DE19882657C2 - Massenspektrometrischer Nachweis von Polypeptiden - Google Patents

Massenspektrometrischer Nachweis von Polypeptiden

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Description

Gebiet der Erfindung
Die offenbarten Verfahren und Kits betreffen im allgemeinen das Gebiet von Proteomics sowie der molekularen Medizin, und insbesondere Verfahren, die Massenspektrometrie verwenden, um die Identität eines Targetpolypeptides zu bestimmen.
Hintergrund
In den vergangenen Jahren ist die Molekularbiologie einer Reihe von humangenetischen Krankheiten durch die Anwendung von rekombinanten DNA-Technologien erklärt worden. Von mehr als 3000 Krankheiten ist bekannt, daß sie genetischen Ursprungs sind (Cooper und Krawczak, "Human Genome Mutations" (BIOS Publ. 1993)), einschließlich beispielsweise Hämophilie, Thalassämie, Duchenne Muskeldystrophie, Huntingtons Krankheit, Alzheimer Krankheit und zystische Fibrose sowie verschiedener Krebsarten wie Brustkrebs. Zusätzlich zu mutierten Genen, die zu genetischen Krankheiten führen, sind bestimmte Geburtsdefekte das Ergebnis von chromosomalen Anormalitäten, beispielsweise einschließlich Trisomie 21 (Down-Syndrom), Trisomie 13 (Patau- Syndrom), Trisomie 18 (Edward-Syndrom), Monosomie X (Turner- Syndrom) und andere Sexualchromosom-Aneuploidien wie das Klinefelter-Syndrom (XXY).
Andere genetische Krankheiten werden durch eine anormal Anzahl von Trinukleotidwiederholungen (trinucleotide repeats) in einem Gen verursacht. Diese Krankheiten schließen Huntingtons Krankheit, Prostatakrebs, spinalzerebellare Ataxie 1 (SCA-1), fragiles X-Syndrom (Kremer et al., Science 252: 1711-14 (1991); Fu et al Cell 67: 1047-58 (1991); Hirst et al., J. Med. Genet. 28: 824-29 (1991)); Myotonische Dystrophie Typ I (Mahadevan et al., Science 255: 1253-55 (1992); Brook et al., Cell 68: 799-808 (1992)), Kennedy Krankheit (die ebenfalls spinale und bulbäre Muskelatrophie genannt wird (La Spada et al., Nature 352; 77-79 (1991)), Machado-Joseph-Krankheit sowie dentatorubrale und pallidolyusiane Atrophie ein. Die anomale Zahl von Tripletwiederholungen kann in jedem Bereich eines Genes, einschließlich einer kodierenden Region, einer nicht kodierenden Region eines Exons, eines Introns oder eines regulatorischen Elementes wie einen Promoter angeordnet liegen. Bei einigen dieser Krankheiten, z. B. Prostatakrebs, ist die Anzahl von Tripletwiederholungen mit der Prognose der Krankheit positiv korreliert.
Beweise zeigen an, daß die Amplifikation einer Trinukleotidwiederholung in der molekularen Pathologie in jeder der oben genannten Krankheiten involviert ist. Obwohl einige dieser Trinukleotidwiederholungen in nicht kodierender DNA aufzutreten scheinen, sind sie eindeutig in Störungen von genomischen Bereichen involviert, die letztendlich die Genexpression beeinflussen. Störungen von verschiedenen Dinukleotid- und Trinukleotidwiederholungen, die aus somatischen Mutationen in Tumorzellen herrühren, können sich ebenfalls auf die Genexpression oder Genregulation auswirken.
Zusätzliche Beweise zeigen an, daß gewisse DNA-Sequenzen ein Individuum gegen eine Reihe von anderen Krankheiten, einschließlich Diabetes, Arteriosklerose, Fettleibigkeit, verschiedenen Autoimmunkrankheiten und Krebsarten wie Kolorektal-, Brust-, Gebärmutter- und Lungenkrebs, empfänglich machen. Das Wissen über genetische Läsionen, die eine genetische Krankheit verursachen oder dazu beitragen, erlaubt die Vorhersage, ob eine Person eine Krankheit oder einen Zustand hat, oder einem Risiko ausgesetzt ist, diese(n) zu entwickeln sowie ebenfalls, zumindest in einigen Fällen, die Prognose der Krankheit zu bestimmen.
Zahlreiche Gene haben polymorphe Bereiche. Da Individuen eine von verschiedenen allelischen Varianten eines polymorphen Bereiches besitzen, kann jedes auf Grundlage des Typs der allelischen Variante von polymorphen Regionen von Genen identifiziert werden. Eine solche Identifikation kann zum Beispiel für forensische Zwecke verwendet werden. In anderen Situationen ist es wichtig, die Identität der allelischen Variante in einem Individuum zu kennen. Zum Beispiel sind allelische Unterschiede in gewissen Genen wie den Haupt- Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Genen in der Transplantatabstoßung oder der Graft-Versus-Host-Disease bei Knochenmarktransplantationen involviert. Demzufolge ist es äußerst wünschenswert, schnelle, empfindliche und genaue Methoden zur Bestimmung der Identität von allelischen Varianten von polymorphen Bereichen von Genen oder genetischen Läsionen zu entwickeln.
Verschiedene Verfahren sind verwendet worden, um allelische Varianten oder genetische Läsionen zu identifizieren. Zum Beispiel kann die Identität einer allelischen Variante oder die Gegenwart einer genetischen Läsion bestimmt werden, indem die Mobilität eines amplifizierten Nukleinsäurefragments mit einem bekannten Standard durch Gel-Elektrophorese verglichen wird, oder durch Hybridisierung mit einer Sonde, die komplementär zu der zu identifizierenden Sequenz ist. Die Identifikation kann allerdings nur erreicht werden, wenn das Nukleinsäurefragment mit einer empfindlichen Reporterfunktion, beispielsweise einem radioaktiven (32P, 35S), fluoreszierenden oder chemilumineszenten Reporter, markiert ist. Radioaktive Markierungen können gefährlich sein und die Signale, die sie produzieren, können im Verlauf der Zeit substantiell abnehmen. Nichtradioaktive Markierungen wie Fluoreszenzmarkierungen können an einer mangelnden Empfindlichkeit und am Verbleichen des Signals, wenn Hochintensitätslaser verwendet werden, leiden. Darüber hinaus sind die Markierung, Elektrophorese und nachfolgende Detektion mühsame, zeitaufwendige und fehlerzugängliche Verfahren. Die Elektrophorese ist besonders fehlergeneigt, da die Größe oder das Molekulargewicht der Nukleinsäure nicht direkt mit seiner Mobilität in der Gelmatrix korreliert werden kann, da sequenzspezifische Effekte, Sekundärstrukturen und Interaktionen mit der Gelmatrix Artefakte bei seiner Wanderung durch das Gel verursachen.
