epitop eines
Peptidanhängsels interagiert. Zum Beispiel kann ein Reagenz ein
Anti-myc-Epitop-Antikörper sein, der spezifisch mit einem Myc-
Epitop, das an ein Targetpolypeptid fusioniert ist,
interagiert. Ein Reagenz kann ebenfalls zum Beispiel ein
Metall-Ion wie ein Nickel-Ion oder Cobalt-Ion sein, das
spezifisch mit einem Polyhistidin-Peptidanhängsel interagiert;
oder Zink, Kupfer oder beispielsweise eine Zinkfingerdomäne,
die spezifisch mit einem Polyarginin oder Polylysin-
Peptidanhängsel interagiert; oder ein Molekül wie Avidin,
Streptavidin oder einem Derivat davon, das spezifisch mit einem
Anhängsel wie Biotin oder einem Derivat davon interagiert
(siehe, z. B. US-Anmeldung Seriennr. 08/649,876 und ebenfalls
die korrespondierende veröffentlichte internationale PCT-
Anmeldung Nr. WO 97/43617, welche Verfahren zur Dissoziation
von Biotinverbindungen, einschließlich Biotin und
Biotinanaloga, die mit dem Polypeptid konjugiert (biotinyliert)
sind, von Biotin bindenden Verbindungen, einschließlich Avidin
und Streptavidin, unter Verwendung von Aminen, insbesondere
Ammoniak, beschreiben).
Wenn bezogen auf ein Reagenz und das Epitop,
Peptidanhängsel oder Anhängsel, an welches das Reagenz bindet,
verwendet, zeigt der Begriff "speziell interagiert" an, daß
eine Bindung mit relativ hoher Affinität geschieht. Als solches
hat ein Reagenz für ein besonderes Epitop, Peptidanhängsel oder
Anhängsel eine Affinität von mindestens ungefähr 1 × 106 M-1, im
allgemeinen von mindestens ungefähr 1 × 107 M-1 und insbesondere
von mindestens ungefähr 1 × 108 M-1. Ein Reagenz, das
beispielsweise spezifisch mit einem besonderen Peptidanhängsel
interagiert, bindet vorrangig das Peptidanhängsel, unabhängig
davon, ob andere nichtverwandte Moleküle vorkommen, und ist
deshalb nützlich, das Peptidanhängsel insbesondere ein
Targetpolypeptid, das an das Peptidanhängsel fusioniert ist,
aus einer Probe, die das Targetpolypeptid enthält,
beispielsweise aus einer in vitro Translationsreaktion, zu
isolieren.
Es kann bei der Durchführung eines offenbarten Verfahrens
vorteilhaft sein, eine Nukleinsäure, beispielsweise eine
Targetnukleinsäure oder ein Polypeptid, beispielsweise ein
Targetpolypeptid mit einem festen Träger wie einem Kügelchen,
Mikrochip, Glas- oder Plastikkapillare oder jeder beliebiger
Oberfläche, insbesondere einer flachen Oberfläche, die eine
Struktur wie Vertiefungen (wells), Stifte oder dergleichen
enthalten kann, zu konjugieren. Eine Nukleinsäure oder ein
Polypeptid kann mit einen festen Träger durch verschiedene
Mittel konjugiert werden, einschließlich beispielsweise durch
eine Interaktion von Streptavidin oder Avidin mit Biotin; eine
hydrophobe Interaktion, durch eine magnetische Interaktion
unter Verwendung beispielsweise von funktionalisierten
magnetischen Kügelchen wie Dynabeads, die mit Streptavidin
beschichtete magnetische Kügelchen sind (Dynal Inc.; Great Neck
NY; Oslo Norway); durch eine polare Interaktion wie eine
"befeuchtende" Assoziation zwischen zwei polaren Oberflächen
oder' zwischen Oligo/Polyethylenglykol; durch die Bildung einer
kovalenten Bindung wie einer Amidbindung, einer
Disulfidbindung, eine Thioetherbindung; durch ein
Vernetzungsmittel; und durch einen säurelabilen oder
photospaltbaren Linker (siehe, zum Beispiel Hermanson,
"Bioconjugate Techniques" (Academic Press 1996)). Des weiteren
kann ein Anhängsel oder ein Peptid wie ein Peptidanhängsel mit
einem Polypeptid von Interesse, insbesondere einem
Targetpolypeptid, konjugiert werden.
Ein hier offenbartes Verfahren kann eingesetzt werden, um
die Aminosäuresequenz eines Polypeptids von Interesse zu
bestimmen, beispielsweise indem ein Mittel verwendet wird, das
Aminosäuren von einem Terminus des Polypeptides abspaltet, um
einen ineinandergreifendne Satz von Deletionsfragmenten des
Polypeptides und abgespaltene Aminosäuren zu erzeugen, sowie
durch Verwendung von Massenspektrometrie, um entweder die
abgespaltenen Aminosäuren oder die Deletionsfragmente zu
identifizieren. Der hier verwendete Ausdruck "Mittel, das
Aminosäuren von einem Terminus des Polypeptides abspaltet",
bezieht sich auf ein Mittel, das physikalisch, chemisch oder
biologisch sein kann, um eine carboxyterminale oder eine
aminoterminale Aminosäure von einem Polypeptid zu entfernen.
Ein physikalisches Mittel wird durch eine Lichtquelle
veranschaulicht, zum Beispiel einen Laser, der eine terminale
Aminosäure abspalten kann, insbesondere wo die Aminosäure an
das Polypeptid durch eine photolabile Bindung gebunden ist. Ein
chemisches Mittel wird durch Phenylisothiocyanat (Edmans
Reagenz) veranschaulicht, das in der Gegenwart einer Säure eine
aminoterminale Aminosäure von einem Polypeptid abspaltet. Ein
biologisches Mittel, das eine Aminosäure von einem Terminus
eines Polypeptides abspaltet, wird durch Enzyme wie
Aminopeptidasen und Carboxypeptidasen, die im Stand der Technik
wohl bekannt sind (siehe, zum Beispiel US-Patent Nr. 5,792,
664; internationale Publikation Nr. WO 96/36732)
veranschaulicht.
Der hier verwendete Ausdruck "Deletionsfragment" bezieht
sich auf den Bereich eines Polypeptides, der nach der
Abspaltung von einer oder mehrerer Aminosäuren verbleibt. Bei
Verwendung in bezug auf ein sequenzierendes Polypeptid bedeutet
der Ausdruck "ineinandergreifender Satz von
Deletionsfragmenten" eine Population von Deletionsfragmenten,
die von der sequenziellen terminalen Abspaltung der Aminosäuren
des Polypeptides herrühren, und die mindestens ein
Deletionsfragment enthält, das in jeder Aminosäure des
Bereiches des zu sequenzierenden Polypeptides endet.
Ein hier offenbartes Verfahren kann verwendet werden, um
ein Individuum zu identifizieren, das eine Krankheit oder einen
Zustand aufweist, oder dieser(n) gegenüber prädisponiert ist.
Der hier verwendete Ausdruck "Krankheit" besitzt seine
üblicherweise verstandene Bedeutung eines pathologischen
Zustandes in einem Individuum. Zum Zweck der vorliegenden
Offenbarung kann eine Krankheit beispielsweise auf eine
genetische Mutation, einen chromosomalen Defekt oder ein
infektiösen Organismus zurückzuführen sein. Der Begriff
"Zustand", der von dem Konditionieren eines Polypeptides zu
unterscheiden ist, wird hier dahingehend verwendet, daß er
jeden Zustand eines Individuums bedeutet, einschließlich
beispielsweise eines pathologischen Zustandes oder eines
Zustandes, der bestimmt, wie das Individuum auf eine
Stimulation antworten wird. Der Zustand eines Individuums wird
teilweise durch den Genotyp des Individuums bestimmt, der eine
Indikation bereitstellen kann, wie das Individuum
beispielsweise auf ein Transplantat oder eine Behandlung mit
einem besonderen Medikament reagieren wird. Demzufolge kann die
Bezugnahme auf ein Individuum, das gegenüber einem Zustand
prädisponiert ist, beispielsweise anzeigen, daß das Individuum
einen Genotyp besitzt, der darauf hinweist, daß das Individuum
nicht vorteilhaft auf ein besonderes Medikament reagieren wird.
Bezugnahme hier auf ein Allel oder eine allelische
Variante, die mit einer Krankheit oder einem Zustand
"assoziert" ist, bedeutet, daß der besondere Genotyp
charakteristisch, zumindest teilweise, für den Genotyp ist, der
von einer Population von Individuen gezeigt werden, die eine
Krankheit oder einen Zustand besitzen, oder dagegen
predisponiert sind. Beispielsweise ist eine allelische Variante
wie eine Mutation in dem MRCA1-Gen mit Brustkrebs assoziiert,
und eine allelische Variante wie eine höhere als eine normale
Zahl von Trinukleotidwiederholungen in einem bestimmtem Gen ist
mit Prostatakrebs assoziiert. Der Fachmann erkennt, daß eine
Assoziation einer allelischen Variante mittels wohlbekannter
statistischer Verfahren zur Probenauswertung und Analyse einer
Population identifiziert werden kann.
Der hier verwendete Ausdruck "konjugiert" betrifft eine
stabile Verknüpfung, die eine kovalente Verknüpfung oder eine
nicht kovalente Verknüpfung sein kann, vorausgesetzt, daß die
nicht kovalente Verknüpfung unter dem Zustand stabil ist, dem
die Bindung ausgesetzt ist. Insbesondere kann ein Polypeptid an
einen festen Träger durch einen Linker konjugiert sein, der
eine nicht spaltbare, spaltbare oder reversible Verknüpfung
bereitstellen kann.
Der hier verwendete Begriff "fester Träger" bedeutet eine
ebene Oberfläche oder eine Oberfläche mit Strukturen, mit der
eine funktionelle Gruppe, einschließlich eines Polypeptides,
das eine reaktive Gruppe enthält, konjugiert sein kann. Der
Ausdruck "Oberfläche mit Strukturen" wird hier dahingehend
verwendet, daß er einen Träger bedeutet, der beispielsweise
Vertiefungen, Stifte oder dergleichen enthält, mit der eine
funktionelle Gruppe, einschließlich eines eine reaktive Gruppe
enthaltenen Polypeptides, verknüpft werden kann. Zahlreiche
Beispiele von festen Trägern werden hier offenbart oder sind
ansonsten im Stand der Technik bekannt.
Der hier verwendete Begriff "Ausgangs-Nukleinsäure"
bezieht sich auf zumindest ein Molekül einer
Targetnukleinsäure, die ein Targetpolypeptid kodiert. Die
Ausgangs-Nukleinsäure kann DNA oder RNA, einschließlich mRNA,
sein und kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein,
einschließlich eines DNA-RNA-Hybrides. Eine Mischung von jeder
der Nukleinsäure kann ebenfalls als Ausgangs-Nukleinsäure zur
Durchführung eines hier offenbarten Verfahrens verwendet
werden, wie es die Nukleinsäuren können, die nachfolgend eine
Amplifikationsreaktion hergestellt werden.
Es sollte selbstverständlich sein, daß der hier verwendete
Begriff "Primer" sich auf mehr als einen Primer beziehen kann,
insbesondere in dem Fall, bei dem eine Mehrdeutigkeit in der
Information betreffend die terminale Sequenz einer zu
amplifizierenden Nukleinsäure besteht. Wo beispielsweise eine
Nukleinsäuresequenz anhand von Proteinsequenz-Information
abgeleitet wird, wird eine Zusammenstellung von Primern, die
alle möglichen Codonvariationen auf Basis der Degeneriertheit
des genetischen Codes repräsentieren, für jeden Strang
verwendet. Es wird erwartet, daß ein Primer aus dieser
Zusammenstellung identisch mit der Region der zu
amplifizierenden Sequenz ist.
Ein Verfahren wird bereitgestellt, um die Identität eines
Targetpolypeptides zu bestimmen, indem Massenspektrometrie
verwendet wird, um die molekulare Masse des Targetpolypeptides
zu ermitteln, und diese mit der molekularen Masse eines
Polypeptides bekannter Identität zu vergleichen, wodurch die
Identität des Polypeptides bestimmt wird. Die Identität des
Targetpolypeptides kann beispielsweise die Masse oder
Aminosäuresequenz von mindestens einem Bereich des
Targetpolypeptides sein, oder, indem die Masse zu einem
bekannten Polypeptid, das ein Wildtyp oder ein bekanntes Mutein
ist, verglichen wird.
Ein Targetpolypeptid kann aus einem Individuum,
insbesondere aus einer Zelle oder einem Gewebe des Individuum
oder aus einer biologischen Flüssigkeit, erhalten werden. Ein
Targetpolypeptid kann ebenfalls durch in vitro Translation
eines RNA-Moleküls erhalten werden, das das Targetpolypeptid
kodiert; oder durch in vitro Transkription einer Nukleinsäure,
die das Targetpolypeptid kodiert, die von der Translation
gefolgt wird, die in vitro oder in einer Zelle durchgeführt
werden kann, worin die zu transkribierende Nukleinsäure aus
einem Individuum erhalten wird. Kits zur Durchführung dieser
Prozesse werden ebenfalls bereitgestellt.
Ein hier offenbartes Verfahren stellt ein schnelles und
zuverlässiges Mittel bereit, um indirekt Information über die
Nukleinsäuresequenz zu erhalten. Da die Masse des Polypeptides
ungefähr nur 10% der Masse der entsprechenden DNA besitzt, ist
das translatierte Polypeptid im allgemeinen
massenspektrometrischer Detektion weitaus mehr zugänglicher als
die korrespondierende Nukleinsäure. Darüber hinaus ergibt die
massenspektrometrische Detektion von Polypeptiden analytische
Signale von weit höherer Empfindlichkeit und Auflösung als
Signale, die üblicherweise mit DNA erhalten werden, aufgrund
der inherenten Instabilität von DNA gegenüber der
Verflüchtigung und ihrer Affinität für nicht flüchtige
kationische Verunreinigungen.
Diese Verfahren und Kits sind insbesondere nützlich für
eine Anzahl von Anwendungen wie die Identifizierung von
Mutationen und somit das Screening auf gewisse genetische
Störungen. Ein hier offenbartes Verfahren stellt ebenfalls ein
effizientes Mittel bereit, die Anwesenheit einer einzelnen Base
in einem Polynukleotid zu bestimmen, beispielsweise eine
Mutation einer einzelnen Base, die ein Stopcodon in einen
offenen Leserahmen eines Genes einführt, da solch eine Mutation
zu einer prematuren Proteinverkürzung führt; oder eine
Differenz in einer einzelnen Base, die zu einem Austausch in
der kodierten Aminosäure in einer allelischen Variante eines
polymorphen Genes führt, da unterschiedliche Aminosäuren auf
Basis ihren Massen unterschieden werden können. Das
Mutationsscreening durch direkte Analyse der Masse eines Genes
wie p53 oder BRCA1 erfordert ein System, das die Detektion
einer Mutation einer einzelnen Base erlaubt, was schwierig sein
kann, wenn eine DNA-Sequenz direkt untersucht wird. Eine
Mutation in einer einzelnen Base, die beispielsweise zu einem
prematuren Stopcodon führt, kann die Masse des kodierten
Proteins durch Verkürzung radikal verändern und ist daher
mittels eines hier offenbarten Verfahrens leicht
identifizierbar. Ein Austausch in einer einzelnen Base muß
nicht zu einem Stopcodon führen, um dedektierbar zu sein, da
ein Austausch einer einzelnen Base, die zu einem
Aminosäureaustausch führt, beispielsweise Alanin zu Glycin,
ebenfalls mittels eines hier offenbarten Verfahrens
dedektierbar ist (siehe Beispiele).
Ein hier offenbartes Verfahren kann verwendet werden, um
die Anwesenheit von Nukleotidwiederholungen, insbesondere einer
anormalen Zahl von Nukleotidwiederholungen zu identifizieren,
indem die Identität eines Targetpolypeptides, das durch solche
Wiederholungen kodiert wird, bestimmt wird. Wie hier offenbart,
kann eine anormale Zahl von Nukleotidwiederholungen mittels
Massenspektrometrie identifiziert werden, um die Masse eines
Targetpolypeptides mit dem eines korrespondierenden bekannten
Polypeptides zu vergleichen.
In einer besonderen Anwendung können die offenbarten
Verfahren und die für die Durchführung solcher Verfahren
einsetzbaren Kits verwendet werden, um beispielsweise eine
anormale Zahl von CAG-Wiederholungen in dem SCA-1 Gen zu
dedektieren, oder um die Gegenwart einer Nukleotidsubstitution
von einem C zu einem G in einer der Trinukleotidwiederholungen
in einem Individuum mit spinozerebellarer Ataxie 1 (SCA-1) zu
dedektieren. Massenspektrometrie wird verwendet, um die
molekulare Masse eines Targetpolypeptides zu bestimmen, das
durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die die Trinukleotid
wiederholungen enthält, und indem die molekulare Masse des
Targetpolypeptides mit der molekularen Masse eines Polypeptides
verglichen wird, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die
eine bekannte Anzahl von Trinukleotidwiederholungen sowie eine
bekannte Nukleotidsequenz besitzt (siehe Beispiel 1). Die
Identifikation der Nulkeotidsequenz der Targetnukleinsäure
anhand dieses Verfahrens wird teilweise durch die erhöhte
Massengenauigkeit ermöglicht, die bei Verwendung von
Massenspektrometrie erhalten wird, um das Translationsprodukt
zu detektieren, eher als direkt die Nukleinsäure durch
Massenspektrometrie zu detektieren.
Zu Veranschaulichungszwecken ist der offene Leserahmen des
Genes, das die (CAG)x-Wiederholungen, die mit SCA-1 assoziert
sind, in Fig. 1 gezeigt. Die SCA-1 Sequenz enthält zusätzlich
zu einem nicht variablen Bereich von 12 CAG-Wiederholungen
einen variablen Bereich, von dem in Fig. 1A gezeigt wird, daß
er 10 CAG-Wiederholungen enthält: Wie in Fig. 1A gezeigt ist,
kodiert das SCA-1 Gen ein 7,5 kiloDalton (kDa) Protein, das 10
aufeinanderfolgende Glutamin-(Q) Reste enthält (Fig. 1B). Eine
genaue direkte Massenanalyse des 60 kDa 200-mer, das in Fig.
1A gezeigt ist, mit der zur Zeit erhältlichen
massenspektrometrischen Instrumentierung wäre eine
Herausforderung. Eine kürzliche Studie des SCA-1 Genes zeigte,
daß üblicherweise 25 bis 36 Wiederholungseinheiten in nicht
betroffenen Individuen vorhanden sind, während betroffene
Individuen 43 bis 81 wiederholende Einheiten besitzen. Bei
Annahme des schlimmsten Falls von 81 Wiederholungseinheiten
müßten 213 Basen zusätzlich zu dem 200-mer, das in Fig. 1A
gezeigt ist, mit ausreichender Auflösung dedektiert werden.
Eine Nukleotidsequenz, die größer als ungefähr ein 400-mer
(< 20 kDa) ist, ist bis jetzt noch nicht auf befriedigende Weise
mittels Massenspektrometrie dedektiert worden. Im Vergleich
dazu erfordert die Analyse des Translationsproduktes für die
Sequenz, die 81 Wiederholungen besitzt, eine Massenmessung von
lediglich ungefähr 137 Aminosäureresten (ungefähr 15 kDa). Eine
typische Massengenauigkeit von 0,3% für eine niedrig
auflösende Instrumentierung führt zu einem maximalen Fehler von
13 Dalton, was weitaus niedriger ist als die Masse eines
einzelnen Aminosäurerestes. Demzufolge kann eine Auflösung, die
weitaus besser ist als eine einzelne Aminosäure, mit einem
Verfahren zur Bestimmung der Identitiät eines
Targetpolypeptides, wie es hier offenbart wird, erhalten
werden.
Jedes Polypeptid, für das Identifizierungsinformation
erforderlich ist, wird hier als Targetpolypeptid betrachtet.
Das Polypeptid kann aus jeder Quelle stammen. Ein
Targetpolypeptid oder eine Targetnukleinsäure, die das
Targetpolypeptid kodiert, kann von einem Individuum erhalten
werden, das üblicherweise ein Säugetier, insbesondere ein
Mensch ist. Im allgemeinen wird das Targetpolypeptid vor der
Massenspektrometrie isoliert, um so die Bestimmung der
molekularen Masse des Polypeptides durch
massenspektrometrische Analyse zu erlauben. Der Grad, zu dem
ein Polypeptid für die Massenspektrometrie isoliert werden
muß, ist im Stand der Technik bekannt und variiert in
Abhängigkeit von der Art der durchgeführten
massenspektrometrischen Analyse.
Ein Targetpolypeptid kann ein Bereich eines Proteins
sein, und kann mittels im Stand der Technik bekannter
Verfahren erhalten werden. Beispielsweise kann ein Protein
mittels eines Antikörpers isoliert werden, anschließend
mittels einer Proteinase, die selektiv an spezifischen
Aminosäuresequenzen schneidet, gespalten werden und das
Targetpolypeptid kann durch eine Methode wie Chromatographie
oder Elektrophorese gereinigt werden. Daher kann ein hier
offenbartes Verfahren durchgeführt werden, indem
beispielsweise eine Protein, das ein Targetpolypeptid
enthält, einer limitierten Proteolyse unterworfen wird; das
Targetpolypeptid isoliert wird, und seine Masse durch
massenspektrometrische Analyse untersucht wird, wodurch ein
Mittel zur Bestimmung der Identität des Targetpolypeptids
bereitgestellt wird.
Ein Antikörper, oder ein Antigen bindendes Fragment
eines Antikörpers, der spezifisch mit einem Epitop
wechselwirkt, das auf einen interessierenden Polypeptid
vorkommt, ist dadurch gekennzeichnet, daß er eine spezifische
Bindungsaktivität von mindestens ungefähr 1 × 106 M-1 im
allgemeinen von mindestens 1 × 107 M-1 oder mehr aufweist.
Demzufolge sind Fab, F(ab')2, Fd oder Fv Fragmente eines
Antikörpers, die spezifische Bindungsaktivität für ein
bestimmtes Epitop beibehalten, in der Bedeutung des Begriffes
Antikörper eingeschlossen.
Ein Antikörper, der zur Isolierung eines
interessierenden Polypeptides, insbesondere eines
Targetpolypeptides nützlich ist, kann ein natürlich
vorkommender Antikörper oder ein nicht natürlich vorkommender
Antikörper sein, einschließlich beispielsweise eines single-
chain-Antikörpers, eines chimeren Antikörpers, eines
bifunktionellen Antikörper oder eines humanisierten
Antikörper sowie eines Antigen bindenden Fragments solcher
Antikörper. Solche nicht natürlich vorkommende Antikörper
können unter Verwendung von Festphasen-Peptidsynthese
hergestellt werden, können rekombinant produziert werden oder
können beispielsweise durch das Screening von
kombinatorischen Bibliotheken, die variable schwere Ketten
und variable leichte Ketten enthalten, erhalten werden (siehe
Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)). Diese und andere
Methoden zur Herstellung von beispielsweise chimeren,
humanisierten, CDR-grafted, single-chain- und bifunktionellen
Antikörpern sind dem Fachmann wohl bekannt (Winter und
Harris, Immunol. Today 14: 243-246 (1993); Ward et al., Nature
341: 544-546 (1989); Hilyard et al., Protein Engineering: A
practical approach (IRL Press 1992); Borrebeck, Antibody
Engineering, 2. Aufl.(Oxford Vjniversity Press 1995); Harlow
und Lane, "Antibodies: A laboratory manual" (Cold Spring
Harbor Laboratory Press 1988)).
Ein Antikörper, der zur Isolierung eines
Targetpolypeptides verwendbar ist, kann aus einer
kommerziellen Quelle erhalten werden, oder kann unter
Verwendung eines Proteins, das das Targetpolypeptid oder ein
Peptidbereich davon enthält, als Immunogen erzeugt werden,
oder unter Verwendung eines Epitopes, das an das Polypeptid
fusioniert ist, beispielsweise einem myc-Epitop. Ein solches
Immunogen kann aus natürlichen Quellen prepariert oder
rekombinant produziert werden, oder kann unter Verwendung von
chemischen Routineverfahren synthetisiert werden. Ein
ansonsten nicht immunogenes Epitop kann immunogen gemacht
werden, indem das Hapten mit einem Trägermolekül wie
Rinderserumalbumin (BSA) oder Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH)
gekoppelt wird, oder indem das Epitop als ein Fusionsprotein
exprimiert wird. Verschiedene Trägermoleküle und Verfahren
zur Kopplung eines Haptens mit einem Trägermolekül sind im
Stand der Technik wohl bekannt (siehe, z. B. Harlow und Lane,
"Antibodies: A laboratory manual" (Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1988)).
Ein Antikörper, der spezifisch mit einem
interessierenden Polypeptid, insbesondere einem
Targetpolypeptid oder einem Peptidbereich davon, interagiert,
ist beispielsweise nützlich 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019882657 00004 99880, um zu bestimmen, ob das das
Targetpolypeptid kodierende Nukleinsäuremolekül in einer
biologischen Probe vorhanden ist. Die Identifikation der
Gegenwart oder des Gehalt eines Targetpolypeptids kann unter
Verwendung wohl bekannter Immungssays und
immunhistochemischer Methoden (Harlow und Lane, "Antibodies:
A laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press
1988)) durchgeführt werden. Insbesondere kann ein
Antikörper, der spezifisch mit einem an ein Targetpolypeptid
fusioniertes Peptidanhängsel interagiert verwendet werden, um
das Targetpolypetid aus einer Probe, die beispielsweise eine
biologische Probe oder eine in vitro Translationsreaktion
sein kann, zu isolieren.
Verfahren zur Erzeugung polyklonaler Antikörper,
beispielsweise in einem Kaninchen, einer Ziege, einer Maus
oder einem anderen Säugetier, sind im Stand der Technik
wohlbekannt (Harlow und Lane, "Antibodies: A laboratory
manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988)). Im
wesentlichen können Milzzellen von einer mit dem
interessierenden Polypeptid immunisierten Maus oder einem
Peptidbereich davon, mit einer geeigneten Myelomzellinie wie
SP/02-Myelomzellen zur Erzeugung von Hybridomzellen
fusioniert werden. Klonierte Hybridomzellinien können unter
Verwendung des Immunisierungs-polypeptides gescreent werden,
um Klone zu identifizieren, die geeignete spezifische
Antikörper sekretieren. Hybridomzellen, die Antikörper mit
einer wünschenswerten Spezifität und Affinität exprimieren,
können isoliert und als kontinuierliche Quelle für die
Antikörper verwendet werden, welche beispielsweise zur
Aufnahme in einem hier bereitgestellten Kit verwendbar sind.
Auf ähnliche Weise stellt ein rekombinanter Phage, der
beispielsweise einen interessierenden single-chain-Antikörper
exprimiert, einen monoklonalen Antikörper bereit, der zur
Herstellung von standardisierten Kits verwendet werden kann.
Die Isolierung und Identifikation eines
Targetpolypeptides kann erleichtert werden, indem ein
Anhängsel an ein Polypeptid verbunden wird, beispielsweise
indem das Polypeptid mit einem Peptidanhängsel fusioniert
wird. Solch ein Fusionspolypeptid kann beispielsweise durch
in vitro-Transkription und Translation einer Nukleotidsequenz
erhalten werden, die das Targetpolypeptid verbunden im Rahmen
mit einer Nukleotidsequenz, die das Peptidanhängsel kodiert,
erhalten werden, anschließend das Fusionspolypeptid aus der
Translationsreaktion unter Verwendung eines Reagenzes, das
spezifisch mit dem Affinitätspeptid interagiert, isoliert
wird. Das Peptidanhängsel kann beispielsweise ein myc-Epitop
sein oder ein Peptidbereich des Haemophilus influenza
Hemagglutinin Proteins, gegen das spezifische Antikörper
hergestellt werden können und ebenfalls kommerziell
erhältlich sind. Ein Peptidanhängsel kann auch eine
Polyhistidinsequenz, beispielsweise eine Hexahistidinsequenz
(His-6) sein, die spezifisch mit Metall-Ionen wie Zink-,
Nickel- oder Cobalt-Ionen interagiert, oder eine Polylysin-
oder Polyargininsequenz, die zumindest vier Lysin- bzw. vier
Argininreste umfaßt, die spezifisch mit Zink, Kupfer oder
beispielsweise einem Zinkfingerprotein interagiert.
Ein Anhängsel kann ebenfalls an das Polypeptid entweder
durch chemische Modifikation des Polypeptides während oder
nach seiner Synthese gefügt werden. Beispielsweise kann ein
Targetpolypeptid, das ein Anhängsel enthält, durch Isolierung
aus einer in vitro-Translationsreaktion eines
Targetnukleinsäuremoleküls erhalten werden, wobei die
Translationsreaktion in der Gegenwart einer modifizierten
Aminosäure durchgeführt wird, und, falls angemessen, mis
aminoacylierten tRNA, die die modifizierte Aminosäure trägt.
Die Modifikation der Aminosäure wird so ausgewählt, daß sie
ein Anhängsel enthält, das die Isolierung des Polypeptids,
das die modifizierte Aminosäure enthält, erlaubt.
Beispielsweise kann ein Lysinrest mit einem biotinyliertem
Lysinanalogon (oder einem anderen Lysinanalogon, das ein
Anhängsel enthält) in der Translationsreaktion ersetzt
werden, was zu einem translatiertem Polypeptid führt, das
biotinylierte Lysinreste enthält. Ein solches getagtes
Polypeptid kann durch Affinitätschromatographie oder
beispielsweise auf einem Bett von immobilisiertem Avidin oder
Streptavidin isoliert werden. Andere modifizierte Aminosäuren
sind im US-Patent Nr. 5,643,722 offenbart.
Ein Targetpolypeptid kann durch Affinitätsreinigung
unter Verwendung beispielsweise eines Antikörpers, Avidin
oder eines anderen spezifischen Reagenzes, das mit einem
festen Träger verbunden ist, isoliert werden. Bei solch einer
Methode wird die Translationsreaktion auf den Träger
aufgegeben, der zum Beispiel in einer Säule vorliegen kann,
und das Polypeptid wird aufgrund seiner spezifischen
Interaktion mit dem Reagenz gebunden. Beispielsweise kann ein
mit einem Polyhistidin-peptidanhängsel fusioniertes
Targetpolypeptid auf einer Säule oder einem Bett mit
chelatisierten Nickel-Ionen isoliert werden, wohingegen ein
Targetpolypeptid, das mit einem Polylysin oder
Polyargininanhängsel fusioniert ist, auf einer Säule oder
einem Bett von chelatisiertem Zink- oder Kupfer-Ionen
isoliert werden kann. Betten oder Säulen, die solche daran
chelatisierten divalenten Metall-Ionen besitzen, können von
einer kommerziellen Quelle erhalten werden, oder mittels im
Stand der Technik bekannter Methoden hergestellt werden. Das
Polypeptid kann anschließend von der Säule in einer
isolierten Form eluiert werden und der Massenspektrometie
unterworfen werden.
Das Polypeptid wird aus Nukleinsäuren hergestellt
werden, die dieses kodieren. Daher kann das Targetpolypeptid
aus einer Zelle oder einem Gewebe eines Individuums isoliert
werden, oder es kann in vitro aus einem RNA-Molekül
synthetisiert werden, beispielsweise durch in vitro-
Translation oder von einem DNA-Molekül durch in vitro-
Transkription und Translation; oder es kann in einer
eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtzelle synthetisiert
werden, die mit der Targetnukleinsäure transformiert ist, die
das Targetpolypeptid kodiert.
In hier bevorzugten Ausführungsformen wird das
Targetpolypeptid aus einer Zelle, einem Gewebe oder einem in
vitro-Translationssystem, beispielsweise einem Retikulozyten
lysatsystem, isoliert. Die In vitro-Translation oder in
vitro-Transkription, die von Translation gefolgt wird,
befinden sich unter den bevorzugten Herstellungsverfahren der
Polypeptide. Die Polypeptide können nach der Translation
unter Verwendung
jeder dem Fachmann im Stand der Technik bekannten
Reinigungsmethode gereinigt werden. Beispielsweise kann das
Polypeptid mittels eines Reagenzes isoliert werden, das
spezifisch mit dem Targetpolypeptid interagiert, oder mit einem
Protein, das das Targetpolypeptid enthält. Ein solches Reagenz
kann ein Antikörper sein, der spezifisch mit einem Epitop der
Targetpolypeptides interagiert, beispielsweise ein Antikörper
gegen ein Epitop, das von einer Trinukleotidwiederholungs
sequenz kodiert wird. Wenn das Targetpolypeptid eine Aminosäure
enthält, die eine von mehreren Aminosäuren sein kann,
beispielsweise, wo das Targetpolypeptid aus einem mutierten
Protein stammt, interagiert der Antikörper vorzugsweise mit
einem Epitop, das nicht ein Epitop einschließt, das die
mutierte(n) Aminosäure(n) enthält. Antikörper, die spezifisch
mit einem das Targetpolypeptid enthaltenen Protein oder mit dem
Targetpolypeptid interagieren, können unter Verwendung von im
Stand der Technik wohlbekannter Methoden hergestellt werden
(Harlow und Lane, "Antibodies: A laboratory manual" (Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1988)).
Ein Targetpolypeptid kann aus einem RNA-Molekül erhalten
werden, beispielsweise durch in vitro-Translation des RNA-
Moleküls. Das Targetpolypeptid kann ebenfalls von einem DNA-
Molekül erhalten werden, wo in vitro-Translation von zumindest
einem Bereich des DNA-Moleküls vor der Translation durchgeführt
wird. Insbesondere kann zumindest ein Bereich des DNA-Moleküls,
das die Nukleotidsequenz, die das Targetpolypeptid kodiert,
amplifiziert werden, beispielsweise mittels PCR vor der
Durchführung der in vitro-Transkription oder -Translation.
Demzufolge kann ein hier offenbartes Verfahren zur Bestimmung
der Identität eines Targetpolypeptides einen Schritt
einschließen, ein Targetnukleinsäuremolekül zu isolieren, das
DNA oder RNA sein kann, und von dem das Targetpolypeptid
erhalten wird.
Eine Nukleinsäureprobe, in isolierter oder nichtisolierter
Form, kann als die Ausgangs-Nukleinsäure in einem hier
offenbarten Verfahren eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß
vermutet wird, daß die Probe die Targetnukleinsäure enthält.
Die Targetnukleinsäure kann ein Teil eines längeren Moleküls
sein oder kann anfangs als ein diskretes Molekül vorliegen, so
daß die spezifische Sequenz die gesamte Nukleinsäure darstellt.
Es ist nicht notwendig, daß eine Ausgangs-Nukleinsäure nur
die Targetnukleinsäure in einer isolierten Form enthält.
Vorausgesetzt, daß die Ausgangs-Nukleinsäure in einer
isolierten Form vorliegt, kann die Targetnukleinsäure eine
kleine Fraktion einer komplexen Mischung sein, beispielsweise
ein Bereich des β-Globin Genes, das in der gesamten humanen DNA
enthalten ist, oder ein Bereich einer Nukleinsäuresequenz eines
bestimmten Mikroorganismuses, der nur eine kleine Fraktion
einer bestimmten biologischen Probe ausmacht. Eine Ausgangs-
Nukleinsäure kann ebenfalls mehr als eine Population von
Targetnukleinsäuren enthalten.
Die Ausgangs-Nukleinsäure kann aus jeder Quelle erhalten
werden, einschließlich einer natürlichen Quelle wie Bakterien,
Hefen, Viren, Protisten sowie höheren Organismen,
einschließlich Pflanzen oder Tieren, insbesondere aus Geweben,
Zellen oder Organellen solcher Quellen, oder kann aus Plasmiden
wie pBR322 erhalten werden, in denen die Nukleinsäure vorher
kloniert wurde. Die Ausgangs-Nukleinsäure kann beispielsweise
eine DNA-Probe darstellen, die aus einem Tier isoliert wird,
insbesondere einem Säugetier wie einem menschlichen Individuum,
und kann aus jeder Zellquelle oder Körperflüssigkeit erhalten
werden. Beispiele von Zellquellen, die in der klinischen Praxis
erhältlich sind, schließen ein, sind jedoch nicht darauf
beschränkt, Blutzellen, buccale Zellen, cervico-Vaginalzellen,
Epithelialzellen aus dem Urin, oder Zellen, die in einem zum
Beispiel durch Biopsie erhaltenen Gewebe vorkommen.
Körperflüssigkeiten schließen Blut, Urin und
Cerebrospinalflüssigkeit sowie Gewebeexudate aus einer
Infektions- oder Entzündungsstelle ein.
Ein Nukleinsäuremolekül kann aus einer Zellquelle oder
Körperflüssigkeit unter Verwendung jedes der zahlreichen im
Stand der Technik und als Routine bekannten Verfahren
extrahiert werden, und die besondere Methode, die zur
Extraktion der Nukleinsäure verwendet wird, wird als die für
die besondere biologische Probe angemessene ausgewählt,
einschließlich, ob die zu isolierende Nukleinsäure DNA oder RNA
ist (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A
laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)).
Zum Beispiel können Einfrier-Auftau- und alkalische
Lyseprozeduren verwendbar sein, um Nukleinsäuremoleküle aus
festen Materialen wie Zell- oder Gewebeproben zu erhalten.
Hitze und alkalische Lyseverfahren können verwendbar sein, um
Nukleinsäuremoleküle aus Urin zu erhalten; und Proteinase K-
Extraktion oder Phenolextraktion kann verwendbar sein, um
Nukleinsäuren aus Zellen oder Geweben wie Blutproben zu
erhalten (Rolff et al., "PCR: Clinical diagnostics and
research" (Springer Verlag Publ. 1994)).