Massenspektrometrie ist für die Sequenzanalyse von Nukleinsäuren verwendet worden (siehe zum Beispiel Schram, Mass Spectrometry of Nucleid Acid Components, Biomedical Applications of Mass Spectrometry 34: 203-287 (1990); Crain, Mass Spectrom. Rev. 9: 505-554 (1990); Murray, J. Mass Spectrom. Rev. 31: 1203 (1996); Nordhoff et al., J. Mass Spectrom. 15: 67 (1997)). Im allgemeinen stellt Massenspektrometrie ein Mittel bereit, individuelle Moleküle "zu wiegen", indem die Moleküle im Vakuum ionisiert werden, und sie durch Verflüchtigung "fliegen" gelassen werden. Unter dem Einfluß von elektrischen und/oder magnetischen Feldern folgen die Ionen Flugbahnen, die von ihrer individuellen Masse (m) und Ladung (z) abhängen. Für Moleküle mit niedrigen Molekulargewicht ist die Massenspektrometrie Teil des physikalisch-organischen Routinerepertoires zur Analyse und Charakterisierung von organischen Molekülen durch die Bestimmung der Masse des zugrundeliegenden molekularen Ions. Indem Kollisionen dieses zugrundeliegenden molekularen Ions mit anderen Partikeln wie Argonatomen herbeigeführt werden, wird darüber hinaus das molekulare Ion fragmentiert, wodurch Sekundär-Ionen durch kollisionsaktivierte Dissoziation (CAD) gebildet werden. Das (der) Fragmentierungsmuster/-Weg erlaubt sehr häufig die Ableitung von detaillierter struktureller Information. Viele Anwendungen von massenspektrometrischen Verfahren sind im Stand der Technik bekannt, insbesondere in den Biowissenschaften (siehe Meth. Enzymol., Vol. 193, "Mass Spectrometry" (McCloskey, ed.; Academic Press, NY 1990; McLaffery et al., Acc. Chem. Res. 27: 297-386 (1994); Chait und Kent, Science 257: 1885-1894 (1992); Siuzdak, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 11290-11297 (1994)), einschließlich Verfahren zum Herstellen und Analysieren von Biopolymerleitern (siehe internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 96/36732; US-Patent Nr. 5,792,664). Allerdings existieren, trotz der Anstrengungen, Massenspektrometrieverfahren auf die Analyse von Nukleinsäuremolekülen anzuwenden, Begrenzungen, einschließlich physikalischer und chemischer Eigenschaften von Nukleinsäuren. Nukleinsäuren sind sehr polare Biopolymere, die sich sehr schwierig verflüchtigen lassen.
Demzufolge besteht ein Bedarf an Verfahren, die Identität eines Nukleinsäuremoleküls, insbesondere genetischer Läsionen in einem Nukleinsäuremolekül unter Verwendung von alternativen Methoden zu bestimmen. Demzufolge ist es hier ein Ziel, Verfahren und Zusammensetzungen bereitzustellen, die diesen Bedarf erfüllen und zusätzliche Vorteile bereitstellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wird ein Verfahren zum Erhalten von Information betreffend die Sequenz eines Targetnukleinsäuremoleküls relativ zur Sequenz eines Referenznukleinsäuremoleküls, das ein Referenz-Polypeptid kodiert, bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte:
  • a) Präparieren des von dem Targetnukleinsäuremolekül kodierten Polypeptids ausgehend von dem Targetnukleinsäuremolekül durch in vitro Translation oder durch in vitro Transkription, gefolgt von Translation, des Targetnukleinsäuremoleküls;
  • b) Bestimmen der molekularen Masse des kodierten Polypeptids durch Massenspektrometrie; und
  • c) Vergleichen der molekularen Masse des kodierten Polypeptids mit der molekularen Masse des korrespondierenden, bekannten Referenz-Polypeptids, wodurch Information über die Sequenz von Nukleotiden im Targetnukleinsäuremolekül erhalten wird.
Nachfolgend wird das Targetnukleinsäuremolekül auch als (Target)-Nukleinsäure und das kodierte Polypeptid auch als Target-Polypeptid bezeichnet. Das Verfahren schließt somit die Schritte ein: Bestimmen der molekularen Masse des Targetpolypeptids oder eines Fragmentes oder eines Fragmentes davon durch Massenspektrometrie, und anschließend Vergleichen der Masse mit einem Standard, wodurch die Identität des Polypeptids ermittelt werden kann. Identität schließt ein, die Sequenz des Polypeptids zu identifizieren, einen Austausch in einer Sequenz verglichen mit einem bekannten Polypeptid zu identifizieren, sowie andere Mittel, durch die Polypeptide und Mutationen davon identifiziert werden können, ist jedoch nicht darauf begrenzt. Die Auswahl des Standards wird als Funktion der gewünschten Information bestimmt.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptids schließt die Schritte ein a) Erhalten eines Targetpolypeptids; b) Bestimmen der molekularen Masse des Targetpolypeptids durch Massenspektrometrie und c) durch Vergleichen der molekularen Masse des Targetpolypeptids mit der molekularen Masse eines korrespondieren bekannten Polypeptids. Indem die molekulare Masse des Targets mit einem bekannten Polypeptid, das eine bekannte Struktur aufweist, verglichen wird, kann die Identität des Targetpolypeptids ermittelt werden. Wie hier offenbart wird, wird das Polypeptid durch Verfahren einschließlich Transkribieren einer Nukleinsäure, die das Targetpolypeptid kodiert, in RNA und Übersetzen der RNA in das Targetpolypeptid, erhalten. Falls gewünscht, kann die Transkription der Nukleinsäure oder die Translation der RNA oder beide in vitro durchgeführt werden.