Für den Einsatz einer Targetnukleinsäure aus Zellen können
die Zellen in einem hypotonischen Puffer suspendiert werden und
auf ungefähr 90°C bis 100°C für ungefähr 1 bis 15 Minuten
erhitzt werden, bis die Zellyse und Dispersion von
intrazellulären Komponenten stattfindet. Nach dem Hitzeschritt
können Amplifikationsreagenzien, falls gewünscht, direkt zu dem
Lysat hinzugegeben werden. Eine solche direkte
Amplifikationsmethode kann beispielsweise bei peripheren
Blutlymphozyten oder Amniozyten verwendet werden. Die Menge an
DNA, die für die Analyse von humaner genomischer DNA extrahiert
wird, beträgt im allgemeinen mindestens ungefähr 5 pg, was
ungefähr einem Zelläquivalent einer Genomgröße von 4 × 109
Basenpaare entspricht. Bei einigen Anwendungen, beispielsweise
der Detektion von Sequenzveränderungen in dem Genom eines
Mikroorganismusses, können variable Mengen an DNA extrahiert
werden.
Im allgemeinen sind die ein Polynukleotid bildenden
Nukleotide natürlich vorkommende Desoxyribonukleotide wie
Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymidin, die mit 2'-Deoxyribose
verbunden sind, oder Ribonukleotide wie Adenin, Cytosin, Guanin
oder Uracil, die mit Ribose verbunden sind. Ein Polynukleotid
enthält ebenfalls Nukleotidanaloga, einschließlich nicht
natürlich vorkommender synthetischer Nukleotide oder
modifizierte natürlich vorkommene Nukleotide. Solche
Nukleotidanaloga sind im Stand der Technik wohlbekannt und
kommerziell erhältlich, wie auch Polynukleotide, die solche
Nukleotidanaloga enthalten (Lin et al., Nucl. Acids Res.
22: 5220-5234 (1994); Jellinek et al., Biochemistry 34: 11 363-
11 372 (1995); Pagratis et al., Nature Biotechnol. 15: 68-73
(1997)). Die kovalente Bindung, die die Nukleotide eines
Polynukleotids miteinander verknüpft, ist üblicherweise eine
Phosphordiesterbindung. Die kovalente Bindung kann ebenfalls
eine der zahlreichen anderen Bindungen sein, einschließlich
einer Thiodiesterbindung, einer Phosphorthioatbindung, einer
peptidähnlichen Bindung oder jede andere dem Fachmann bekannte
Bindung, die verwendbar ist, um Nukleotide zur Erzeugung von
synthetischen Polynukleotiden zu verknüpfen (siehe z. B. Tarn et
al., Nucl. Acids Res. 22: 977-986 (1994); Ecker und Crooke,
BioTechnology 13: 351-360 (1995)).
Wo es gewünscht wird, ein Polynukleotid zur Verwendung in
einem hier offenbarten Verfahren oder zur Aufnahme in einem Kit
zu synthetisieren, kennt der Fachmann die Auswahl der
bestimmten Nukleotide oder Nukleotidanaloga und die kovalente
Bindung, die zur Verknüpfung der Polynukleotide verwendet wird,
hängt teilweise von dem Zweck ab, für den das Polynukleotid
hergestellt wird. Wo beispielsweise ein Polynukleotid einer
Umgebung ausgesetzt wird, die wesentliche Nukleaseaktivität
enthält, wählt der Fachmann Nukleotidanaloga oder kovalente
Bindungen aus, die relativ resistent gegenüber Nukleasen sind.
Ein Polynukleotid, daß natürlich vorkommende Nukleotide und
Phosphordiesterbindungen enthält, kann chemisch synthetisiert
werden, oder kann unter Verwendung eines geeigneten
Polynukleotids als Template mittels rekombinanter DNA-Methoden
hergestellt werden. Im Vergleich dazu wird ein Polynukleotid,
das Nukleotidanaloga oder andere kovalente Bindungen als
Phosphordiesterbindungen üblicherweise chemisch synthetisiert,
obwohl ein Enzym wie T7 Polymerase gewisse Arten von
Nukleotidanaloga einbauen kann und daher verwendet werden kann,
um solch ein Polynukleotid rekombinant von einem geeigneten
Template ausgehend herzustellen (Jellinek et al., Biochemistry
34: 11 363-11 372 (1995)).
Ein Polynukleotid, beispielsweise ein Oligonukleotid, das
spezifisch an eine Nukleinsäure hybridisiert, insbesondere an
eine Targetnukleinsäure oder an eine Targetnukleinsäure
flankierender Sequenzen, ist besonders nützlich. Ein solches
Hybridisierungs-Polynukleotid ist teilweise dadurch
gekennzeichnet, daß es zumindest 9 Nukleotide lang ist, wobei
solche Sequenzen besonders nützlich als Primer für die
Polymerasekettenreaktion (PCR) sind und zumindest 14 Nukleotide
lang sein oder, falls gewünscht, zumindest 17 Nukleotide lang
sein können. Solche Nukleotidsequenzen sind besonders als
Hybridisierungssonden sowie für PCR nützlich. Es sollte klar
sein, daß die Bedingungen, die für die spezifische
Hybridisierung eines ersten Polynukleotides, beispielsweise
eines PCR-Primers, mit einem zweiten Polynukleotid,
beispielsweise einer Targetnukleinsäure, zum Teil von dem Grad,
der zwischen den Sequenzen geteilten Komplementarität abhängt,
dem GC-Gehalt der hybridisierenden Moleküle und der Länge der
Antisense-Nukleinsäuresequenz, und daß Bedingungen, die
geeignet sind, eine spezifische Hybridisierung zu erhalten, auf
Basis von leicht erhältlichen Formeln berechnet werden können
oder empirisch bestimmt werden können (Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1989: Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology (Green Publ., NY 1989)).
Ein Targetpolypeptid kann erhalten werden, indem ein RNA-
Molekül, das das Targetpolypeptid kodiert, in vitro
translatiert wird. Falls gewünscht, kann das RNA-Molekül durch
in vitro-Transkription einer Nukleinsäure, im allgemeinen DNA,
die das Targetpolypeptid kodiert, erhalten werden. Die
Translation eines Targetpolypeptides kann beeinflußt werden,
indem ein RNA-Molekül, das das Polypeptid kodiert, direkt in
eine in vitro-Translationsreaktion eingeführt wird, oder indem
ein DNA-Molekül, das das Polypeptid kodiert, in eine in vitro-
Transkription/Translationsreaktion eingeführt wird oder in eine
in vitro-Transkriptionsreaktion, und anschließend die RNA in
eine in vitro-Translationsreaktion überführt wird.
Für die in vitro-Transkription wird die Target-DNA auf
operable Weise mit einem. Promotor verknüpft, von dem aus die
Transkription in der Gegenwart einer RNA-Polymerase initiiert
wird, die fähig ist mit dem Promotor, Ribonukleotiden und
anderen für die in vitro-Transkription notwendigen Reagenzien
zu interagieren. Die in vitro-Transkription kann als ein
separater Schritt aus einer in vitro-Translationsreaktion
durchgeführt werden, oder kann in einer einzigen Reaktion unter
Verwendung von wohlbekannten Verfahren durchgeführt werden
(siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A
laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989);
siehe ebenfalls US-Patent Nr. 4,766,072, das zur in vitro-
Transkription verwendbare Vektoren beschreibt). In vitro-
Transkriptionskits sind ebenfalls wohlbekannt und sind
kommerziell erhältlich (Promega Corp.; Madison WI).
Eine in vitro-Transkriptionsreaktion wird durchgeführt,
indem eine Template-DNA, die im allgemeinen die
Targetnukleinsäure einschließt, für ungefähr eine Stunde bei
37°C oder 40°C, abhängig von der Polymerase, in der Gegenwart
von Ribonukleotiden, einem Cap-Analogon wie GpppG oder einem
methyliertem Derivat davon, einem RNAase-Inhibitor, einer RNA-
Polymerase, die den Promotor erkennt, der stromaufwärts auf
operable Weise mit der zu transkribierenden DNA verbunden ist,
erkennt, und einem geeigneten Puffer, der Tris-HCl, MgCl2,
Spermidine und NaCl enthält, inkubiert wird. Nach der
Transkriptionsreaktion kann RNAase freie DNAase hinzugegeben
werden, um das DNA-Template zu entfernen und die RNA,
beispielsweise durch Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt
werden (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory
manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)).
Üblicherweise werden ungefähr 5 bis 10 µg RNA pro Mikrogramm
Template-DNA erhalten.
Wo RNA in einer prokaryontischen in vitro-Transkription
hergestellt wird, kann die RNA in einer uncapped-Form
hergestellt werden, wie durch in vitro-Transkription in der
Abwesenheit eines Cap-Analogons, da die Translation von RNA in
einem prokaryontischen System nicht die Anwesenheit eines Caps
wie N7-Methyl-G, das kovalent zu dem 5'Ende der mRNA verbunden
ist, erfordert. Capped-RNA wird viel effizienter als uncapped-
RNA in eukaryontischen Systemen translatiert und deshalb kann
es wünschenswert sein, die RNA während der Transkription oder
während der Translation zu cappen, wenn ein eukaryontisches
Translationssystem verwendet wird. Die in vitro transkribierte
RNA kann beispielsweise durch Ethanolfällung isoliert werden,
und anschließend für die in vitro-Translation verwendet werden.
Translationssysteme können zellulär oder zellfrei sein und
können prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Zelluläre
Translationssyteme verwenden im allgemeinen intakte Zellen,
beispielsweise Oocyten oder verwenden permeabilisierte Zellen,
wohingegen zellfreie (in vitro) Translationssysteme Zell- oder
Gewebelysate oder -extrakte verwenden, gereinigte oder partiell
gereinigte Komponenten oder Kombinationen davon.
In vitro-Translationssysteme sind wohlbekannt und
kommerziell erhältlich und viele unterschiedliche Arten und
Systeme sind wohlbekannt und routinemäßig eingesetzt. Beispiele
von in vitro-Translationssystemen schließen eukaryontische
Zellysate wie Kaninchenretikulocytenlysate, Kaninchenoocyten
lysate, humane Zellysate, Insektenzellysate oder Weizen
keimextrakte ein. Solche Lysate und Extrakte können hergestellt
werden oder sind kommerziell erhältlich (Promega Corp.;
Stratagene, La Jolla CA; Amersham, Arlington Heights IL; und
GIBCO/BRL, Grand Island NY). In vitro-Translationssysteme
enthalten im allgemeinen Makromoleküle wie Enzyme;
Translations-, Initiations- und Elongationsfaktoren; chemische
Reagenzien; und Ribosomen. Mischungen von gereinigten
Translationsfaktoren sowie Kombinationen von Lysaten oder
Lysaten, die mit gereinigten Translationsfaktoren wie
Initiationsfaktor-1 (IF-1), IF-2, IF-3 (alpha oder beta),
Elongationsfaktor T (EF-Tu) oder Terminationsfaktoren
supplementiert sind, können ebenfalls für die mRNA-Translation
in vitro verwendet werden.
Inkubationszeiten für die in vitro-Translation liegen im
Bereich von ungefähr 5 Minuten bis viele Stunden, betragen
üblicherweise jedoch ungefähr 30 Minuten bis 5 Stunden,
üblicherweise ungefähr 1 bis 3 Stunden. Die Inkubation kann auf
kontinuierliche Weise durchgeführt werden, wobei Reagenzien in
das System eingespült werden und naszierende Polypeptide
entfernt oder zur Akkumulation unter Verwendung eines
kontinuierliches Flußsystems wie von Spirin et al. (Science
242: 1162-64 (1988) beschrieben verbleiben gelassen werden. Ein
solcher Prozeß kann wünschenswert für die Produktion von
naszierenden Polypeptiden im großen Maßstab sein. Die
Inkubationszeiten variieren beträchtlich mit dem Volumen der
Translationsmischung und der Inkubationstemperatur.
Inkubationstemperaturen können zwischen ungefähr 4°C bis 60°C
liegen, im allgemeinen zwischen ungefähr 15°C bis 50°C und
üblicherweise zwischen ungefähr 25°C bis 45°C, insbesondere
ungefähr 25°C oder ungefähr 37°C.
Translationsreaktionen enthalten im allgemeinen einen
Puffer wie Tris-HCl, HEPES oder andere geeignete Puffermittel,
um die Lösung bei ungefähr pH 6 bis pH 8, im allgemeinen
ungefähr pH 7, zu halten. Andere Komponenten eines
Translationssystems können Dithiothreitol (DTT) oder 2-
Mercaptoethanol als Reduktionsmittel enthalten, RNasin, um RNA-
Abbau zu inhibieren, sowie Nukleosidtriphosphate oder
Kreatinphosphat und Kreatinkinase, um chemische Energie für den
Translationsprozeß bereitzustellen.
Ein in vitro-Translationssystem kann ein
Retikulocytenlysat sein, das kommerziell erhältlich ist, oder
gemäß den hier offenbarten oder anderweitig im Stand der
Technik bekannten Verfahren hergestellt werden kann.
Kommerziell erhältliche Retikulocytenlysate sind beispielsweise
von New England Nuclear and Promega Corp. (Kat. #L4960, L4970
und L4980) erhältlich. Ein in vitro-Translationssystem kann
ebenfalls ein Weizenkeim-Translationssystem sein, das
kommerziell erhältlich ist, oder gemäß wohlbekannter Methoden
hergestellt werden kann. Kommerziell erhältliche
Weizenkeimextrakte können beispielsweise von Promega Corp.
erhalten werden (beispielsweise Kat. #L4370). Ein in vitro-
Translationssystem kann ebenfalls eine Mischung eines
Retikulocytenlysates und eines Weizenkeimextraktes sein sowie
kommerziell erhalten werden, zum Beispiel von Promega Corp.
(Kat. #L4340). Andere verwendbare in vitro-Translationssysteme
schließen E. coli-Extrakte, Insektenzellextrakte und
Froschoocytenextrakte ein.
Ein Kaninchenretikulocytenlysat kann wie folgt hergestellt
werden. Kaninchen werden durch Inokulation mit
Acetylphenylhydrazin anämisch gemacht. Ungefähr sieben Tage
später werden die Kaninchen zur Ader gelassen und das Blut wird
gesammelt und mit einer eiskalten Salzlösung, die NaCl,
Magnesiumacetat (MgAc), KCl sowie Heparin enthält, gemischt.
Die Blutmischung wird durch Mull gefiltert, zentrifugiert und
der Buffy Coat der weißen Zellen wird entfernt. Das Pellet, das
Erythrocyten und Retikulocyten enthält, wird mit der Salzlösung
gewaschen, anschließend durch die Zugabe eines gleichen
Volumens kalten Wassers lysiert. Endogene RNA wird durch
Behandlung des Lysats mit mikroccokaler Nuklease und Calcium-
Ionen, die für die Nukleaseaktivität notwendig sind, abgebaut
und die Reaktion wird durch die Zugabe von EGTA, das die
Calciumionen chelatisiert und die Nuklease inaktiviert,
beendet. Hemin (ungefähr 20 bis 80 µM), das ein starker
Suppressors eines Inhibitors des Initiationsfaktors elF-2 ist,
kann ebenfalls zu dem Lysat gegeben werden. Die
Translationsaktivität des Lysates kann durch die Zugabe eines
energieerzeugenden Systems, beispielsweise
Phosphorcreatinkinase und Phosphorcreatin optimiert werden. Die
Lysate können anschließend aliquotiert und bei -70°C oder in
flüssigen Stickstoff aufbewahrt werden. Weitere Details
betreffend eines solchen Protokolles sind bekannt (siehe zum
Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory
manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)).
Eine in vitro-Translationsreaktion unter Verwendung eines
Retikulocytenlysates kann wie folgt durchgeführt werden. Zehn
µl eines Retikulocytenlysates, das wie oben offenbart
hergestellt werden kann oder käuflich erworben werden kann,
wird mit Spermidin, Creatinphosphat, Aminosäuren, HEPES-Puffer
(pH 7,4), KCl, MgAc und der zu translatierenden RNA gemischt
und für eine geeignete Zeitdauer, im allgemeinen ungefähr eine
Stunde bei 30°C inkubiert. Die optimale Menge an MgAc zum
Erzielen einer effizienten Translation variiert von einer
Reticulozytenlysat-Präparation zur anderen und kann mittels
einer Standardpräperation von RNA und einer Konzentration an
MgAc, die von 0 bis 1 mM variiert wird, bestimmt werden. Die
optimale Konzentration an KCl kann ebenfalls in Abhängigkeit
von der spezifischen Reaktion variieren. Beispielsweise sind
70 mM KCl optimal für die Translation von capped RNA, wohingegen
40 mN im allgemeinen optimal für die Translation von uncapped
RNA sind. Gegebenenfalls wird der Translationsprozess mittels
eines Verfahrens wie die massenspektrometrische Analyse
überwacht. Die Überwachung kann ebenfalls durchgeführt werden,
indem beispielsweise eine oder mehrere radioaktive Aminosäuren
sowie 35S-Methionin hinzugegeben werden, und der Einbau der
Radiomarkierung in die Translationsprodukte gemessen wird,
indem die Proteine in dem Lysat mit beispielsweise TCA
präzipitiert werden und die Menge der Radioaktivität, die in
dem Präzipitat zu verschiedenen Zeitpunkten während der
Inkubation vorhanden sind, gezählt wird. Die
Translationsprodukte können ebenfalls durch Immunopräzipitation
oder durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert
werden (siehe zum Beispiel, Sambrook et al., Molecular Cloning:
A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989;
Harlow and Lane, "Antibodies: A labroatory manual" (Cold Spring
Harbor Laboratory Press 1988)).
Ein Weizenkeimextrakt kann ebenfalls wie von Roberts und
Paterson (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 70: 2330-2334 (1973))
beschrieben, hergestellt werden, und kann, falls gewünscht, wie
von Anderson (Meth. Enzymol. 101: 635 (1983)) beschrieben
modifiziert werden. Das Protokoll kann ebenfalls, gemäß dem
Herstellerprotokoll L418 (Promega Corp.) modifiziert werden. Im
allgemeinen wird Weizenkeimextrakt hergestellt, indem
Weizenkörner in einem Extraktionspuffer vermahlen werden,
gefolgt von Zentrifugation, um Zelltrümmer zu entfernen. Der
Überstand wird durch Chromatographie von endogenen Aminosäuren
und von Pflanzenpigmenten, die für die Translation
inhibitorisch sind, abgetrennt. Der Extrakt wird mit
mikroccocaler Nuklease behandelt, um endogene mRNA zu
zerstören, wodurch die Hintergrund-Translation auf ein Minimum
reduziert wird. Der Weizenkeimextrakt enthält die zellulären
Komponenten, die zur Proteinsynthese notwendig sind,
einschließlich tRNA, rRNA sowie Initiations-, Elongations- und
Terminationsfaktoren. Der Extrakt kann weiterhin optimiert
werden, indem ein energieerzeugendes System wie
Phosphorkreatinkinase und Phosphorkreatin hinzugegeben wird;
MgAc wird zu einem Gehalt, der für die Translation der meisten
mRNA-Spezies empfohlen wird, im allgemeinen ungefähr 6,0 bis
7,5 mM Magnesium, hinzugefügt.
Die in vitro Translation in Weizenkeimextrakten kann
ebenfalls, wie zum Beispiel von Erickson und Blobel (Meth.
Enzymol. 96: 38 (1982)) beschrieben, durchgeführt werden, und
kann beispielsweise modifiziert werden, indem die endgültige
Ionenkonzentration auf 2,6 mM Magnesium und 140 mM Kalium
eingestellt wird und der pH auf 7.5 (US-Patent Nr. 4,983,521).
Die Reaktionsmischungen können bei 24°C für 60 Minuten
inkubiert werden. Translationen in Weizenkeimextrakten können
ebenfalls, wie im US-Patent Nr. 5,492,817 beschrieben,
durchgeführt werden.
In vitro Translationsreaktionen können durch die Zugabe
von Ionen oder anderen Reagenzen optimiert werden.
Beispielsweise ist Magnesium für die optimale Translation
wichtig, da es die Stabilität von assemblierten Ribosomen
verstärkt und ihrer Bindung aneinander während der Translation
dient. Magnesium scheint ebenfalls die Polymerasebindung zu
erleichtern. Kalium ist ebenfalls zur Optimierung der
Translation wichtig, allerdings darf anders als Magnesium, für
gekoppelte Transkriptions- und Translationsreaktionen die
Kaliumionen-Konzentration nicht über den Gehalt für
Standardtranslations-Präparationen geändert werden.
Kalium und Magnesium kommen in dem Standardkaninchen-
Reticulozytenlysat vor und ihre Gehalte stammen teilweise von
dem endogenen Lysatgehalt und teilweise von den Zugaben, die
bei der Präparation des Lysats gemacht werden, wie sie für
Translationslysate vorgenommen werden. Da die
Magnesiumkonzentration innerhalb eines eher schmalen Bereichs
für eine optimale Translation angepaßt werden sollte, sollten
die Magnesiumgehalte im Lysat direkt durch die Verwendung eines
Magnesiumtests vor der Zugabe von zusätzlichem Magnesium
gemessen werden, so daß die Menge an Magnesium in einer
Reaktion von einem Lysatansatz zum nächsten standardisiert
werden kann. Der Lancer "Magnesium Rapid State Diagnostic Kit"
(Oxford Lab Ware Division, Sherwood Medical Co.; St. Louis MO)
ist ein hilfreicher Test zur genauen Messung der
Magnesiumgehalte in einer biologischen Flüssigkeit. Sobald die
Magnesiumkonzentration für einen ausgewählten Lysatansatz
bestimmt ist, kann zusätzliches Magnesium, beispielsweise in
der Form einer konzentrierten Magnesiumsalzlösung, auf bekannte
Art zugefügt werden, um die Magnesiumkonzentration des Lysats
innerhalb des optimalen Bereichs zu bringen, oder im Falle
einer modifizierten Lysatpräparation, als eine Hälfte einer
Reaktionsmischung verwendet werden, um innerhalb zweimal des
optimalen Bereichs zu sein. Die Endkonzentration an Magnesium
des Kaninchenretikulozytenlysate wird beispielsweise angepaßt,
indem eine konzentrierte Lösung von MgCl2 oder MgAc auf eine
Konzentration größer als 2,5 mM, jedoch geringer als 3,5 mM,
üblicherweise zwischen 2,6 mM und 3,0 mM, hinzugefügt wird.
Eine übliche Zugabe zu einer in vitro Translationsreaktion
ist eine Menge an Polyamin, die ausreichend ist, eine
effiziente Kettenverlängerung zu stimulieren. Demzufolge kann
Spermidin zu einer Translationreaktion mit einem
Retikulozytenlysat bis zu einer Endkonzentration von ungefähr
0,2 mN hinzugefügt werden. Spermidin kann ebenfalls zu
Weizenkeimextrakten hinzugegeben werden, im allgemeinen zu
einer Konzentration von ungefähr 0,9 mM. Da die Konzentration
von Polyaminen die effektive Magnesiumkonzentration in einer
Reaktion erniedrigt, sollte die Gegenwart von Spermidin in
einer Translationsreaktion in Betracht gezogen werden, wenn die
zur Verwendung geeignete Konzentration an Magnesium bestimmt
wird. DTT wird ebenfalls zu der Translationsmischung
hinzugegeben, üblicherweise bei einer Endkonzentration von
ungefähr 1,45 mM in Retikulozyten-Lysaten und ungefähr 5,1 mM
in Weizenkeimextrakten.
Translationssysteme können mit zusätzlichen Faktoren, wie
tRNA-Molekülen, die kommerziell erhältlich sind (Sigma
Chemical, St. Louis MO; Promega Corp., Madison WI; Boehringer
Mannheim Biochemicals, Indianapolis IN), supplementiert werden,
oder können aus E. coli, Hefe, Kalbsleber oder Weizenkeim
mittels wohlbekannter Methoden, hergestellt werden. Die
Isolierung und Reinigung von tRNA-Molekülen schließt Zellyse
und Phenolextraktion ein, die von Chromatographie auf DEAE-
Cellulose gefolgt wird. Aminosäure spezifische tRNA,
beispielsweise tRNA<fMet<, kann durch Expression von klonierten
Genen isoliert werden und in Wirtszellen überexprimiert und
separiert aus Gesamt-tRNA in hohen Ausbeuten und hoher Reinheit
mittels beispielsweise präparativer polyakrylamider
Gelelektrophorese werden, was durch das Ausschneiden von Banden
und Elution gefolgt wird (Seong and RajBhandary, Proc. Natl.
Acad. Sci., USA 84: 334-338, (1987)).
Die Translationseffizienz kann verbessert werden, indem
RNAase-Inhibitoren, wie RNASIN oder Heparin, zu der
Translationsreaktion gegeben werden. RNASIN kann beispielsweise
von Promega Corp. (Katalognr. N2514) erhalten werden. Es werden
ungefähr 40 Einheiten RNASIN zu einer 50 µl-Reaktion
hinzugegeben. Obwohl die Zugabe eines RNAase-Inhibitors zu
Retikulozytenlysaten nicht entscheidend ist, tritt nur eine
limitierte Translation auf, wenn ein RNAase-Inhibitor nicht zu
einer Translationreaktion mit einem Weizenkeimextraktion
hinzugegeben wird.
Der Translationsprozess, einschließlich der Bewegung der
Ribosomen auf den RNA-Molekülen wird zu einem geeigneten
Zeitpunkt durch die Zugabe eines Inhibitors der Translation,
beispielsweise Cycloheximid bei einer Endkonzentration von
1 µg/ml, inhibiert. Magnesium-Ionen, beispielsweise MgCl2 können
bei einer Konzentration von ungefähr 5 mM ebenfalls
hinzugegeben werden, um die Komplexe aus mRNA-80S-Ribosom
naszierendem Polypeptid (Polysome) beizubehalten.
Zur Bestimmung der optimalen in vitro
Translationsbedingungen kann die Translation von mRNA in einem
in vitro System, beispielsweise durch massenspektrometrische
Analyse, überwacht werden. Alternativ dazu kann eine markierte
Aminosäure wie 35S-Methionin in die Translationsreaktion,
zusammen mit einer Aminosäuremischung, der diese spezifische
Aminsosäure fehlt (zum Beispiel Methionin), aufgenommen werden.
Eine markierte nicht radioaktive Aminosäure kann ebenfalls in
ein naszierendes Polypeptid eingebaut werden. Beispielsweise
kann die Translationsreaktion eine mis-aminoacylierte tRNA
enthalten (US-Patent Nr. 5,643,722). Beispielsweise kann ein
nicht radioaktiver Marker an ein tRNA-Molekül mis-aminoacyliert
werden und der tRNA-Aminosäurekomplex wird zu dem
Translationssystem hinzugegeben. Das System wird inkubiert, um
den nicht radioaktiven Marker in das naszierende Polypeptid
einzubauen, und Polypeptide, die den Marker enthalten, können
unter Verwendung von für den Marker geeignete Nachweisverfahren
detektiert werden. Mis-Aminoacylierung eines tRNA-Moleküls kann
ebenfalls verwendet werden, um eine Marker zu einem Polypeptid
hinzuzufügen, um die Isolierung des Polypeptids zu erleichtern.
Solche Marker schließen beispielsweise Biotin, Streptavidin und
Derivate davon ein (siehe US-Patent Nr. 5,643,722). Der
Translationsprozess kann durch massenspektrometrische Analyse
verfolgt werden, was nicht die Verwendung von Radioaktivität
oder anderer Markierung erfordert.
Die in vitro Transkription- und Translationsreaktionen
können simultan durchgeführt werden, beispielsweise mittels
eines kommerziell erhältlichen Systems wie dem gekoppelten
Transkriptions-/Translationssystem (Promega Corp., Katalognr.
L4606, 4610 oder 4950). Gekoppelte Transkriptions- und
Translationssysteme, die RNA-Polymerase und eukaryontische
Lysate verwenden, sind im US-Patent Nr. 5,324,637 beschrieben.
Eine gekoppelte in vitro Transkription und Translation kann
ebenfalls mittels eines prokaryontischen Systems, wie einem
bakteriellen System, beispielsweise E. coli S30 zellfreien
Extrakten (Zubay, Ann. Rev. Genet. 7: 267 (1973)), durchgeführt
werden. Obwohl solche prokaryontischen Systeme eine gekoppelte
in vitro Transkription und Translation ermöglichen, können sie
ebenfalls nur für die in vitro Translation verwendet werden.
Wenn ein prokaryontisches Translationssystem verwendet wird,
sollte die RNA-Sequenzelemente enthalten, die für die
Translation einer RNA in einem prokaryontischen System
erforderlich sind. Beispielsweise sollte die RNA
prokaryontische ribosomale Bindungsstellen enthalten, die in
eine Targetnukleinsäure während der Amplifikation mittels eines
Primers, der die prokaryontische Ribosomenbindungssequenz
enthält, eingebaut werden können. Die Ribosomenbindungssequenz
ist stromabwärts eines Promotors zur Verwendung bei der in
vitro Transkription angeordnet.
Zelluläre Translationssysteme können wie folgt hergestellt
werden. Zellen werden durch Inkubation über einen kurzen
Zeitraum, in einer Lösung, die niedrige Konzentrationen an
Detergenz in einem hypotonischen Medium enthält,
permeabilisiert. Verwendbare Detergenzien schließen Nonidet-P
40 (NP40) Triton X-100 (TX-100) oder Desoxycholat in
Konzentrationen von ungefähr 0,01 nM bis 1,0 mM ein, im
allgemeinen zwischen ungefähr 0,1 µm bis ungefähr 0,01 mM,
insbesondere ungefähr 1 µM. Solche Systeme können aus intakten
Zellen in Kultur gebildet werden, einschließlich bakteriellen
Zellen, Primärzellen, immortalisierten Zellinien, humanen
Zellen oder gemischten Zellpopulationen.
Ein Targetpolypeptid kann aus einer Wirtszelle erhalten
werden, die mit einer Nukleinsäure, die als Targetpolypeptid
transformiert ist und dieses exprimiert. Die Targetnukleinsäure
kann beispielsweise durch PCR amplifiziert werden, in einem
Expressionsvektor inseriert werden und der Expressionsvektor in
einer Wirtszelle eingeführt werden, die für die Expression des
durch die Targetnukleinsäure kodierten Polypeptids geeignet
ist. Wirtszellen können eukaryontische Zellen, insbesondere
Säugerzellen, wie humane Zellen, sein oder prokaryontische
Zellen, einschließlich beispielsweise E. coli. Eukaryontische
und prokaryontische Expressionsvektoren sind im Stand der
Technik wohlbekannt und können aus kommerziellen Quellen
erhalten werden. Nach der Expression in einer Wirtszelle kann
das Targetpolypeptid mittels hier offenbarter Verfahren
isoliert werden. Beispielsweise kann das Targetpolypeptid durch
Affinitätschromatographie auf einer mit Nickel-Ionen
chelatisierten Säule gereinigt werden, wenn das
Targetpolypeptid mit einem His-6-Peptid fusioniert ist.
Mindestens ein Bereich der Targetnukleinsäure kann
amplifiziert werden, bevor das Targetpolypeptid, das von der
Nukleinsäure kodiert wird, erhalten wird. PCR kann
beispielsweise vor der in in vitro Transkription und
Translation einer Targetnukleinsäure durchgeführt werden.
Amplifkationsverfahren schließen die Polymerasekettenreaktion
(Newton and Graham, "PCR" (BIOS Publ. 1994)) ein;
nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation,
transkriptionsbasierte Amplifikationssysteme, selbsterhaltende
Sequenzreplikation; Q-beta-Replikase-basierte Amplifikation;
Ligation-Amplifikationsreaktion; Ligasekettenreaktion
(Wiedemann et al., PCR Meth. Appl. 3: 57-64 (1994); Barany, Proc.
Natl. Acad. Sci., USA 88, 189-93 (1991)); Strang-Verdrängungs-
Amplifikation (Walker et al Nucl. Acids Res. 22: 2670-77
(1994)); sowie Variationen dieser Methoden, einschließlich
beispielsweise reverser Transkriptions-PCR (RT-PCR; Higuchi et
al., Bio/Technology 11: 1026-1030 (1993)), sowie
allelspezifische Amplifikation.
Wo eine Nukleotidsequenz der Targetnukleinsäure durch PCR
amplifiziert wird, werden wohlbekannte Reaktionsbedingungen
verwendet. Die minimalen Komponenten einer
Amplifikationsreaktion schließen Template-DNA-Molekül ein;
einen Forward Primer und einen Reversen Primer, von denen jeder
fähig ist, an das Template-DNA-Molekül oder eine damit
verbundene Nukleotidsequenz zu hybridisieren; alle der vier
unterschiedlichen Nukleosidtriphosphate oder geeignete Analoga
davon; ein Mittel für die Polymerisation wie DNA-Polymerase;
und einen Buffer, der den geeigneten pH, Ionenstärke, Co-
Faktoren und dergleichen aufweist. Im allgemeinen werden
ungefähr 25 bis 30 Amplifikationszyklen durchgeführt, wobei
jeder einen Denaturierungsschritt, einen Annealing-Schritt und
einen Verlängerungsschritt einschließt, allerdings können
weniger Zyklen ausreichen oder mehr Zyklen können erforderlich
sein, in Abhängigkeit beispielsweise von der Menge der
Template-DNA-Moleküle, die in der Probe vorhanden sind.
Beispiele von PCR-Reaktionsbedingungen werden im US-Patent Nr.
5,604,099 beschrieben.
Eine Nukleinsäuresequenz kann unter Verwendung von PCR,
wie im US-Patent Nr. 5,545,539 beschrieben, amplifiziert
werden, das eine Verbesserung der grundlegenden Prozedur zur
Amplifizierung einer Targetnukleotidsequenz bereitstellt, indem
eine effektive Menge eines Osmolyts auf Glycinbasis in dem
Amplifikations-Reaktionsgemisch eingeschlossen wird. Die
Verwendung eines Osmolyten auf Glycinbasis verbessert die
Amplifikation von Sequenzen, die viele G und C Reste aufweisen,
und kann deshalb beispielsweise verwendet werden, um
Trinukleotid-Wiederholungssequenzen wie diejenigen zu
amplifizieren, die mit fragilem X-Syndrom (CGG-Wiederholungen)
und myotonische Dystrophie (CTG-Wiederholungen) assoziiert
sind.
Ein Primer kann von einer natürlich vorkommenden
Nukleinsäure hergestellt werden, beispielsweise durch Reinigung
einer Restriktionsverdau der Nukleinsäure, oder kann
synthetisch hergestellt werden. Ein Primer ist in der Lage als
Initiationspunkt der Nukleinsäuresynthese zu wirken, wenn er
untern Bedingungen, die für die Synthese eines Primer-
Verlängerungsprodukts ausreichen, gebracht wird. Besonders
nützliche Primer können spezifisch an die Targetsequenz oder an
Sequenzen, die zur Targetsequenz benachbart sind,
hybridisieren.
Jede spezifische Nukleinsäuresequenz kann mittels PCR
amplifiziert werden. Es ist lediglich notwendig, daß eine
ausreichende Anzahl von Basen an den Enden der Targetsequenz
oder in der Targetsequenz bekannt sind, um so die Präparation
von zwei Oligonukleotid-Primern zu ermöglichen, die an die
Termini der zu amplifizierenden Sequenz und deren Komplement
bei relativen Positionen entlang jeder Sequenz zu
hybridisieren, so daß ein Verlängerungsprodukt, das von einem
Primer synthetisiert wird, wenn es von seinem Template
(Komplement) separiert wird, es als Template zur Verlängerung
des anderen Primers zu einer Nukleinsäure mit definierter Länge
dienen kann. Je größer die Kenntnis über die Basen an beiden
Enden der Sequenz, desto größer kann die Spezifität der Primer
für die Targetnukleinsäure sein und daher, desto größer die
Effizienz des Amplifikationsprozesses. Falls gewünscht, kann
jedoch ein Primer, der spezifisch für ein Ende der
Targetnukleinsäure ist, verwendet werden und ein zweiter Primer
auf Basis einer bekannten Sequenz, die mit dem
gegenüberliegenden Terminus der Targetnuleinsäure verknüpft
ist, für die Amplifikation des komplementären Stranges
verwendet werden.
Ein Primer muss auch lang genug sein, um die Synthese von
Verlängerungsprodukten in der Gegenwart eines
Polymerisationsmittels zu primen. Die genaue Länge des Primers
hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Temperatur,
bei der Hybridisierung und Primerverlängerung durchgeführt
werden soll; der Zusammensetzung der Primer und des verwendeten
Verfahrens. Abhängig von der Komplexität der Targetsequenz,
enthält ein Primer üblicherweise ungefähr 9 bis ungefähr 25
Nukleotide, obwohl er mehr Nukleotide enthalten kann. Im
Vergleich zu längeren Primern benötigen kürzere Primer im
allgemeinen niedrigere Temperaturen, um ausreichend stabile
Hybridkomplexe mit einer Template-Nukleinsäure zu bilden (siehe
Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1989).
Hier offenbarte Primer werden ausgewählt, um im
wesentlichen komplementär zu den unterschiedlichen Strängen von
jeder spezifischen, zu amplifizierenden Sequenz zu sein. Als
solche können die Primer spezifische, mit ihrem entsprechenden
komplementären Strängen unter definierten
Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Eine Primersequenz
muß nicht die exakte Sequenz des Templates wiederspiegeln.
Beispielsweise kann ein nicht komplementäres Nukleotidfragment
an das 5'-Ende des Primers angefügt werden, wobei der Rest der
Primersequenz komplementär zu dem Templatestrang ist. Primer
sollten im allgemeinen eine exakte Komplementarität mit einer
Sequenz aus einer Target-Nukleinsäure, oder einem Komplement
davon aufweisen, so daß eine optimale Amplifikation erhalten
werden kann.
Ein Forward oder ein Reverse Primer kann, falls gewünscht,
eine Nukleotidsequenz eines Promotors, beispielsweise einem
bakteriophagen Promotor, wie einem SP6-, T3- oder T7-Promotor
enthalten. Die Amplifikation einer Target-Nukleinsäuresequenz
mittels eines solchen Primers erzeugt eine amplifizierte
Targetnukleinsäure, die auf operabler Weise mit dem Promotor
verknüpft ist. Eine solche Nukleinsäure kann in einer in vitro
Transkription eingesetzt werden, um die amplifizierte Target-
Nukleinsäuresequenz zu transkribieren. Nukleotidsequenzen des
SP6, T3 und T7 Promotors sind wie folgt dargestellt:
- - SP6 Promotorsequenzen:
5'd(CATACGATTTAGGTGACACTATAG)3' SEQ ID NO: 1;
5'd(ATTTAGGTGACACTATAG)3' SEQ ID NO: 2; - - T3 Promotorsequenz:
5'd(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)3' SEQ ID NO: 3; und - - T7 Promotorsequenz:
5'd(TAATACGACTCACTATAGGG)3' SEQ ID NO: 4.