Ein hier offenbartes Verfahren kann ebenfalls einen Schritt einschließen, eine Nukleinsäure, die das Targetpolypeptid kodiert, vor dem Schritt a) zu amplifizieren, zum Beispiel indem eine Polymerase- Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines Forward-Primers und eines reversen Primers durchgeführt wird. Der Forward- Primer oder der reverse Primer kann einen RNA- Polymerasepromotor wie einen SP6 Promotor, T3 Promotor oder T7 Promotor enthalten. Darüber hinaus kann ein Primer eine Nukleotidsequenz für eine Transkriptionsstartstelle enthalten. Ein Primer kann ebenfalls ein Translationsstartcodon (ATG) kodieren. Demzufolge kann ein Targetpolypeptid von einer Nukleinsäure translatiert werden, die auf natürliche Weise in vivo nicht transkribiert oder translatiert wird, zum Beispiel indem ein Startcodon in die zu translatierende Nukleinsäure eingebaut wird, wodurch ein Translationsleserahmen bereitgestellt wird. Weiterhin kann ein Primer eine Nukleotidsequenz oder ein Komplement davon enthalten, die ein zweites Peptid oder Polypeptid kodiert, zum Beispiel ein Peptidanhängsel wie ein myc-Epitop- Anhängsel, ein Haemophilus influenza Hemagglutinin- Peptidanhängsel, eine Polyhistidinsequenz, eine Polylysinsequenz oder eine Polyargininsequenz. Ein hier offenbartes Verfahren kann in vivo durchgeführt werden, z. B. in einer Wirtszelle wie einer bakteriellen Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäure transformiert wird, die ein Targetpolypeptid kodiert, oder einer eukaryontischen Wirtszelle wie einer Säugerzelle, die mit einer Nukleinsäure, die ein Targetpolypeptid kodiert, transfektiert wird.
Ein hier offenbartes Verfahren wird unter Verwendung von massenspektrometrischer Analyse durchgeführt, einschließlich z. B. matrixunterstützter Laserdesorbtionsionisation (MALDI), kontinuierlicher oder gepulster Elektronenspray-Ionisation, Ion-Spray, Thermospray oder Massive Cluster Impact Massenspektrometrie und einem Detektionsformat wie lineare Flugzeit (time-of-flight/TOF), Reflektron Flugzeit, Einfach- Quadrupol, Mehrfach-Quadrupol, Einfach-Magnetischem Sektor, Mehrfach-Magnetischem Sektor, Fourier-Transform- Cyclotronresonanz, Ion-Trap sowie Kombinationen davon wie MALDI-TOF-Spektrometrie. Ein Vorteil der Verwendung eines bereitgestellten Verfahrens ist der, daß keine radioaktive Markierung erforderlich ist. Ein weiterer Vorteil ist, daß relativ kurze Polypeptide von einer Targetnukleinsäure synthetisiert werden, wodurch eine genaue Messung des molekularen Gewichts durch Massenspektrometrie, verglichen mit der Analyse der Nukleinsäure selbst, bereitgestellt wird. Ein RNA-Molekül, das ein Targetpolypeptid kodiert, kann in einem zellfreien Extrakt translatiert werden, der ein eukaryontischer zellfreier Extrakt wie ein Retikulozyten- Lysat, ein Weizenkeimextrakt oder einer Kombination davon, oder ein prokaryontischer zellfreier Extrakt, z. B. ein bakterieller Zellextrakt wie ein E. coli-S30-Extrakt sein kann. Falls gewünscht, kann die Translation und Transkription einer Targetnukleinsäure in demselben zellfreien Extrakt, beispielweise einem Retikulozyten-Lysat oder einem prokaryontischen Zellextrakt, durchgeführt werden.
Ein Targetpolypeptid wird im allgemeinen vor dem Nachweis durch massenspektrometrische Analyse isoliert. Zum Beispiel kann das Polypeptid von Nukleinsäuren stammen, die aus einer Zelle oder einem Gewebe, das von einem Individuum wie einem Menschen erhalten worden ist, isoliert werden. Das Targetpolypeptid kann unter Verwendung eines Reagenzes isoliert werden, das spezifisch mit dem Targetpolypeptid interagiert, beispielsweise einem Antikörper, der spezifisch mit dem Targetpolypeptid interagiert, oder das Targetpolypeptid kann an ein Peptidanhängsel fusioniert werden und unter Verwendung eines Reagenzes isoliert werden, das spezifisch mit dem Peptidanhängsel, z. B. einem für das Peptidanhängsel spezifischen Antikörper, interagiert. Ein Reagenz kann ein anderes Molekül sein, das spezifisch mit dem Peptidanhängsel interagiert, beispielsweise Metall-Ionen wie Nickel- oder Cobalt-Ionen, die spezifisch mit einem Hexahistidin-(His-6)Peptidanhängsel interagieren.
Ein Targetpolypeptid kann auf einen festen Träger wie einem Kügelchen oder einem Mikrochip immobilisiert werden, der eine ebene Oberfläche haben kann oder eine Oberfläche mit Strukturen, die im wesentlichen aus jedem üblicherweise zur Gestaltung einer solchen Vorrichtung verwendeten Material hergestellt wird. Ein Mikrochip ist zum Beispiel verwendbar, um Gruppen in einer adressierbaren Anordnung (Raster, array) anzuheften. Die Immobilisierung eines Targetpolypeptids stellt ein Mittel zur Isolierung des Polypeptids bereit, sowie ein Mittel, das isolierte Targetpolypeptid vor der Massenspektrometrie zu manipulieren.
Es werden Verfahren zum Sequenzieren eines immobilisierten Targetpolypeptids bereitgestellt, die das Sequenzieren vom Carboxyterminus oder vom Aminoterminus einschließen. Weiterhin werden Verfahren zur Bestimmung der Identität von jedem der Targetpolypeptide in einer Vielzahl von Targetpolypeptiden durch Multiplexing bereitgestellt.
In besonderen Ausführungsformen wird ein posttranslationales Einfangen (capture) und Immobilisieren eines Targetpolypeptids mittels eines spaltbaren Linkers bereitgestellt, um ein Polypeptid orthogonal zu sequenzieren. Diese Verfahren können einschließen: 1) Erhalten des Targetpolypeptids; 2) Immobilisieren des Targetpolypeptids auf einer festen Oberfläche; 3) Behandeln des immobilisierten Targetpolypeptids mit einem Enzym oder chemisch in einer zeitabhängigen Weise, um eine Reihe von deletierten Fragmenten zu erzeugen; 4) die gespaltenen Polypeptidfragmente werden konditioniert; 5) Abspalten des Linkers und dadurch Freisetzen des immobilisierten Fragmentes; 6) Bestimmen der Masse des freigesetzten Fragmentes; und 7) Alignment der Massen von jedem der Polypeptidfragmente, um die Aminosäuresequenz zu bestimmen. Variationen dieser Verfahren, in denen ein oder mehrere Schritte kombiniert oder ausgelassen werden, werden ebenfalls hier betrachtet.
In einer Ausführungsform schließt der zweite Schritt ein, den aminoterminalen Bereich des Polypeptids auf einem festen Träger mittels eines photospaltbaren Linkers zu immobilisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der feste Träger wie in Fig. 2 beschrieben aktiviert und mit der Aminogruppe des Targetpolypeptids reagieren gelassen.
In einer weiteren Ausführungsform schließt der zweite Schritt ein, den carboxyterminalen Bereich des Polypeptids auf einem festen Träger über einen photospaltbaren Linker zu immobilisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der photospaltbare Linker ein Linker, der von dem festen Träger mittels Licht abgespalten werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der feste Träger wie in Fig. 3 beschrieben aktiviert und mit der Carboxygruppe des Targetpolypeptids reagieren gelassen.
In einer weiteren Ausführungsform schließt der zweite Schritt ein, entweder den Carboxy- oder den Aminoterminus von Gruppen von verschiedenen Polypeptiden an einem festen Träger in einem Raster (Array)-Format mittels eines photospaltbaren Linkers zu immobilisieren. In einer bevorzugteren Ausführungsform werden diskrete Bereiche einer Siliciumoberfläche mittels der in Fig. 2 beschriebenen Chemie aktiviert und ein Raster (Array) besteht aus 2 bis 999 Positionen.
In einer weiteren Ausführungsform schließt der zweite Schritt ein, den aminoterminalen Bereich des Polypeptids an einen festen Träger mittels eines spaltbaren Linkers zu immobilisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der spaltbare Linker ein Silyl-Linker, der von dem festen Träger abgespalten werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der feste Träger wie in Fig. 2 beschrieben aktiviert und mit der Aminogruppe des Targetpolypeptids reagieren gelassen.
In weiteren Ausführungsform schließt der zweite Schritt ein, den carboxyterminalen Bereich des Polypeptids an einen festen Träger mittels eines spaltbaren Linkers zu immobilisieren. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist der spaltbare Linker ein Silyl-Linker, der von dem festen Träger abgespalten werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der feste Träger wie in Fig. 3 beschrieben aktiviert und mit der Carboxygruppe des Targetpolypeptids reagieren gelassen.
In einer weiteren Ausführungsform schließt der zweite Schritt ein, entweder den Carboxy- oder den Aminoterminus einer Gruppe verschiedener Polypeptide an einen festen Träger in einem Raster-Format mittels eines spaltbaren Linkers zu immobilisieren. In einer bevorzugteren Ausführungsform werden diskrete Bereiche einer Siliciumoberfläche mit der in Fig. 2 beschriebenen Chemie aktiviert, wodurch ein Raster, das vorzugsweise aus 2 bis 999 Positionen besteht, gebildet wird.
In einer weiteren Ausführungsform schließt der dritte Schritt ein, das aminoterminale Ende des Targetpolypeptides (der Targetpolypeptide) an den festen Träger zu immobilisieren und mit einer Exopeptidase zu behandeln. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Verdau mit Exopeptidase in einer zeitabhängigen Weise durchgeführt, um eine ineinandergreifende (nested) Gruppe immobilisierter Polypeptidfragmente mit variierender Länge zu erzeugen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Exopeptidase aus der Gruppe von einer oder mehrerer Monopeptidasen und Polypeptidasen einschließlich Carboxypeptidase Y, Carboxypeptidase P, Carboxypeptidase A, Carboxypeptidase G und Carboxypeptidase B, ausgewählt.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Exopeptidase aus der Gruppe von einer oder mehreren Monopeptidasen und Polypeptidasen, einschließlich Aminopeptidasen, einschließlich Alanin-Aminopeptidase, Leucin-Aminopeptidase, Pyroglutamat-Peptidase, Dipeptidylpeptidase, microsomale Peptidase und anderen Enzymen, die fortschreitend das aminoterminale Ende einer Polypeptidase verdauen, ausgewählt.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt der dritte Schritt einen Schritt, bei dem ein Exopeptidaseverdau unter Reaktionsbedingungen durchgeführt wird, die jede Sekundär- oder Tertiärstruktur entfernen, wodurch die terminalen Reste des Polypeptides unzugänglich für Exopeptidasen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform setzen die Reaktionsbedingungen den Terminus eines Targetpolypeptides (von Targetpolypeptiden) Temperaturen oberhalb ungefähr 70°C und unterhalb ungefähr 100°C aus. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die Exopeptidase eine thermostabile Carboxypeptidase oder Aminopeptidase. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform setzen die Reaktionsbedingungen den Terminus eines Targetpolypeptides Bedingungen von hoher Ionenstärke aus. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die Exopeptidase eine salztolerante Carboxypeptidase oder Aminopeptidase.
In einer weiteren Ausführungsform schließt der zweite Schritt ein, das Polypeptid nach der enzymatischen Behandlung oder Reinigung zu konditionieren. In einer bevorzugteren Ausführungsform schließen die Konditionierungsmethoden Verfahren ein, die das Polypeptid oder Polypeptidfragmente in einer Weise präparieren, die im allgemeinen die massenspektrometrische Analyse verbessern. In einer bevorzugteren Ausführungsform kann die Konditionierung einen Kationenaustausch einschließen.