Ein Primer; der einen Promotor enthalten kann, kann
ebenfalls ein Initations-(ATG)Codon oder das Komplement davon
enthalten, falls geeignet, stromabwärts des Promotors gelegen,
so daß eine Amplifikation der Target-Nukleinsäure zu einer
amplifizierten Targetsequenz führt, die ein ATG-Kodon im Rahmen
mit dem gewünschten Leserahmen enthält. Der Leserahmen kann ein
natürlicher Leserahmen oder jeder andere Leserahmen sein. Wo
das Targetpeptid nicht natürlich existiert, erlaubt eine
operable Verknüpfung des Initiationskodon mit der Nukleinsäure,
die das Targetpolypeptid kodiert, eine Translation des
Targetpolipeptids in den gewünschten Leserahmen.
Ein Forward oder Reverse Primer kann ebenfalls eine
Nukleotidsequenz oder das Komplement einer Nukleotidsequenz
(falls es in dem Reverse Primer vorkommt), die ein zweites
Polypeptid kodiert. Das zweite Polypeptid kann ein
Affinitätspeptid sein, das spezifisch mit einem bestimmten
Reagenz, beispielsweise einem Antikörper, interagiert. Ein
zweites Polypeptid kann ebenfalls einen nicht blockierten und
reaktiven Aminoterminus oder Carboxyterminus besitzen.
Die Fusion eines Peptidanhängsels an ein Targetpolypeptid,
oder ein anderes Polypeptid von Interesse erlaubt die Detektion
und Isolierung des Polypeptids. Ein Targetpolypeptid, das von
einer Target-Nukleinsäure kodiert wird, die an eine Sequenz
fusioniert ist, die ein Peptidanhängsel kodiert, kann aus einer
in vitro Reaktionsmischung mittels eines Reagenzes, das
spezifisch mit dem Peptidanhängsel interagiert, isoliert
werden, anschließend kann das isolierte Targetpolypeptid, wie
hier offenbart, der Massenspektrometrie unterworfen werden. Es
sollte deutlich sein, dass ein isoliertes Targetpolypeptid, das
mit einem Peptidanhängsel oder einem zweiten Polypeptid
fusioniert ist, in einer ausreichend gereinigten Form vorliegt,
um die massenspektrometrische Analyse zu erlauben, da die Masse
des Peptidanhängsels bekannt ist und bei der Bestimmung
berücksichtigt werden kann.
Zahlreiche Peptidanhängsel sowie die
Nukleinsäuresequenzen, die solche Peptidanhängsel kodieren,
üblicherweise in einem Plasmid enthalten, sind bekannt und,
kommerziell erhältlich (z. B. NOVAGEN). Jedes Peptid kann als
Anhängsel verwendet werden, vorausgesetzt, daß ein Reagenz wie
ein Antikörper, der spezifisch mit dem Peptidanhängsel
interagiert, erhältlich ist, oder hergestellt und identifiziert
werden kann. Häufig verwendete Peptidanhängsel schließen ein
myc-Epitop, das eine 10 Aminosäurensequenz aus c-myc enthält
(siehe Ellison et al., J. Biol. Chem. 266: 21 150-21 157 (1991)),
das pFLAG-System (International Biotechnologies, Inc.); das
pEZZ-Protein A-System (Pharmacia); ein 16 Aminosäure
Peptidanteil des Haemophilus influenza Hemagglutinin Proteins,
ein Gluthathion-S-Transferase-(GST)-Protein sowie ein His-6-
Peptid ein. Reagenzien, die spezifisch mit einem
Peptidanhängsel interagieren, sind ebenfalls bekannt und einige
sind kommerziell erhältlich und schließen Antikörper und
verschiedene andere Moleküle, in Abhängigkeit von dem
Anhängsel, beispielsweise Metall-Ionen wie Nickel- oder Cobalt-
Ionen ein, die spezifisch mit einem Polyhistidinpeptid wie His-
6 interagieren, oder Glutathion, das zu einem festen Träger,
wie Agarose, konjugiert werden kann und spezifisch mit GST
interagiert.
Ein zweites Polypeptid kann ebenfalls designed werden, um
als Massenmodifikator des Targetpolypeptids, das von der
Target-Nukleinsäure kodiert wird, zu dienen. Demzufolge kann
die Masse eines Targetpolypeptid modifiziert werden, indem ein
das Targetpolypeptid kodierendes RNA-Molekül translatiert wird,
das auf operable Weise mit einer die Masse modifizierenden
Aminosäuresequenz verknüpft ist, wobei die massenmodifizierende
Sequenz am Aminoterminus oder am Carboxyterminus des
Fusionspolypeptids sich befinden kann. Die Modifikation der
Masse des Polypeptids, das von der Target-Nukleinsäure
abgeleitet ist, ist beispielsweise nützlich, wenn verschiedene
Peptide in einer einzigen massenspektrometischen Analyse
analysiert werden, da die Massenmodifikation die Auflösung
eines Massenspektrums erhöhen kann und die Analyse von zwei
oder mehreren unterschiedlichen Targetpolypeptiden durch
Multiplexing erlaubt.
Eine Massenmodifikation schließt Modifikationen wie die
Zugabe eines Peptids oder Peptidfragments zu dem
Targetpolypeptid ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Beispielsweise kann ein Targetpolypeptid massenmodifiziert
werden, indem das Targetpolypeptid translatiert wird, um
zusätzliche Aminosäuren wie Polyhistidin, Polylysin oder
Polyarginin einzuschließen. Diese Modifikationen dienen nicht
nur als Hilfe bei der massenspektrometrischen Analyse, sondern
können ebenfalls bei der Reinigung, Identifikation und
Immobilisierung helfen. Die Modifikationen können
posttranslational hinzugefügt werden oder können in die
Nukleinsäure eingeführt werden, die das sich ergebende
Polypeptid kodiert.
Wo eine Vielzahl von Targetpolypeptiden differentiell
massenmodifiziert werden soll, kann darüber hinaus jedes
Polypeptid in der Vielzahl mittels einer unterschiedlichen
Polyhistidinsequenz, beispielsweise His-4, His-5, His-6 usw.
massenmodifiziert werden. Die Verwendung einer solchen die
Masse modifizierenden Einheit stellt den weiteren Vorteil
bereit, daß die Einheit als Peptidanhängsel wirkt, was
beispielsweise zur Isolierung des damit verknüpften
Targetpolypeptids hilfreich sein kann.
Ein Vorteil der obigen Verfahren ist, daß sie erlauben,
daß ein Mulitplexing mit einer Vielzahl von Polypeptiden
durchgeführt werden kann und deshalb nützlich sind, um die
Aminosäuresequenzen von jedem der Vielzahl von Polypeptiden,
insbesondere einer Vielzahl von Targetpolypeptiden zu
bestimmen.
Es können mehr als eine Target-Nukleinsäure in derselben
Reaktion mittels verschiedener Primerpaare amplifiziert werden,
wobei jedes Paar eine unterschiedliche Target-
Nukleinsäuresequenz, in einer Mischung aus Ausgangs-
Nukleinsäuren amplifiziert. Die Amplifikation kann simultan
durchgeführt werden, vorausgesetzt, daß die Annealing-
Temperatur von allen Primerpaaren ausreichend ähnlich ist, oder
kann sequentiell durchgeführt werden, wobei mit dem ersten Paar
von Primern, das die niedrigste Annealing-Temperatur von
verschiedenen Primerpaaren aufweist, begonnen wird,
anschließend, nach Amplifikation der ersten Target-
Nukleinsäure, ein zweites Primerpaar, das eine höhere
Annealingtemperatur aufweist, hinzugefügt wird, und die zweite
Amplifikation bei der höheren Temperatur durchgeführt wird,
usw.. Individuelle Reaktionen mit unterschiedlichen
Primerpaaren können ebenfalls durchgeführt werden, anschließend
können die Reaktionsprodukte vereinigt werden. Die Verwendung
solcher Verfahren stellt ein Mittel zur simultanen Bestimmung
der Identität von mehr als einer allelischen Variante einer
oder mehrerer polymorpher Regionen von einem oder mehreren
Genen oder genetischen Läsionen bereit.
Ein Primer, beispielsweise der Forward Primer kann
ebenfalls regulatorische Sequenzelemente, die zur Translation
von RNA in einem prokaryontischen oder eukaryontischen System
erforderlich ist, enthalten. Wo es wünschenswert ist, eine
Translation in einem prokaryontischen Translationssystem
durchzuführen, kann der Primer insbesondere eine
prokaryontische ribosomale Bindungsstelle (Shine-Dalgarno-
Sequenz) enthalten, die stromabwärts der Promotorsequenz und
ungefähr 5 bis 10 Nukleotide stromaufwärts des
Initiationskodons angeordnet ist. Eine prokaryontische
ribosomale Bindungsstelle kann beispielsweise die
Nukleotidsequenz TAAGGAGG (SEQ ID NO: 5) besitzen.
Ein Primer, im allgemeinen der Reverse Primer, kann
ebenfalls eine Sequenz enthalten, die ein Stopcodon in einem
oder mehreren Leserahmen kodiert, um eine geeignete Termination
des Targetpolypeptids sicherzustellen. Darüber hinaus können,
indem in den reversen Primer Sequenzen eingebaut werden, die
drei Stopcodons kodieren, in einem von jedem der drei möglichen
Leserahmen, gegebenenfalls durch einige Reste separiert,
zusätzliche Mutationen, die stromabwärts (3') von einer
Mutation auftreten, die andernfalls zu einer prämaturen
Termination des Polypeptide führt, detektiert werden.
Zur Präparation der Primer für den Amplifikationsprozess
können die Nukleotidsequenzen von zahlreichen Target-
Nukleinsäuren von GenBank oder aus relevanten
Zeitschriftenartikeln, Patenten oder veröffentlichten
Patentanmeldungen erhalten werden. Oligonukleotidprimer können
mittels jeder geeigneter Methode, einschließlich beispielsweise
organischer Synthese einer Nukleinsäure aus Nukleosidderivaten
hergestellt werden, und kann in Lösung oder auf einem festen
Träger durchgeführt werden. Beispielsweise ist die
Phosphortriester-Methode eingesetzt worden, um Genfragmente
oder kurze Gene herzustellen. Bei der Phosphortriester-Methode
werden Oligonukleotide hergestellt, anschließend miteinander
verbunden, um längere Nukleinsäuren zu bilden (siehe Narang et
al., Meth. Enzymol. 68: 90 (1979); US-Patent Nr. 4,356,270).
Primer können ebenfalls, wie im US-Patent Nr. 5,547,835; US-
Patent Nr. 5,605,798 oder US-Patent Nr. 5,622,824 beschrieben,
synthetisiert werden.
Die Primer zur Amplifikation werden so ausgewählt, daß die
Amplifikationsreaktion eine Nukleinsäure erzeugt, die nach
Transkription und Translation zu einem nicht natürlich
auftretenden Polypeptid führen kann, beispielsweise einem
Polypeptid, das durch einen offenen Leserahmen kodiert wird,
der nicht der offene Leserahmen ist, der das natürliche Protein
kodiert. Demzufolge kann durch geeignetes Primerdesign,
insbesondere durch Aufnahme eines Initiationskodons in den
gewünschten Leserahmen, und falls vorhanden, stromabwärts eines
Promotors in dem Primer, kann ein Polypeptid, das von einer
Target-Nukleinsäure hergestellt wird, durch einen der zwei
nicht kodierenden Leserahmen der Nukleinsäure kodiert werden.
Eine solche Methode kann verwendet werden, um Stopcodons aus
dem Leserahmen zu verschieben, die das Protein verkürzen vor
der Maturierung und relevante Aminosäuren ausschließen, oder,
um ein Polypeptid, das eine Aminosäurewiederholung enthält,
löslicher zu machen.
Ein nicht natürlich vorkommendes Targetpolypeptid kann
ebenfalls durch eine 5' oder 3' nicht kodierende Region einer
Exon-Region einer Nukleinsäure kodiert werden; durch ein
Intron; oder durch ein regulatorisches Element wie eine
Promotorsequenz, die in einem der sechs Rahmen (drei Rahmen pro
Strang) zumindest ein Teil eines offenen Leserahmens enthält.
Bei diesen Situatioen enthält ein Primer zur Amplifikation der
Target-Nukleinsäure einen Promotor und ein Initiationscodon, so
daß die amplifizierte Nukleinsäure transkribiert und in vitro
translatiert werden kann. Daher erlaubt ein wie hier
offenbartes Verfahren zur Bestimmung der Identität eines
Targetpolypeptids die Bestimmung der Identität einer
Nukleotidsequenz, die in jedem Bereich eines Chromosoms
lokalisiert ist, vorausgesetzt, daß ein Polypeptid von
zumindest 2 Aminosäuren, üblicherweise zumindest 3 oder 4
Aminosäuren, insbesondere zumindest 5 Aminosäuren durch einen
der sechs Leserahmen des Polynukleotids kodiert wird.
Für die massenspektrometrische Analyse kann ein
Targetpolypeptid, oder ein anderes interessierendes Polypeptid,
auf einem festen Träger konjugiert und darauf immobilisiert
werden, um die Manipulation des Polypeptids zu erleichtern.
Solche Träger sind dem Fachmann wohlbekannt und schließen jede
Matrix ein, die als fester Träger zur Verknüpfung von Proteinen
verwendet wird. Der Träger wird so ausgewählt, dass er
undurchlässig gegenüber den Bedingungen der
massenspektrometrischen Analyse ist. Träger, die eine flache
Oberfläche oder eine Oberfläche mit Strukturen aufweisen
können, schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt,
Kügelchen wie Silicagel-Kügelchen, Glaskügelchen mit
kontrollierten Poren, magnetische Kügelchen, Dynabeads, Wang-
Harz, Merrifield-Harz, SEPHADEX/SEPHAROSE-Kügelchen oder
Cellulose-Kügelchen; Kapillaren, ebene Träger wie Glasfaser-
Filter, Glasoberflächen, Metalloberflächen (einschließlich
Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Silicium und Kupfer),
Plastikmaterialien (einschließlich Platten mit
Mehrfachvertiefungen oder Membranen (die beispielsweise aus
Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid
gebildet werden), Wafer, Kämme, Stifte oder Nadeln
(einschließlich Anordnungen von Stiften, die für die
kombinatorische Synthese oder Analyse geeignet sind) oder
Kügelchen in einer Raster von Grübchen, Vertiefungen,
insbesondere Nanoliter-Vertiefungen in flachen Oberflächen,
einschließlich Wafer, wie Siliciumwafer; und Wafer mit
Vertiefungen mit oder ohne Filterboden. Ein fester Träger wird
auf geeignete Weise für die Konjugation des Polypeptids
funktionalisiert und kann jede für den Träger geeignete Form
aufweisen.
Ein fester Träger wie ein Kügelchen kann für die
Immobilisierung von Polypeptiden funktionalisiert werden, und
das Kügelchen kann weiter mit dem festen Träger, falls
gewünscht, assoziiert werden. Wenn ein Kügelchen an ein
zweiten, festen Träger konjugiert werden soll, können
Polypeptide auf dem funktionalisierten Träger vor, während oder
nachdem das Kügelchen mit dem zweiten Träger konjugiert wird,
immobilisiert werden.
Ein interessierendes Polypeptid kann direkt an einen
festen Träger konjugiert werden oder kann indirekt durch eine
funktionelle Gruppe konjugiert werden, die entweder auf dem
Träger vorkommt oder durch einen Linker, der an dem Träger
angefügt ist, oder dem Polypeptid, oder beidem. Beispielsweise
kann ein Polypeptid auf einem festen Träger aufgrund einer
hydrophoben, hydrophilen oder ionischen Interaktion zwischen
dem Träger und dem Polypeptid immobilisiert werden. Obwohl eine
solche Methode nützlich für gewisse Manipulationen, wie der
Konditionierung des Polypeptids vor der Massenspektrometrie
ist, ist eine solche direkte Interaktion dahingehend limitiert,
daß die Orientierung des Polypeptids nicht bekannt ist, und auf
Basis der Position der interagierenden Aminosäuren,
beispielsweise hydrophober Aminosäuren in dem Polypeptid,
zufällig sein kann. Daher wird ein Polypeptid im allgemeinen
durch Konjugation durch eine funktionelle Gruppe entweder auf
den festen Träger oder dem Polypeptid oder beidem, in einer
definierten Orientierung immobilisiert.
Ein interessierendes Polypeptid kann modifiziert werden,
indem eine geeignete funktionelle Gruppe an dem Carboxyterminus
oder Aminoterminus des Polypeptids oder an einer Aminosäure in
dem Peptid, beispielsweise an eine reaktive Seitenkette oder
dem Peptidrückgrat, angefügt wird. Es sollte allerdings
deutlich sein, daß eine natürlich vorkommende Aminosäure, die
üblicherweise in dem Polypeptid vorkommt, ebenfalls eine
funktionelle Gruppe enthalten kann, die zur Konjugation des
Polypeptids mit den festen Träger geeignet ist. Beispielsweise
kann ein Cysteinrest, der in dem Polypeptid vorkommt, verwendet
werden, um das Polypeptid mit einem festen, eine
Sulfhydrylgruppe enthaltenden Träger zu konjugieren,
beispielsweise einem Träger, der durch einen Disulfid-Linker
daran angeheftete Cysteinreste aufweist. Andere Bindungen, die
zwischen zwei Aminosäuren ausgebildet werden können, schließen
beispielsweise ein Monosulfidbindungen zwischen zwei
Lanthioninresten, welche nicht natürlich vorkommende
Aminosäuren sind, die in ein Polypeptid eingebaut werden
können; eine Lactambindung, die durch eine
Transamidierungsreaktion zwischen den Seitenketten einer sauren
Aminosäure und einer basischen Aminosäure gebildet wird, wie
zwischen der γ-Carboxylgruppe von Glu (oder der β-
Carboxylgruppe von Asp) und der ε-Aminogruppe von Lys; oder
eine Lactonbindung, die beispielsweise durch eine Vernetzung
zwischen der Hydroxygruppe von Ser und der γ-Carboxylgruppe von
Glu (oder β-Carboxylgruppe von Asp) gebildet wird. Daher kann
ein fester Träger modifiziert werden, um einen gewünschten
Aminosäurerest, beispielsweise einen Glu-Rest zu enthalten, und
ein Polypeptid mit einem Ser-Rest, insbesondere einem Ser-Rest
an dem Carboxyterminus oder Aminoterminus, kann mit dem festen
Träger durch die Bildung einer Lactonbindung konjugiert werden.
Es sollte jedoch deutlich sein, daß der Träger nicht
modifiziert zu werden braucht, um die bestimmte Aminosäure,
beispielsweise Glu, zu enthalten, wo es gewünscht wird, eine
lactonartige Bindung mit einem Ser in einem Polypeptid zu
bilden, sondern kann anstelle dessen modifiziert werden, um
eine zugängliche Carboxylgruppe zu enthalten, wodurch eine
Funktion bereitgestellt wird, die der γ-Gruppe von Glu
entspricht.
Ein interessierendes Polypeptid kann ebenfalls modifiziert
werden, um die Konjugation an einem festen Träger zu
erleichtern, beispielsweise durch Einbau einer chemischen oder
physikalischen Einheit an einer geeigneten Position in dem
Polypeptid, im allgemeinen dem C-Terminus oder N-Terminus. Der
Fachmann erkennt allerdings, daß eine solche Modifikation,
beispielsweise der Einbau einer Biotin-Einheit, die Fähigkeit
des jeweiligen Reagenzes beeinflussen kann, spezifisch mit dem
Polypeptid zu interagieren und wird demzufolge, falls relevant,
diesen Faktor bei der Auswahl berücksichtigen, wie ein
interessierendes Polypeptid am besten zu modifizieren ist.
In einem Aspekt der hier bereitgestellten Verfahren kann
ein interessierendes Polypeptid kovalent mit einem festen
Träger konjugiert werden, und das immobilisierte Polypeptid
kann verwendet werden, ein Targetpolypeptid einzufangen, das
das immobilisierte Polypeptid bindet. Das Targetpolypeptid kann
anschließend von dem immobilisierten Polypeptid für die
Massenspektrometrie durch Ionisation oder Verflüchtigung
freigesetzt werden, während das kovalent konjugierte Polypeptid
an den Träger gebunden bleibt.
Demzufolge wird ein Verfahren zur Bestimmung der Identität
von Polypeptiden bereitgestellt, die spezifisch mit einem
interessierenden Polypeptid interagieren. Beispielsweise kann
ein solches Verfahren verwendet werden, um die Identität von
Targetpolypeptiden zu bestimmen, die aus einer oder mehreren
biologischen Proben erhalten werden, die spezifisch mit dem
immobilisierten, interessierenden Polypeptid interagieren. Ein
solches Verfahren kann beispielsweise ebenfalls verwendet
werden, um die Identität von Bindungsproteinen wie Antikörper,
die an das immobilisierte Polypeptid-Antigen von Interesse
binden oder Rezeptoren, die an immobilisierte
Polypeptidliganden von Interesse binden, oder dergleichen zu
bestimmen. Ein solches Verfahren kann beispielsweise verwendet
werden, um eine kombinatorische Bibliothek von modifizierten
Targetpolypeptiden wie modifizierten Antikörpern, Antigenen,
Rezeptoren, Hormonen oder anderen Polypeptiden zu screenen, um
die Identität von solchen Targetpolypeptiden zu bestimmen, die
spezifisch mit dem immobilisierten Polypeptid interagieren.
In einem Aspekt der hier bereitgestellten Verfahren kann
ein Polypeptid von Interesse kovalent an einen festen Träger
konjugiert werden und das immobilisierte Polypeptid kann
verwendet werden, um ein Targetpolypeptid einzufangen, das das
immobilisierte Polypeptid bindet. Das Targetpolypeptid kann
anschließend von dem immobilisierten Polypeptid für die
Massenspektrometrie durch Ionisation oder Verflüchtigung
freigesetzt werden, während das kovalent konjugierte Polypeptid
an den Träger gebunden bleibt.
Demzufolge wird ein Verfahren bereitgestellt, um die
Identität von Polypeptiden zu bestimmen, die mit einem
Polypeptid von Interesse interagieren. Beispielsweise kann ein
solches Verfahren verwendet werden, um die Identität von
Targetpolypeptiden zu bestimmen, die aus einer oder mehrerer
biologischer Proben erhalten werden, die spezifisch mit dem
immobilisierten Polypeptid von Interesse interagieren. Ein
solches Verfahren kann ebenfalls verwendet werden, um
beispielsweise die Identität von Bindungsproteinen wie
Antikörper, die an das immobilisierte Polypeptid-Antigen von
Interesse binden, oder Rezeptoren, die an einen immobilisierten
Polypeptidliganden von Interesse binden, oder dergleichen zu
bestimmen. Solch ein Verfahren kann eingesetzt werden, um
beispielsweise eine kombinatorische Bibliothek von
modifizierten Targetpolypeptiden, wie modifizierte Antikörper,
Antigene, Rezeptoren, Hormone oder andere Polypeptide zu
screenen, um die Identität derjenigen Polypeptide zu bestimmen,
die spezifisch mit dem immobilisierten Polypeptid interagieren.
Ein Polypeptid von Interesse kann mit einem festen Träger
konjugiert werden, der auf Basis der Vorteile ausgewählt werden
kann, die bereitgestellt werden können. Die Konjugation eines
Polypeptids an einen Träger bietet beispielsweise den Vorteil,
daß ein Träger einen relativ großen Oberflächenbereich zur
Immobilisierung von Polypeptiden aufweist. Ein Träger wie ein
Kügelchen kann jede dreidimensionale Struktur besitzen,
einschließlich einer Oberfläche, auf die ein Polypeptid,
funktionelle Gruppe oder ein anderes Molekül angeheftet werden
kann. Falls gewünscht kann ein Träger wie ein Kügelchen, das
zusätzliche Charakteristikum haben, daß es weiterhin mit einem
unterschiedlichen festen Träger konjugiert werden kann,
beispielsweise an die Wände eines Kapillarröhrchens. Ein für
die offenbarten Verfahren oder Kits verwendbarer Träger besitzt
üblicherweise eine Größe im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr
100 µm im Durchmesser; kann aus jedem unlöslichen oder festen
Material, wie oben offenbart, hergestellt werden, und kann ein
quellfähiges Kügelchen, beispielsweise ein Polymerkügelchen wie
ein Wang-Harz oder ein nicht quellfähiges Kügelchen wie ein
Glas mit kontrollierten Poren sein.
Eine feste Oberfläche kann ebenfalls modifiziert werden,
um die Konjugation eines Polypeptids von Interesse zu
erleichtern. Eine thiolreaktive Funktionalität ist besonders
nützlich, um ein Polypeptid mit einem festen Träger zu
konjugieren. Eine thiolreaktive Funktionalität ist eine
chemische Gruppe, die rasch mit einer nukleophilen Thiolgruppe
reagieren kann, um eine kovalente Bindung, beispielsweise eine
Disulfidbindung oder eine Thioetherbindung, zu erzeugen. Im
allgemeinen sind Thiolgruppen gute Nukleophile und daher sind
thiolreaktive Funktionalitäten im allgemeinen reaktive
Elektrophile. Eine Vielzahl von thiolreaktiven Funktionalitäten
sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich
beispielsweise Haloacetyle, wie Iodacetyl; Diazoketone,
Epoxyketone, α- und β-ungesättigte Carbonyle wie α-Enone und β-
Enone; und andere reaktive Michael-Akzeptoren wie Maleinimid,
Säurehalogene, Benzylhalogene und dergleichen. Eine freie
Thiolgruppeeines Disulfides kann beispielsweise mit einer
freien Thiolgruppe durch Ausbildung einer Disulfidbindung,
einschließlich eines Disulfidaustausches, reagieren. Die
Reaktion einer Thiolgruppe kann temporär durch Blockierung mit
einer geeigneten Schutzgruppe, wie sie im Stand der Technik
üblich ist (siehe Greene und Wuts "Protective Groups in Organic
Synthesis" 2. Aufl. (John Wiley & Sons 1991)) verhindert werden.
Reduktionsmittel, die zur Reduktion eines eine
Disulfidbindung enthaltenden Polypeptids verwendbar sind,
schließen Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) ein, das
üblicherweise in einer Konzentration von ungefähr 1 bis 100 mM,
üblicherweise ungefähr 10 mM verwendet wird, und bei einem pH
von ungefähr 3 bis 6, üblicherweise ungefähr pH 4,5, einer
Temperatur von ungefähr 20°C bis 45°C, üblicherweise 37°C, für ungefähr
1 bis 10 Stunden, üblicherweise ungefähr 5 Stunden umgesetzt
wird; Dithiothreitol, das im allgemeinen in einer Konzentration
von 25 bis 100 mM und bei einem pH von ungefähr 6 bis 10
umgesetzt wird, üblicherweise ungefähr pH 8, einer Temperatur
von ungefähr 25°C bis 45°C, üblicherweise ungefähr 37°C, für
ungefähr 1 bis 10 Stunden, üblicherweise ungefähr 5 Stunden
eingesetzt wird. TCE bietet dahingehend einen Vorteil, das es
bei niedrigem pH reaktiv ist, was Thiole effektiv protoniert,
wodurch nukleophile Reaktionen von Thiolen unterdrückt, und
deshalb zu weniger Nebenreaktionen als mit anderen
Disulfidreduktionsmitteln führt.
Eine thiolreaktive Funktionalität wie
3-Mercaptopropyltriethoxysilan kann verwendet werden, um eine
Siliciumoberfläche mit Thiolgruppen zu funktionalisieren. Die
aminofunktionalisierte Siliciumoberfläche kann anschließend mit
einem heterobifunktionellen Reagenz wie N-Succinimidyl(4-
iodacetyl)aminobenzoat (STAB) (Pierce; Rockford IL) umgesetzt
werden. Falls gewünscht, können die Thiolgruppen mit einer
photospaltbaren Schutzgruppe blockiert werden, die anschließend
beispielsweise durch Photolitographie selektiv abgespalten
werden kann, um Bereiche einer Oberfläche zur Immobilisierung
eines interessierenden Polypeptids bereitzustellen.
Photospaltbare Schutzgruppen sind im Stand der Technik bekannt
(siehe beispielsweise die veröffentlichte internationale PCT-
Anmeldung Nr. WO 92/10092; McCray et al., Ann. Rev. Biophys.
Chem. 18: 39-270 (1989)) und können durch Bestrahlung von
ausgewählten Bereichen der Oberfläche beispielsweise mittels
einer Photolitographie-Maske selektiv deblockiert werden.
Wie hier erläutert, kann das Polypeptid entweder direkt an
den Träger oder mittels einer Verknüpfungseinheit oder
-einheiten verbunden werden. Es kann jeder Träger, von dem der
Fachmann weiß, das er zur Verknüpfung von Peptiden oder
Aminosäuren mit Trägern geeignet ist, entweder direkt oder
mittels eines Spacers, verwendet werden. Linker schließen Rink-
Amidlinker (siehe beispielsweise Rink (1976) Tetrahedron
Letters 28: 787), Tritylchloridlinker (siehe z. B., Leznoff
(1978) ACe. Chem. Res. 1: 27), Merrifield-Linker (siehe
beispielsweise, Bodansky et al. 1976) Peptide Synthesis,
Academic Press, 2. Auflage, New York) ein. Beispielsweise sind
Trityllinker bekannt (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,410,068 und
US-Patent Nr. 5,612,474). Aminotrityllinker (siehe Fig. 3)
sind ebenfalls bekannt (siehe zum Beispiel US-Patent Nr.
5,198,531). Linker, die geeignet sind, Peptide chemisch mit
Trägern zu verbinden, schließen Disulfidbindungen,
Thioetherbindungen, gehinderte Disulfidbindungen und kovalente
Bindungen zwischen freien reaktiven Gruppen wie Amin- und
Thiolgruppen ein. Diese Bindungen können mittels
heterobifunktioneller Reagenzen hergestellt werden, um reaktive.
Thiolgruppen auf einem oder beiden Polypeptiden zu erzeugen und
anschließend die Thiolgruppen auf einem Polypeptid mit
reaktiven Thiolgruppen oder Amingruppen auf dem anderen zu
reagieren. Andere Linker schließen ein säurespaltbare Linker
wie Bismaleinimideothoxypropan, säurelabile Transferrin-
Konjugate und Adipinsäuredihydrazide, die in saureren
intrazellulären Kompartimenten gespalten werden photospaltbare
Quervernetzer, die durch sichtbares oder UV-Licht gespalten
werden, RNA-Linker, die durch Ribozyme oder andere RNA-Enzyme
spaltbar sind, sowie Linker, wie die verschiedenen Domänen wie
CH1, CH2 und CH3 der konstanten Region von humanem IgG1 (siehe
Batra et al (1993) Molecular Immunol. 30: 379-386).
Es kann jeder Linker, der dem Fachmann für die
Immobilisierung eines Polypeptids mit einem festen Träger
bekannt ist, in einem hier offenbarten Verfahren verwendet
werden. Kombinationen von beliebigen Linkem werden hier
ebenfalls betrachtet. Beispielsweise kann ein Linker wie eine
Silylverbindung, der unter massenspektrometrischen Bedingungen
spaltbar ist, oder eine photospaltbare Verbindung kombiniert
werden mit einem Linker wie eine Avidin-Biotin-Verknüpfung, die
unter diesen Bedingungen nicht gespalten wird, jedoch unter
anderen Bedingungen gespalten werden kann.
Ein Polypeptid von Interesse kann direkt mit einem Träger
oder mittels eines Linkers verbunden werden. Beispielsweise
kann das Polypeptid mit einem Träger wie einem Kügelchen
mittels eines variablen Spacers konjugiert werden. Darüber
hinaus kann die Konjugierung direkt spaltbar sein,
beispielsweise durch eine photospaltbare Verbindung wie eine
Streptavidin oder Avidin zu Biotin Wechselwirkung, die mittels
eines Lasers gespaltet werden kann, wie es bei der
Massenspektrometie geschieht, oder indirekt durch einen
photospaltbaren Linker (siehe US-Patent Nr. 5,643,722) oder
einen säurelabilen Linker, wärmeempfindlichen Linker,
enzymatisch spaltbaren Linker oder einen anderen solcher
Linker.
Ein Linker kann eine reversible Verbindung bereitstellen,
so daß diese unter den Bedingungen der Massenspektrometrie
gespalten wird. Ein solcher Linker kann beispielsweise eine
photospaltbare Bindung wie ein Ladungstransferkomplex oder eine
labile Bindung, die zwischen relativ stabilen organischen
Resten gebildet wird, sein. Ein Linker (L) an einem Polypeptid
kann eine Verbindung, die im allgemeinen eine temporäre
Verbindung ist, mit einer zweiten funktionellen Gruppe (L') auf
dem festen Träger erzeugen. Wenn das Polypeptid von Interesse
eine negative Nettoladung besitzt oder konditioniert ist, um
eine solche Ladung aufzuweisen, kann die Verbindung, die mit L'
gebildet wird, des weiteren beispielsweise eine quaternäre
Ammoniumgruppe sein. In diesem Fall trägt die Oberfläche des
festen Trägers eine negative Ladung, die das negativ geladene
Polypeptid abstößt, wodurch die Desorption des Polypeptids für
die massenspektrometrische Analyse erleichtert wird. Die
Desorption kann aufgrund der Wärme geschehen, die von einem
Laserpuls erzeugt wird, oder, wenn L' ein Chromophor ist, durch
spezifische Absorption von Laserenergie, die sich in Resonanz
mit dem Chromophor befindet.
Eine Verbindung (L-L') kann beispielsweise eine
Disulfidbindung sein, die chemisch durch Mercaptoethanol oder
Dithioerythrol spaltbar ist; eine Biotin-/Streptavidin-Bindung,
die photospaltbar sein kann; ein heterobifunktionelles Derivat
einer Tritylethergruppe, die durch Exposition zu sauren
Bedingungen oder unter Bedingungen der Massenspektrometrie
gespalten werden kann (Köster et al., "A Versatile Acid-Labile
Linker for Modification of Synthetic Biomolecules," Tetrahedron
Lett. 31: 7095 (1990)), eine Lävulinyl-vermittelte Bindung, die
unter annähernd neutralen Bedingungen mit einem Hydrazin-
/Acetat-Buffer gespaltet werden kann, eine Arginin-Arginin-
oder eine Lysin-Lysin-Bindung, von jede durch eine
Endopeptidase wie Trypsin gespalten werden kann, eine
Pyrophosphatbindung, die durch eine Pyrophosphatase gespalten
werden kann; oder eine Ribonukleotidbindung, die mittels einer
Ribonuklease oder durch Exposition zu alkalischen Bedingungen
gespalten werden kann.
Die Funktionalitäten L und L' können ebenfalls einen
Ladungstransferkomplex ausbilden, wodurch eine temporäre L-L'-
Verbindung gebildet wird. Da das "Ladungstransferband" durch
UV/vis-Spektrometrie bestimmt werden kann (siehe Foster,
"Organic Charge Transfer Complexes" (Academic Press 1969))
kann die Laserenergie auf die korrespondierende Energie der
Ladungstransfer-Wellenlänge eingestellt werden und die
spezifische Desorption von dem festen Träger kann initiiert
werden. Es ist klar, daß verschiedenen Kombinationen von L und
L' diesem Zweck dienen können, und daß die Donor-Funktionalität
sich auf dem festen Träger befinden kann, oder an das zu
detektierende Polypeptid gekoppelt sein kann, oder umgekehrt.
Eine reversible L-L'-Verbindung kann ebenfalls erzeugt
werden, indem relativ stabile Radikale homolytisch gebildet
werden. Unter dem Einfluß eines Laserpulses kann die Desorption
sowie Ionisation an der radikalischen Position stattfinden.
Verschiedene organische Radikale können so ausgewählt werden,
daß in Relation zu der Dissoziationsenergie, die erforderlich
ist, um die Bindung zwischen den Radikalen homolytisch zu
spalten, eine korrespondierende Laserwellenlänge ausgewählt
werden kann (siehe Wentrup, "Reactive Molecules" (John Wiley &
Sons 1984)).
Andere Linker schließen diejenigen ein, die in
Fusionsproteine eingebaut und in einer Wirtszelle expremiert
werden können. Solche Linker können ausgewählte Aminosäuren,
Enzymsubstrate oder jedes geeignete Peptid sein. Der Linker
kann beispielsweise durch geeignete Auswahl von Primern
hergestellt werden, wenn die Nukleinsäure isoliert wird.
Alternativ dazu können sie durch posttranslationale
Modifikation des interessierenden Proteins hinzugefügt werden.
Inbesondere sind selektiv spaltbare Linker, einschließlich
photospaltbarer Linker, säurespaltbarer Linker; säurelabiler
Linker und wärmeempfindlicher Linker verwendbar. Säurespaltbare
Linker schließen beispielsweise Bismaleimideothoxypropan ein,
Adipinsäuredihydrazid-Linker (siehe Fattom et al., Infect.
Immun. 60: 584-589 (1992)) sowie säurelabile Transferrin-
Konjugate, die einen ausreichenden Anteil an Transferrin
enthalten, um den Eintritt in den intrazellulären Transferrin-
Cycling-Pathway zu ermöglichen (siehe Welhöner et al., J. Biol.
Chem. 266: 4309-4314 (1991)).
Fig. 2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform des
Verfahrens des orthogonalen Einfangens, Spalten und MALDI-
Analyse eines Peptids. Diese Ausführugsform demonstriert das
Einfangen durch den Aminoterminus des Peptids. Wie gezeigt,
wird das Polypeptid auf einer Oberfläche eines Trägers durch
die Verwendung einer Diisopropylsilyldiethergruppe eingefangen.