Es werden ebenfalls Kits, die Komponenten enthalten, die für die Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptids auf der Basis eines hier offenbarten Verfahrens ermöglichen, bereitgestellt. Ein solches Kit kann Reagenzien für die in vitro Transkription und/oder Translation der amplifizierten Nukleinsäure enthalten, um das Targetpolypeptid zu erhalten; gegebenenfalls ein Reagenz zur Isolierung des Targetpolypeptides; sowie Anweisungen zur Verwendung bei der Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptides durch massenspektrometrische Analyse. Die Kits können ebenfalls zum Beispiel Forward- oder Reverse-Primers enthalten, die in der Lage sind, an eine Nukleinsäure, die das Targetpolypeptid kodiert, zu hybridisieren, und die Nukleinsäure zu amplifizieren. Solche Kits können auch ein organisches oder anorganisches Lösungsmittel enthalten, zum Beispiel ein Ammoniumsalz oder ein Reagenziensystem, um das Targetpolypeptid vor der massenspektrometrischen Analyse zu verflüchtigen und zu ionisieren. Darüber hinaus kann ein Kit eine Kontrollnukleinsäure oder Polypeptid mit bekannter Identität enthalten. Ein Kit kann ebenfalls beispielsweise einen festen Träger zur Immobilisierung eines Targetpeptides bereitstellen, einschließlich, falls gewünscht, Reagenzien, um eine solche Immobilisierung durchzuführen. Ein Kit kann weiterhin Reagenzien enthalten, die zur Manipulation eines Targetpolypeptides verwendbar sind, beispielsweise Reagenzien, um das Targetpolypeptid vor der Massenspektrometrie zu konditionieren oder Reagenzien zur Sequenzierung des Polypeptides. Ein hier offenbartes Kit kann verwendet werden, um die zahlreichen offenbarten Verfahren durchzuführen, und kann beispielsweise gestaltet werden für die Verwendung bei der Bestimmung der Anzahl von Nukleotidwiederholungen einer Targetnukleinsäure, oder ob eine Targetnukleinsäure eine unterschiedliche Anzahl von Nukleotidwiederholungen bezogen auf eine Referenznukleinsäure enthält.
Ein Targetpolypeptid kann von einer allelischen Variante einer polymorphen Region eines Genes eines Individuums kodiert werden, oder von einer allelischen Veriante einer polymorphen Region, die sich in einem chromosomalen Bereich befindet, der nicht in einem Gen liegt. Ein hier offenbartes Verfahren kann den Schritt einschließen, zu bestimmen, ob die allelische Variante identisch mit einer allelischen Variante einer polymorphen Region ist, die mit einer Krankheit oder einem Zustand assoziiert ist, wodurch angezeigt wird, ob ein Individuum eine Krankheit oder einen Zustand, die/der mit der spezifischen allelischen Variante des polymorphen Bereiches des Genes assoziiert ist, hat oder ein Risiko besitzt, diese(n) zu entwickeln. Die Krankheit oder der Zustand kann beispielsweise mit einer anormalen Zahl von Nukleotidwiederholungen (nucleotide repeats), beispielsweise Dinukleotid-, Trinukleotid-, Tetranukleotid- oder Pentanukleotid-wiederholungen assoziiert sein. Da Trinukleotidwiederholungen beispielsweise sehr lang sein können, ist die Bestimmung der Anzahl von Trinukleotidwiederholungen direkt durch Analyse der DNA nicht einfach. Da ein hier offenbartes Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptides auf der Analyse eines Polypeptides, insbesondere eines Polypeptides, das im wesentlichen durch Trinukleotidwiederholungen kodiert wird, basiert, ist die Bestimmung der Anzahl von Trinukleotidwiederholungen unter Verwendung der offenbarten Verfahren und Kits genauer. Eine Krankheit oder ein Zustand, der unter Verwendung eines offenbarten Verfahrens oder Kits identifiziert werden kann, schließt zum Beispiel ein:
Huntingtons Krankheit, Prostatakrebs, fragiles X-Syndrom Typ A, Myotonische Dystrophie Typ I, Kennedys Krankheit, Machado- Joseph-Krankheit, dentatorubrale und pallidolyusiane Atrophie sowie spinobulbäre muskuläre Atrophie; gleichwohl Alterung, die identifiziert werden kann, indem die Anzahl von Nukleotidwiederholungen in telomeren Nukleinsäuren aus einem Individuum untersucht wird. Die Krankheit oder der Zustand kann ebenfalls mit einem Gen wie einem Gen, das BRCA1, BRCA2, APC kodiert; einem Gen, das Dystrophin, β-Globin, Faktor IX, Faktor VIIc, Ornithin-d-Aminotransferase, Hypoxanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase oder dem Transmembranrezeptor der cystischen Fibrose (CFTR) oder ein Proto-Oncogen kodiert, assoziiert sein.
Ein hier offenbartes Verfahren oder Kit kann verwendet werden, um den Genotyp eines Individuums zu ermitteln, indem die Identität von einer oder mehreren allelischen Varianten von einer oder mehreren polymorphen Regionen in einem oder mehreren Genen oder Chromosomen des Individuums bestimmt wird. Beispielsweise kann das eine oder die mehreren Gene mit Transplantatabstoßung verbunden sein, und das Verfahren kann verwendet werden, um die Kompatibilität zwischen einem Spender und einem Empfänger eines Transplantates zu bestimmen. Solche Gene können beispielsweise MHC-Gene sein. Die Ermittlung des Genotyps eines Individuums mittels eines hier bereitgestellten Verfahrens kann für forensische oder für Identitätsbestimmungs-Zwecke verwendet werden, und die polymorphen Bereiche können in mitochondrialen Genen vorliegen oder können kurze Tandemrepeats sein.