Andere Silyldiethergruppen, einschließlich Diallkylsilyl,
Diarylsilyl und Alkylarylsilyl, können ebenfalls verwendet
werden, sind jedoch darauf nicht beschränkt. Reaktionen einer
hydroxylierten Trägeroberfläche mit Diisopropylsilylchlorid und
einem Hydroxyester stellt die Ausgangsoberfläche, die mit
Diisopropylsilyldietherester gebunden ist, bereit.
Unter Bezugnahme auf die Figur ist R3 jede
Verknüpfungseinheit, die von einem Träger stammt, der für die
Verknüpfung mit einer Derivatisierungsgruppe derivatisiert
wurde, die eine zur Reaktion verfügbare Hydroxylgruppe
aufweist. R3 kann ebenfalls eine Verknüpfung wie Biotin-
Streptavidin oder Biotin-Avidin sein. R3 schließt Gruppen wie
Polyethylenglycol (PEG), eine Alkylen- oder eine Arylengruppe
ein.
Die hydroxylierte Trägeroberfläche kann mittels Verfahren,
die dem Fachmann wohlbekannt sind, hergestellt werden. Zum
Beispiel N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat (SIAB). Andere
Mittel als Linker (R3) schließen ein Dimaleimid, Dithio-bis-
nitrobenzoesäure (DTNB), N-Succinimidyl-S-acetyl-thioacetat
(SATA), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP),
Succinimidyl-4-(N-Maleimidmethyl)cyclohexan-1-carboxylat
(SMCC), ist jedoch nicht auf diese beschränkt. 6-
Hydrazinonicotimid (HYNIC) kann ebenfalls in dem neuen
Verfahren verwendet werden. Für weiter Beispiele von
Vernetzungsmitteln siehe beispielsweise Wong "Chemistry of
Protein Conjugation and Cross-Linking", CRC Press (1991) und
Hermanson, "Bioconjugate Techniques" Academic Pres (1995).
Hydroxyester, die verwendet werden können, schließen ein
Hydroxyacetat (Glycolat), α-, β-, γ-, . . . ω-Hydroxyalkanoate,
ω-Hydroxy(polyethylenglycol)COOH, Hydroxybenzoate,
Hydroxyarylalkanoate sowie Hydroxyalkylbenzoate, sind jedoch
nicht darauf beschränkt. Unter Bezugnahme auf Fig. 2 kann
deshalb R4 jede divalente Gruppe sein, die eine Länge von 2
oder mehr Bindungen aufweist, so wie (CH2)n, worin n 2 oder
größer ist, und Polyethylenglycol. Der derivatisierte Träger
wird anschließend mit dem gewünschten Peptid umgesetzt, um das
Peptid auf den Träger unter Verlust von R1OH, einzufangen. In
Ausführungsformen, in denen COOR1 eine aktive Estergruppe ist,
kann das Peptid direkt mit der Estergruppe umgesetzt werden. In
diesen bevorzugten Ausführungsformen wird R1 von Gruppen wie N-
Succinimidyl, Natrium-3-sulfo-N-succinimidyl und 4-Nitrophenyl
ausgewählt, ist jedoch nicht darauf beschränkt. In anderen
Ausführungsformen wird der Ester verseift, zum Beispiel mit
Hydroxid, um die entsprechende Säure zu erhalten. Diese Säure
wird anschließend mit dem Aminoterminus des Peptids unter
Standardbedingungen zur Peptidkopplung gekoppelt (z. B. 1-(3-
Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) und
N-Hydroxysuccinimid (NHS). Das eingefangene Peptid wird
anschließend mittels Reaktion mit einem Enzym oder einem
Reagenz, das für eine vorgegebene Amidbindung des Peptids
spezifisch ist, verkürzt (fragmentiert). Die Spaltung des
verkürzten ein N-terminales Fragment des Originalpeptids
enthaltenden Peptids von dem Träger wird anschließend durch
Reaktion mit milder Säure erreicht. Für diese Abspaltung
geeignete Säure schließen Essigsäure, Trifluoressigsäure,
Paratoluolsulfonsäure und Mineralsäuren ein, sind jedoch darauf
nicht beschränkt. Eine bevorzugte Säure ist
3-Hydroxypicolinsäure, die ebenfalls eine geeignete Matrix für
die nachfolgende MALDI-Analyse ist.
Fig. 3 illustriert weitere bevorzugte Linker und
Einfangstrategien für die MALDI-Analyse von Peptiden. Wie
gezeigt, kann das Peptid durch den Carboyxterminus eingefangen
werden, indem ein aminoderivatisierter Träger eingesetzt wird.
Der aminoderivatisierte Ausgangsträger kann hergestellt werden,
indem eine hydroxylierte Oberfläche des Trägers mit
Diisopropylsilyldichlorid und einem Aminoalkohol umgesetzt
wird. Aminoalkohole, die verwendet werden können, schließen α-,
β-, γ-, . . ., ω-Aminoalkanole, ω-Hydroxy(polyethylenglykol)NH2,
Hydroxyaniline, Hydroxyarylalkylamine sowie Hydroxyalkylaniline
ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Daher kann unter
Bezugnahme auf Fig. 3 R4 jede divalente Gruppe sein, deren
Länge 2 oder mehr Bindungen beträgt. Das Einfangen des Peptids
durch den aminoderivatisierten Träger wird durch dehydrative
Kopplung des Peptids mit der Aminogruppe erreicht. Solche
Bedingungen zur Peptidkopplung sind dem Fachmann wohlbekannt.
Illustriert ist ein Satz von Bedingungen zum Einfangen des
Peptids (d. h. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid
hydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS)). Das
eingefangene Peptid kann anschließend verkürzt, vom Träger
abgespalten und wie in Fig. 2 gezeigt, analysiert werden.
Ebenfalls sind in Fig. 3 andere für das Einfangen von
Peptiden auf Trägern für die MALDI-Analyse verwendbare Linker
veranschaulicht. Beispielsweise können Trityl-enthaltende
Linker, die entweder mit Ester- oder Aminoeinheiten
funktionalisiert sind, verwendet werden, um Peptide am Amino-
bzw. Carboxyterminus einzufangen. Andere, dem Fachmann bekannte
Linker, zum Beispiel photospaltbare Linker, sind ebenfalls für
die Verwendung zum Einfangen der Peptide auf der
Trägeroberfläche erhältlich.
Es werden photospaltbare Linker bereitgestellt. Die Linker
enthalten O-Nitrobenzyleinheiten und Phosphatbindungen, die
eine vollständige photolytische Spaltung der Konjugate
innerhalb von Minuten nach UV-Einstrahlung ermöglichen. Die UV-
Wellenlängen werden so ausgewählt, daß die Strahlung die
Polypeptide nicht beschädigt und beträgt üblicherweise ungefähr
350 bis 380 nm, üblicherweise ungefähr 365 nm.
Ein photospaltbarer Linker kann die allgemeine Struktur
gemäß Formel I aufweisen:
wobei R20 ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl oder ω-Hydroxyalkyl
ist; R21 aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Alkoxycarbonyl,
Aryloxycarbonyl und Carboxy ausgewählt wird; R22 Wasserstoff
oder (Dialkylamino) ω-cyanoalkoxy)P- ist; t 0-3 ist; sowie R50
Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy ist.
Ein photospaltbarer Linker kann ebenfalls die Formel II
aufweisen:
wobei R20 ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl, ω-Hydroxyalkyl oder
Alkyl ist; R21 aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Alkoxycarbonyl,
Aryloxycarbonyl und Carboxy ausgewählt wird; R22 Wasserstoff
oder (Dialkylamino) ω-cyanoalkoxy)P- ist; und X20 Wasserstoff,
Alkyl oder OR20 ist.
Bei einem bestimmten photospaltbaren Linker ist R20 3-
(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl, 3-Hydroxypropyl oder Methyl;
R21 wird aus Wasserstoff, Methyl und Carboxy ausgewählt; R22 ist
Wasserstoff oder (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und X20
ist Wasserstoff, Methyl oder OR20. Bei einem anderen
photospaltbaren Linker ist R20 3-(4,4'-
Dimethoxytrityloxy)propyl; R21 ist Methyl; R22 ist
(Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und X20 ist Wasserstoff.
Bei noch einem weiteren photospaltbaren Linker ist R20 Methyl;
ist R21 Methyl; ist R22 (Diisopropylamino) (2-cyanoethoxy) P-; und
ist X20 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy.
Ein photospaltbarer Linker kann ebenfalls die allgemeine
Formel gemäß Formel III besitzen:
wobei R23 Wasserstoff oder (Dialkylamino) ω-cyanoalkoxy)P- ist;
und R24 aus ω-Hydroxyalkoxy, ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkoxy,
ω-Hydroxyalkyl und ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl ausgewählt
wird und unsubstituiert ist oder an der Alkyl- oder Alkoxykette
mit einer oder mehrerer Alkylgruppen substituiert; r und s
jeweils unabhängig 0-4 sind; und R50 Alkyl, Alkoxy, Aryl oder
Aryloxy ist.
Bei bestimmten photospaltbaren Linkem ist R24
ω-Hydroxyalkyl oder ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl und ist an
der Alkylkette mit einer Methylgruppe substituiert. Bei einem
weiteren photospaltbaren Linker ist R23 Wasserstoff oder
(Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und R24 wird aus
3-Hydroxypropoxy, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy, 4-
Hydroxybutyl, 3-Hydroxy-1-propyl, 1-Hydroxy-2-propyl,
3-Hydroxy-2-methyl-1-propyl, 2-Hydroxyethyl, Hydroxymethyl,
4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-
1-propyl, 2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl, 1-(4,4'-
Dimethoxytrityloxy)-2-propyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-
methyl-1-propyl und 4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl ausgewählt.
Bei noch einem weiteren photospaltbaren Linker ist R23
(Diisopropylamino)(2-Cyanoethoxy)P-; sind r und s 0; und R24
wird aus 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy, 4-(4,4'-
Dimethoxytrityloxy)butyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl,
2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl, 1-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-
2-propyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-methyl-1-propyl und
4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl ausgewählt. R24 ist besonders
bevorzugt 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy.
Photospaltbare Linker gemäß Formeln I oder II können
mittels der unten beschriebenen Verfahren, durch geringfügige
Modifikation der Verfahren, indem die geeigneten
Ausgangsmaterialien ausgewählt werden, oder durch jede andere
dem Fachmann bekannte Methode hergestellt werden. Detaillierte
Vorgehensweisen für die Synthese von photospaltbaren Linker der
Formel II sind im Beispiel 2 und 3 angegeben.
Bei den photospaltbaren Linkem von Formel II, worin X20
Wasserstoff ist, können die Linker auf die folgende Weise
hergestellt werden. Alkylierung von 5-Hydroxy-2-
nitrobenzaldehyd mit einem ω-Hydroxyalkylhalogenid,
beispielsweise 3-Hydroxypropylbromid, gefolgt von dem Schutz
des resultierenden Alkohols, beispielsweise als ein Silylether,
ergibt einen 5- ω-Silyloxyalkoxy)-2-nitrobenzaldehyd. Zugabe
einer organometallischen Verbindung zu dem Aldehyd ergibt einen
benzylischen Alkohol. Organometallische Verbindungen, die
verwendet werden können, schließen Trialkylverbindungen (für
Linker, bei denen R21 Alkyl ist) wie Trimethylaluminium ein;
Borhydride (für Linker, bei denen R21 Wasserstoff ist) wie
Natriumborhydrid; oder Metallcyanide (für Linker, bei denen R21
Carboxy oder Alkoxycarbonyl ist) wie Kaliumcyanid. Im Falle der
Metallcyanide wird das Reaktionsprodukt, ein Cyanohydrin,
entweder unter sauren oder basischen Bedingungen in der
Gegenwart von entweder Wasser oder Alkohol hydrolysiert, um die
interessierende Verbindung zu ergeben.
Die Silylgruppe der Seitenkette des resultierenden
Benzylalkohols kann gegen eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe durch
Desilylierug, beispielsweise unter Verwendung von
Tetrabutylammoniumfluorid, ausgetauscht werden, um den
entsprechenden Alkohol zu ergeben, gefolgt von Reaktion mit
4,4'-Dimethoxytritylchlorid. Die Reaktion beispielsweise mit 2-
Cyanoethyl-diisopropylchlorphosphoramidit ergibt den Linker,
bei dem R22 (Dialkylamino) ω-Cyanoalkoxy)P- ist.
Ein spezielles Beispiel einer Synthese eines
photospaltbaren Linkers der Formel II ist dem folgenden Schema
gezeigt, das ebenfalls die Verwendung des Linkers bei der
Oligonukleotidsynthese demonstriert. Das Schema soll lediglich
veranschaulichend sein und in keiner Weise den Umfang der
Methoden hier einschränken. Experimentielle Details der
Synthesetransformationen werden in den Beispielen angegeben.
Die Synthese der Linker von Formel II, worin X20 OR20,
3,4-Dihydroxyacetophenon ist, wird selektiv an dem 4-Hydroxyl
durch Reaktion, beispielsweise mit Kaliumcarbonat und einem
Silylchlorid geschützt. Benzoatester, Propionphenon,
Butyrophenone und dergleichen können anstelle des Acetophenons
verwendet werden. Das sich ergebende 4-Silyloxy-3-
hydroxyacetophenon wird anschließend mit einem Alkylhalogenid
(für Linker, in denen R20 Alkyl ist) an dem 3-Hydroxy alkyliert
und, beispielsweise mit Tetrabutylammoniumfluorid, desyliert,
um ein 3-Alkoxy-4-Hydroxyacetophenon zu ergeben. Diese
Verbindung wird anschließend am 4-Hydroxyl durch Reaktion mit
einem ω-Hydroxyalkylhalogenid, beispielsweise 3-
Hydroxypropylbromid, alkyliert, um ein 4-(ω-Hydroxyalkoxy)-3-
alkoxyacetophenon zu ergeben. Der Seitenkettenalkohol wird
anschließend als ein Ester, beispielsweise ein Acetat,
geschützt. Diese Verbindung wird anschließend an der 5-Position
beispielsweise mit konzentrierter Salpetersäure nitriert, um
das entsprechende 2-Nitroacetophenon zu ergeben. Verseifung des
Seitenkettenesters, beispielsweise mit Kaliumcarbonat, und
Reduktion des Ketons, beispielsweise mit Natriumborhydrid, in
beliebiger Reihenfolge ergibt ein 2-Nitro-4-(ω-Hydroxyalkoxy)-
5-alkoxybenzylalkohol.
Der selektive Schutz des Seitenkettenalkohols als der
korrespondierende 4,4'-Dimethoxytritylether wird anschließend
durch Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid erreicht.
Weitere Reaktion, beispielsweise mit 2-Cyanoethyl-diisopropyl
chlorphosphoramidit ergibt die Linker, bei denen R22
(Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist.
Ein spezielles Beispiel der Synthese eines photospaltbaren
Linkers von Formel II ist im folgenden Schema gezeigt. Das
Schema soll lediglich eine Veranschaulichung sein und in keiner
Weise den Umfang der Methoden hier einschränken.
Photospaltbare Linker von Formel III können durch die hier
offenbarten Verfahren, durch geringfügige Modfikation der
Verfahren, indem geeignete Ausgangsmaterialien gewählt werden,
oder durch andere dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt
werden.
Im allgemeinen werden photospaltbare Linker gemäß Formel
III aus ω-Hydroxyalkyl- oder Alkoxyarylverbindungen
hergestellt, insbesondere aus ω-Hydroxy-alkyl oder
Alkoxybenzolen. Diese Verbindungen sind kommerziell erhältlich
oder können entweder aus einem ω-Hydroxyalkylhalogenid,
beispielsweise 3-Hydroxypropylbromid, hergestellt werden oder
aus Phenyllithium (für die ω-Hydroxyalkylbenzole) oder Phenol
(für die ω-Hydroxyalkoxybenzole). Acylierung der
ω-Hydroxygruppe, beispielsweise als ein Acetatester, gefolgt von
Friedel-Crafts-Acylierung des aromatischen Rings mit 2-
Nitrobenzoylchlorid stellt ein 4-(ω-Acetoxy-alkyl oder Alkoxy)-
2-Nitrobenzophenon bereit. Reduktion des Ketons, beispielsweise
mit Natriumborhydrid, und Verseifung des Seitenkettenesters
werden in beliebiger Reihenfolge durchgeführt, um ein 2-
Nitrophenyl-4-(hydroxy-alkyl oder Alkoxy)phenylmethanol zu
ergeben. Schutz der terminalen Hydroxylgruppe als der
entsprechende 4,4'-Dimethoxytritylether wird durch Reaktion mit
4,4'-Dimethoxytritylchlorid erreicht. Anschließend wird die
benzylische Hydroxylgruppe umgesetzt, beispielsweise mit 2-
Cyanoethyl-diisopropyl-chlorphosphoramidit, um Linker gemäß
Formel III zu ergeben, in denen R23 (Dialkylamino)-(ω-
Cyanoalkoxy)P- ist.
Andere photospaltbare Linker gemäß Formel III können
hergestellt werden, indem 2-Phenyl-1-propanol oder 2-
Phenylmethyl-1-propanol durch die ω-Hydroxy-alkyl- oder
Alkoxybenzole in der obigen Synthese ersetzt werden. Diese
Verbindungen sind kommerziell erhältlich, können jedoch
ebenfalls durch Reaktion, beispielsweise von
Phenylmagnesiumbromid oder Benzylmagnesiumbromid mit dem
erforderlichen Oxiran (Propylenoxid) in der Gegenwart von
katalytischen Kupferionen hergestellt werden.
Eine Vielzahl chemisch spaltbarer Linker kann ebenfalls
verwendet werden, um ein Polypeptid mit einem festen Träger zu
verbinden. Säurelabile Linker sind besonders verwendbare,
chemisch spaltbare Linker für die Massenspektrometrie,
insbesondere für MALDI-TOF, da die säurelabile Bindung während
des Konditionieren des Targetpolypeptids nach Zugabe einer 3-
HPA Matrixlösung gespalten wird. Die säurelabile Bindung kann
als separate Linkergruppe eingeführt werden, beispielsweise
eine säurelabile Tritylgruppe, oder kann in einen synthetischen
Linker eingebaut werden, indem eine oder mehrere Silylbrücken
mittels Diisopropylsilyl eingeführt werden, wodurch eine
Diisopropyl-silylverbindung zwischen dem Polypeptid und dem
festen Träger gebildet wird. Die Diisopropylsilylverbindung
kann mittels mild saurer Bedingungen, wie 1,5%
Trifluoressigsäure (TFA) oder 3-HPA/1% TFA MALDI-TOF-
Matrixlösung gespalten werden. Verfahren für die Herstellung
von Diisopropylverbindungen und Analoga davon, sind im Stand
der Technik wohlbekannt (siehe zum Beispiel Saha et al., J.
Org. Chem. 58: 7827-7831 (1993)).
Wie hier offenbart wird, kann ein interessierendes
Polypeptid mit einem festen Träger wie einem Kügelchen,
konjugiert werden. Des weiteren kann ein erster fester Träger
wie ein Kügelchen ebenfalls, falls gewünscht, durch jedes
geeignete Mittel, einschließlich derjenigen, die hier für die
Konjugation eines Polypeptids mit einem Träger offenbart sind,
mit einem zweiten festen Träger konjugiert werden, der ein
zweites Kügelchen oder ein anderer Träger sein. Demzufolge kann
jedes der Konjugationsverfahren und Mittel, die hier bezogen
auf die Konjugation eines Polypeptids mit einem festen Träger
offenbart sind, ebenfalls für die Konjugation eines ersten
Trägers mit einem zweiten Träger angewandt werden, wobei der
erste und der zweite feste Träger dieselben oder
unterschiedlich sein können.
Geeignete Linker, die Quervernetzungsmittel sein können,
zur Verwendung für die Konjugation eines Polypeptids mit einem
festen T 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019882657 00004 99880räger schließen eine Vielzahl von Reagenzien ein, die
mit einer funktionellen Gruppe, die auf der Oberfläche des
Trägers vorkommt, oder mit dem Polypeptid oder beiden reagieren
kann. Als Quervernetzungsmittel verwendbare Reagenzien
schließen homobifunktionelle und insbesondere
heterobifunktionelle Reagenzien ein. Verwendbare bifunktionelle
Quervernetzungsmittel schließen N-Succinimidyl(4-
iodacetyl)aminobenzoat (STAB), Dimaleimid, Dithio-bis-
nitrobenzoesäure (DTNB), N-Succinimidyl-S-acetyl-thioacetat
(SATA), N-Succinimidyl-3-(2-Pryridyldithio)propionat (SPDP),
Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat
(SMCC) und 6-Hydrazino-Nicotimid (HYNIC) ein, sind jedoch nicht
auf diese beschränkt.
Ein Quervernetzungsmittel kann ausgewählt werden, um eine
selektiv spaltbare Bindung zwischen einem Polypeptid und dem
festen Träger bereitzustellen. Beispielsweise kann ein
photolabiler Linker wie 3-Amino-(2-nitrophenyl)propionsäure
(Brown et al., Molec. Divers. 4-12 (1995); Rothschild et al.
Nucl. Acids Res. 24: 351-66 (1996); US-Patent Nr. 5,643,722) als
ein Mittel zum Abspalten eines Polypeptids von einem festen
Träger verwendet werden. Andere Quervernetzungsmittel sind im
Stand der Technik wohlbekannt (siehe zum Beispiel, "Chemistry
of Protein Conjugation and Cross-Linking" (CRC Press 1991);
Hermanson, supra, 1996).
Ein Polypeptid kann auf einem festen Träger wie einem
Kügelchen durch eine kovalente Amidbindung immobiliert werden,
die zwischen einem mit einer Carboxylgruppe funktionalisiertem
Kügelchen und dem Aminoterminus des Polypeptids gebildet wird,
oder umgekehrt durch eine kovalente Amidbindung, die zwischen
einem mit einer Aminogruppe funktionalisiertem Kügelchen und
dem Carboxyterminus des Polypetids gebildet wird.
Des weiteren kann ein bifunktioneller Trityllinker an den
Träger angefügt werden, beispielsweise an einen 4-Nitrophenyl
aktiven Ester auf einem Harz wie ein Wang-Harz durch eine
Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe auf dem Harz mittels eines
Aminoharzes. Unter Verwendung einer bifunktionellen Trityl-
Vorgehensweise kann der feste Träger die Behandlung mit einer
flüchtigen Säure, wie Ameisensäure oder Trifluoressigsäure
erfordern, um sicherzustellen, daß das Polypeptid gespalten
wird und entfernt werden kann. In solch einem Fall kann das
Polypeptid als Patch ohne Kügelchen auf dem Boden einer
Vertiefung eines festen Trägers oder auf der ebenen Oberfläche
eines festen Trägers, abgeschieden werden. Nach Zugabe einer
Matrixlösung kann das Polypeptid in ein Massenspektrometer
hinein desorbiert werden.
Hydrophobe Trityllinker können ebenfalls als säurelabile
Linker ausgenutzt werden, indem eine flüchtige Säure oder eine
geeignete Matrixlösung, beispielsweise eine 3-HTA enthaltende
Matrixlösung verwendet wird, um eine aminoverküpfte
Tritylgruppe von dem Polypeptid abzuspalten. Die Säurelabilität
kann ebenfalls verändert werden. Beispielsweise kann Trityl,
Monomethoxytrityl, Dimethoxytrityl oder Trimethoxytrityl zu dem
geeigneten p-substituierten oder säurelabileren
Tritylaminderivaten des Polypeptids verändert werden; d. h.
Tritylether- und Tritylaminbindungen können zu dem Polypeptid
ausgebildet werden. Demzufolge kann ein Polypeptid von einem
hydrophoben Linker entfernt werden, beispielsweise indem die
hydrophobe Anziehung auseinandergetissen wird oder indem
Tritylether- oder Tritylaminbindungen unter sauren Bedingungen
gespalten werden, einschließlich, falls gewünscht, unter
typischen massenspektrometrischen Bedingungen, bei denen eine
Matrix wie 3-HTA als Säure wirkt.
Wie hier offenbart, kann ein Polypeptid mit einem festen
Träger, beispielsweise einem Kügelchen, konjugiert werden und
das Kügelchen kann, entweder vor, während oder nach der
Konjugation des Polypeptids mit einem zweiten festen Träger
konjugiert werden, wobei eine oder beide Konjugationen zu der
Ausbildung einer säurelabilen Bindung führt. Beispielsweise
kann die Verwendung eines Trityllinkers eine kovalente oder
eine hydrophobe Konjugation bereitstellen und unabhängig von
der Art der Konjugation wird die Tritylgruppe bereitwillig
unter sauren Bedingungen abgespalten. Orthogonal spaltbare
Linker können ebenfalls zum Binden eines ersten festen Trägers,
beispielsweise eines Kügelchens, an einen zweiten festen Träger
oder für die Bindung eines Polypeptids von Interesse an einen
festen Träger, verwendbar sein. Unter Verwendung eines solchen
Linkers kann ein erster fester Träger, beispielsweise ein
Kügelchen, selektiv von einem zweiten festen Träger,
abgespalten werden, ohne das Polypeptid von dem Träger
abzuspalten. Das Polypeptid kann von dem Kügelchen zu einem
späteren Zeitpunkt abgespalten werden. Beispielsweise kann ein
Disulfidlinker, der unter Verwendung eines Reduktionsmittels
wie DTT abgespalten werden kann, verwendet werden, um ein
Kügelchen an einen zweiten festen Träger zu binden, und eine
säurespaltbare, bifunktionelle Tritylgruppe kann verwendet
werden, um ein Polypeptid auf dem Träger zu immobilisieren.
Wenn gewünscht, kann die Verbindung des Polypeptids mit dem
festen Träger zuerst gespalten werden, was beispielsweise die
Verbindung zwischen dem ersten und dem zweiten Träger intakt
läßt. Trityllinker können eine kovalente oder hydrophobe
Konjugation bereitstellen und unabhängig von der Art der
Konjugation wird die Tritylgruppe bereitwillig unter sauren
Bedingungen gespalten.
Ein erster fester Träger wie ein Kügelchen kann mit einem
zweiten festen Träger mittels der Verfahren, Verbindungen und
Konjugationsmittel, die hier offenbart sind, konjugiert werden.
Darüber hinaus kann ein Kügelchen beispielsweise an einen
zweiten Träger durch eine Verbindungsgruppe gebunden werden,
die so ausgewählt werden kann, daß sie eine Länge und eine
chemische Natur aufweist, damit eine Bindung der Kügelchen mit
hoher Dichte an den festen Träger oder eine Bindung mit hoher
Dichte des Polypeptids an den Kügelchen, gefördert wird. Eine
solche Verknüpfungsgruppe kann beispielsweise eine "baumartige"
Struktur haben, wodurch eine Vielzahl von funktionellen Gruppen
pro Verknüpfungsstelle auf dem festen Träger bereitgestellt
wird. Beispiele von solchen Verknüpfungsgruppen schließen
Polylysin, Polyglutamihsäure, Pentaerythrol und Tris-Hydroxy-
Aminomethan ein.
Ein Polypeptid kann mit einem festen Träger konjugiert
werden, oder ein erster fester Träger kann ebenfalls zu einem
zweiten festen Träger durch eine nicht kovalente Interaktion
konjugiert werden. Beispielsweise kann ein magnetisches
Kügelchen, das aus einem ferromagnetischen Material hergestellt
ist, das fähig ist, magnetisiert zu werden, von einem
magnetischen, festen Träger angezogen werden, und kann von dem
Träger durch Entfernen des Magnetfelds freigegeben werden.
Alternativ dazu kann der feste Träger mit einer ionischen oder
hydrophoben Einheit ausgestattet werden, die die Interaktion
einer ionischen bzw. hydrophoben Einheit mit einem Polypeptid,
beispielsweise einem Polypetid, das eine angefügte Tritylgruppe
enthält, oder mit einem zweiten festen Träger, der hydrophoben
Charakter aufweist, erlauben kann.
Ein fester Träger kann ebenfalls mit einem Mitglied eines
spezifischen Bindungspaares ausgestattet werden, und daher mit
einem Polypeptid oder einem zweiten festen Träger konjugiert
werden, der eine komplementäre Bindungseinheit enthält.
Beispielsweise kann ein mit Avidin oder mit Streptavidin
beschichtetes Kügelchen an ein Polypeptid gebunden werden, das
eine Biotineinheit darin eingebaut hat, oder mit einem zweiten
festen Träger, der mit Biotin oder einem Derivat von Biotin wie
Iminobiotin beschichtet ist.
Es sollte klar sein, daß jedes der Bindungspaare, die hier
offenbart oder anderweitig im Stand der Technik bekannt sind,
in Bezug auf die hier angegebenen Beispiele, vertauscht werden
kann. Daher kann beispielsweise Biotin entweder in ein
Polypeptid oder einen festen Träger eingebaut werden und
umgekehrt, eine Avidin oder eine andere Biotin bindende Einheit
könnte in den Träger bzw. das Polypeptid eingebaut werden.
Andere spezifische Bindungspaare, deren Verwendung hier
betrachtet wird, schließen Hormone und deren Rezeptoren, Enzyme
und deren Substrate, eine Nukleotidsequenz und deren
komplementäre Sequenz, einen Antikörper und ein Antigen, mit
dem er spezifisch interagiert und andere solche Paare, die dem
Fachmann bekannt sind, ein, sind jedoch nicht auf diese
beschränkt.
Die Immobilisierung von einem oder mehreren Polypeptiden
von Interesse, insbesondere Targetpolypeptide, erleichtert die
Manipulation der Polypeptide. Beispielsweise erleichtert die
Immobilisierung der Polypeptide auf einem festen Träger die
Isolierung der Polypeptide aus einer Reaktion oder den Transfer
der Polypeptide während der Durchführung einer Serie von
Reaktionen. Als solche kann die Immobilisierung von
Polypeptiden die Konditionierung der Polypeptide, oder die
Massenmodifikation der Polypeptide vor der Durchführung der
massenspektrometrischen Analyse, erleichtern.
Beispiele von bevorzugten Bindungspaaren oder Linker-
Interaktionen werden in der Tabelle angegeben.
Das Konditionieren eines Polypeptids vor der
Massenspektrometrie kann die Auflösung eines Massenspektrums
des Polypeptids erhöhen, wodurch die Bestimmung der Identität
eines Targetpolypetids erleichtert wird. Ein Polypetid kann
beispielsweise konidtioniert werden, indem das Polypeptid mit
einem Kationen-Austauschermaterial oder einem Anionen-
Austauschermaterial behandelt wird, welches die
Ladungsheterogenität des Polypeptids verringern kann, wodurch
die Peak-Verbreiterung reduziert oder eliminiert wird. Darüber
hinaus kann das in Kontakt bringen eines Polypeptids mit einem
Alkylierungsmittel wie beispielsweise Alkyliodid, Iodacetamid,
Iodethanol oder 2,3-Epoxy-1-propanol die Ausbildung von
Disulfidbindungen in dem Polypeptid verhindern, wodurch die
Auflösung eines Massenspektrums des Polypeptids erhöht wird.
Auf ähnliche Weise können geladene Aminosäuren in ungeladene
Derivate umgewandelt werden, indem die Polypeptide mit
Trialkylsilyl-chloriden in Kontakt gebracht werden, was die
Ladungsheterogenität reduziert und die Auflösung des
Massenspektrums erhöht.
Es gibt ebenfalls Mittel die Auflösung zu verbessern,
insbesondere für kürzere Peptide, indem modifizierte
Aminosäuren eingebaut werden, die basischer als die
entsprechenden unmodifizierten Reste sind. Eine solche
Modifikation erhöht im allgemeinen die Stabilität des
Polypeptids während der massenspektrometrischen Analyse.
Ebenfalls können Kationen-Austausch-Chromatographie sowie
allgemeine Wasch- und Reinigungsprozeduren, die Proteine und
andere Reaktions-Mischungs-Komponenten von dem Targetpolypeptid
entfernen, verwendet werden, um das Peptid nach einer in vitro-
Translation zu reinigen, und dadurch die Auflösung des
Spektrums, das von einer massenspektrometrischen Analyse des
Targetpolypeptids resultiert, zu erhöhen.
Die Konditionierung kann ebenfalls den Einbau
modifizierter Aminosäuren in das Polypeptid einschließen,
beispielsweise von massenmodifizierten Aminosäuren, die die
Auflösung eines Massenspektrums erhöhen können. Beispielsweise
kann der Einbau eines massenmodifizierten Leucin-Restes in
einem interessierenden Polypeptids nützlich sein, um die
Auflösung (zum Beispiel durch Erhöhen der Massendifferenz)
eines Leucin-Restes von einem Isoleucin-Rest zu erhöhen,
wodurch die Bestimmung einer Aminosäuresequenz des Polypeptids
erleichtert wird. Eine modifizierte Aminosäure kann ebenfalls
eine Aminosäure sein, die eine bestimmte Blockierungsgruppe
enthält, wie diejenigen Gruppen, die bei chemischen Verfahren
der Aminosäuresynthese verwendet werden. Beispielsweise kann
der Einbau eines Glutaminsäure-Rests mit einer
Blockierungsgruppe, die an die Carboxylgruppe der Seitenkette
angefügt ist, die Masse des Glutaminsäure-Rests modifizieren
und bietet den zusätzlichen Vorteil, eine geladene Gruppe aus
dem Polypeptid zu entfernen, wodurch die Auflösung eines
Massenspektrums eines Polypeptids, das die blockierte
Aminosäure enthält, weiter erhöht wird.
Die Immobilisierung eines Polypeptids auf einem festen
Träger unter Verwendung eines Stiftwerkzeugs kann besonders
vorteilhaft sein. Stiftwerkzeuge schließen die hier offenbarten
oder anderweitig im Stand der Technik bekannten, ein (siehe zum
Beispiel die anhängige US-Anmeldungen Serien Nr. 08/786, 988 und
08/787, 638 sowie die internationale PCT-Anmeldung Nr.
WO 98/20166).
Ein Stiftwerkzeug in einem Raster, beispielsweise einem
4 × 4 Raster, kann auf Vertiefungen, die Polypeptide von
Interesse enthalten, angewendet werden. Wenn das Stiftwerkzeug
eine funktionelle Gruppe aufweist, die an jede Stiftspitze
angeheftet ist, oder ein festen Träger, beispielsweise
funktionalisierte Kügelchen oder paramagnetische Kügelchen, an
jeden Stift angeheftet ist, kann das Polypeptid in einer
Vertiefung eingefangen werden (≦ 1 pmol Kapazität). Während des
Einfangschrittes können die Stifte in Bewegung gehalten werden
(vertikal, 1-2 mm Entfernung), um die Effizienz des Einfangens
zu erhöhen. In Fällen, wo eine Reaktion wie eine in vitro
Transkription, in den Vertiefungen durchgeführt wird, kann die
Bewegung der Stifte die Effizienz der Reaktion erhöhen.
Polypetide von Interesse, insbesondere Targetpolypeptide,
werden aufgrund des Kontaktes mit dem Stiftwerkzeug
immobilisiert. Eine weitere Immobilisierung kann sich ergeben,
indem ein elektrisches Feld an das Stiftwerkzeug angelegt wird.
Wenn eine Spannung an das Stiftwerkzeug angelegt wird, werden
die Polypeptide, abhängig von ihrer Nettoladung, von der Anode
oder der Kathode angezogen. Ein solches System kann zur
Isolierung der Polypeptide verwendbar sein, da ungeladenen
Moleküle in Lösung verbleiben, und Moleküle, die eine zur
Nettoladung der Polypeptide entgegengesetzte Ladung aufweisen,
werden zu dem gegenüberliegenden Pol (Anode oder Kathode)
angezogen. Für eine größere Spezifität kann das Stiftwerkzeug
(mit oder ohne Spannung) so modifiziert werden, daß ein für ein
Polypeptid von Interesse spezifisches Reagenz daran konjugiert
wird, so daß nur die Polypeptide von Interesse, an die Stifte
gebunden werden. Beispielsweise können die Stifte angefügte
Nickel-Ionen aufweisen, so daß nur Peptide, die eine
Polyhistidinsequenz enthalten, gebunden werden. Auf ähnliche
Weise können die Stifte für ein Targetpolypeptid spezifische
Antikörper daran angeheftet haben, oder an Kügelchen, die
wiederum an die Stifte angeheftet sind, so daß nur die
Targetpolypeptide, die das Epitop enthalten, das von dem
Antikörper erkannt wird, von den Stiften gebunden wird.
Verschiedene Stift-Konfirmationen schließen beispielsweise
eine Konfiguration fester Stifte ein, oder Stifte mit einem
Kanal oder einem Loch durch das Zentrum, das eine optische
Faser zur massenspektrometrischen Detektion beherbergen kann.
Der Stift kann eine flache Spitze haben oder jeder der Zahl von
Konfigurationen, einschließlich Nanovertiefungen, konkav,
konvex, verkürzt konisch oder verkürzt pyramidal,
beispielsweise eine Größe von 4 bis 800 µm quer × 100 µm in der
Tiefe. Die einzelnen Stifte, die jede gewünschte Größe haben
können, sind im allgemeinen ungefähr 10 mm lang, üblicherweise
5 mm lang, und insbesondere ungefähr 1 mm lang. Die Stifte und
die Mounting-Platte können aus Polystyrol hergestellt werden,
das ein einzelnes durch Spritzguß erhaltenes Teil sein kann.
Polystyrol ist für diese Verwendung nützlich, da es leicht
funktionalisiert werden kann und mit hohen Toleranzen geformt
werden kann. Die Stifte in einer Vorichtung des Stiftwerkzeugs
können einknickbar sein, beispielsweise gesteuert durch einen
scherenartigen Mechanismus, so daß die Nadeln in größere Nähe
gebracht werden, was die Größe insgesamt reduziert.
Eingefangene Polypeptide können durch eine Vielzahl von
Mitteln analysiert werden, einschließlich beispielsweise
spektrometrischer Techniken, wie UV/VIS, IR, Fluoreszenz,
Chemilumineszenz, NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie oder
anderen im Stand der Technik bekannte Verfahren sowie
Kombinationen davon. Falls Bedingungen die direkte Analyse von
eingefangenen Polypeptiden ausschließen, können die Polypeptide
von den Stiften unter Bedingungen freigegeben oder überführt
werden, so daß die Vorteile der Probenkonzentrierung nicht
vorlorengehen. Demzufolge können die Polypeptide von den
Stiften mittels eines minimalen Volumens eines Elutionsmittel
und ohne Verlust von Probe entfernt werde. Wo die Polypeptide
an die Kügelchen gebunden sind, die an die Stifte angefügt
sind, können die die Polypeptide enthaltenden Kügelchen von den
Nadeln entfernt werden und Messungen direkt von den Kügelchen
aus durchgeführt werden.
Vor der Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptids
durch Massenspektrometrie kann ein Stiftwerkzeug, das das
Polypeptid daran angeheftet hat, entfernt werden und mehrmals
gewaschen werden, beispielsweise in Amoniumcitrat, um das
Polypeptid vor der Zugabe von Matrix zu konditionieren. Die
Stifte können anschließend in eine Matrixlösung getaucht
werden, deren Matrixkonzentration so eingestellt ist, daß die
Matrixlösung nur genau an die Spitzen der Nadeln anhaftet.
Alternativ dazu kann das Stiftwerkzeug umgedreht werden und die
Matrixlösung auf die Spitze von jeder Nadel mittels einer
Miktrotropfen-Vorrichtung gesprüht werden. Die Polypeptide
können ebenfalls von den Stiften in eine Nanovertiefung oder
einen Chip abgespalten werden, beispielsweise vor der Zugabe
von Matrix. Für die direkte Analyse von den Stiften kann eine
Edelstahl-"Masken"-Sonde über den. Stiften befestigt werden,
anschließend kann die Masken-Sonde in dem Massenspektrometer
installiert werden.
Es können zwei Massenspektrometer-Geometrien verwendet
werden, um eine Vorrichtung mit dem Stiftwerkzeug aufzunehmen.
Eine erste Geometrie beherbergt feste Stifte. Effektiv schmilzt
der Laser eine Materialschicht von der Oberfläche der Kristalle
ab, so daß die sich ergebenden Ionen beschleunigt werden und
durch die Ionenoptik fokussiert werden. Eine zweite Geometrie
beherbergt Stifte mit optischen Fasern, in denen der Laser die
Proben von hinten trifft. Effektiv wird der Laser auf die
rückseitige Platte des Stiftwerkzeugs fokussiert und in eine
kurze optische Faser mit einem Durchmesser von ungefähr 100 µm
und einer Länge von ungefähr 7 mm, um die Dicke der Rückplatte
einzuschließen. Diese Geometrie erfordert, dass die
verflüchtigte Probe durch die Tiefe der Matrix/Kügelchen-
Mischung hindurchtritt, die Ionen verlangsamt und abkühlt, und
zu einer Art von verzögerter Extraktion führt, was die
Auflösung der Untersuchung erhöhen kann (siehe zum Beispiel
Juhasz et al. (1996) Analysis, Anal. Chem. 68: 941-946, siehe
ebenfalls beispielsweise US-Patent Nr. 5,777,325, US-Patent
Nr. 5,742,049, US-Patent Nr. 5,654,545, US-Patent Nr. 5,641,959 und
US-Patent Nr. 5,760,393 zu Beschreibungen von MALDI und
Protokollen zur verzögerten Extraktion.
Die Sonde, durch die die Stifte geführt werden, kann
ebenfalls verschiedene Geometrien aufweisen. Beispielsweise
kann eine große Sonde mit mehreren Löchern, mit einem für jede
Nadel, über das Stiftwerkzeug gebracht werden und der ganze
Aufbau wird in der X-Y-Achse in dem Massenspektrometer
verschoben. Die Sonde kann ebenfalls eine befestigte Sonde mit
einem einzelnen Loch sein, das groß genug ist, um ein adequates
elektrisches Feld zu ergeben, jedoch klein genug, um zwischen
die Stifte zu passen. Das Stiftwerkzeug wird dann in allen drei
Achsen verschoben, wobei jeder Stift durch das Loch zur
sequentiellen Analyse eingeführt wird. Das letztere Format ist
für ein Stiftwerkzeug mit hoher Dichte geeigneter,
beispielsweise einem Stiftwerkzeug auf Basis eines 384-
Vertiefungs- oder einem Mikroplatten-Format mit höherer Dichte.
Diese beiden Sonden sind für die zwei oben offenbarten
Massenspektrometergeometrien geeignet.
Stiftwerkzeuge können zur Immobilisierung von Polypeptiden
von Interesse auf eine räumlich adressierbare Weise auf einem
Raster verwendbar sein. Solche räumlich adressierbaren oder
vor-adressierbaren Raster sind bei einer Vielzahl von Verfahren
verwendbar, einschließlich beispielsweiseder Qualitätskontrolle
und Diagnose der Aminosäuresequenzierung. Die Stiftwerkzeuge,
die in den anhängigen US-Anmeldungen, Seriennummern 08/786,988
und 08/787, 639 sowie der internationalen PCT-Anmeldung Nr.
WO 98/20166 beschrieben sind, sind serielle und parallele
Verteilungswerkzeuge, die eingesetzt werden können, um Multi-
Element-Raster von Polypeptiden auf einer Oberfläche eines
festen Trägers zu generieren. Die Raster-Oberfläche kann eben
sein, mit Kügelchen oder geometrisch verändert, um Vertiefungen
aufzuweisen, die Kügelchen enthalten können. Ein Stiftwerkzeug,
das die parallele Entwicklung eines Proben-Raster ermöglicht,
wird bereitgestellt. Ein solches Werkzeug ist ein Zusammenbau
von Vesikel-Elementen oder Stiften, wobei jeder der Stifte eine
enge Innenkammer einschließen kann, die zum Aufbewahren von
Nanoliter-volumina von Flüssigkeiten geeignet ist. Jede der
Nadeln paßt in ein Gehäuse, das eine Innenkammer besitzt. Das
Innengehäuse kann mit einer Druckquelle verbunden sein, die den
Druck innerhalb der Innengehäusekammer kontrollieren kann, um
den Fluß von Flüssigkeit durch die Innenkammer der Nadel zu
regulieren, wodurch eine kontrollierte Verteilung von
definierten Flüssigkeitsvolumina aus dem Vesikel erlaubt wird.
Das Stiftwerkzeug kann ebenfalls eine Düseneinheit
aufweisen, die einen Kapillarstift mit einer Innenkammer
einschließen kann sowie ein Wandlerelement, das an dem Stift
montiert ist und in der Lage ist, Flüssigkeit durch die
Innenkammer des Stiftes zu treiben, um die Flüssigkeit aus dem
Stift auszustoßen. Auf diese Weise kann das Werkzeug einen Spot
(Fleck) der Flüssigkeit auf einer Trägeroberfläche verteilen,
indem es die Flüssigkeit aus dem Stift heraussprüht. Das
Wandlerelement kann ebenfalls bewirken, daß ein Tropfen der
Flüssigkeit aus der Kapillare austritt, so daß Flüssigkeit auf
das Raster oder eine anderen festen Träger übertragen werden
kann, indem der Tropfen mit der Oberfläche des Rasters in
Kontakt tritt. Das Stiftwerkzeug kann ebenfalls ein Rasrer von
Polypeptiden ausbilden, indem die Polypeptide in eine Serie von
Schritten verteilt werden, während sich der Stift zu
unterschiedlichen Stellen oberhalb der Rasteroberfläche bewegt,
um das Probenraster auszubilden. Das Stiftwerkzeug kann
anschließend präparierte Polypeptidraster auf eine
Plattenanordnung übertragen, die die Raster für die Analyse
durch Massenspektrometrie abgibt, was einen Satz von
Spektralsignalen erzeugt, die die Zusammensetzung der zu
analysierenden Polypeptide anzeigt.
Das Stiftwerkzeug kann ebenfalls ein Gehäuse aufweisen,
das eine Vielzahl von Seiten- und Bodenbereichen hat, in denen
eine Vielzahl von Öffnungen gebildet sind, wobei die Wände und
der Bodenbereich des Gehäuses ein Innenvolumen definieren; ein
oder mehrere flüssigkeitsdurchlässige Vesikel oder Stifte, die
innerhalb der Öffnungen montiert sind, die eine für Nanovolumen
ausgebildete Flüssigkeitsaufbewahrungskammer zum Aufbewahren
von Nanovolumina von Flüssigkeit aufweisen, wobei die
Flüssigkeitsaufnahmekammer in Flüssigskommunikation mit dem
Innenvolumen des Gehäuses steht, und ein Abgabeelement, das in
Verbindung steht mit dem Innenvolumen des Gehäuses, um selektiv
Nanovolumina von Flüssigkeit aus den flüssigkeitsdurchlässigen
Vesikeln mit Nanovolumengröße abzugeben, wenn sich die
Flüssigkeit in den Flüssigkeitsaufnahmekammern der Vesikel
befindet. Dies ermöglicht dem Abgabeelement, Nanovolumina der
Flüssigkeit auf der Oberfläche des Trägers zu verteilen, wenn
die Vorrichtung oberhalb und passgenau mit dem Träger
angeordnet ist.
Das flüssigkeitsdurchlässige Vesikel kann ein offenes
proximales Ende aufweisen und einen distalen Spitzenbereich,
der sich überhalb des Bodenbereiches des Gehäuses erstreckt,
wenn er innerhalb der Öffnungen montiert ist. Dadurch kann das
offene proximale Ende die Flüssigkeitsaufbewahrungskammer in
Flüssigkeitsverbindung mit dem inneren Volumen bringen, wenn es
an die Öffnungen montiert ist. Gegebenenfalls sind die Vielzahl
von flüssigkeitsdurchlässigen Vesikel entfernbar und
auswechselbar innerhalb der Öffnungen des Gehäuses montiert
oder können alternativ eine Klebstoffabdichtung zur festen
Montage der Vesikel innerhalb des Gehäuses aufweisen.
Die Flüssigkeitsaufnahmekammer kann ebenfalls eine enge
Bohrung aufweisen, die in ihren Abmessungen so angepaßt ist,
daß sie mit Flüssigkeit durch Kapillarwirkung gefüllt wird und
kann so bemessen sein, um im wesentlichen vollständig mit der
Flüssigkeit durch Kapillarwirkung gefüllt zu werden. Die
Vielzahl von flüssigkeitsdurchlässigen Vesikeln schließen eine
Anordnung (Array) von flüssigkeitsabgebenden Nadeln ein, die
aus Metall, Glas, Silicium, polymerem Material oder jedem
geeigneten Material ausgebildet sein können, und daher wie hier
offenbart, ebenfalls als ein fester Träger dienen können.
Das Gehäuse kann ebenfalls einen oberen Bereich aufweisen
und mechanische Vorspannelemente, um die Mehrzahl von
flüssigkeitsdurchlässigen Vesikeln in Dichtungskontakt mit dem
unteren Gehäusebereich vorzuspannen. Darüber hinaus kann jedes
flüssigkeitsdurchlässige Vesikel einen proximalen Endabschnitt
aufweisen, der einen Flansch aufweist und ferner ein
Dichtungselement aufweist, das zwischen dem Flansch und einer
inneren Oberfläche des Bodenbereiches des Gehäuses angeordnet
ist, um eine Abdichtung zwischen dem Innenvolumen und einer
externen Umgebung zu bilden. Die Vorspannelemente können
mechanisch sein und können eine Vielzahl von Federelementen
aufweisen, von denen jedes mit einem Ende an das proximale Ende
von jeder der Vielzahl von flüssigkeitsdurchlässigen Vesikeln
gekoppelt ist, und am anderen Ende mit einer inneren Oberfläche
des oberen Bereiches des Gehäuses. Die Federn können eine
mechanische Vorspannkraft auf das proximale Ende der Vesikel
ausüben, um die Dichtung zu bilden.
Das Gehäuse kann ebenfalls einen oberen Bereich aufweisen
sowie ein Befestigungselement, um den oberen Bereich des
Gehäuses an dem unteren Bereich des Gehäuses zu befestigen. Das
Befestigungselement kann eine Vielzahl von Öffnungen zur
Aufnahme von Befestigungselementen aufweisen, die innerhalb des
oberen und unteren Bereiches des Gehäuses ausgebildet sind, und
eine Vielzahl von Befestigungselementen, um den oberen
Abschnitt und den unteren Bereich des Gehäuses aneinander zu
befestigen.
Das Abgabeelement kann eine Druckquelle aufweisen, die in
Flüssigkeitsverbindung mit dem Innenvolumen des Gehäuses steht,
um das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu
bringen. Wo die flüssigkeitsdurchlässigen Vesikel durch
Kapillarwirkung gefüllt werden sollen, kann das Abgabeelement
außerdem eine Druck-Steuereinrichtung aufweisen, die die
Druckquelle variieren kann, um das Innenvolumen des Gehäuses in
variierende Druckzustände zu bringen. Dies ermöglicht dem
Regelelement der Steuereinrichtung das Innenvolumen in einen
ausgewählten Druckzustand zu bringen, der ausreicht, um die
Kapillarwirkung zu kompensieren und die Fluidaufnahmekammer
jeder Vesikel bis zu einer vorgegebenen Höhe zu füllen, die
einer vorgegebenen Fluidmenge entspricht. Außerdem kann die
Steuereinrichtung ein Fluidauswahlelement zum selektiven
Entleeren einer ausgewählten Nanovolumen-Fluidmenge aus der
Kammer jeder Vesikel aufweisen. Weiterhin wird eine
Drucksteuereinrichtung bereitgestellt, die unter der Steuerung
eines Computerprogramms arbeitet, das in einem
Datenverarbeitungssystem abläuft, um eine variable Steuerung
über den an der Innenkammer des Gehäuses anliegenden Druck
bereitzustellen.
Das fluiddurchlässige Vesikel kann ein proximales Ende
aufweisen, das sich zum Innenvolumen des Gehäuses hin öffnet,
und die Fluidaufnahmekammern der Vesikel sind so bemessen, daß
sie sich im wesentlichen vollständig durch Kapillarwirkung mit
dem Fluid füllen, ohne am proximalen offenen Ende einen
Meniskus zu bilden. Wahlweise kann die Vorrichtung mehrere
Vesikeln aufweisen, wobei ein erster Teil der mehreren Vesikeln
Fluidaufnahmekammern einer ersten Größe und ein zweiter Teil
Fluidaufnahmekammern einer zweiten Größe aufweist, wodurch
mehrere Fluidvolumina abgegeben werden können.
Die Vorrichtung kann ebenfalls ein Fluidauswahlelement mit
einer Druckquelle aufweisen, die mit dem Gehäuse gekoppelt ist
und in Verbindung mit dem Innenvolumen steht, um das
Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen,
sowie ein mit der Druckquelle gekoppeltes Einstellelement zum
Variieren des Drucks im Innenvolumen des Gehäuses, um an die
Fluidkammer jeder der fluiddurchlässigen Vesikeln einen
Überdruck anzulegen und die daraus abgegebene Fluidmenge zu
variieren. Das Auswahlelement und das Einstellelement können
Computerprogramme sein, die in einem Datenverarbeitungssystem
ablaufen, das den Betrieb einer mit der Innenkammer verbundenen
Drucksteuereinrichtung lenkt.
Die Vorrichtung mit Stiftwerkzeug kann zur Abgabe eines
Fluids, das ein Polypeptid, insbesondere ein Targetpolypeptid
von Interesse enthält, in eine oder mehrere Vertiefungen eines
Mehrkavitätensubstrats verwendet werden. Die Vorrichtung kann
ein Gehäuse mit mehreren Seiten und einem unteren Abschnitt, in
dem mehrere Öffnungen ausgebildet sind, aufweisen, wobei die
Wände und der untere Abschnitt ein Innenvolumen definieren;
eine Mehrzahl von fluiddurchlässige Vesikeln, die innerhalb der
Öffnungen montiert sind und eine Fluidaufnahmekammer aufweisen,
die mit dem Innenvolumen des Gehäuses in Verbindung steht, und
eine Fluidauswahl- und Abgabeeinrichtung, die mit dem
Innenvolumen des Gehäuses in Verbindung steht, zur variablen
Auswahl einer in die Fluidaufnahmekammern der Vesikeln
eingefüllten Fluidmenge, die aus einer einzigen Gruppe der
mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln abzugeben ist. Demzufolge
geben die Abgabemittel eine ausgewählte Menge der Flüssigkeit
in die Vertiefungen einer Vorrichtung mit mehreren Kavitäten
ab, wenn die Vorrichtung oberhalb und passgenau mit der
Vorrichtung angebracht wird.
Die Flüssigkeitsabgabevorrichtung zum Abgeben einer ein
Polypeptid von Interesse enthaltenden Flüssigkeit in eine oder
mehrere Vertiefungen einer Vorrichtung mit mehreren Kavitäten
kann ein Gehäuse aufweisen, das eine Vielzahl von Seiten-,
oberen und unteren Bereichen aufweist, wobei im Bodenbereich
eine Vielzahl von Öffnungen ausgebildet sind, und die Wände und
oberen und Bodenbereiche des Gehäuses ein Innenvolumen
definieren, eine Vielzahl von flüssigkeitsdurchlässigen
Vesikeln, die innerhalb der Öffnung montiert sind, mit einer
Flüssigkeitsaufnahmekammer, die ausgelegt ist, um Nanovolumina
der Flüssigkeit aufzubewahren, wobei die
Flüssigkeitsaufbewahrungskammer in Flüssigkeitsverbindung mit
dem Volumen des Gehäuses angebracht ist und mechanische
Vorspannelemente, um die Vielzahl von flüssigkeitsdurchlässigen
Vesikeln in abdichtendem Kontakt mit dem Bodenbereich des
Gehäuses mechanisch zu verspannen.
Die Identität eines isolierten Targetpolypeptides wird
mittels Massenspektrometrie bestimmt. Für die
massenspektrometrische Analyse kann das Targetpolypeptid in
einem geeigneten Lösungsmittel- oder Reagenziensystem
solubilisiert werden. Die Auswahl eines Lösung- oder des
Reagenziensystems, beispielsweise einem organischen oder
anorganischen Lösungsmittel, hängt von den Eigenschaften des
Targetpolypeptides und der Art der durchgeführten
Massenspektrometrie ab und fußt auf im Stand der Technik wohl
bekannten Verfahren (siehe z. B., Vorm et al., Anal. Chem.
66: 3281 (1994) für MALDI; Valaskovic et al., Anal. Chem.
67: 3802 (1995) für ESI). Die Massenspektrometrie von Peptiden
wird ebenfalls beispielsweise in der internationalen PCT-
Anmeldung WO 93/24834 von Chait et al. sowie im US-Patent
5,792,664 beschrieben.
Ein Lösungsmittel wird so ausgewählt, um das Risiko, daß
das Targetpolypeptid durch die für den Verdampfungsprozeß
zugeführten Energie zersetzt wird, beträchtlich zu reduzieren
oder gänzlich auszuschließen. Ein verringertes Risiko der
Zersetzung des Targetpolypeptides kann beispielsweise erreicht
werden, indem die Probe in eine Matrix eingebettet wird, die
eine organische Verbindung wie ein Zucker, beispielsweise eine
Pentose oder Hexose, oder ein Polysaccharid wie Cellulose sein
kann. Solche Verbindungen werden thermolytisch in CO2 und H2O
zersetzt, so daß keine Reste gebildet werden, die zu chemischen
Reaktionen führen können. Die Matrix kann ebenfalls eine
anorganische Verbindung wie Ammoniumnitrat sein, daß zersetzt
wird, ohne im wesentlichen Rückstände zu hinterlassen. Die
Verwendung von diesen und anderen Lösungsmitteln ist dem
Fachmann bekannt (siehe z. B. US-Patent 5,062,935).
Massenspektrometer-Formate zur Verwendung in der Analyse
eines Targetpolypeptides schließen Ionisations (I) Techniken
wie matrixunterstützte Laserdesorptionen (MALDI),
kontinuierliche oder gepulste Elektronenspray (ESI) und
verwandte Verfahren wie Ionenspray oder Thermospray und Massive
Cluster Impact (MCI) ein ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
Solche Ionenquellen können mit Detektionsformaten abgeglichen
werden, die lineare oder nicht lineare Reflektron-Flugzeit
(TOF), Einfach- oder Mehrfach-Quadrupol, Einfach- oder
Mehrfach-Magnetischer-Sektor, Fourier Transforma-Ionen-
Cyclotron-Resonanz (FTICR), Ionenfallen, und Kombinationen
davon wie Ionenfalle/Flugzeit einschließen. Für die Ionisation
können zahlreiche Matrix/Wellenlängenkombinationen (MALDI) oder
Lösungsmittelkombinationen (ESI) verwendet werden. Sub-Attomol-
Gehalte von Proteinen sind beispielsweise mittels ESI-
Massenspektrometrie (Valaskovic, et al., Science 273: 1199-1202
(1996)) und MALDI-Massenspektrometrie ((Li et al., J. Am. Chem.
Soc. 118: 1662-1663 (1996)) detektiert worden.
Die Elektronenmassenspektrometrie ist ebenfalls von Fenn
et al., (J. Phys. Chem. 88: 4451-59 (1984); PCT Anmeldung Nr. WO
90/14148) beschrieben worden und jüngste Anmendungen sind in
Übersichtsartikeln zusammengefaßt (Smith et al., Anal. Chem.
62: 882-89 (1990); Ardrey, Electrospray Mass Spectrometry,
Snectroscopy Europe 4: 10-18 (1992)). MALDI-TOF-
Massenspektrometrie ist von Hillenkamp et al., ("Matrix
Assisted UV-Laser Desorption/Ionization; A New Approach to Mass
Spectrometry of Large Biomolecules, Biological Mass
Spectrometry", (Burlingame and McClosey, Hrsg., Elsevier
Science Publ. 1990), Seiten 49-60) beschrieben worden. Mit ESI
ist die Bestimmung von Molekulargewichten in femtomol
Probenmengen aufgrund der Anwesenheit von Mehrfach-Ionen-Peaks,
von denen alle für die Massenberechnung verwendet werden
können, sehr genau.
Die durch Massenspektrometrie bestimmte Masse eines
Targetpolypeptides kann mit der Masse eines korrespondierenden
bekannten Polypeptides verglichen werden. In dem Fall in dem
das Targetpolypeptid ein mutiertes Protein ist, kann
beispielsweise das korrespondierende bekannte Polypeptid das
korrespondierende normale Protein sein. Auf ähnliche Weise kann
in den Fällen, in denen angenommen wird, daß das
Targetpolypeptid von einen Gen translatiert wird, das eine
anormal hohe Anzahl von Trinucleotidwiederholungen besitzt, das
korrespondierende bekannte Polypeptid das korrespondierende
Protein mit einer Wildtyp-Anzahl an Wiederholungen, falls es
diese gibt, sein. Wo das Targetpolypeptid eine Reihe von sich,
wiederholenden Aminosäuren enthält, die direkt mit der Anzahl
von Trinukleotidwiederholungen korreliert sind, die von der DNA
transkribiert und translatiert werden, kann die Anzahl der sich
wiederholenden Trinucleotidwiederholungen in der DNA, die das
Polypeptid codiert, von der Masse des Polypeptides abgeleitet
werden. Falls gewünscht, kann das Polypeptid vor der
Massenspektrometrie wie hier offenbart konditioniert werden,
was die Identifizierung des Polypeptides erleichtert.
Matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) wird unter dem
massenspektrometrischen Verfahren bevorzugt. Verfahren zur
Durchführung von MALDI sind dem Fachmann wohl bekannt (siehe
beispielsweise). Zahlreiche Methoden zur Verbesserung der
Auflösung sind ebenfalls bekannt. Beispielsweise kann die
Auflösung bei der MALDT-TOF Massenspektrometrie verbessert
werden, indem die Anzahl von hochenergetischen Kollisionen
während der Ionenextraktion verringert wird (siehe z. B. Juhasz
et al., (1996) Analysis, Anal. Chem. 68: 941-946, siehe z. B.
ebenfalls US-Patent 5,777,325, US-Patent Nr. 5,742,049,
US-Patent Nr. 5,654,545, US-Patent Nr. 5,641,959, US-Patent Nr.
5,645,545, US-Patent 5,760,393 sowie US-Patent Nr. 5,760,393
für Beschreibungen von MALDI und Protokollen zur verzögerten
Extraktion).
Ein hier offenbarten Verfahren zur Bestimmung der
Identität eines Targetpolypeptides mittels Massenspektrometrie
kann durchgeführt werden, indem die Aminosäuresequenz eines
Targetpolypeptides oder ein Bereich davon bestimmt wird. Die
Aminosäuresequenzierung kann beispielsweise vom Carboxyterminus
mittels einer Carboxypeptidase wie Carboxypeptidase Y,
Carboxypeptidase P, Carboxypeptidase A, Carboxypeptidase G oder
Carboxypeptidase B oder einem anderen Enzym durchgeführt
werden, das ein Polypeptid fortschreitend von seinem
Carboxyterminus verdaut, oder von N-Terminus des
Targetpolypeptides mittels des Verfahrens des Edmann-Abbaus
oder mittels einer Aminopeptidase wie Alanin-Aminopeptidase,
Leucin-Aminppeptidase, Pyroglutamat-Peptidase,
Dipeptidylpeptidase, microsomale Peptidase oder einem anderen
Enzym, das ein Polypeptid fortschreitend von seinem
Aminotherminus verdaut. Falls gewünscht, kann das
Targetpolypeptid mittels eines Enzyms wie Trypsin,
Chymotrypsin, Asp-N, Thrombin oder einem anderen geeigneten
Enzym zuerst in Peptidfragmente gespalten werden. Die Fragmente
können anschließend isoliert werden und der
Aminosäuresequentierung durch Massenspektrometrie unterworfen
werden, oder es kann ein ineinandergreifender Satz von
Deletionsfragmenten des Polypeptides hergestellt werden, indem
das Polypeptid für verschiedene Zeiträume in der Gegenwart
einer Aminopeptidase oder einer Carboxypeptidase inkubiert
wird, und, falls gewünscht, in der Gegenwart von Reagenzien,
die die Aktivität einer Peptidase gegenüber dem Polypeptid
modifizieren (siehe zum Beispiel US-Patent 5,792,664;
internationale Publikation WO 96/36732). Falls gewünscht, kann
ein Anhängsel, beispielsweise ein Peptipanhängsel mit einem
Fragment eines Targetpolypeptides konjugiert werden. Eine
solche Konjugation kann vor oder nach der Spaltung des
Polypeptides durchgeführt werden.
Die Aminosäuresequenzierung eines Targetpolypetides kann
entweder mit dem freien Polypeptid oder nach der
Immobilisierung des Polypeptides auf einem festen Träger
durchgeführt werden. Ein Targetpolypeptid kann auf einem festen
Träger beispielsweise durch Verbinden des Polypeptides mit dem
Träger durch seinen Aminoterminus oder seinem Carboxyterminus
immobilisiert werden, oder direkt oder mittels eines Linkers
oder Linkern durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind,
oder hier beschrieben werden, anschließend Behandeln des
immobilisierten Polypeptides mit einer für den ungebundenen
Therminus spezifischen Exopeptidase. Wo ein Targetpolypeptid an
einen festen Träger durch seinen Aminoterminus verbunden ist,
kann beispielsweise das immobilisierte Polypeptid mit einer
Carboxypeptidase behandelt werden, die das Polypeptid von
seinem Carboxyterminus sequenziell abbaut. Wenn das
Targetpolypeptid mit einem festen Träger durch seinen
Carboxyterminus verbunden ist, kann alternativ dazu das
Polypeptid von seinem Aminoterminus, beispielsweise mittels
Edmanns Reagenz verdaut werden.
Für die Aminosäuresequenzierung wird das Targetpolypeptid
mit der Protease in einer zeitabhängigen Weise behandelt und
freigesetzte Aminosäuren werden durch Massenspektrometrie
identifiziert. Falls gewünscht, kann der Abbau eines
Targetpolypeptides in einer Reaktorvorrichtung durchgeführt
werden (siehe internationale Publikation WO 94/21822,
veröffentlicht am 29.09.1994), in der das Polypeptid frei in
Lösung vorliegen kann und die Protease mobilisiert sein kann,
oder in der die Protease frei in Lösung vorliegen kann und das
Polypeptid immobilisiert sein kann. Die Reaktionsmischung, die
eine freigesetzte Aminosäure enthält, wird in Zeitintervallen
oder als ein kontinuierlicher Strom zu einem Massenspektrometer
für die Analyse transportiert. Vor der massenspektrometrischen
Analyse können die freigesetzten Aminosäuren in ein
Reaktionsgefäß zur Konditionierung transportiert werden, die
durch Massenmodifikation geschehen kann. Die Bestimmung der
Aminosäuresequenz des Targetpolypeptides, insbesondere die
Identifizierung einer allelischen Variation in dem
Targetpolypeptid, verglichen mit dem korrespondierenden
bekannten Polypeptid, kann beispielsweise nützlich sein, um zu
bestimmen, ob das Individuum, von dem das Targetpolypeptid
erhalten wurde, eine besondere Krankheit oder einen Zustand
hat, oder dafür prädispositoniert ist.
Das Polypeptid kann falls gewünscht beispielsweise vor der
Sequenzierung durch Massenmodifizierung konditioniert werden.
Es sollte allerdings klar sein, daß die Massenmodifikation
eines Polypeptides vor dem chemischen oder dem enzymatischen
Abbau beispielsweise die Grade oder den Grad des Abbaus
beeinflussen kann. Demzufolge weiß der Fachmann, daß der
Einfluß der Konditionierung und Massenmodifikation auf den
Polypeptidabbau vor dem Beginn der Aminosäuresequenzierung
charakterisiert werden sollte.
Ein hier offenbartes Verfahren wird bequemerweise in einem
Multiplexingformat durchgeführt, wodurch eine Bestimmung der
Identität einer Vielzahl von 2 oder mehreren Targetpolypeptiden
in einer einzelnen Prozedur ermöglicht wird. Für das
Multiplexing kann eine Population von Targetpolypeptiden durch
in vitro Translation synthetisiert werden, wobei jede der
Targetnukleinsäuren, die jedes der Targetpolypeptide kodiert,
in einer separaten Reaktion, in der Gegenwart von einer oder
mehreren massenmodifizierenden Aminosäuren translatiert wird.
Die Population von Targetpolypeptiden kann beispielsweise von
Targetnukleinsäuren kodiert werden, die verschiedene polymorphe
Regionen eines bestimmten Genes repräsentieren. Jede der
individuellen Reaktionen kann mittels einer oder mehrerer
Aminosäuren durchgeführt werden, die differenziell
massenmodifiziert sind, beispielsweise insbesondere unter
Verwendung basischer Reste, die differenziell massenmodifiert
sind. Nach der Translation ist jedes Targetpolypetid durch die
bestimmte massenmodifizierte Aminosäure unterscheidbar.
Eine Vielzahl von Targetpolypeptiden kann ebenfalls
beispielsweise aus natürlich vorkommenden Proteinen erhalten
werden und durch Multiplexing untersucht werden, vorausgesetzt,
daß jede der Vielzahl von Targetpolypeptiden differenziell
massenmodifiert ist. Wo beispielsweise eine Vielzahl von
Targetpolypeptiden untersucht werden soll, um zu bestimmen, ob
ein bestimmtes Polypeptid eine allelische Variante ist, die
entweder einen Gly-Rest oder einen Ala-Rest enthält, können die
Gly- und Ala-Reste in jedem Polypeptid in der Vielzahl mit
einem Massenmarker massenmodifiziert werden, der für das
Polypeptid spezifisch ist. Die Identifizierung eines Gly- oder
Alarestes mit einer besonderen Masse kann verwendet werdet, um
das bestimmte Polypeptid und die Natur des Polymorphismus zu
bestimmen.
Aminosäuremodifikationen können während oder nach der in
vitro Translation des Targetpolypeptides beeinflußt werden.
Beispielsweise kann jede Aminosäure mit einer funktionellen
Gruppe an einer Seitenkette mittels dem Fachmann bekannter
Verfahren derivatisiert werden. Beispielsweise kann N-
Succinimedyl-3(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) verwendet
werden, um Sulfhydrylgruppen in Lysinresten einzuführen,
wodurch die Masse des Polypeptides im Vergleich zu den
unbehandelten Polypeptiden verändert wird.
Bei anderen Verfahren als demjenigen, bei denen das
Polypeptid sequenziert und dadurch identifiziert wird, wird die
Identifikation eines Polypeptides durch den Vergleich mit einem
Referenz- (oder bekannten) Polypeptid bewirkt. Der die
Identität anzeigende Vergleich ist eine Funktion des
ausgewählten Referenz-Polypeptides. Das Referenz-Polypeptid
kann so ausgewählt werden, daß das Targetpolypeptid entweder
eine Masse besitzt, die im wesentlichwn gleich (identisch
innerhalb des experimentellen Fehlers) mit dem Referenz-
Polypeptid ist, oder eine Masse hat, die sich von dem Referenz-
Polypeptid unterscheidet.
Wenn das Referenzpolypeptid durch ein Wildtyp-Allel eines
Genes kodiert Wird, das als genetischer Marker dient und die
Methode zum Screening auf die Anwesenheit einer Krankheit oder
eines Zustandes dient, die (der) durch eine Mutation in diesem
Allel angezeigt wird, kann beispielsweise die Anwesenheit der
Mutation durch Beobachten einer Differenz zwischen der Masse
des Targetpolypeptides und des Referenz-Polypeptides
identifiziert werden. Die Beobachtung einer solchen Differenz
"identifiziert" dadurch das Polypeptid und zeigt die
Anwesenheit des Markers für die Krankheit oder des Zustandes
an. Das Ergebnis zeigt die Anwesenheit einer Mutation an.
Wenn alternativ das Referenzpolypeptid durch ein mutiertes
Allel eines Genes kodiert wird, das als genetischer Marker
dient, und das Verfahren zum Screening auf die Anwesenheit
einer Krankheit oder eines Zustandes dient, die (der) durch
eine Mutation in demjenigen Allel angezeigt wird, wird die
Anwesenheit der Mutation identifiziert, indem kein Unterschied
zwischen der Masse des Targetpolypeptides und dem
Referenzpolypeptid beobachtet wird. Die Beobachtung von keiner
Differenz "identifiziert" dadurch das Polypeptid und zeigt die
Gegenwart des Markers der Krankheit oder des Zustandes an.
Weiterhin kann dieses Ergebnis Information über die spezifische
Mutation bereitstellen.
Ein hier offenbartes Verfahren kann ebenfalls ein Mittel
zur Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptides
bereitstellen, indem die Massen von definierten
Peptidfragmenten des Targetpolypeptides mit den Massen von
korrespondierenden Peptidfragmenten eines bekannten
Polypeptides verglichen werden. Ein solches Verfahren kann
durchgeführt werden, indem beispielsweise das Targetpolypeptid
durch in vitro Transiation erhalten wird oder durch in vitro
Transkription, gefolgt von Translation einer Nukleinsäure, die
das Targetpolypeptid kodiert; in Kontakt bringen des
Targetpolypeptides mit mindestens einem Mittel, das zumindest
eine Peptidbindung in dem Targetpolypeptid spaltet,
beispielsweise einer Endopeptidase wie Trypsin oder einem
chemischen Spaltungsmittel wie Cyanbromid, um Peptidfragmente
des Targetpolypeptides zu erzeugen; Bestimmen der molekularen
Masse von mindestens einem der Peptidfragmente des
Targetpolypeptides durch Massenspektrometrie; und Vergleichen
der molekularen Masse der Peptidfragmente des
Targetpolypeptides mit der molekularen Masse von
Peptidfragmenten des korrespondierenden bekannten Polypeptides.
Die Massen der Peptidfragmente des korrespondierenden bekannten
Polypeptides können entweder in einer parallelen Reaktion mit
dem Targetpolypeptid bestimmt werden, wobei das
korrespondierende bekannte Polypeptid ebenfalls mit den Mitteln
in Kontakt gebracht wird; können mit bekannten Massen für
Peptidfragmente des korrespondierenden bekannten Peptides
verglichen werden, das mit dem bestimmten Spaltungsmittel in
Kontakt gebracht wurde; oder kann aus einer Datenbank mit
Sequenzinformationen über Polypeptide mittels Algorithmen, die
die molekulare Masse von Peptidfragmenten eines Polypeptides
bestimmen, erhalten werden.
Das offenbarte Verfahren zur Bestimmung der Identität
eines Targetpolypeptides mittels Durchführung von
Massenspektrometrie mit definierten Peptidfragmenten des
Targetpolypeptides ist insbesondere auf ein Multiplexingformat
anpaßbar. Demzufolge wird ein Verfahren zur Bestimmung der
Identität von jedem Targetpolypeptid in einer Vielzahl von
Targetpolypeptiden bereitgestellt, indem die Vielzahl von
Targetpolypeptiden erhalten wird; jedes Targetpolypeptid mit
zumindest einem Mittel in Kontakt gebracht wird, das zumindest
eine Peptidbindung in jedem Targetpolypeptid spaltet, um
Peptidfragmente von jedem Targetpolypeptid zu erzeugen;
Bestimmen der molekularen Masse von zumindest einem der
Peptidfragmente von jedem Targetpolypeptid in der Vielzahl
durch Massenspektrometrie; und Vergleichen der molekularen
Masse der Peptidfragmente von jedem Targetpolypeptid mit der
molekularen Masse von Peptidfragmenten eines korrespondierenden
bekannten Polypeptides.
Bei der Durchführung eines offenbarten Verfahrens kann es
wünschenswert sein, die Targetpolypeptide zu konditionieren.
Die Polypeptide können vor der Spaltung konditioniert werden,
oder die Peptidfragmente des Targetpolypeptides, das durch
Massenspektrometrie untersucht wird, können vor der
Massenspektrometrie konditioniert werden. Es kann ebenfalls
wünschenswert sein, die Masse des Targetpolypeptids zu
modifizieren, insbesondere durch differenzielle
Massenmodifikation von jedem Targetpolypeptid, wenn eine
Vielzahl von Targetpolypeptiden in einem Multiplexingformat
untersucht wird. Die Massenmodifikation kann entweder mit jedem
Polypeptid vor dem Inkontaktbringen des Polypeptides mit dem
Spaltungsmittel durchgeführt werden, oder mit den
Peptidfragmenten des Polypeptides, die durch
Massenspektrometrie untersucht werden.