Ein offenbartes Verfahren oder Kit kann ebenfalls verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Individuum einen pathogenen Organismus wie ein Virus, Bakterium, Pilz oder Protisten trägt. Ein Verfahren zur Bestimmung des Isotyps eines pathogenen Organismus wird ebenfalls bereitgestellt. Abhängig von der zu detektierenden Sequenz können die hier offenbarten Verfahren und Kits daher verwendet werden, um beispielsweise eine genetische Krankheit oder eine chromosomale Anormalität zu diagnostizieren; eine Prädisposition gegenüber oder eine Frühindikation einer Gen beeinflußten Krankheit oder eines Zustandes, beispielsweise Fettleibigkeit, Arteriosklerosis, Diabetes oder Krebs; oder eine Infektion durch einen pathogenen Organismus, beispielsweise einem Virus, Bakterium, Parasit oder Pilz; oder um Informationen bezüglich der Identität, Vererbung oder Verträglichkeit bereitzustellen, beispielsweise unter Verwendung von Minisatelliten- oder Mikrosatelliten-Sequenzen oder HLA-Phenotyping.
Ein hier offenbartes Verfahren stellt ein Mittel zum Erhalten von Information über die Sequenz eines Targetnukleinsäuremoleküls mittels Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Polypeptids von Interesse bereit. Solch ein Verfahren kann beispielsweise unter Verwendung von Massenspektrometrie durchgeführt werden, um die Identität eines Aminosäurerestes zu bestimmen, der vom Aminoterminus oder dem Carboxyterminus des interessierenden Polypeptides freigesetzt wird. Ein solcher Prozeß kann ebenfalls beispielsweise durchgeführt werden, indem ein ineinandergreifender (nested) Satz von carboxylterminalen oder aminoterminalen Deletionsfragmenten des interessierenden Polypeptides oder Peptidfragmente davon hergestellt werden, und den ineinandergreifende Satz von Deletionsfragmenten der Massenspektrometrie zu unterwerfen, wodurch die Aminosäuresequenz des Polypeptides bestimmt wird.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz eines interessierenden Polypeptides kann beispielsweise durchgeführt mittels eines Polypeptides durchgeführt, das auf einen festen Träger, immobilisiert wird, falls gewünscht reversibel. Darüber hinaus kann ein solches Verfahren mit einer Vielzahl solcher Polypeptiden durchgeführt werden, die beispielsweise eine Vielzahl von Targetpolypeptiden sind, die in einem adressierbaren Raster auf einen festen Träger wie einem Microchip immobilisiert sind, der z. B. zumindest zwei Positionen und sowie soviele wie 999 Positionen oder 1096 Positionen oder 9999 Positionen oder mehr enthalten kann. Im allgemeinen wird ein Targetpolypeptid oder die Aminosäuren, die davon abgespalten werden, vor der Massenspektrometrie konditioniert, wodurch die Auflösung des Massenspektrums erhöht wird. Beispielsweise kann ein Targetpolypeptid durch Massenmodifikation konditioniert werden. Weiterhin können die Aminosäuresequenzen einer Vielzahl von massenmodifizierten Targetpolypeptiden durch Massenspektrometrie unter Verwendung eines Multiplexingformates bestimmt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Fig. 1A zeigt die Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure (SEQ ID NO: 8), die durch PCR-Amplifikation von DNA erhalten werden kann, die einen nicht variablen Bereich von 12 CAG- Wiederholungen enthält (ohne Kursivschrift dargestellt) und eine variable Wiederholung von 10 CAG-Repeat-Einheiten (Kursiv dargestellt) mit Primer (unterstrichen), die die Sequenz (Forward-Primer) oder das Komplement der Sequenz (Reverse- Primer) aufweisen. Die T7 Promotorsequenz und die für ein Hexahistidinpeptid (His-6) kodierenden Sequenz sind fett dargestellt.
Fig. 1B zeigt die Sequenz (SEQ ID NO: 9) des 71 Aminosäure Polypeptides, das von der in Fig. 1A gezeigten Nukleinsäuresequenz kodiert ist. Der Bereich von 10 Variablen Glutamin (Q) Resten, die durch die Trinukleotidwiederholungen kodiert wird, ist kursiv dargestellt. Das His-6 Peptid ist in Fettdruck dargestellt.
Fig. 2 erläutert ein beispielhaftes Schema für das orthogonale Einfangen, Spalten und die MALDI-Analyse eines Polypeptides. Das Peptid ist an eine feste Oberfläche die ein Mikrochip sein kann, durch die Verwendung eines säurespaltbaren Diisopropylsilyl-Linkers konjugiert. Das Peptid ist an seinem Aminoterminus mit den Linker durch die Bildung einer Amidbindung konjugiert. Das immobilisierte Polypeptid kann beispielsweise unter Verwendung einer Carboxypeptidase verkürzt werden oder kann unter Verwendung einer Endopeptidase wie Trypsin gespalten werden, wird anschließend von dem festen Träger durch Exposition zu sauren Bedingungen wie die 3-HPA (3- Hydroxypicolinsäure) Matrix-Lösung. Das abgespaltene Polypeptid wird dann einer Massenspektrometrie, beispielsweise MALDI, unterworfen.
Fig. 3 veranschaulicht weitere Linker und Einfangstrategien, um ein Polypeptid auf einer festen Oberfläche reversibel zu immobilisieren. Fig. 3 stellt Reaktionsbedingungen bereit, um ein Polypeptid mittels seines Carboxyterminus an einen festen Träger unter Verwendung von 1- Ethyl-3-(3-Dimethylamino-propyl) carbodiimid-hydrochlorid (EDC)/N-Hydroxysuccinimidyl (NHS) zu konjugieren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Definitionen
Soweit nicht anderweitig definiert, besitzen alle hier verwendeten Techniken und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung wie sie gewöhnlicherweise vom Fachmann auf dem Gebiet, zu dem die Erfindung gehört, verstanden wird. Alle Patente, Anmeldungen und Publikationen, auf die Bezug genommen wird, werden durch Referenz hier mit aufgenommen. Zum besseren Verständnis wird hier die Bedeutung von bestimmten Begriffen und Ausdrücken, die in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet werden, bereitgestellt.