Ein Targetpolypeptid, insbesondere jedes Targetpolypeptid
einer Vielzahl von Targetpolypeptiden kann vor der
Konditionierung oder Massenmodifizierung des Polypeptides oder
vor dem Inkontaktbringen des Polypeptides mit einem
Spaltungsmittel auf einem festen Träger immobilisiert werden.
Insbesondere kann der feste Träger eine flache Oberfläche sein,
oder eine Oberfläche mit Strukturen wie Vertiefungen, so daß
jedes der Targetpolypeptide in der Vielzahl in einem Raster
angeordnet werden kann, jedes an einer bestimmten Adresse. Im
allgemeinen wird ein Targetpolypeptid auf dem festen Träger
durch einen spaltbaren Linker wie einem säurelabilen Linker,
einen chemisch spaltbaren Linker oder einem photospaltbaren
Linker immobilisiert. Nach der Behandlung des
Targetpolypeptides können die freigesetzten Peptidfragmente
durch Massenspektrometrie analysiert werden, oder die
freigesetzten Peptidfragmente können aus der Reaktion gewaschen
werden und die verbleibenden immobilisierten Peptidfragmente
können beispielsweise durch chemische Spaltung oder
Photospaltung, falls geeignet, freigesetzt werden und können
durch Massenspektrometrie analysiert werden.
Es kann ebenfalls nützlich sein, ein bestimmtes
Targetpolypeptid auf einem Träger sowohl durch den
Aminoterminus und den Carboxyterminus beispielsweise mittels
eines chemisch spaltbaren Linkers an einem Terminus und einem
photospaltbaren Linker an der anderen Ende zu immobilisieren.
Auf diese Weise können die Targetpolypeptide, die
beispielsweise in einem Raster in Vertiefungen immobilisiert
sein können, mit einem oder mehreren Mitteln in Kontakt
gebracht werden, die zumindest eine Peptidbindung in den
Polypeptiden spalten, anschließend können die internen
Peptidfragmente aus den Vertiefungen gewaschen werden, zusammen
mit dem Mittel und jedem Reagenz in den Vertiefungen, wodurch
ein Peptidfragment des Targetpolypeptides, das auf dem festen
Träger durch den chemisch spaltbaren Linker immobilisiert ist
und ein zweites Peptidfragment von der entgegengesetzten Seite
des Targetpolypeptides, das durch den photospaltbaren Linker
immobilisiert ist, zurücklassen wird. Jedes Peptidfragment kann
anschließend durch Massenspektrometrie nach der sequenziellen
Spaltung der Fragmente untersucht werden, beispielsweise
nachdem zuerst der chemisch spaltbare Linker gespalten wird,
und anschließend der photospaltbare Linker gespalten wird. Ein
solches Verfahren stellt ein Mittel bereit, beide Termini eines
Polypeptides zu analysieren, wodurch die Identifikation des
Targetpolypeptides erleichtert wird. Es sollte deutlich sein,
daß die Immobilisierung eines Targetpolypeptides an beiden
Termini durchgeführt werden kann, indem beide Enden des
Targetpolypeptides modifiziert werden, wobei ein Terminus
modifiziert wird, um die Bildung einer chemisch spaltbaren
Verbindung mit dem festen Träger zu ermöglichen und der andere
Terminus modifiziert wird, um die Bildung einer photospaltbaren
Verbindung mit dem festen Träger zu ermöglichen. Alternativ
dazu können die Targetpolypeptide in zwei Bereiche gespalten
werden, einen Bereich, der an einem Terminus so modifiziert
ist, daß er die Bildung beispielsweise einer chemisch
spaltbaren Verbindung ermöglicht, und den zweiten Bereich, der
an dem anderen Terminus so modifiziert ist, daß er die Bildung
beispielsweise einer photospaltbaren Verbindung ermöglicht. Die
zwei Populationen der modifizierten Targetpolypeptide können
zusammen auf einem festen Träger immobilisiert werden, der die
geeigneten funktionellen Gruppen zur Vervollständigung der
Immobilisierung enthält.
Es werden hier Verfahren zur Bestimmung der Identität
eines Targetpolypeptides offenbart. Die Identität des
Targetpolypeptides ermöglicht es, Informationen betreffend die
DNA Sequenz, die das Targetpolypeptid kodiert, zu erhalten. Das
Targetpolypeptid kann aus einem Eukaryonten wie einem
Vertebraten, insbesondere einem Säugetier wie einem Menschen
stammen, oder kann aus einem Prokaryonten, einschließlich eines
Bakteriums oder eines Virus stammen. Im allgemeinen kann das
Polypeptid aus jedem Organismus, einschließlich einer Pflanze
stammen.
Ein Targetpolypeptid kann auf einem festen Träger
immobilisiert werden, wodurch die Manipulation des Polypeptides
vor der Massenspektrometrie erleichtert wird. Ein
Targetpolypeptid kann beispielsweise in vitro translatiert
werden. Ein solches Verfahren zum Erhalten eines
Targetpolypeptides erlaubt auf einfache Weise das Anfügen eines
Anhängsels an das Polypeptid, beispielsweise indem ein
Fusionspolypeptid des Targetpolypeptides mit einem
Peptidanhängsel wie ein Polyhistidinanhängsel hergestellt wird.
Die Anwesenheit eines Peptidanhängsel wie ein
Polyhistidinanhängsel stellt ein Mittel bereit, das
Targetpolypeptid beispielsweise aus der in vitro
Translationsreaktion zu isolieren, indem die Mischung über eine
Nickelchelatsäule gegeben wird, da Nickel-Ionen spezifisch mit
einer Polyhistidinsequenz interagieren. Das Targetpolypeptid
kann dann durch Konjugation mit einem festen Träger eingefangen
werden, wodurch das Targetpolypeptid immobilisiert wird. Im
allgemeinen kann die Konjugation des Polypeptides mit einem
festen Träger durch einen Linker vermittelt werden, der
wünschenswerte Eigenschaften bereitstellt, wie daß er leicht
spaltbar ist, beispielsweise chemisch spaltbar, wärmespaltbar
oder photospaltbar. Wie in Fig. 2 gezeigt, kann beispielsweise
das Targetpolypeptid an seinem Aminoterminus mit einem festen
Träger durch einen Diisopropyllinker immobilisiert werden, der
unter sauren Bedingungen wie bei Exposition zu der Matrixlösung
3-HPA für die Massenspektrometrie leicht spaltbar ist. Das
weiteren kann die Konjugation eines Polypeptides an einen
festen Träger durch Engineering des Polypeptides erleichtert
werden, um beispielsweise einen Strang von Lysinresten zu
enthalten, die die Konzentration von Aminogruppen erhöht, die
verfügbar sind, um mit einem aktivierten Carboxylträger zu
reagieren. Natürlich kann ein Polypeptid durch seinen
Carboxyterminus mittels eines modifizierten Linkers, der in
Fig. 2 gezeigt ist, (siehe Fig. 3) konjugiert werden, oder kann
unter Verwendung anderer, hier offenbarter oder anderweitig
bekannter Linker konjugiert werden. Das immobilisierte
Targetpolypeptid kann anschließend manipuliert werden,
beispielsweise durch protolytische Spaltung mittels einer
Endopeptidase oder eines chemischen Mittels, wie Cyanbromid,
durch sequenzielle Verkürzung von seinem freien Ende mittels
einer Exopeptidase oder einer chemischen Reagenz wie Edmanns
Reagenz oder durch Konditionierung bei der Präparation für die
massenspektrometrische Analyse, beispielsweise durch
Kationenaustausch, um die massenspektrometrische Analyse zu
verbessern. Ein Vorteil, solche Manipulationen mit einem
immobilisierten Polypeptid durchzuführen, ist, daß die
Reagenzen und unerwünschten Reaktionsprodukte von dem
zurückbleibenden immobilisierten Polypeptid weg gewaschen
werden können, das anschließend von dem festen Träger in einer
separaten Reaktion abgespalten werden kann, oder das der
Massenspektrometrie, insbesondere MALDI-TOF unter Bedingungen
unterworden werden kann, die das Polypeptid von dem Träger
abspalten, beispielsweise Exposition eines Polypeptides, das
mit dem Träger durch einen photospaltbaren Linker verbunden
ist, gegenüber dem MALDI-Laser.
Zum Zweck der Konjugationsreaktionen sowie der
enzymatischen Reaktionen wird aufgrund sterischer Betrachtungen
angenommen, daß die Termini des Targetpolypeptides reaktiver
sind als die Seitengruppen der Aminosäuren. Allerdings ist
deutlich, daß Aminosäureseitengruppen reaktiver als der
relevante Terminus sein können, in einem solchen Fall weiß der
Fachmann, daß die Seitengruppe vor der Durchführung der
interessieren Reaktion blockiert werden sollte. Verfahren zur
Blockierung einer Aminosäureseitengruppe sind wohlbekannt und
blockierte Aminosäurenreste sind leicht erhältlich und werden
beispielsweise für die chemische Synthese von Peptiden
verwendet. In ähnlicher Weise ist deutlich, daß ein
interessierender Terminus des Polypeptides beispielsweise
aufgrund einer posttranslationalen Modifikation blockiert sein
kann, oder innerhalb eines Polypeptides aufgrund einer
Sekundär- oder Tertiärkonformation verborgen sein kann.
Demzufolge erkennt der Fachmann, daß beispielsweise ein
blockierter Aminoterminus eines Polypeptides reaktiv gemacht
werden muß, entweder durch Abspaltung der aminoterminalen
Aminosäuren oder durch Entfernen der Blockierung der
Aminosäure. Wenn der interessierende Terminus innerhalb der
Polypeptidstruktur verborgen ist, weiß der Fachmann darüber
hinaus, daß das Polypeptid in Lösung auf ungefähr 70 bis 100°C
vor der Durchführung einer Reaktion erhitzt werden kann. Es ist
beispielsweise deutlich, daß, wenn die durchzuführende Reaktion
eine enzymatischen Spaltung ist, die ausgewählten Enzyme bei
erhöhten Temperaturen stabil sein sollten. Solche
temperaturstabilen Enzyme, beispielsweise thermostabile
Peptidasen, einschließlich Carboxypeptidasen und
Aminopeptidasen werden aus thermophilen Organismen erhalten und
sind kommerziell erhältlich. Wenn es nicht wünschenswert ist,
wärme zu verwenden, um einen ansonsten vergrabenen Terminus
eines Polypeptides zu exponieren, kann darüber hinaus die
Veränderung der Salzbedingungen ein Mittel zur Exposition des
Terminus bieten. Beispielsweise kann ein Polypeptidterminus
mittels Bedingungen von hoher Ionenstärke exponiert werden, in
solchen Fällen wird ein Enzym wie eine Exopeptidase auf
Grundlage seiner Toleranz gegenüber Bedingung hoher Ionenstärke
ausgewählt.
Abhängig von dem zu detektierenden Targetpolypeptid
ermöglichen die offenbarten Verfahren die Diagnose
beispielsweise einer genetischen Krankheit oder einer
chromosomalen Anormalität; einer Prädisposition gegenüber oder
eine frühe Indikation einer Gen beeinflußten Krankheit oder
eines Zustandes wie Fettleibigkeit, Artheriosklerosis, Diabetes
oder Krebs oder einer Infektion durch einen pathogenen
Organismus einschließlich eines Virus, Bakteriums, Parasiten
oder Pilzes; oder um Informationen bezüglich der Identität oder
der zugrundeliegenden Vererbung bereitzustellen, die
beispielsweise auf der einer Analyse von Minisatelliten und
Mikrosatelliten basiert, oder bezüglich Kompatiblität,
beispielsweise auf Basis der HLA-Phänotyp-Bestimmung.
Ein Verfahren wird hier bereitgestellt zur Detektion von
genetischen Läsionen, die durch eine anormale Zahl von
Trinukleotidwiederholungen charakterisiert sind, die im Bereich
von weniger als 10 bis mehr als 100 zusätzlichen
Trinukleotidwiederholungen bezogen auf die Anzahl von
Wiederholungen, falls vorhanden, in einem Gen in einem nicht
betroffenen Individuum. Krankheiten mit solchen genetischen
Läsionen schließen beispielsweise ein Huntingtons Krankheit,
Prostatakrebs; SCA-1, fragiles X-Syndrom (Kremer et al.,
Science 252: 1711-14 (1991); Fu et al., Cell 67: 1047-58 (1991);
Hirst et al., J. Med. Genet., 28: 824-29 (1991); myotonische
Dystrophie Typ I (Mahadevan et al., 255: 1253-55 (1992); Brook
et al., Cell 68: 799-808 (1992)), Kennedys Krankheit (die
ebenfalls spinale und bulbäre Muskelatrophie bezeichnet wird;
La Spada et al., Nature 352: 770-79 (1991)); Machado-Joseph-
Krankheit sowie dentatorubrale und pallidolyusiane Atrophie.
Die anormale Anzahl von Tripletwiederholungen kann sich in
jeder Region eines Genes befinden, einschließlich einer
kodierenden Region, einer nicht kodierenden Region eines Exons,
eines Introns oder einem Promoter oder einem anderen
regulatorischen Element. Beispielsweise tritt die ausgedehnte
Trinucleotidwiederholung, die mit myotonischer Dystrophie
assoziiert ist, in der 3' nicht translatierten Region (UTR) des
MtPK-Genes auf Chromosom 19 auf. Bei einigen dieser
Krankheiten, beispielsweise Prostatakrebs, ist die Anzahl der
Trinukleotidwiederholungen positiv mit der Prognose der
Krankheit so korreliert, daß eine höhere Anzahl von
Trinukleotidwiederholungen mit einer schlimmeren Prognose
korreliert.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Identität einer
allelischen Variante einer polymorphen Region eines Genes,
insbesondere eines humanen Genes, wird ebenfalls
bereitgestellt. Alliche Varianten können in der Identität eines
einzigen Nukleotids oder Basenpaares differieren,
beispielsweise durch Subsitution eines Nukleotides; in zwei
oder mehr Nukleotiden oder Basenpaaren; oder in der Anzahl von
Nukleotiden beispielsweise aufgrund von Deletionen von
Nukleotiden oder von Trinukleotidwiederholungen; oder aufgrund
chromosomaler Umlagerungen, wie Translokationen. Spezifische
allelische Varianten von polymorphen Regionen sind mit
spezifischen Krankheiten assoziiert und korrelieren in einigen
Fällen mit der Prognose der Krankheit. Eine spezifische
allelische Variante einer polymorphen Region, die mit einer
Krankheit assoziiert ist, wird hier als eine "mutierte
allelische Variante" bezeichnet und wird als "genetische
Läsion" betrachtet.
Ebenfalls wird ein Verfahren zur Bestimmung der
genetischen Natur eines Phänotyps oder zur Identifizierung
einer Prädisposition gegenüber diesem Phenotyp bereitgestellt.
Beispielsweise kann bestimmt werden, ob ein Individuum eine
Prädisposition gegenüber einer spezifischen Krankheit oder
einem Zustand aufweist, daß heißt, ob das Individuum ein Risiko
besitzt oder dieses hat, eine Krankheit oder einen Zustand zu
entwickeln, der mit einer spezifischen oder allelischen
Varianten einer polymorphen Region eines Genes assoziiert ist.
Ein solches Individuum kann identifiziert werden, indem
bestimmt wird, ob das Individuum eine allelische Variante
trägt, die mit der spezifischen Krankheit oder dem Zustand
assoziiert ist. Wenn die Krankheit eine rezessive Krankheit
ist, kann weiterhin bestimmt werden, ob das Individuum ein
Träger eines rezessiven Alleles, eines Genes ist, das mit der
spezifischen Krankheit oder dem Zustand assoziiert ist.
Zahlreiche Krankheiten oder Zustände sind mit einem
spezifischen Gen verbunden worden und insbesondere mit einer
spezifischen Mutation unter genetischer Läsion eines Genes.
Beispielsweise sind hyperproliferatorische Krankheiten wie
Krebsarten mit Mutationen in spezifischen Genen assoziiert.
Solche Krebsarten schließen Brustkrebs ein, der mit Mutationen
in BRCA 1 oder BRCA 2 in Verbindung gebracht worden ist.
Mutierte Allele von BRCA 1 sind beispielsweise im US-Patent
5,622,829 beschrieben. Andere Gene wie Tumor-Suppressor-Gene,
die bei Mutation mit der Entwicklung von Krebs assoziiert
werden, schließen p53 (assoziiert mit vielen Krebsformen); Rb
(Retinoblastom); WT1 (Wilms Tumor) and verschiedene Proto-
Onkogene wie c-myc und c-fos (siehe Thompson und Thompson,
"Genetics in Medicine" 5. Aufl.; Nora et al., "Medical
Genetics" 4. Aufl. (Lea und Febiger, Hrsg)). ein, sind jedoch
nicht auf diese beschränkt.
Ein hier offenbartes Verfahren kann verwendet werden, DNA-
Mutationen zu detektieren, die zu der Translation eines
verkürzten Polypeptides führen, wie es zum Beispiel für BRCA 1
und BRCA 2 vorkommt. Die Translation von Nukleinsäureregionen,
die eine solche Mutation enthalten, führt zu einem verkürzten
Peptid, das leicht von dem korrespondierenden, nicht verkürzten
Polypeptid mittels Massenspektrometrie unterschieden werden
kann.
Ein hier offenbartes Verfahren kann ebenfalls verwendet
werden, um den Genotyp eines Individuums zu bestimmen,
beispielsweise eines Individuums, das als Empfänger oder ein
Spender eines Organes oder eines Knochenmarktransplantates in
Betracht gezogen wird. Beispielsweise kann die Identität von
MHC-Allelen, insbesondere HLA-Allelen in einem Individuum
bestimmt werden. Die mittels einer solchen Methode erhaltene
Information ist nützlich, da die Transplantation eines
Transplantates in einem Empfänger, der unterschiedliche
Transplantations-Antigene als das Transplatat besitzt, zu einer
Abstoßung des Transplantates führen kann und zu "graft versus
host disease" bei einer Knochenmarktransplantation führen kann.
Die Antwort eines Individuum auf Medikamente kann durch
Variationen in Wirkstoff modifizierenden Systemen wie dem
Cytochrom P450 System beeinflußt werden, und die
Suszeptibilität gegenüber bestimmten infektiösen Krankheiten
kann durch den genetischen Status beeinflußt werden. Daher kann
die Identifikation von bestimmten allelischen Varianten
verwendet werden, um die potentielle Antwort eines Individuums
auf bestimmte Wirkstoffe oder die Empfänglichkeit eines
Individuums gegenüber einer Infektionskrankheit vorherzusagen.
Gene, die in Pharmacogenetics involviert sind, sind bekannt
(siehe z. B., Nora et al., "Medical Genetics" 4. Aufl. (Lea und
Febiger, Hrsg.).
Einige polymorphe Regionen müssen nicht mit einer
Krankheit oder einem Zustand verbunden sein. Beispielsweise
enthalten viele Loci im humanen Genom eine polymorphe Region
mit kurzen Tandern-Repeats (STR). STR-Loci enthalten kurze, sich
wiederholende Sequenzelemente von 3 bis 7 Basenpaaren Länge. Es
wird geschätzt, daß es 200 000 erwartete trimere und tetramere
STR s gibt, die in einer Häufigkeit von einem pro 15 kb im
humanen Genom vorkommen (siehe z. B. internationale PCT-
Anmeldung WO 92/13969 A1; Edward et al., Nucl. Acids Res.
19: 4791 (1991); Beckmann et al., (1992) Genomics 12: 627-631).
Annähernd die Hälfte dieser STR-Loci sind polymorph, und
stellen daher eine reiche Quelle an genetischen Markern bereit.
Die Variation in der Anzahl von Wiederholungseinheiten bei
einem bestimmten Locus ist für die beobachtete Polymorphismus-
Reminiszenz von variablen Nukleotidtandern-Wiederholungs-(VNTR)
Loci verantwortlich (Nakamura et al., (1987) Science 235: 1616-1622);
sowie Minisatelliten-Loci (Jeffreys et al. (1985) Nature
314: 67-73), die längere Repeat-Einheiten enthalten und
Mikrosatelliten oder Dinukleotid-Wiederholungs-Loci (Luty et
al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4308; Litt et al. Nucleic
Acids Res. 18: 4301;. Litt et al. (1990) Nucleic Acids Res.
18: 5921; Luty et al. (1990) Am. J. Genet. 46: 776-783; Tautz
(1989) Nucl. Acids Res. 17: 6463-6471; Weber et al. (1989) Am.
J. Hum. Genet. 44: 388-396; Beckmann et al. (1992) Genomics
12: 627-631).
Polymorphe STR-Loci und andere polymorphe Regionen von
Genen sind extrem nützliche Marker für die humane
Identifikation, Vaterschafts- und Mutterschaftstest, genetische
Kartierung, Wanderungs- und Vererbungsstreite, Zygotentest bei
Zwillingen, Test auf Inzucht beim Menschen, Qualitätskontrolle
von kultivierten Humanzellen, Identifikation von menschlichen
Überresten und der Überprüfung von Samenproben, Bluttropfen und
anderem Material in der forensischen Medizin. Solche Loci sind
ebenfalls nützliche Marker bei der kommerziellen Tierzüchtung
in Pflanzenarten und Tieren können durch die Verbindungsanalyse
mittels polymorpher DNA-Marker identifiziert werden. Effiziente
Verfahren zur Bestimmung der Identität solcher Loci werden hier
offenbart.
STR-Loci können mittels PCR unter Verwendung spezifischer
Primer-Sequenzen amplifiziert werden, die in den Regionen
identifiziert sind, die aufzuspürenden Tandemrepeat flankieren.
Allelische Formen dieser Loci werden durch die Anzahl von
Kopien der Wiederholungssequenz, die in der amplifizierten
Region enthalten ist, unterschieden. Beispiele von STR-Loci
schließen Pentanukleotidwiederholungen im humanen CD4 Locus
(Edwards et al., Nucl. Acids Res. 19: 4791 (1991);
Tetranukleotidwiederholungen in dem humanen Aromatase Cytochrom
P-450 Gen (CYP19; Polymeropoulos et al., Nucleic Acids Res.
19: 195 (1991)); Tetranucleotide im Gen der Untereinheit A des
humanen Koagulationsfaktor XIII (F13A1; Polymeropoulos et al.,
Nucl. Acids. Res. 19: 4306 (1991)); Tetranucleotidwiederholungen
im F13B Locus (Nishimura et al., Nucl. Acids Res. 20: 1167
(1992)) Tetranucleotidwiederholungen im humanen c-les/fps
Proto-Onkogen (FES; Polymeropoulos et al., Nucl. Acids Res.
19: 4018 (1991)); Tetranucleotidwiederholungen im LFL-Gen
(Zuliane et al., Nucl. Acids Res. 18: 4958 (1990));
Polymorphismus der Trinucleotidwiederholungen im humanen
pankreatischen Phospolipase A-2 Gen (PLA2; Polymeropoulos et
al. Nucl. Acids Res. 18: 7468 (1990)); Polymorphismen der
Tetranucleotidwiederholungen im VWF Gen (Ploos et al., Nucl.
Acids Res. 18: 4957 (1990)); und Tetranucleotidwiederholungen im
humanen Thyriod-Peroxidase (hTPO) Locus (Anker et al., Hum.
Mol. Genet. 1: 137 (1992)) ein, sind jedoch nicht auf diese
beschränkt.
Eine Target-DNA-Sequenz kann Teil einer fremden
genetischen Sequenz wie dem Genom eines eindringenden
Mikroorganismusses, einschließlich beispielsweise Bakterien und
deren Phagen, Viren, Pilze, Protozoen und dergleichen, sein.
Die hier bereitgestellten Verfahren sind insbesondere
anwendbar, um zwischen verschiedenen Varianten oder Stämmen
eines Mikroorganismuses zu unterscheiden, beispielsweise um
einen geeigneten therapeutischen Eingriff auszuwählen.
Beispiele von krankheitsverursachenden Viren, die Menschen und
Tiere infizieren und die mittels eines offenbarten Verfahrens
selektiert werden können, schließen ein Retroviridae (zum
Beispiel humane Immun-Defizienzviren wie HIV-1, das ebenfalls
als HTLV-III, LAV oder HTLV-III/LAV bezeichnet wird; Ratner et
al., Nature, 313: 227-284 (1985); Wain Hobson et al. Cell, 40:
9-17 (1985) HIV-2 (Guyader et al., Nature, 328: 662-669 (1987);
europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 655 501), sowie andere
Isolate wie HIV-LP (internationale Veröffentlichung WO
94/00562), Picornaviridae (Polioviren, Hepatitis A Virus, (Gus
et al., I, Intervirology, 20: 1-7 (1983)); Enteroviren, humane
Coxsackie-Viren, Rhino-Viren, Echo-Viren, Calcivirdae (z. B.
Stämme, die Gastroenteritis verursachen), Togaviridae (z. B.
Encephalitis-Viren), Flaviridae (z. B. Dengue-Viren,
Enzephalitis-Viren, Gelbfieber-Viren), Coronaviridae (z. B.
Corona-Viren), Rhabdoviridae (z. B. vesikuläre Stomatitis-
Viren, Tollwut-Viren), Filoviridae (z. B. Ebola-Viren);
Paramyxoviridae (z. B. Parainfluenza-Viren, Mumps-Virus,
Masern-Virus, respiratorisches Syncytial-Virus);
Orthomyxoviridae (z. B. Influenza-Viren); Bungaviridae (z. B.
Hantaan-Viren, Bunga-Viren, Phlebo-Viren und Nairo-Viren);
Arenaviridae (z. B. Hemoragische Fieber-Viren); Reoviridae (z.
B. Reo-Viren, Orbi-Viren und Rota-Viren); Birnaviridae;
Hepadnaviridae (z. B. Hepatitis B Virus); Parvoviridae (z. B.
Parvo-Viren); Papovaviridae; Hepadnaviridae (Hepatitis B
Virus); Parvoviridae (die meisten Adeno-Viren); Papovaviridae
(Papillom-Viren, Polyoma-Viren); Adenoviridae (die meisten
Adeno-Viren); Herpesviridae (Herpes simplex Virus Typ 1 (HSV-1)
und HSV-2, Varicella Zaster Virus, Cytomegalovirus,
Herpesviren); Poxviridae (Variola-Viren, Vaccina-Viren, Pocken-
Viren); Iridoviridae (z. B. afrikanisches Schweinefieber-
Virus); und unklassifizierte Viren (z. B. die ätiologischen
Mittel der Spongiform-Enzephalophathien, das Mittel von Delta
Hepatitis, von dem angenommen wird, daß es ein zerstörerischer
Satellit des Hepatitis B Virus ist), die Mittel von nicht-A,
nicht-B Hepatitis (Klasse 1 = intern übertragen; Klasse 2 =
parenteral übertragen, d. h. Hepatitis C); Norwalk und
verwandte Viren sowie Astro-Viren, sind jedoch nicht auf diese
beschränkt.
Beispiele von infektiösen Bakterien schließen Helicobacter
pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia,
Mycobacteria sp. (z. B. M. tuberculosis, M. avium, M.
intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus
aureus, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Listeria
monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Gruppe A Streptococcus),
Streptococcus agalactiae (Gruppe B Streptococcus),
Streptococcus sp. (Viridans-Gruppe), Streptococcus faecalis,
Streptococcus bovis, Streptococcus sp. (anaerobie Spezies),
Streptococcus pneumoniae, Pathogene Campylobacter sp.,
Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis,
Corynebacterium diphteriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix
rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani,
Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella
multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum,
Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema
pertenue, Leptospira, und Actinomyces israelli ein, sind jedoch
nicht auf diese beschränkt.
Beispiele von infektiösen Pilzen schließen Cryptococcus
neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis,
Blastomyces dermatidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans
ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Andere infektiöse
Organismen schließen Protisten wie Plasmodium falciparum und
Toxoplasma gondii ein.
Die hier bereitgestellten Verfahren und Kits werden anhand
der folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, die in keiner
Weise als einschränkend verstanden werden sollen. Der Inhalt
aller zitierten Referenzen, einschließlich Literaturstellen,
veröffentlichten Patenten, veröffentlichten Patentanmeldungen,
die in dieser Anmeldung zitiert sind, werden ausdrücklich durch
Bezugnahme darauf hier einbezogen. Die Durchführung der
Verfahren verwenden, solange nicht anderweitig angezeigt,
übliche Techniken der Zellbiologie, Zellkultur,
Molekularbiologie, transgenen Biologie, Mikrobiologie,
rekombinanter DNA und Immunologie, die im Bereich des
Fachwissens liegen. Solche Techniken sind ausführlich in der
Literatur erklärt, siehe z. B., DNA Coning, Band I und II (D. N.
Glover Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait
Hrsg., 1984); Mullis et al. US-Patent Nr. 4,683,194; Nucleic
Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg., 1984);
Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg.,
1984); Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss,
Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986);
B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the
treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.);
Gene Transfer Vectors Mammalian Cells (J. H. Miller und M. P.
Calos Hrsg., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In
Enzymology, Band 154 und 155 (Wu et al., Hrsg.), Immunochemical
Methods In Cell Molecular Biology (Mayer und Walker, Hrsg.
Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental
Immunology, Band I-IV (D. M. Weir und C. C. Blackwell, Hrsg.,
1986); Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986).
Die folgenden Beispiele sind lediglich zum Zweck der
Veranschaulichung aufgenommen und sollen den Umfang der
Erfindung nicht beschränken.
Dieses Beispiel zeigt, das genomische DNA, die von
Patienten mit spinaler, zerebellarer Ataxie 1 (SCA-1) erhalten
worden ist, verwendet werden kann, um Targetpolypeptide zu
identifizieren, die durch Trinucleotidwiederholungen kodiert
sind, die mit SCA-1 assoziiert sind.
Humane genomische DNA wurde mittels des QIAMP Blut Kits
(Qulagen) gemäß Herstellerprotokoll extrahiert. Eine Region der
extrahierten DNA, die die mit SCA-1 assoziierte (CAG)-
Wiederholung enthält, wurde mittels PCR unter Verwendung von
Primern, die modifiziert waren, um eine Transkription-Promotor-
Sequenz und eine Region, die für ein His-6 Peptidanhängsel
kodiert, zu enthalten, amplifiziert. Der Forward Primer hatte
die folgende Nukleotidsequenz, in dem die T7 Promotorsequenz
kursiv dargestellt ist und die Basen auf der 5'-Seite des
Promotors zufällig sind:
5'-d(GAC TTT ACT TGT ACG TGC ATA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CTG ACC ATG GGC AGT CTG AGC CA) (SEQ ID NO: 6).
5'-d(GAC TTT ACT TGT ACG TGC ATA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CTG ACC ATG GGC AGT CTG AGC CA) (SEQ ID NO: 6).
Der Rückwärts-Primer hatte die folgende Nukleotidsequenz,
in der die Nukleotidsequenz, die das His-6 Peptidanhängsel
kodiert, in Fettdruck dargestellt ist, und die ersten sechs 5'-
Basen zufällig sind:
Das Reaktionsvolumen betrug insgesamt 50 µl mit 20 µmol
Primer pro Reaktion. Taq-Polymerase, einschließlich 10x Puffer,
wurde von Boehringer Mannheim erhalten und dNTPs wurden von
Pharmacia erhalten. Die Zyklusbedingungen schlossen 5 Minuten
bei 94°C ein, gefolgt von 35 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C,
45 Sekunden bei 53°C, 30 Sekunden bei 72°C, mit einer letzten
Verlängerungszeit von 2 Minuten bei 72°C. Die PCR-Produkte
wurden mittels des Qiagen QUIAQUICK Kits gereinigt, und die
Elution der gereinigten Produkte wurde mittels 50 µl 10 mM Tris-
HCl (pH 8) durchgeführt.
Die gekoppelte Transkription und Translation wurde unter
Verwendung des TNT-Reaktionspuffers (Promega) durchgeführt. Die
Reaktionskomponenten wurden in einem Gesamtvolumen von 50 µl
aufgetaut und gemäß dem Protokoll des Herstellers unter
Verwendung von 1 µl T7-RNA-Polymerase und 1 pmol-amplifizierter
DNA vermischt, mit der Ausnahme, daß unmarkiertes Methionin
anstelle von 35S-Methionin verwendet wurde. Die
Reaktionsmischung wurde für 90 Minuten bei 30°C inkubiert.
Das translatierte Polypeptid mit einem His-6 Anhängsel
wurde aus der Weizenkeimextrakt-Mischung unter Verwendung des
Qiagen QIAEXPRESS Ni-NTA Proteinreinigungssystem gemäß dem
Protokoll des Herstellers gereinigt. Kurz gesagt, wurde die
Extraktmischung durch Zentrifugation durch eine Spin-Säule
gewaschen, die ein Nickel-Nitriloessigsäure-Harz enthält, das
das His-6 Peptidanhängsel des Polypeptids durch Affinität
einfängt. Das Polypeptid wurde von der Säule mit 100 mM
Imidazol eluiert.
Das translatierte Polypeptid wurde entweder direkt mit
Matrix aus der Elutionslösung vermischt oder wurde zuerst
lyophilisiert und in 5 µl H2O resuspendiert. Diese Lösung wurde
1 : 1 (v : v) mit Matrixlösung vermischt (konzentrierte
Sinnapinsäure in 50/50 v : v Ethanol/H2O) und 0,5 µl der Mischung
wurde zu einer Probensonde zur Analyse in einem linearen
Fluzeit-Massenspektrometer hinzugegeben, das in verzögertem
Ionenextraktionsmodus mit einem Quellenpotential von 25 kV
betrieben wurde. Eine interne Kalibrierung wurde für alle
Spektren mittels dreier intensiver Matrixionen-Signale
erreicht.
Genomische DNA wurde wie oben beschrieben von 4 Patienten
mit SCA-1 erhalten. Drei der Patienten hatten 10, 15 oder 16
CAG-Wiederholungen und der vierte Patient hatte eine unbekannte
Anzahl von Trinukleotid-Wiederholungen.
Eine Region, die die Trinukleotid-Wiederholungen enthält,
wurde mittels PCR, unter Verwendung von Primern (SEQ ID Nr. 6
und 7), die an Sequenzen auf jeweils einer Seite der
Wiederholungen hybridisierten, amplifiziert. Die
Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 8) eines PCR-Produkts, das von
einer Region, die 10 CAG-Wiederholungen enthielt, ist in Fig.
1A gezeigt und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 8) eines
Polypeptids, das von der amplifizierten Nukleinsäure kodiert
wird, ist in Fig. 1B gezeigt (SEQ ID Nr. 9).
Die amplifizierte DNA jedes Patienten wurde einer in vitro
Transkription und Translation unterworfen, und die
Targetpolypeptide wurden auf einer Nickelchromatographie-Säule
isoliert. Die massenspektrometrische Analyse der durch die
Targetpolypeptide kodierten Peptiden, die durch die 10, 15 und
16 CRG-Wiederholungen kodiert waren, zeigten an, daß diese
Peptide eine molekulare Masse von 8238,8, 8865,4 bzw. 8993,6
Dalton besaßen. Das Polypeptid, das von der Nukleinsäure des
vierten Patienten kodiert wurde, mit einer unbekannten Anzahl
von Trinukleotidwiederholungen, besaß ein Molekulargewicht von
8224,8. Während dieser Wert nicht genau einer Einheitenzahl von
Wiederholungen entspricht (10 ist die näheste), ist er
konsistent mit der Detektion einer Punkt-Mutation; d. h., der
-14-Dalton-Shift für dieses Polypeptid korrespondiert zu einer
Ala → Gly-Mutation aufgrund einer C → G-Mutation in einer der
Wiederholungen. Dieses Ergebnis zeigt an, daß das offenbarte
Verfahren die Identifikation eines Targetpolypeptids
ermöglicht, das durch eine genetische Läsion kodiert wird, die
mit einer Krankheit assoziiert ist. Des weiteren zeigen die
Ergebnisse, daß ein solches Verfahren die Detektion eines
Unterschieds einer einzigen Base zwischen zwei Nukleinsäuren
ermöglicht.
Die Detektion solcher subtiler Differenzen in den
Proteinlängen werden mit elektrophoretischen Methoden selbst
bei Verwendung von multiplen, internen Standards nicht
reproduzierbar erhalten. Selbst MS-Instrumentierung mit
niedrigem Wirkungsgrad ist für ein weitaus bessere
Massengenauigkeit als 0,1% in diesem Massenbereich mittels
interner Kalibierung befähigt; Instrumentierung mit höheren
Witkungsgrad, wie Fourier-Transformations-MS ist zu einer ppm-
Massengenauigkeit mit interner oder externer Kalibrierung
fähig. Es sei angemerkt, daß der Massenunterschied zwischen den
15 und den 16 Wiederholungseinheiten-Polypeptiden 1,4% beträgt
und der 14 Dalton Massen-Shift aufgrund der Punkt-Mutation
zwischen den 10 Wiederholungs-Patienten 0,17% beträgt. Es ist
deutlich, daß jede dieser Situationen routinemäßig erfolgreich
analysiert werden kann.
3-Brom-1-propanol(3,34 g, 24 mmol) wurde in 80 ml
wasserfreiem Acetonitril mit 5-Hydroxy-2-nitrobenzaldehyd (3,34
g, 20 mmol), K2CO3 (3, 5 g) sowie KI (100 mg) über Nacht (15 Std.)
am Rückfluß erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde auf
Raumtemperatur abgekühlt und 150 ml Methylenchlorid wurden
hinzugefügt. Die Mischung wurde filtriert und der feste
Rückstand wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigte,
organische Lösung wurde bis zur Trockne eingedampf und in 100 ml
Methylenchlorid gelöst. Die sich ergebende Lösung wurde mit
gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat
getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels im Vakkum
wurden 4,31 g (96%) des gewünschten Produkts erhalten.
Rf = 0,33 (Dichloromethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol) Maximum: 313, 240 (Schulter), 215 nm; Minimum: 266 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 10.28 (s, 1H), 8.17 (d, 1H), 7.35 (d, 1H), (s, 1H), 4.22 (t, 2H), 3.54 (t, 2H), 1.90 (m, 2H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 189.9, 153.0, 141.6, 134.3, 127.3, 118.4, 114.0, 66.2, 56.9, 31.7.
Rf = 0,33 (Dichloromethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol) Maximum: 313, 240 (Schulter), 215 nm; Minimum: 266 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 10.28 (s, 1H), 8.17 (d, 1H), 7.35 (d, 1H), (s, 1H), 4.22 (t, 2H), 3.54 (t, 2H), 1.90 (m, 2H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 189.9, 153.0, 141.6, 134.3, 127.3, 118.4, 114.0, 66.2, 56.9, 31.7.
2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)benzaldehyd (1 g, 4,44 mmol)
wurde in 50 ml wasserfreiem Acetonitril aufgelöst. Zu dieser
Lösung wurde 1 ml Triethylamin, 200 mg Imidazol und 0,8 g
(5,3 mmol) tBDMSCl hinzugegeben. Die Mischung wurde bei
Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Methanol (1 ml) wurde zur
Beendigung der Reaktion hinzugefügt. Das Lösungsmittel wurde im
Vakkuum entfernt und der feste Rückstand wurde in 100 ml
Methylenchlorid gelöst. Die sich ergebende Lösung wurde mit
gesättigter Natriumbicarboriatlösung und anschließend mit Wasser
gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat
getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt. Die
Rohmischung wurde mit Methylenchlorid einer Silicagel-Schnell-
Säule unterworfen, um 1,44 g (96%) 2-Nitro-5-(3-O-t-
butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd zu ergeben.
Rf = 0,67 (Hexan/Ethylacetat, 5/1).
UV (Methanol), Maximum: 317, 243, 215 nm; Minimum: 235, 267 nm
1H NMR (DMSO-d6) δ 10,28 (s, 1H), 8,14 (d, 1H), 7,32 (d, 1H), 7,20 (s, 1H), 4,20 (t, 2H), 3,75 (t, 2H), 1,90 (m, 2H), 0,85 (s, 9H), 0,02 (s, 6H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 189,6, 162,7, 141,5, 134,0, 127,1, 118,2 113,8, 65,4, 58,5, 31,2, 25,5, -3,1, -5,7.
Rf = 0,67 (Hexan/Ethylacetat, 5/1).
UV (Methanol), Maximum: 317, 243, 215 nm; Minimum: 235, 267 nm
1H NMR (DMSO-d6) δ 10,28 (s, 1H), 8,14 (d, 1H), 7,32 (d, 1H), 7,20 (s, 1H), 4,20 (t, 2H), 3,75 (t, 2H), 1,90 (m, 2H), 0,85 (s, 9H), 0,02 (s, 6H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 189,6, 162,7, 141,5, 134,0, 127,1, 118,2 113,8, 65,4, 58,5, 31,2, 25,5, -3,1, -5,7.
Im Hochvakkuum getrockneter 2-Nitro-5-(3-O-t-
butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd (1,02 g, 3 mmol) wurde in
50 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. 2M Trimethyl
aluminium in Toluol (3 ml) wurde tropfenweise innerhalb 10
Minuten hinzugefügt und die Reaktionsmischung wurde bei
Raumtemperatur gehalten. Es wurde für weitere 10 Minuten
gerührt und die Mischung wurde in 10 ml eiskaltes Wasser
gegoßen. Die Emulsion wurde von der Wasserphase abgetrennt und
über 100 g Natriumsulfat getrocknet, um das verbleibende Wasser
zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt und
die Mischung wurde auf eine Silicagel-Säule mit Gradienten-
Methanol in Methylenchlorid aufgetragen. Es wurden 0,94 g (86%)
des gewünschten Produkts isoliert.
Rf = 0,375 (Hexan/Ethylacetat, 5/1)
UV (Methanol), Maximum: 306, 233, 206 nm; Minimum: 255, 220 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 8,00 (d, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,00 (d, 1H), 5,49 (b, OH), 5,31 (q, 1H), 4,19 (m, 2H), 3,77 (t, 2H), 1,95 (m, 2H), 1,37 (d, 3H), 0,86 (s, 9H), 0,04 (s, 6H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 162,6, 146,2, 139,6, 126,9, 112,9, 112,5, 64,8, 63,9, 58,7, 31,5, 25,6, 24,9, -3,4, -5,8.
Rf = 0,375 (Hexan/Ethylacetat, 5/1)
UV (Methanol), Maximum: 306, 233, 206 nm; Minimum: 255, 220 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 8,00 (d, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,00 (d, 1H), 5,49 (b, OH), 5,31 (q, 1H), 4,19 (m, 2H), 3,77 (t, 2H), 1,95 (m, 2H), 1,37 (d, 3H), 0,86 (s, 9H), 0,04 (s, 6H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 162,6, 146,2, 139,6, 126,9, 112,9, 112,5, 64,8, 63,9, 58,7, 31,5, 25,6, 24,9, -3,4, -5,8.
1-(2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)phenyl)-
ethanol (0,89 g, 2,5 mmol) wurden in 30 ml THF gelöst und 0,5
mmol nBu4NF wurden unter Rühren hinzugegeben. Die Mischung
wurde bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt und das
Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt. Der zurückbleibende
Rest wurde auf eine Silicagel-Säule mit einem Gradienten-
Methanol in Methylenchlorid aufgetragen. 1-(2-Nitro-5-(3-
hydroxypropoxy)phenyl)ethanol (0,6 g (99%)) wurde erhalten.
Rf = 0,17 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 304, 232, 210 nm; Minimum: 255, 219 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 8,00 (d, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,00 (d, 1H), 5,50 (d, OH), 5,28 (t, OH), 4,59 (t, 1H), 4,17 (t, 2H), 3,57 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,36 (d, 2H).
13C NMR (DMOS-d6) δ 162,8, 146,3, 139,7, 127,1, 113,1, 112,6, 65,5, 64,0, 57,0, 31,8, 25,0.
Rf = 0,17 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 304, 232, 210 nm; Minimum: 255, 219 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 8,00 (d, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,00 (d, 1H), 5,50 (d, OH), 5,28 (t, OH), 4,59 (t, 1H), 4,17 (t, 2H), 3,57 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,36 (d, 2H).
13C NMR (DMOS-d6) δ 162,8, 146,3, 139,7, 127,1, 113,1, 112,6, 65,5, 64,0, 57,0, 31,8, 25,0.
1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol (0,482 g,
2 mmol) wurde zweimal mit wasserfreiem Pyridin verdampft und in
20 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wurde in einem
Eis-Wasserbad abgekühlt und 750 mg (2,2 mmol) DMTCl wurden
hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur
über Nacht gerührt und 0,5 ml Methanol wurden zur Beendigung
der Reaktion hinzugegeben. Das Lösungsmittel wurde im Vakkuum
entfernt und der Rückstand wurde zweimal mit Toluol co-
verdampft, um Spuren von Pyridin zu entfernen. Der verbleibende
Rückstand wurde auf einer Silicagel-Säule mit einem Gradienten-
Methanol, in Methylenchlorid, das Tropfen von Trimethylamin
enthielt, aufgetragen, um 0,96 g (89%) des gewünschten Produkts
1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)phenyl)ethanol zu
erhalten.
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 350 (Schulter), 305, 283, 276 (Schulter), 233, 208 nm; Minimum: 290, 258, 220 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 8,00 (d, 1H), 6,82-7, 42 (ArH), 5, 52 (d, OH), 5,32 (m, 1H), 4,23 (t, 2H), 3,71 (s, 6H), 3,17 (t, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
13C NMR (DMOS-d6) δ 162,5, 157,9, 157,7, 146,1, 144,9, 140,1, 139,7, 135,7, 129,5, 128,8, 127,6, 127,5, 127,3, 126,9, 126,4, 113,0, 112,8, 112,6, 85,2, 65,3, 63,9, 59,0, 54,8, 28,9, 24,9.
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 350 (Schulter), 305, 283, 276 (Schulter), 233, 208 nm; Minimum: 290, 258, 220 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 8,00 (d, 1H), 6,82-7, 42 (ArH), 5, 52 (d, OH), 5,32 (m, 1H), 4,23 (t, 2H), 3,71 (s, 6H), 3,17 (t, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
13C NMR (DMOS-d6) δ 162,5, 157,9, 157,7, 146,1, 144,9, 140,1, 139,7, 135,7, 129,5, 128,8, 127,6, 127,5, 127,3, 126,9, 126,4, 113,0, 112,8, 112,6, 85,2, 65,3, 63,9, 59,0, 54,8, 28,9, 24,9.
1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)-
phenyl)ethanol (400 mg, 0,74 mmol), wurde im Hochvakkuum
getrocknet und in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. Zu
dieser Lösung wurden 0,5 ml N,N-Diisopropylethylamin und 0,3 ml
(1,34 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-Diisopropylchlorphosphoramidit
hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur
für 30 Minuten gerührt und 0,5 ml Methanol wurden zur
Beendigung der Reaktion hinzugegeben. Die Mischung wurde mit
gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen und über
Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakkuum,
entfernt und eine Silicagel-Schnell-Säule mit 1% Methanol in
Methylenchlorid, das Tropfen von Triethylamin enthielt, ergab
510 mg (93%) des gewünschten Phosphoramidits.
Rf 0,87 (Dichlormethan/Methan, 99/1).
Rf 0,87 (Dichlormethan/Methan, 99/1).
3-brom-1-propanol (53 ml, 33 mmol) wurden in 100 ml
wasserfreiem Acetonitril, mit 4-Hydroxy-3-methoxyacetophenon
(5 g, 30 mmol), K2CO3 (5 g) und KI (300 mg) über Nacht (15 Std.)
am Rückfluß erhitzt. Methylenchlorid (150 ml) wurden zu der
Reaktionsmischung nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur gegeben.
Die Mischung wurde gefiltert und der feste Rückstand wurde mit
Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigte, organische Lösung
wurde bis zur Trocknung verdampft und in 100 ml Methylenchlorid
gelöst. Die sich ergebende Lösung wurde mit gesättigter NaCl-
Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem
Entfernen des Lösungsmittels im Vakkuum, wurden 6,5 g (96,4%)
des gewünschten Produktes erhalten.
Rf = 0,41 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum; 304, 273, 227, 210 nm: Minimum: 291, 244, 214 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 7,64 (d, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,04 (d, 1H), 4,58 (b, OH), 4,12, (t, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,56 (t, 2H), 2,54 (s, 3H), 1,88 (m, 2H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 196,3, 152,5, 148,6, 129,7, 123,1, 111,5, 110,3, 65,4, 57,2, 55,5, 31,9, 26,3.
Rf = 0,41 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum; 304, 273, 227, 210 nm: Minimum: 291, 244, 214 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 7,64 (d, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,04 (d, 1H), 4,58 (b, OH), 4,12, (t, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,56 (t, 2H), 2,54 (s, 3H), 1,88 (m, 2H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 196,3, 152,5, 148,6, 129,7, 123,1, 111,5, 110,3, 65,4, 57,2, 55,5, 31,9, 26,3.
4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,5 g, 15,6
mmol) wurde getrocknet und in 80 ml wasserfreiem Acetonitril
aufgelöst. Zu dieser Mischung wurden 6 ml Triethylamin und 6 ml
Essigsäureanhydrid hinzugegeben. Nach 4 Stunden wurden 6 ml
Methanol hinzugegeben und das Lösungsmittel wurde im Vakkuum
entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml Dichlormethan aufgelöst
und die Lösung wurde mit verdünnter Natriumbicarbonat-Lösung,
anschließend mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde
über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde
entfernt. Der feste Rückstand auf eine Silicagel-Säule mit
Methylenchlorid aufgetragen, um 4,1 g 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-
methoxyacetophenon (98,6%) zu ergeben.
Rf = 0,22 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 303, 273, 227, 210 nm; Minimum: 290, 243, 214 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 7,62 (d, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,08 (d, 1H), 4,12 (m, 4H), 3,82 (s, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,04 (m, 2H), 2,00 (s, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 195,3, 170,4, 152,2, 148,6, 130,0, 123,0, 111,8, 110,4, 65,2, 60,8, 55,5, 27,9, 26,3, 20,7.
Rf = 0,22 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 303, 273, 227, 210 nm; Minimum: 290, 243, 214 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 7,62 (d, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,08 (d, 1H), 4,12 (m, 4H), 3,82 (s, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,04 (m, 2H), 2,00 (s, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 195,3, 170,4, 152,2, 148,6, 130,0, 123,0, 111,8, 110,4, 65,2, 60,8, 55,5, 27,9, 26,3, 20,7.
4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,99 g, 15
mmol) wurde portionsweise zu 15 ml, 70% HNO3 in einem Wasserbad
hinzugegeben; die Reaktionstemperatur wurde bei Raumtemperatur
gehalten. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für
30 Minuten gerührt und 30 g zerstoßenes Eis wurden hinzugefügt.
Diese Mischung wurde mit 100 ml Dichlormethan extrahiert und
die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumbicarbonat-
Lösung gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat
getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt. Die
Rohmischung wurde auf eine Silicagel-Säule mit einem Gradienten
Methanol in Methylenchlorid aufgetragen, um 3,8 g (81,5%) des
gewünschten Produkts 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6-
nitroacetophenon und 0,38 g (8%) Ipso-substituiertes Produkt 5-
(3-Acetoxypropoxy-methoxy-1,2-Dinitrobenzol zu ergeben. Ipso-
substituiertes Nebenprodukt 5-(3-Acetoxypropoxy)-4-methoxy-1, 2-
dinitrobenzol:
Rf = 0,47 (Dichlormethan/Methanol, 99/1)
UV (Methanol), Maximum: 334, 330, 270, 240, 212 nm; Minimum: 310, 282, 263, 223 nm.
1H NMR (CDCl3) δ 7,36 (s, 1H), 7,34 (s, 1H), 4,28 (t, 2H), 4,18 (t, 2H), 4,02 (s, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
13C NMR (CDCl3) δ 170,9, 152,2, 151,1, 117,6, 111,2, 107,9, 107,1, 66,7, 60,6, 56,9, 28,2, 20,9.
Rf = 0,47 (Dichlormethan/Methanol, 99/1)
UV (Methanol), Maximum: 334, 330, 270, 240, 212 nm; Minimum: 310, 282, 263, 223 nm.
1H NMR (CDCl3) δ 7,36 (s, 1H), 7,34 (s, 1H), 4,28 (t, 2H), 4,18 (t, 2H), 4,02 (s, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
13C NMR (CDCl3) δ 170,9, 152,2, 151,1, 117,6, 111,2, 107,9, 107,1, 66,7, 60,6, 56,9, 28,2, 20,9.
Rf
= 0,29 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 246, 213 nm; Minimum: 320, 270, 227 nm.
1
UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 246, 213 nm; Minimum: 320, 270, 227 nm.
1
H NMR (CDCl3
) δ 7,62 (s, 1H), 5,74 (s, 1H), 4,28 (t, 2H), 4,20
(t, 2H), 3,96 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s,
3H).
13
13
C NMR (CDCl3
) δ 200,0, 171,0, 154,3, 148,8, 138,3, 133,0,
108,8, 108,0, 66,1, 60,8, 56,6, 30,4, 28,2, 20,9.
4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6-nitroacetophenon (3,73 g,
12 mmol) wurde zu 150 ml Ethanol und 6,5 g K2CO3 hinzugegeben.
Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt und
TLC mit 5% Methanol in Dichlormethan zeigte die
Vervollständigung der Reaktion an. Zu demselben Reaktions
gemisch wurden 3,5 g NaBH4 hinzugegeben und die Mischung wurde
bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Aceton (10 ml) wurden
hinzugefügt, um mit dem verbleibenden NaBH4 zu reagieren. Das
Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt und der Rest wurde in
50 g Silicagel aufgenommen. Die Silicagel-Mischung wurde auf das
obere Ende einer Silicagel-Säule mit 5% Methanol in
Methylenchlorid gegeben, um 3,15 g (97%) des gewünschten
Produkts 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-
nitrophenyl)ethanol zu ergeben.
Rf
= 0,60 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
Rf
= 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 243, 219 nm; Minimum: 317,264, 233 nm.
1
UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 243, 219 nm; Minimum: 317,264, 233 nm.
1
H NMR (DMSO-d6
) δ 7,54 (s, 1H), 7,36 (s, 1H), 5,47 (d, OH),
5,27 (m, 1H), 4,55 (t, OH), 4,05 (t, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,55
(q, 2H), 1,88 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
13
13
C NMR (DMSO-d6
) δ 153,4, 146,4, 138,8, 137,9, 109,0, 108,1,
68,5, 65,9, 57,2, 56,0, 31,9, 29,6.
1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol
(0,325 g, 1,2 mmol) wurde mit wasserfreiem Pyridin zweimal co-
verdampft und in 15 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung
wurde in einem Eis-Wasserbad abgekühlt und 450 mg (1,33 mmol)
DMTCl wurden hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei
Raumtemperatur über Nacht gerührt und 0,5 ml Methanol wurden
zur Beendigung der Reaktion hinzugegeben. Das Lösungsmittel
wurde im Vakkuum entfernt und der Rückstand wurde zweimal mit
Toluol co-verdampft, um Spuren von Pyridin zu entfernen. Der
verbleibende Rückstand wurde auf eine Silicagel-Säule gegeben
mit einem Gradienten Methanol in Methylenchlorid, der Tropfen
von Triethylamin enthielt, um 605 mg (88%) des gewünschten
Produkts 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-
nitrophenyl)ethanol zu ergeben.
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 354, 302, 282, 274, 233, 209 nm; Minimum: 322, 292, 263, 222 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 7,54 (s, 1H), 6,8-7,4 (ArH), 5,48 (d, OH) 5,27 (m, 1H), 02225 00070 552 001000280000000200012000285910211400040 0002019882657 00004 02106 4,16 (t, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,72 (s, 6H), 3,15 (t, 2H), 1,98 (t, 2H), 1,37 (d, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 157,8, 153,3, 146,1, 144,9, 138,7, 137,8, 135,7, 129,4, 128,7, 127,5, 127,4, 126,3, 112,9, 112,6, 108,9, 108,2, 85,1, 65,7, 63,7, 59,2, 55,8, 54,8, 29,0, 25,0.
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 354, 302, 282, 274, 233, 209 nm; Minimum: 322, 292, 263, 222 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 7,54 (s, 1H), 6,8-7,4 (ArH), 5,48 (d, OH) 5,27 (m, 1H), 02225 00070 552 001000280000000200012000285910211400040 0002019882657 00004 02106 4,16 (t, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,72 (s, 6H), 3,15 (t, 2H), 1,98 (t, 2H), 1,37 (d, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 157,8, 153,3, 146,1, 144,9, 138,7, 137,8, 135,7, 129,4, 128,7, 127,5, 127,4, 126,3, 112,9, 112,6, 108,9, 108,2, 85,1, 65,7, 63,7, 59,2, 55,8, 54,8, 29,0, 25,0.
1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-
nitrophenyl)ethanol (200 mg, 3,5 mmol) wurde unter Hochvakkuum
getrocknet und in 15 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. Zu
dieser Lösung wurden 0,5 ml N,N-Diisopropylethylamin und 0,2 ml
(0,89 mmol) 2-Cyaonoethyl-N,N-Diisopropylchlorphosphoramidit
hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur
für 30 Minuten gerührt und 0,5 ml Methanol wurden zur
Beendigung der Reaktion hinzugegeben. Die Mischung wurde mit
gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen und über
Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakkuum
entfernt und eine Silicagel-Schnell-Säule mit 1% Methanol in
Methylenchlorid, das Tropfen von Triethylamin enthielt, ergab
247 mg (91,3%) des gewünschten Phosphoramidits 1-(4-(3-O-4,4'-
dimethoxytrityl propoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-O-((2-
cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino)ethan.
Rf = 0,87 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
Rf = 0,87 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
Da Modifikationen dem Fachmann ersichtlich sind, ist
beabsichtigt, daß diese Erfindung lediglich durch den Umfang
der nachfolgenden Ansprüche begrenzt ist.
Claims (49)
1. Verfahren zum Erhalten von Information betreffend die
Sequenz eines Targetnukleinsäuremoleküls relativ zur Sequenz
eines Referenznukleinsäuremoleküls, das ein Referenz-
Polypeptid kodiert, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
- a) Präparieren des von dem Targetnukleinsäuremolekül kodierten Polypeptids ausgehend von dem Targetnukleinsäuremolekül durch in vitro Translation oder durch in vitro Transkription, gefolgt von Translation, des Targetnukleinsäuremoleküls;
- b) Bestimmen der molekularen Masse des kodierten Polypeptids durch Massenspektrometrie; und
- c) Vergleichen der molekularen Masse des kodierten Polypeptids mit der molekularen Masse des korrespondierenden, bekannten Referenz-Polypeptids, wodurch Information über die Sequenz von Nukleotiden im Targetnukleinsäuremolekül erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Information über die
genetische Natur eines Phänotyps eines Individuums gewonnen
wird, wobei das Targetnukleinsäuremolekül aus dem Individuum
erhalten wird, wobei der Vergleich des kodierten Polypeptides
mit dem Referenz-Polypeptid zur Identifizierung einer
allelische Variante einer polymorphen Region eines Chromosoms
in dem Individuum dient.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das
Targetnukleinsäuremolekül, das das kodierte Polypeptid
kodiert, RNA ist, und wobei das kodierte Polypeptid durch in
vitro Translation erhalten wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine RNA, die
das kodierende Polypeptid kodiert, durch in vitro
Transkription des Nukleinsäuremoleküls, die das kodierte
Poylpeptid kodiert, hergestellt wird, und wobei das kodierte
Polypeptid durch in vitro Translation der RNA erhalten wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, das weiterhin
das Amplifizieren des Targetnukleinsäuremoleküls, das das
kodiererte Polypeptid kodiert, umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Amplifizieren
unter Verwendung eines Primers durchgeführt wird, der eine
Nukleotidsequenz umfaßt, die einen RNA-Polymerase-Promotor
kodiert, wobei nach der Amplifikation der Promotor auf
operable Weise mit dem Targetnukleinsäuremolekül, das das
kodierente Polypeptid kodiert, verbunden ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der RNA-Polymerase-
Promotor aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus SP6-
Promotor, T3-Promotor und T7-Promotor besteht.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, wobei das
kodierte Polypeptid ein Anhängsel umfaßt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, wobei die
Transkription und/oder Translation in vivo durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, wobei das
kodierte Polypeptid vor der Massenspektrometrie isoliert
wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, wobei das
kodierte Polypeptid auf einem festen Träger immobilisiert
wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, wobei das
Massenspektrometrieformat aus der Gruppe ausgewählt wird, die
aus matrixunterstützter Laserdesorption/Ionisation (MALDI)
MALDI mit verzögerter Extraktion, kontinuierlicher oder
gepulster Elektronenspray-, Ionenspray-, Thermospray- oder
Massive Cluster Impact-Spektrometrie besteht und einem
Detektionsformat, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus
linearem Flugzeit, Reflektron- Flugzeit, Einfach-Quadrupol,
Mehrfach-Quadrupol, Einfach- Magnetischem Sektor, Mehrfach-
Magnetischem Sektor, Fourier-Transform-Ionencyclotron-
Resonanz, Ion-Trap und Kombinationen davon besteht.
13. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Phänotyp die
Antwort des Individuums auf einen Wirkstoff betrifft, und
wobei die genetische Natur des Phänotyps mit der Antwort
verbunden ist.
14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das kodierte
Polypeptid durch eine allelische Variante einer polymorphen
Region eines Chromosoms in einem Individuum kodiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die polymorphe
Region sich in einem Gen befindet.
16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die allelische
Variante mit einer Krankheit oder einem Zustand verbunden
ist, wodurch angezeigt wird, daß das Individuum die Krankheit
oder den Zustand hat oder ein Risiko besitzt, diese(n) zu
entwickeln.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Krankheit oder
der Zustand mit einer anormalen Zahl von Nukleotid-
Wiederholungen in der allelischen Variante assoziiert ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Nukleotid-
Wiederholungen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus
Dinukleotid-, Trinukleotid, Tetranukleotid und
Pentanukleotid-Wiederholungen besteht.
19. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Krankheit oder
der Zustand aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus
Huntingtons Krankheit, Prostatakrebs, fragiles X Syndrom Typ
A, myotonische Dystrophie Typ 1, Kennedy Krankheit, Machado-
Joseph-Krankeit, dentatorubrale und pallidolyusiane Atrophie,
spinobulbäre Muskelatrophie und Alterung besteht.
20. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Gen aus der
Gruppe ausgewählt wird, die aus BRCA1, BRCA2, APC,
Dystrophin-Gen, β-Globin, Faktor IX, Faktor VIIc, Ornithin-d-
Aminotransferase, Hypoxanthin-Guanin-
Phosphoribosyltransferase, CFTR, p53 und einem Proto-Onkogen
besteht.
21. Verfahren nach Anspruch 2 oder 16, wobei die
allelische Variante auf eine Punktmutation zurückzuführen
ist.
22. Verfahren flach Anspruch 1 oder 2, wobei das
Targetnukleinsäuremolekül ein mitochondriales Gen ist.
23. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die polymorphe
Region mit Transplantatabstoßung assoziiert ist und das
Verfahren zur Bestimmung der Kompatibilität zwischen einem
Spender und einem Empfänger eines Transplantats dient.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die polymorphe
Region der Haupt-Histokompatibilitäts-Locus ist.
25. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das kodierte
Polypeptid von einem Targetnukleinsäuremolekül kodiert wird,
das Nukleotid-Wiederholungen umfaßt, und das Verfahren einer
Verwendung dient, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus
Bestimmung des Genotyps des Individuums, forensischer Analyse
und Vaterschaftstest besteht.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Bestimmung des
Genotyps durchgeführt wird, indem die Anzahl von Nukleotid-
Wiederholungen quantifiziert wird.
27. Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Nukleotid-
Wiederholungen Dinukleotid-, Trinukleotid-, Tetranukleotid-
oder Pentanukleotid-Wiederholungen sind.
28. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das
Targetnukleinsäuremolekül aus einem infektiösen Organismus
erhalten wird.
29. Verfahren nach Anspruch 2 oder 16, wobei die
allelische Variante eine Mutation ist, die zu einem Stop-
Codon führt, die anhand der molekularen Masse des kodierten
Polypeptids, was ein verkürztes Polypeptid anzeigt,
identifiziert wird.
30. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren
durchgeführt wird mit
einer Vielzahl von Targetnukleinsäuremolekülen, die eine Vielzahl von kodierten Polypeptiden kodieren, und
die Vielzahl von kodierten Polypeptiden vor dem Schritt b) differentiell massenmodifiziert wird.
einer Vielzahl von Targetnukleinsäuremolekülen, die eine Vielzahl von kodierten Polypeptiden kodieren, und
die Vielzahl von kodierten Polypeptiden vor dem Schritt b) differentiell massenmodifiziert wird.
31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei vor der Bestimmung
der molekularen Masse von jedem differentiell
massenmodifizierten kodierten Polypeptid durch
Massenspektrometrie jedes kodierte Polypeptid mittels eines
spaltbaren Linkers auf dem festen Träger immobilisiert wird.
32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der spaltbare
Linker aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem
säurespaltbaren Linker, säurelabilen Linker, wärmelabilen
Linker und einem photospaltbaren Linker besteht.
33. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der feste Träger
aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Träger, der
eine flache Oberfläche aufweist und einen Träger, der eine
Oberfläche mit einer Struktur aufweist, besteht.
34. Verfahren nach Anspruch 31, wobei jedes kodierte
Polypeptid in einer Anordnung (Array) auf dem festen Träger
immobilisiert wird.
35. Verfahren nach Anspruch 32, wobei jedes kodierte
Polypeptid aufgrund seiner spezifischen Interaktion mit einem
weiteren Polypeptid immobilisiert wird, wobei das weitere
Polypeptid in einer Anordnung (Array) auf dem festen Träger
konjugiert ist.
36. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das kodierte
Polypeptid
vor dem Schritt b) in Kontakt gebracht wird mit zumindest einem Mittel, das zumindest eine Peptidbindung in dem kodierten Polypeptid spaltet, um Peptidfragmente des kodierten Polypeptids zu erzeugen; und
die molekulare Masse von zumindest einem der Peptidfragmente des kodierten Polypeptids durch Massenspektrometrie in Schritt b) bestimmt wird; und
die molekulare Masse des zumindest einen Peptidfragments des kodierten Polypeptids mit der molekularen Masse von Peptidfragmenten eines korrespondierenden bekannten Polypeptids in Schritt c) verglichen wird.
vor dem Schritt b) in Kontakt gebracht wird mit zumindest einem Mittel, das zumindest eine Peptidbindung in dem kodierten Polypeptid spaltet, um Peptidfragmente des kodierten Polypeptids zu erzeugen; und
die molekulare Masse von zumindest einem der Peptidfragmente des kodierten Polypeptids durch Massenspektrometrie in Schritt b) bestimmt wird; und
die molekulare Masse des zumindest einen Peptidfragments des kodierten Polypeptids mit der molekularen Masse von Peptidfragmenten eines korrespondierenden bekannten Polypeptids in Schritt c) verglichen wird.
37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei das kodierte
Polypeptid auf einem festen Träger vor dem in Kontakt bringen
des kodierten Polypeptids mit dem Spalt-Mittel immobilisiert
wird.
38. Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Spalt-Mittel,
das zumindest eine Peptidbindung in dem kodierten Polypeptid
spaltet, eine Endopeptidase ist.
39. Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Verfahren mit
einer Vielzahl von Targetnukleinsäuremolekülen durchgeführt
wird.
40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Masse jedes
kodierten Polypeptids vor dem in Kontakt bringen in
modifiziert wird, oder die Masse des zumindest einen
Peptidfragments von jedem kodierten Polypeptid vor der
Bestimmung der molekularen Masse modifiziert wird.
41. Verfahren nach Anspruch 39 oder 40, wobei jedes
kodierte Polypeptid in der Vielzahl auf einem festen Träger
vor dem in Kontakt bringen jedes Targetpolypeptids mit dem
Spalt-Mittel immobilisiert wird.
42. Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Vielzahl der
kodierten Polypeptide in einer Anordnung (Array)
immobilisiert wird.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 39-42, wobei das
Mittel, das zumindest eine Peptidbindung in jedem kodierten
Polypeptid spaltet, eine Endopeptidase ist.
44. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die
Massenspektrometrie matrixunterstützte
Laserdesorption/Ionisation (MALDI)-time of flight-
Massenspektrometrie ist.
45. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das
Targetnukleinsäuremolekül, das das Polypeptid kodiert, aus
einer biologischen Probe erhalten wird, und das kodierte
Polypeptid oder das Targetnukleinsäuremolekül, das das
Polypeptid kodiert, ein Marker für eine Krankheit oder einen
Zustand ist, wodurch bestimmt wird, ob das Individuum diese
Krankheit oder diesen Zustand besitzt oder dagegen
prädispositioniert ist.
46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Probe aus der
Gruppe ausgewählt wird, die aus eine Gewebeprobe, einer
Zellprobe und einer biologischen Flüssigkeit besteht.
47. Verfahren nach Anspruch 45, wobei das
Targetnukleinsäuremolekül, das das Polypeptid kodiert,
zumindest einen Bereich eines Genes aufweist, das aus der
Gruppe ausgewählt wird, die aus BRCA1, BRCA2, APC,
Dystrophin-Gen, β-Globin, Faktor IX, Faktor VIIc, Ornithin-d-
Aminotransferase, Hypoxanthin-Guanin-
Phosphoribosyltransferase, CFTR, p53 und einem Proto-Onkogen
besteht.
48. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Krankheit oder
der Zustand aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus
Huntingtons Krankheit, Prostatakrebs, fragiles X Syndrom Typ
A, myotonische Dystrophie Typ 1, Kennedy Krankheit, Machado-
Joseph-Krankeit, dentatorubrale und pallidolyusiane Atrophie,
spinobulbäre Muskelatrophie und Alterung besteht.
49. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Krankheit oder
der Zustand durch einen Organismus verursacht wird, der aus
der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Virus, einem
Bakterium, einem Pilz und einem Protisten besteht.