Der hier verwendete Begriff "Allel" bezieht sich auf eine alternative Form einer Nukleotidsequenz in einem Chromosom. Bezugnahme auf ein "Allel" schließt eine Nukleotidsequenz in einem Gen oder einem Bereich davon sowie eine Nukleotidsequenz, die keine Gensequenz ist, ein. Allele besetzen denselben Locus oder dieselbe Position auf homologen Chromosomen. Ein Individuum, das zwei identische Allele eines Genes besitzt, wird als "homozygot" für das Allel betrachtet, wohingegen ein Individuum, das zwei unterschiedliche Allele besitzt, als "heterozygot" betrachtet wird. Allele von spezifischen Nukleotidsequenzen, beispielsweise eines Genes, können sich voneinander in einem einzigen Nukleotid oder in verschiedenen Nukleotiden unterscheiden, wobei der Unterschied auf eine Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden zurückzuführen sein kann. Eine Form eines Genes, das eine Mutation enthält, ist ein Beispiel für ein Allel. Im Vergleich dazu ist ein Wildtyp-Allel ein Allel, das, wenn es in zwei Kopien in einem Individuum vorliegt, zu einem Wildtyp- Phänotyp führt. Es können verschiedene unterschiedliche Wildtyp-Allele eines speziellen Genes vorkommen, da bestimmte Nukleotidaustausche in einem Gen den Phänotyp eines Individuums, das zwei Kopien des Genes mit den Nukleotidaustauschen besitzt, nicht berührt.
Der Begriff "allelische Variante" bezieht sich auf einen Bereich eines Allels, der eine polymorphe Region in einer chromosomalen Nukleinsäure enthält. Der Begriff "allelische Variante" einer polymorphen Region eines Genes bezieht sich auf eine Region eines Genes, die eine von verschiedenen Nukleotidsequenzen, die in der Region des Genes in verschiedenen Individuen gefunden wird, aufweist. Der Begriff "Bestimmung der Indentität einer allelischen Variante einer polymorphen Region" bezieht sich auf die Bestimmung der Nukleotidsequenz oder der kodierten Aminosäuresequenz einer polymorphen Region, wodurch bestimmt wird, zu welcher der möglichen allelischen Varianten der polymorphen Region die besondere allelische Variante korrespondiert.
Der Begriff "Polymorphismus" bezieht sich auf die Coexistenz von mehr als einer Form eines Alleles in einer Population. Ein Polymorphismus kann in einer Region eines Chromosoms auftreten, die nicht mit einem Gen verbunden ist, oder kann beispielsweise als eine allelische Variante oder einen Teil davon eines Genes auftreten. Ein Teil eines Genes, der in zumindest zwei unterschiedlichen Formen existiert, beispielsweise zwei unterschiedlichen Nukleotidsequenzen, wird als eine "polymorphe Region eines Genes" bezeichnet. Eine polymorphe Region eines Genes kann auf ein einzelnes Nukleotid lokalisiert werden, dessen Identität in unterschiedlichen Allelen abweicht, oder kann verschiedene Nukleotide lang sein.
Der hier verwendete Begriff "biologische Probe" bezieht sich auf jedes Material, das von einer lebenden Quelle erhalten wird, beispielsweise einem Tier wie einem Menschen oder anderen Säugetieren, einer Pflanze, einem Bakterium, einem Pilz, einem Protisten oder einem Virus. Die biologische Probe kann in jeder Form vorliegen, einschließlich eines festen Material wie einem Gewebe, Zellen, einem Zellpellet, einem Zellextrakt, oder einer Biopsie, oder einer biologischen Flüssigkeit wie Urin, Blut, Speichel, Fruchtwasser, Exudat aus einem Infektions- oder Entzündungsbereich oder einer Mundspülung, die buccale Zellen enthält.
Der hier verwendete Begriff "Polypeptid" bedeutet zumindest zwei Aminosäuren oder Aminosäurederivate, einschließlich massenmodifizierter Aminosäuren, die durch eine Peptidbindung, die eine modifizierte Peptidbindung sein kann, verbunden sind. Ein Polypeptid kann von einer Nukleotidsequenz translatiert werden, die zumindest einen Bereich einer kodierenden Sequenz darstellt, oder von einer Nukleotidsequenz, die nicht auf natürliche Weise translatiert wird, was beispielsweise darauf zurückzuführen ist, daß sie sich in einem anderen Leserahmen als dem kodierenden Rahmen befindet oder daß es eine Intronsequenz, eine 3' oder 5' nichttranslatierte Sequenz oder eine regulatorische Sequenz wie ein Promotor ist. Ein Polypeptid kann ebenfalls chemisch synthetisiert werden und kann durch chemische oder enzymatische Methoden nach der Translation oder chemischen Synthese modifiziert werden. Die Begriffe " Protein", "Polypeptid" und "Peptid" werden hier miteinander austauschbar verwendet, wenn sie sich auf eine translatierte Nukleinsäure, beispielsweise ein Genprodukt, beziehen.
Der hier verwendete Ausdruck "Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptids" bezieht sich auf die Bestimmung von zumindest einem Charakteristikum des Polypeptids durch Massenspektrometrie, beispielsweise die Identität von zumindest einer Aminosäure, oder auf die Identifikation eines besonderen Patterns von Peptidfragmenten des Targetpolypeptides. Die Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptides kann beispielsweise unter Verwendung von Massenspektrometrie durchgeführt werden, um die Aminosäuresequenz von zumindest einem Teil des Polypeptides zu bestimmen, oder um das Pattern von Peptidfragmenten des Targetpolypeptides zu bestimmen, die beispielsweise durch Behandlung des Polypeptides mit einer oder mehrerer Endopeptidasen erzeugt worden sind.
Bei der Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptides kann die Anzahl der Nukleotidwiederholungen, die das Targetpolypeptid kodiert, quantifiziert werde. Der hier verwendete Begriff "Quantifizieren", bedeutet, in bezug auf Nukleotidwiederholungen, die ein Targetpolypeptid kodieren, eine Bestimmung der exakten Anzahl von Nukleotidwiederholungen, die in der Nukleotidsequenz, die das Targetpolypeptid kodiert, vorkommen. Wie hier offenbart kann die Anzahl von Nukleotidwiederholungen, beispielsweise Trinukleotid­ wiederholungen, quantifiziert werden, indem Massenspektrometrie verwendet wird, um die Anzahl von Aminosäuren, die durch die Wiederholung kodiert werden, die in dem Targetpolypeptid vorkommen, zu bestimmen. Es sollte allerdings erkannt werden, daß die Anzahl von Nukleotidwiederholungen, die ein Targetpolypeptid kodieren, nicht quantifiziert werden muß, um die Identität eines Targetpolypeptides zu bestimmen, da eine Messung der relativen Anzahl von Aminosäuren, die durch eine Region von Nukleotidwiederholungen kodiert werden, ebenfalls verwendet werden kann, um die Identität des Targetpolypeptides zu bestimmen, indem das Massenspektrum des Targetpolypeptides mit dem eines entsprechenden bekannten Polypeptides verglichen wird.