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WO (1) | WO1999012040A2 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102004042530A1 (de) * | 2004-09-02 | 2006-03-23 | Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag | Polypeptidmarker zur Diagnose von Arteriosklerose |
Families Citing this family (196)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5605798A (en) * | 1993-01-07 | 1997-02-25 | Sequenom, Inc. | DNA diagnostic based on mass spectrometry |
WO1997033000A1 (en) | 1996-03-04 | 1997-09-12 | Genetrace Systems, Inc. | Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry |
US6329180B1 (en) | 1996-09-13 | 2001-12-11 | Alex M. Garvin | Genetic analysis using peptide tagged in-vitro synthesized proteins |
US5777324A (en) | 1996-09-19 | 1998-07-07 | Sequenom, Inc. | Method and apparatus for maldi analysis |
US5965363A (en) | 1996-09-19 | 1999-10-12 | Genetrace Systems Inc. | Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis |
DE69738206T2 (de) * | 1996-11-06 | 2008-07-17 | Sequenom, Inc., San Diego | DNA-Diagnostik mittels Massenspektrometrie |
US7285422B1 (en) * | 1997-01-23 | 2007-10-23 | Sequenom, Inc. | Systems and methods for preparing and analyzing low volume analyte array elements |
CA2274587A1 (en) * | 1996-12-10 | 1998-06-18 | Genetrace Systems Inc. | Releasable nonvolatile mass-label molecules |
NZ516848A (en) * | 1997-06-20 | 2004-03-26 | Ciphergen Biosystems Inc | Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine |
CA2243230A1 (en) * | 1998-07-15 | 2000-01-15 | Aled Edwards | A device and method for the determination of protein domain boundaries |
US20120244594A9 (en) | 1998-09-04 | 2012-09-27 | Cell Signaling Technology, Inc. | Immunoaffinity isolation of modified peptides from complex mixtures |
US7300753B2 (en) * | 1998-09-04 | 2007-11-27 | John Rush | Immunoaffinity isolation of modified peptides from complex mixtures |
US7198896B2 (en) * | 1998-09-04 | 2007-04-03 | Cell Signaling Technology, Inc. | Immunoaffinity isolation of modified peptides from complex mixtures |
US20030194700A1 (en) * | 1998-12-01 | 2003-10-16 | Toshiaki Ito | Biochip and method for producing the same |
EP1151296A4 (de) * | 1998-12-16 | 2005-01-26 | Sequel Genetics Inc | Verfahren und produkte für auf peptiden basierende charakterisierung und analyse von dns-sequenzen |
JP2003524394A (ja) * | 1999-02-11 | 2003-08-19 | マキシジェン, インコーポレイテッド | ハイスループット質量分析法 |
US7166475B2 (en) * | 1999-02-26 | 2007-01-23 | Cyclacel Ltd. | Compositions and methods for monitoring the modification state of a pair of polypeptides |
US20020009394A1 (en) | 1999-04-02 | 2002-01-24 | Hubert Koster | Automated process line |
US6994969B1 (en) * | 1999-04-30 | 2006-02-07 | Methexis Genomics, N.V. | Diagnostic sequencing by a combination of specific cleavage and mass spectrometry |
US6306628B1 (en) * | 1999-08-25 | 2001-10-23 | Ambergen, Incorporated | Methods for the detection, analysis and isolation of Nascent proteins |
DE19943743C2 (de) * | 1999-09-03 | 2002-02-07 | Jerini Biotools Gmbh | Verfahren zur Identifizierung von Bindungspartnern mit positions-spezifischen Arrays |
AU7868300A (en) * | 1999-10-07 | 2001-05-10 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Prostate cancer marker proteins |
US20030207297A1 (en) * | 1999-10-13 | 2003-11-06 | Hubert Koster | Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers |
US7917301B1 (en) | 2000-09-19 | 2011-03-29 | Sequenom, Inc. | Method and device for identifying a biological sample |
US7332275B2 (en) * | 1999-10-13 | 2008-02-19 | Sequenom, Inc. | Methods for detecting methylated nucleotides |
US20020155445A1 (en) * | 1999-12-16 | 2002-10-24 | Jarvik Jonathan W. | Methods and products for peptide based DNA sequence identification and analysis |
US7060506B2 (en) | 2000-01-31 | 2006-06-13 | Cyclacel, Ltd. | Compositions and methods for monitoring the modification of modification dependent binding partner polypeptides |
US7816098B2 (en) * | 2000-01-31 | 2010-10-19 | Sense Proteomic Limited | Methods of making and using a protein array |
WO2001056955A1 (en) * | 2000-02-03 | 2001-08-09 | Nanoscale Combinatorial Synthesis, Inc. | Nonredundant split/pool synthesis of combinatorial libraries |
US6569383B1 (en) * | 2000-03-11 | 2003-05-27 | Intrinsic Bioprobes, Inc. | Bioactive chip mass spectrometry |
WO2001096607A2 (en) | 2000-06-13 | 2001-12-20 | The Trustees Of Boston University | Use of nucleotide analogs in the analysis of oligonucleotide mixtures and in highly multiplexed nucleic acid sequencing |
US7244701B2 (en) * | 2000-06-16 | 2007-07-17 | Zealand Phama A/S | Diuretic peptide conjugate |
US7550425B2 (en) * | 2000-06-16 | 2009-06-23 | Zealand Pharma A/S | Diuretic peptide conjugates |
US6680203B2 (en) * | 2000-07-10 | 2004-01-20 | Esperion Therapeutics, Inc. | Fourier transform mass spectrometry of complex biological samples |
PT1309861E (pt) * | 2000-08-15 | 2006-10-31 | Discerna Ltd | Arrays funcionais de proteinas |
AU4338502A (en) * | 2000-10-23 | 2002-06-24 | Genetics Inst | Acid-labile isotope-coded extractant (alice) and its use in quantitative mass spectrometric analysis of protein mixtures |
CA2426686A1 (en) | 2000-10-30 | 2002-07-18 | Sequenom, Inc. | Method and apparatus for delivery of submicroliter volumes onto a substrate |
US6649419B1 (en) * | 2000-11-28 | 2003-11-18 | Large Scale Proteomics Corp. | Method and apparatus for protein manipulation |
US20020115056A1 (en) | 2000-12-26 | 2002-08-22 | Goodlett David R. | Rapid and quantitative proteome analysis and related methods |
ATE521890T1 (de) | 2000-12-26 | 2011-09-15 | Inst Systems Biology | Schnelle und quantitative proteomanalyse und entsprechende verfahren |
US6800453B2 (en) * | 2001-01-23 | 2004-10-05 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleic-acid programmable protein arrays |
US7166436B2 (en) | 2001-01-26 | 2007-01-23 | Syngenta Participations, Ag | Differential labeling for quantitative analysis of complex protein mixtures |
US6969757B2 (en) | 2001-01-26 | 2005-11-29 | Syngenta Participations Ag | Differential labeling for quantitative analysis of complex protein mixtures |
KR20030074773A (ko) * | 2001-02-01 | 2003-09-19 | 싸이퍼젠 바이오시스템즈, 인코포레이티드 | 탠덤 질량 분광계에 의한 단백질 확인, 특성화 및 서열결정을 위한 개선된 방법 |
DE10106339A1 (de) * | 2001-02-09 | 2002-08-22 | Hans-Joachim Mueller | Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen über die Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden |
WO2002071051A2 (en) | 2001-02-14 | 2002-09-12 | Picoliter, Inc. | Acoustic sample introduction for analysis and/or processing |
US6855925B2 (en) * | 2001-02-14 | 2005-02-15 | Picoliter Inc. | Methods, devices, and systems using acoustic ejection for depositing fluid droplets on a sample surface for analysis |
US6707038B2 (en) | 2001-02-14 | 2004-03-16 | Picoliter Inc. | Method and system using acoustic ejection for selective fluid deposition on a nonuniform sample surface |
US20040121313A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in organs for transplantation |
US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
US7718354B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-05-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
US7226739B2 (en) | 2001-03-02 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
US20030027135A1 (en) | 2001-03-02 | 2003-02-06 | Ecker David J. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
DE60237194D1 (de) * | 2001-03-02 | 2010-09-16 | Activx Biosciences Inc | Plattform für protein-profiling |
US20020137106A1 (en) * | 2001-03-09 | 2002-09-26 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Detection of biological pathway components |
US20030036057A1 (en) * | 2001-03-09 | 2003-02-20 | Andreas Braun | Genes and polymorphisms associated with cardiovascular disease and their use |
CN1273615C (zh) * | 2001-04-03 | 2006-09-06 | 塞莫费尼根股份有限公司 | 用于简化复合肽混合物的方法和试剂盒 |
WO2002084250A2 (en) | 2001-04-17 | 2002-10-24 | Femtolink Biotechnologies Llc | Methods for mass spectrometry detection and quantification of specific target proteins in complex biological samples |
WO2002086168A1 (en) * | 2001-04-19 | 2002-10-31 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Biomolecule characterization using mass spectrometry and affinity tags |
US20020155587A1 (en) | 2001-04-20 | 2002-10-24 | Sequenom, Inc. | System and method for testing a biological sample |
AU2002338428A1 (en) * | 2001-04-20 | 2002-11-05 | Carnegie Mellon University | Methods and systems for identifying proteins |
US6617308B2 (en) * | 2001-04-30 | 2003-09-09 | Syn X Pharma, Inc. | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1865 daltons |
US6677303B2 (en) * | 2001-04-30 | 2004-01-13 | Syn X Pharma | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1097 daltons |
US6627607B2 (en) * | 2001-04-30 | 2003-09-30 | Syn X Pharma, Inc. | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1845 daltons |
US6693080B2 (en) * | 2001-04-30 | 2004-02-17 | Syn X Pharma | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1521 daltons |
US6593298B2 (en) * | 2001-04-30 | 2003-07-15 | Syn X Pharma, Inc. | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1690 daltons |
US6627606B2 (en) * | 2001-04-30 | 2003-09-30 | Syn X Pharma, Inc. | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1465 daltons |
US6703366B2 (en) * | 2001-04-30 | 2004-03-09 | George Jackowski | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1,896 daltons |
US6627608B2 (en) * | 2001-04-30 | 2003-09-30 | Syn X Pharma, Inc. | Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1206 daltons |
US6620786B2 (en) * | 2001-04-30 | 2003-09-16 | Syn X Pharma, Inc. | Biopolymer marker indicative of disease state having molecular weight of 2937 daltons |
US7074570B2 (en) * | 2001-05-23 | 2006-07-11 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Peptide fragmentation |
US20050130222A1 (en) * | 2001-05-25 | 2005-06-16 | Lee Peter J.J. | Sample concentration maldi plates for maldi mass spectrometry |
JP2002372517A (ja) * | 2001-05-31 | 2002-12-26 | Inst Of Physical & Chemical Res | 質量分析法によるタンパク質の構造解析方法 |
US7074558B2 (en) * | 2001-06-07 | 2006-07-11 | Pbi Technology, Inc. | Nucleic acid amplification using an RNA polymerase and DNA/RNA mixed polymer intermediate products |
US20110111424A1 (en) * | 2001-06-21 | 2011-05-12 | Cell Signaling Technology, Inc. | Analysis of ubiquitinated polypeptides |
US7217510B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for providing bacterial bioagent characterizing information |
US8073627B2 (en) * | 2001-06-26 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | System for indentification of pathogens |
US6800449B1 (en) | 2001-07-13 | 2004-10-05 | Syngenta Participations Ag | High throughput functional proteomics |
AU2002367839A1 (en) * | 2001-07-16 | 2003-11-17 | Hk Pharmaceuticals, Inc. | Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions |
CA2458227A1 (en) * | 2001-08-22 | 2003-03-06 | Helix Biopharma Corporation | Method and device for integrated protein expression, purification and detection |
US7133864B2 (en) | 2001-08-23 | 2006-11-07 | Syngenta Participations Ag | System and method for accessing biological data |
JP2005507877A (ja) * | 2001-08-31 | 2005-03-24 | ファーマシア コーポレイション | ペプチド生体マーカー及び同定方法 |
US7148343B2 (en) * | 2001-10-12 | 2006-12-12 | Gentra Systems, Inc. | Compositions and methods for using a solid support to purify RNA |
EP1450957A1 (de) * | 2001-10-26 | 2004-09-01 | Sequenom, Inc. | Verfahren und vorrichtung für probenhandhabungs-fertigungssysteme mit hohem durchsatz |
US20030091976A1 (en) * | 2001-11-14 | 2003-05-15 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Methods for monitoring polypeptide production and purification using surface enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry |
US20040009567A1 (en) * | 2001-12-28 | 2004-01-15 | Mds Proteomics Inc. | Enzyme/chemical reactor based protein processing method for proteomics analysis by mass spectrometry |
US20030153729A1 (en) * | 2001-12-28 | 2003-08-14 | Duewel Henry S. | Enzyme/chemical reactor based protein processing method for proteomics analysis by mass spectrometry |
US20040053356A1 (en) * | 2001-12-28 | 2004-03-18 | Mds Proteomics Inc. | Enzyme/chemical reactor based protein processing method for proteomics analysis by mass spectrometry |
ATE421088T1 (de) * | 2002-03-11 | 2009-01-15 | Caprotec Bioanalytics Gmbh | Verbindungen und verfahren für die analyse des proteoms |
US7432342B2 (en) * | 2002-05-03 | 2008-10-07 | Sequenom, Inc. | Kinase anchor protein muteins, peptides thereof and related documents |
US20040171070A1 (en) * | 2002-05-20 | 2004-09-02 | Ramagauri Bhikhabhai | Peptide analysis using a solid support |
US6770871B1 (en) | 2002-05-31 | 2004-08-03 | Michrom Bioresources, Inc. | Two-dimensional tandem mass spectrometry |
GB0305796D0 (en) | 2002-07-24 | 2003-04-16 | Micromass Ltd | Method of mass spectrometry and a mass spectrometer |
US6624409B1 (en) | 2002-07-30 | 2003-09-23 | Agilent Technologies, Inc. | Matrix assisted laser desorption substrates for biological and reactive samples |
US7632686B2 (en) | 2002-10-03 | 2009-12-15 | Anderson Forschung Group | High sensitivity quantitation of peptides by mass spectrometry |
WO2004035169A2 (en) * | 2002-10-15 | 2004-04-29 | The Regents Of The University Of Michigan | Multidimensional protein separation system |
WO2004050839A2 (en) * | 2002-11-27 | 2004-06-17 | Sequenom, Inc. | Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery |
EP1578399A4 (de) | 2002-12-06 | 2007-11-28 | Isis Pharmaceuticals Inc | Verfahren für die rasche identifikation von pathogenen bei tier und mensch |
WO2004053370A1 (en) * | 2002-12-09 | 2004-06-24 | Waters Investments Limited | Peltier based freeze-thaw valves and method of use |
US20040248162A1 (en) * | 2002-12-17 | 2004-12-09 | Affymetrix, Inc. | Releasable polymer arrays |
US20040185473A1 (en) * | 2002-12-17 | 2004-09-23 | Affymetrix, Inc. | Releasable polymer arrays |
US20060127965A1 (en) * | 2002-12-31 | 2006-06-15 | Charlie Rodi | Bindingzyme arrays and high-throughput proteomic methods |
US7422865B2 (en) * | 2003-01-13 | 2008-09-09 | Agilent Technologies, Inc. | Method of identifying peptides in a proteomic sample |
WO2004064972A2 (en) * | 2003-01-16 | 2004-08-05 | Hk Pharmaceuticals, Inc. | Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions |
US20070141570A1 (en) * | 2003-03-07 | 2007-06-21 | Sequenom, Inc. | Association of polymorphic kinase anchor proteins with cardiac phenotypes and related methods |
US8046171B2 (en) | 2003-04-18 | 2011-10-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and apparatus for genetic evaluation |
WO2004097369A2 (en) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Sequenom, Inc. | Fragmentation-based methods and systems for de novo sequencing |
US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
US7368290B2 (en) * | 2003-05-12 | 2008-05-06 | Sandia National Laboratories | Structural determination of intact proteins using mass spectrometry |
US7964343B2 (en) | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
US8158354B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
US7425700B2 (en) * | 2003-05-22 | 2008-09-16 | Stults John T | Systems and methods for discovery and analysis of markers |
US20040236603A1 (en) * | 2003-05-22 | 2004-11-25 | Biospect, Inc. | System of analyzing complex mixtures of biological and other fluids to identify biological state information |
WO2005012578A1 (en) | 2003-07-31 | 2005-02-10 | Sequenom, Inc. | Methods for high level multiplexed polymerase chain reactions and homogeneous mass extension reactions for genotyping of polymorphisms |
US20050277204A1 (en) * | 2003-08-12 | 2005-12-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Sample preparation methods and devices |
AU2004288132A1 (en) * | 2003-08-12 | 2005-05-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Sample preparation methods and devices |
WO2005024068A2 (en) * | 2003-09-05 | 2005-03-17 | Sequenom, Inc. | Allele-specific sequence variation analysis |
US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
US8097416B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
US20120122103A1 (en) | 2003-09-11 | 2012-05-17 | Rangarajan Sampath | Compositions for use in identification of bacteria |
US8163895B2 (en) | 2003-12-05 | 2012-04-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of orthopoxviruses |
US20070087448A1 (en) * | 2004-02-16 | 2007-04-19 | Nelsestuen Gary L | Biological profiles and methods of use |
US20050181513A1 (en) * | 2004-02-18 | 2005-08-18 | Viorica Lopez-Avila | Methods and compositions for assessing a sample by MAILDI mass spectrometry |
US7666592B2 (en) | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
US8119336B2 (en) | 2004-03-03 | 2012-02-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of alphaviruses |
CA2561381C (en) * | 2004-03-26 | 2015-05-12 | Sequenom, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
US7608394B2 (en) | 2004-03-26 | 2009-10-27 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation |
US20050244973A1 (en) * | 2004-04-29 | 2005-11-03 | Predicant Biosciences, Inc. | Biological patterns for diagnosis and treatment of cancer |
WO2006073436A2 (en) * | 2004-04-29 | 2006-07-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Mass tag pcr for multiplex diagnostics |
ES2641832T3 (es) | 2004-05-24 | 2017-11-14 | Ibis Biosciences, Inc. | Espectrometría de masas con filtración de iones selectiva por establecimiento de umbrales digitales |
US20050266411A1 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-01 | Hofstadler Steven A | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
US7785843B2 (en) * | 2004-06-23 | 2010-08-31 | Sequenom, Inc. | Target-specific compomers and methods of use |
US7811753B2 (en) | 2004-07-14 | 2010-10-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
US7563598B2 (en) * | 2004-07-30 | 2009-07-21 | Ambergen, Inc. | Detection of truncation mutations by mass spectrometry |
US7786261B2 (en) * | 2004-09-02 | 2010-08-31 | National Research Council Of Canada | Coiled-coil fusion proteins comprising cell receptor domains |
AU2005284980A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Sequenom, Inc. | Methods for long-range sequence analysis of nucleic acids |
US20060073534A1 (en) * | 2004-10-05 | 2006-04-06 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc | Method for cleaving and deglycosylating antibodies to promote ligand binding |
AU2005305012C1 (en) | 2004-11-05 | 2012-07-19 | Qiagen North American Holdings, Inc. | Compositions and methods for purifying nucleic acids from stabilization reagents |
US7547775B2 (en) * | 2004-12-31 | 2009-06-16 | Affymetrix, Inc. | Parallel preparation of high fidelity probes in an array format |
US8084207B2 (en) | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
WO2006094238A2 (en) | 2005-03-03 | 2006-09-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
US9180196B2 (en) | 2005-03-11 | 2015-11-10 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Photodegradable groups for tunable polymeric materials |
US8343710B1 (en) * | 2005-03-11 | 2013-01-01 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Photodegradable groups for tunable polymeric materials |
AU2006272776B2 (en) | 2005-07-21 | 2012-01-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants |
WO2007035864A2 (en) * | 2005-09-20 | 2007-03-29 | Cell Biosciences, Inc. | Electrophoresis standards, methods and kits |
JP2007108015A (ja) * | 2005-10-13 | 2007-04-26 | Biologica:Kk | 分析用の保持体及びその利用 |
EP1952147A2 (de) | 2005-11-16 | 2008-08-06 | Novartis AG | Biomarker zur anti-nogo-a-antikörperbehandlung bei rückenmarksverletzung |
WO2007061981A2 (en) | 2005-11-21 | 2007-05-31 | Lumera Corporation | Surface plasmon resonance spectrometer with an actuator-driven angle scanning mechanism |
US7463358B2 (en) | 2005-12-06 | 2008-12-09 | Lumera Corporation | Highly stable surface plasmon resonance plates, microarrays, and methods |
US8088582B2 (en) | 2006-04-06 | 2012-01-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for the use in identification of fungi |
AU2007268369A1 (en) * | 2006-05-30 | 2007-12-06 | Synergenz Bioscience Limited | Methods and compositions for assessment of pulmonary function and disorders |
US8178316B2 (en) | 2006-06-29 | 2012-05-15 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluating proteins |
US20150232540A1 (en) | 2006-07-11 | 2015-08-20 | Cell Signaling Technology, Inc. | Analysis of ubiquitnated polypeptides |
EP2064332B1 (de) | 2006-09-14 | 2012-07-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Gezielte gesamtgenomamplifizierung zur identifizierung von krankheitserregern |
WO2008104002A2 (en) | 2007-02-23 | 2008-08-28 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic dna analysis |
WO2008151023A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
WO2009039122A2 (en) | 2007-09-17 | 2009-03-26 | Sequenom, Inc. | Integrated robotic sample transfer device |
WO2009070772A1 (en) * | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Monogram Biosciences, Inc. | Enhanced method for detecting and/or quantifying an analyte in a sample |
US8530182B2 (en) | 2007-12-05 | 2013-09-10 | Centers For Disease Control And Prevention | Viral protein quantification process and vaccine quality control therewith |
US8004669B1 (en) | 2007-12-18 | 2011-08-23 | Plexera Llc | SPR apparatus with a high performance fluid delivery system |
WO2009117785A1 (en) * | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Newsouth Innovations Pty Limited | Method of hla tissue typing |
WO2009131909A2 (en) * | 2008-04-21 | 2009-10-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Recombinant deamidated gliadin antigen |
WO2009155103A2 (en) * | 2008-05-30 | 2009-12-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of tick-borne pathogens |
WO2009148995A2 (en) * | 2008-06-02 | 2009-12-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
WO2010002993A1 (en) | 2008-07-01 | 2010-01-07 | Genocea Biosciences, Inc. | Antigen screening system |
WO2010012002A1 (en) * | 2008-07-25 | 2010-01-28 | Saryna Medical Corporation | Methods and systems for genetic analysis of fetal nucleated red blood cells |
EP2851433B1 (de) * | 2008-08-01 | 2017-10-11 | Brown University | System und Verfahren zur Bestimmung von Molekülen anhand von Massenspektrometrie sowie entsprechende Verfahren |
WO2010033599A2 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods |
EP2347254A2 (de) | 2008-09-16 | 2011-07-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Probenverarbeitungseinheiten, -systeme und damit verbundene verfahren |
US8534447B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-09-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
WO2010039870A1 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of neisseria, chlamydia, and/or chlamydophila bacteria |
WO2010039848A2 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of streptococcus pneumoniae |
WO2010093943A1 (en) | 2009-02-12 | 2010-08-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Ionization probe assemblies |
EP2226637A1 (de) * | 2009-03-04 | 2010-09-08 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | Vernetzungsmittel auf solidem Träger |
WO2010104798A1 (en) | 2009-03-08 | 2010-09-16 | Ibis Biosciences, Inc. | Bioagent detection methods |
WO2010114842A1 (en) | 2009-03-30 | 2010-10-07 | Ibis Biosciences, Inc. | Bioagent detection systems, devices, and methods |
US8945511B2 (en) | 2009-06-25 | 2015-02-03 | Paul Weinberger | Sensitive methods for detecting the presence of cancer associated with the over-expression of galectin-3 using biomarkers derived from galectin-3 |
US9194877B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-11-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems for bioagent indentification |
WO2011008971A1 (en) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
WO2011014811A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests |
EP3098325A1 (de) | 2009-08-06 | 2016-11-30 | Ibis Biosciences, Inc. | Basenzusammensetzungen ohne massenbestimmung zur nukleinsäureerkennung |
US20110065111A1 (en) * | 2009-08-31 | 2011-03-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions For Use In Genotyping Of Klebsiella Pneumoniae |
US9890408B2 (en) | 2009-10-15 | 2018-02-13 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
US8774488B2 (en) | 2010-03-11 | 2014-07-08 | Cellscape Corporation | Method and device for identification of nucleated red blood cells from a maternal blood sample |
WO2011115840A2 (en) | 2010-03-14 | 2011-09-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Parasite detection via endosymbiont detection |
RU2445000C2 (ru) * | 2010-03-22 | 2012-03-20 | Общество с ограниченной ответственностью "ЭкоБиоФарм" | Способ диагностики онкологических заболеваний предстательной железы на основе ацилкарнитина и арахидоноил амина |
ES2676183T3 (es) | 2010-07-02 | 2018-07-17 | Ventana Medical Systems, Inc. | Detección de dianas usando marcas de masa y espectrometría de masas |
US8629093B2 (en) | 2010-09-01 | 2014-01-14 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition comprising mixture of chelants |
WO2017026241A1 (ja) * | 2015-08-07 | 2017-02-16 | 国立大学法人愛媛大学 | 質量分析を用いたb型肝炎ウイルスの測定方法 |
CN105699476B (zh) * | 2016-03-29 | 2018-03-13 | 武汉大学 | 一种多肽化衍生方法及其在maldi‑tof‑ms检测小分子化合物中的应用 |
KR101953800B1 (ko) * | 2016-10-12 | 2019-03-04 | 주식회사 엘지화학 | 초고온용 에어로겔 블랭킷, 이의 제조방법 및 이의 시공방법 |
JP2022505162A (ja) * | 2018-10-18 | 2022-01-14 | ディーエイチ テクノロジーズ デベロップメント プライベート リミテッド | 質量分析システムとの使用のための試料採取要素の官能化 |
EP4010456A4 (de) | 2019-08-05 | 2023-09-13 | Seer, Inc. | Systeme und verfahren zur probenvorbereitung, datenerzeugung und proteinkoronaanalyse |
KR20220044212A (ko) | 2019-08-09 | 2022-04-06 | 넛크래커 테라퓨틱스 인코포레이티드 | 미세유체 장치 및 이의 사용 방법 |
WO2021167906A1 (en) * | 2020-02-19 | 2021-08-26 | Chan Zuckerberg Biohub, Inc. | Nucleic acid sequence detection by endonuclease digestion and mass spectrometry |
CN116773840B (zh) * | 2023-08-25 | 2023-10-27 | 四川徕伯益自动化技术有限公司 | 一种样本溶液的溯源方法及介质 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993024834A1 (en) * | 1992-05-29 | 1993-12-09 | The Rockefeller University | Method and product for the sequence determination of peptides using a mass spectrometer |
US5547835A (en) * | 1993-01-07 | 1996-08-20 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry |
US5605798A (en) * | 1993-01-07 | 1997-02-25 | Sequenom, Inc. | DNA diagnostic based on mass spectrometry |
Family Cites Families (89)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2739829C2 (de) | 1977-09-03 | 1986-04-10 | Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH, 8000 München | Anordnung zur Analyse einer Probenschicht durch Beschuß mit elektromagnetischer Strahlung |
US4356270A (en) | 1977-11-08 | 1982-10-26 | Genentech, Inc. | Recombinant DNA cloning vehicle |
US4442354A (en) | 1982-01-22 | 1984-04-10 | Atom Sciences, Inc. | Sputter initiated resonance ionization spectrometry |
DE3329892A1 (de) | 1983-08-18 | 1985-03-07 | Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg | Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden |
US4983521A (en) | 1983-10-26 | 1991-01-08 | The Regents Of The University Of California | Transmembrane integrator sequences |
US4683194A (en) | 1984-05-29 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences |
US5118605A (en) | 1984-10-16 | 1992-06-02 | Chiron Corporation | Polynucleotide determination with selectable cleavage sites |
GB2168478A (en) | 1984-11-26 | 1986-06-18 | Scan Limited M | Analysis of protein etc using mass spectrometry |
JPS61200524A (ja) | 1985-03-01 | 1986-09-05 | Fuji Photo Film Co Ltd | 光走査装置 |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4766072A (en) | 1985-07-17 | 1988-08-23 | Promega Corporation | Vectors for in vitro production of RNA copies of either strand of a cloned DNA sequence |
US5604099A (en) | 1986-03-13 | 1997-02-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
JP2640812B2 (ja) | 1986-10-21 | 1997-08-13 | 協和醗酵工業株式会社 | 粉粒体の高濃度気力輸送方法及びその装置 |
GB8626075D0 (en) | 1986-10-31 | 1986-12-03 | Vg Instr Group | Time-of-flight mass spectrometer |
US5670381A (en) | 1988-01-29 | 1997-09-23 | Abbott Laboratories | Devices for performing ion-capture binding assays |
DE3809504C1 (de) | 1988-03-22 | 1989-09-21 | Bruker - Franzen Analytik Gmbh, 2800 Bremen, De | |
ATE141946T1 (de) | 1988-06-14 | 1996-09-15 | Qiagen Gmbh | Hiv-2-virusvarianten |
US5237016A (en) | 1989-01-05 | 1993-08-17 | Siska Diagnostics, Inc. | End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids |
US4920264A (en) | 1989-01-17 | 1990-04-24 | Sri International | Method for preparing samples for mass analysis by desorption from a frozen solution |
WO1990014148A1 (en) | 1989-05-19 | 1990-11-29 | Fenn John B | Multiply charged ions and a method for determining the molecular weight of large molecules |
GB2236186B (en) | 1989-08-22 | 1994-01-05 | Finnigan Mat Gmbh | Process and device for laser desorption of analyte molecular ions, especially of biomolecules |
US5045694A (en) | 1989-09-27 | 1991-09-03 | The Rockefeller University | Instrument and method for the laser desorption of ions in mass spectrometry |
US5410068A (en) | 1989-10-23 | 1995-04-25 | Perseptive Biosystems, Inc. | Succinimidyl trityl compounds and a process for preparing same |
US5288644A (en) | 1990-04-04 | 1994-02-22 | The Rockefeller University | Instrument and method for the sequencing of genome |
US5135870A (en) | 1990-06-01 | 1992-08-04 | Arizona Board Of Regents | Laser ablation/ionizaton and mass spectrometric analysis of massive polymers |
DE4019005C2 (de) | 1990-06-13 | 2000-03-09 | Finnigan Mat Gmbh | Vorrichtungen zur Analyse von Ionen hoher Masse |
CA2097708A1 (en) | 1990-12-06 | 1992-06-07 | Stephen P. A. Fodor | Very large scale immobilized polymer synthesis |
WO1992013629A1 (en) | 1991-01-31 | 1992-08-20 | Wayne State University | A method for analyzing an organic sample |
US5210412A (en) | 1991-01-31 | 1993-05-11 | Wayne State University | Method for analyzing an organic sample |
US5198531A (en) | 1991-06-14 | 1993-03-30 | Research Diagnostic Antibodies | Polymeric resin for peptide synthesis |
EP0566714B1 (de) | 1991-10-11 | 1997-01-02 | Promega Corporation | Gekoppelte transkription und translation in zellfreien eukaryoten-extrakten |
US5492817A (en) | 1993-11-09 | 1996-02-20 | Promega Corporation | Coupled transcription and translation in eukaryotic cell-free extract |
IL103674A0 (en) | 1991-11-19 | 1993-04-04 | Houston Advanced Res Center | Method and apparatus for molecule detection |
WO1993009668A1 (en) | 1991-11-22 | 1993-05-27 | Affymax Technology N.V. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
DE4202123C2 (de) | 1992-01-27 | 1995-04-06 | Bruker Franzen Analytik Gmbh | Vorrichtung für die massenspektrometrische Untersuchung schneller organischer Ionen |
US5382793A (en) | 1992-03-06 | 1995-01-17 | Hewlett-Packard Company | Laser desorption ionization mass monitor (LDIM) |
US5792664A (en) | 1992-05-29 | 1998-08-11 | The Rockefeller University | Methods for producing and analyzing biopolymer ladders |
WO1994000562A1 (en) | 1992-06-24 | 1994-01-06 | The Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | A novel human immunodeficiency virus |
US5503980A (en) | 1992-11-06 | 1996-04-02 | Trustees Of Boston University | Positional sequencing by hybridization |
US5795714A (en) | 1992-11-06 | 1998-08-18 | Trustees Of Boston University | Method for replicating an array of nucleic acid probes |
US6194144B1 (en) | 1993-01-07 | 2001-02-27 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry |
DE69432629T3 (de) | 1993-01-25 | 2008-01-17 | Takeda Pharmaceutical Co. Ltd. | Antikörper gegen beta-amyloid oder derivative davon und seine verwendung |
US5628184A (en) | 1993-02-03 | 1997-05-13 | Santos; Rolando R. | Apparatus for reducing the production of NOx in a gas turbine |
US6074823A (en) | 1993-03-19 | 2000-06-13 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation |
DE69430909T2 (de) | 1993-03-19 | 2003-02-27 | Sequenom Inc | Dns-sequenzbestimmung durch massenspektrometrie auf dem weg des abbaus mit exonuklease |
US5381008A (en) | 1993-05-11 | 1995-01-10 | Mds Health Group Ltd. | Method of plasma mass analysis with reduced space charge effects |
US5376788A (en) | 1993-05-26 | 1994-12-27 | University Of Manitoba | Apparatus and method for matrix-assisted laser desorption mass spectrometry |
CA2512290C (en) | 1993-05-28 | 2010-02-02 | Baylor College Of Medicine | Method and apparatus for desorption and ionization of analytes |
FR2709761B1 (fr) | 1993-09-10 | 1995-11-24 | Pasteur Institut | Procédé de détection de molécules contenant des mésappariements nucléotidiques et de localisation de ces mésappariements, et application à la détection de substitutions ou de délétions de bases . |
JPH07150956A (ja) | 1993-11-26 | 1995-06-13 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | ターボクーリングエンジン |
US5622829A (en) | 1993-12-08 | 1997-04-22 | The Regents Of The University Of California | Genetic markers for breast, ovarian, and prostatic cancer |
US5538897A (en) * | 1994-03-14 | 1996-07-23 | University Of Washington | Use of mass spectrometry fragmentation patterns of peptides to identify amino acid sequences in databases |
ATE197156T1 (de) | 1994-03-23 | 2000-11-15 | Penn State Res Found | Verfahren zum nachweis von verbindungen einer konbinatorischen bibliothek. |
US5986076A (en) | 1994-05-11 | 1999-11-16 | Trustees Of Boston University | Photocleavable agents and conjugates for the detection and isolation of biomolecules |
US5643722A (en) | 1994-05-11 | 1997-07-01 | Trustees Of Boston University | Methods for the detection and isolation of proteins |
US5612474A (en) | 1994-06-30 | 1997-03-18 | Eli Lilly And Company | Acid labile immunoconjugate intermediates |
US5545539A (en) | 1994-10-18 | 1996-08-13 | Genzyme Corporation | Method for nucleotide sequence amplification |
US5504326A (en) | 1994-10-24 | 1996-04-02 | Indiana University Foundation | Spatial-velocity correlation focusing in time-of-flight mass spectrometry |
EP0830460A1 (de) | 1995-04-11 | 1998-03-25 | Trustees Of Boston University | Festphasensequenzierung von biopolymeren |
AU5576796A (en) | 1995-04-26 | 1996-11-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of using neurotrophic factors to enhance neuronal gr afts |
JP2001500606A (ja) | 1995-05-19 | 2001-01-16 | パーセプティブ バイオシステムズ,インコーポレーテッド | 質量スペクトル分析を用いた統計的に確実性のあるポリマー配列決定のための方法および装置 |
US5753439A (en) | 1995-05-19 | 1998-05-19 | Trustees Of Boston University | Nucleic acid detection methods |
US5625184A (en) | 1995-05-19 | 1997-04-29 | Perseptive Biosystems, Inc. | Time-of-flight mass spectrometry analysis of biomolecules |
US5830655A (en) | 1995-05-22 | 1998-11-03 | Sri International | Oligonucleotide sizing using cleavable primers |
US5700642A (en) | 1995-05-22 | 1997-12-23 | Sri International | Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers |
US5654150A (en) * | 1995-06-07 | 1997-08-05 | President And Fellows Of Harvard College | Method of expression cloning |
US6146854A (en) | 1995-08-31 | 2000-11-14 | Sequenom, Inc. | Filtration processes, kits and devices for isolating plasmids |
US5869242A (en) | 1995-09-18 | 1999-02-09 | Myriad Genetics, Inc. | Mass spectrometry to assess DNA sequence polymorphisms |
US5654545A (en) | 1995-09-19 | 1997-08-05 | Bruker-Franzen Analytik Gmbh | Mass resolution in time-of-flight mass spectrometers with reflectors |
WO1997016699A1 (en) | 1995-10-30 | 1997-05-09 | Trustees Of Boston University | Piezoelectric force sensing apparatus and methods for biopolymer sequencing |
AU707636C (en) | 1995-11-23 | 2003-01-16 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Materials and methods relating to the identification and sequencing of the BRCA2 cancer susceptibility gene and uses thereof |
US5641959A (en) | 1995-12-21 | 1997-06-24 | Bruker-Franzen Analytik Gmbh | Method for improved mass resolution with a TOF-LD source |
US5742049A (en) | 1995-12-21 | 1998-04-21 | Bruker-Franzen Analytik Gmbh | Method of improving mass resolution in time-of-flight mass spectrometry |
WO1997037041A2 (en) | 1996-03-18 | 1997-10-09 | Sequenom, Inc. | Dna sequencing by mass spectrometry |
US5777325A (en) | 1996-05-06 | 1998-07-07 | Hewlett-Packard Company | Device for time lag focusing time-of-flight mass spectrometry |
US5928906A (en) | 1996-05-09 | 1999-07-27 | Sequenom, Inc. | Process for direct sequencing during template amplification |
US6022688A (en) | 1996-05-13 | 2000-02-08 | Sequenom, Inc. | Method for dissociating biotin complexes |
DE19624802A1 (de) | 1996-06-21 | 1998-01-02 | Forssmann Wolf Georg | Verfahren zum direkten diagnostischen Nachweis von pathogenen, genetisch bedingten Punktmutationen in Proteinen bei Herzerkrankungen durch chemische und physikalische Methoden, besonders der direkten und indirekten Kopplung der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie und der Massenspektrometrie |
WO1998011249A1 (en) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Garvin Alex M | Mutation detection using peptide tagged in vitro synthesized proteins |
US5777324A (en) | 1996-09-19 | 1998-07-07 | Sequenom, Inc. | Method and apparatus for maldi analysis |
US5864137A (en) | 1996-10-01 | 1999-01-26 | Genetrace Systems, Inc. | Mass spectrometer |
US6133436A (en) | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
DE69738206T2 (de) | 1996-11-06 | 2008-07-17 | Sequenom, Inc., San Diego | DNA-Diagnostik mittels Massenspektrometrie |
US6024925A (en) | 1997-01-23 | 2000-02-15 | Sequenom, Inc. | Systems and methods for preparing low volume analyte array elements |
US5900481A (en) | 1996-11-06 | 1999-05-04 | Sequenom, Inc. | Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports |
WO1998020020A2 (en) | 1996-11-06 | 1998-05-14 | Sequenom, Inc. | High density immobilization of nucleic acids |
US6140053A (en) | 1996-11-06 | 2000-10-31 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation |
WO1998020019A1 (en) | 1996-11-06 | 1998-05-14 | Sequenom, Inc. | Compositions and methods for immobilizing nucleic acids to solid supports |
WO1998032876A1 (en) | 1997-01-23 | 1998-07-30 | Brax Group Limited | Characterising polypeptides |
-
1997
- 1997-09-02 US US08/922,201 patent/US6207370B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-09-02 US US09/146,054 patent/US6322970B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-02 EP EP02025544A patent/EP1296143B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-02 DE DE19882657T patent/DE19882657C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-02 AU AU91298/98A patent/AU744266B2/en not_active Ceased
- 1998-09-02 JP JP2000508990A patent/JP2001515209A/ja active Pending
- 1998-09-02 WO PCT/US1998/018311 patent/WO1999012040A2/en active IP Right Grant
- 1998-09-02 DE DE69840878T patent/DE69840878D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-02 DE DE69836488T patent/DE69836488D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-02 AT AT02025544T patent/ATE433112T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-09-02 EP EP98943528A patent/EP1010008B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-02 AT AT98943528T patent/ATE346304T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-09-02 CA CA002300356A patent/CA2300356A1/en not_active Abandoned
-
2000
- 2000-03-01 NO NO20001043A patent/NO20001043L/no unknown
- 2000-09-18 US US09/664,977 patent/US6387628B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-11-06 US US10/007,557 patent/US20030003465A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993024834A1 (en) * | 1992-05-29 | 1993-12-09 | The Rockefeller University | Method and product for the sequence determination of peptides using a mass spectrometer |
US5547835A (en) * | 1993-01-07 | 1996-08-20 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry |
US5605798A (en) * | 1993-01-07 | 1997-02-25 | Sequenom, Inc. | DNA diagnostic based on mass spectrometry |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102004042530A1 (de) * | 2004-09-02 | 2006-03-23 | Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag | Polypeptidmarker zur Diagnose von Arteriosklerose |
DE102004042530B4 (de) * | 2004-09-02 | 2006-10-19 | Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag | Verfahren zur Diagnose von Arteriosklerose |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US6387628B1 (en) | 2002-05-14 |
EP1010008B1 (de) | 2006-11-22 |
ATE433112T1 (de) | 2009-06-15 |
AU744266B2 (en) | 2002-02-21 |
AU9129898A (en) | 1999-03-22 |
EP1296143A2 (de) | 2003-03-26 |
WO1999012040A3 (en) | 1999-09-02 |
ATE346304T1 (de) | 2006-12-15 |
CA2300356A1 (en) | 1999-03-11 |
US6207370B1 (en) | 2001-03-27 |
NO20001043D0 (no) | 2000-03-01 |
WO1999012040A2 (en) | 1999-03-11 |
DE19882657T1 (de) | 2000-08-24 |
JP2001515209A (ja) | 2001-09-18 |
NO20001043L (no) | 2000-05-02 |
DE69836488D1 (de) | 2007-01-04 |
US20030003465A1 (en) | 2003-01-02 |
EP1010008A2 (de) | 2000-06-21 |
EP1296143A3 (de) | 2004-02-04 |
DE69840878D1 (de) | 2009-07-16 |
US6322970B1 (en) | 2001-11-27 |
EP1296143B1 (de) | 2009-06-03 |
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Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE19882657C2 (de) | Massenspektrometrischer Nachweis von Polypeptiden | |
US6558902B1 (en) | Infrared matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of macromolecules | |
DE69735445T2 (de) | Abspaltbare, nicht-flüchtige moleküle zur massenmarkierung | |
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EP1889047B1 (de) | Verwendung von konjugaten mit mittels photodissoziation oder fragmentation spaltbaren bindern für die massenspektrometrieanalyse von gewebeschnitten | |
DE69727489T2 (de) | Verfahren zur massenspektrometrie | |
US7198893B1 (en) | DNA diagnostics based on mass spectrometry | |
EP1036202B1 (de) | Verfahren zur identifikation von nucleinsäuren durch matrix-assistierte laser desorptions/ionisations massenspektrometrie | |
DE69626196T3 (de) | Dna-diagnostik mittels massenspektrometrie | |
EP0850320B1 (de) | Verfahren zur erkennung von ligandenpaar bindung mit erhöter empfindlichkeit | |
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