Der hier verwendete Ausdruck "Nukleotidwiederholungen" bezieht sich auf jede Nukleotidsequenz, die sich tandemartig wiederholende Nukleotide enthält. Solche sich tandemartig wiederholenden Necleotide können Dinukleotid-, Trinukleotid-, Tetranukleotid- oder Tentanukleotidsequenzen oder jede tandemartige Anordnung von sich wiederholenden Einheiten sein.
Wie hier verwendet, bedeutet ein Referenzpolypeptid ein Polypeptid, mit dem das Targetpolypeptid verglichen wird, um das Polypeptid mit Methoden zu identifizieren, die das Sequenzieren des Polypeptides nicht einschließen. Referenzpolypeptide sind üblicherweise bekannte Polypeptide.
Der hier verwendete Ausdruck "konditioniert" oder "Konditionieren" in bezug auf ein Polypeptid, insbesondere ein Targetpolypeptid bedeutet, daß das Polypeptid so modifiziert ist, daß die Laserenergie, die erforderlich ist, um das Polypeptid zu verflüchtigen, erniedrigt wird, die Wahrscheinlichkeit der Fragmentierung des Polypeptides minimiert wird, oder die Auflösung eines Massenspektrums des Polypeptides oder der Komponente Aminosäuren erhöht wird. Die Auflösung eines Massenspektrums eines Targetpolypeptides kann erhöht werden, indem das Polypeptid vor der Durchführung der Massenspektrometrie konditioniert wird. Die Konditionierung kann zu jeder Phase vor der Massenspektrometrie durchgeführt werden, und kann insbesondere während der Immobilisierung des Polypeptides durchgeführt werden. Ein Polypeptid kann konditioniert werden, indem das Polypeptid beispielsweise mit einem Kationen-Austauschmaterial oder einem Anionen- Austauschmaterial behandelt wird, das die Ladungsheterogenität des Polypeptides verringert, wodurch eine Verbreiterung des Peaks aufgrund von Heterogenitäten in der Anzahl von Kationen (oder Anionen), die an die verschiedenen Polypeptide in einer Population gebunden sind, eliminiert werden. Indem ein Polypeptid mit einem Alkylierungsmittel wie Alkyliodid, Iodacetamid, Iodethanol oder 2,3-Epoxy-1-propanol in Kontakt gebracht wird, kann beispielsweise die Bildung von Disulfidbrücken in einem Polypeptid verhindert werden. Auf ähnliche Weise können geladene Aminosäure-Seitenketten in ungeladene Derivate durch den Einsatz von Trialkylsilylchloriden umgewandelt werden.
Das Konditionieren von Proteinen ist im allgemeinen nicht notwendig, da Proteine relativ stabil unter sauren, hochenergetischen Bedingungen sind, so daß Proteine keine Konditionierung für die massenspektrometrische Analyse erfordern. Es gibt allerdings Mittel zur Verbesserung der Auflösung, insbesondere für kürzere Peptide, wie den Einbau von modifizierten Aminosäuren, die basischer sind als die korrespondierenden nicht modifizierten Reste. Solche Modifikationen erhöhen im allgemeinen die Stabilität des Polypeptides während der massenspektrometrischen Analyse. Ebenfalls können Kationenaustausch-Chromatographie sowie allgemeine Wasch- und Reinigungsprozeduren, die Proteine und andere Komponenten von Reaktionsmischungen von dem Targetpolypeptid entfernen, verwendet werden, um das Peptid nach einer in vitro Translation zu reinigen und dadurch die Auflösung des Spektrums, das von der massenspektrometrischen Analyse des Targetpolypeptides stammt, zu erhöhen.
Wie hier verwendet bezieht sich verzögerte Extraktion auf Verfahren, bei denen Bedingungen ausgewählt werden, daß sie eine längere optimale Extraktionsverzögerung und damit eine längere Verweilzeit erlauben, was zu einer verbesserter Auflösung führt (siehe z. B. Jahusz et al. (1996) Analysis, Anal. Chem. 68: 941-946; und Vestal et al. (1995) Rapid Communications in Mass Spectrometry 9: 1044-1050; siehe ebenfalls zum Beispiel US-Patent Nr. 5,777,325, US-Patent Nr. 5,742,049, US-Patent Nr. 5,654,545, US-Patent Nr. 5,641,959, US-Patent Nr. 5,654,545 sowie US-Patent Nr. 5,760,393 für Beschreibungen von MALDI und Protokollen zur verzögerten Extraktion). Insbesondere ist die verzögerte Ionenextraktion eine Technik, wodurch eine Zeitverzögerung zwischen der Bildung der Ionen und der Anwendung des Beschleunigungsfeldes eingeführt wird. Während der Zeitverschiebung bewegen sich die Ionen an neue Positionen gemäß ihrer anfänglichen Geschwindigkeiten. Indem die Verzögerungszeit und die Beschleunigungsfelder in der Beschleunigungsregion sorgfältig ausgewählt werden, kann die Flugzeit der Ionen angepaßt werden, um die Flugzeit unabhängig von der Anfangsgeschwindigkeit zur ersten Ordnung zu machen. Zum Beispiel schließt ein besonderes Verfahren die Exposition der Targetpolypeptid-Probe gegenüber einem elektrischen Feld vor und während des Ionisationsprozesses ein, was zu einer Reduktion des Hintergrundsignals aufgrund der Matrix führt, eine schnelle Fragmentierung induziert und den Energietransfer vor der Ionenextraktion steuert.
Der hier verwendete Begriff "Multiplexing" bezieht sich auf die simultane Bestimmung der Identität von zumindest zwei Targetpolypeptiden durch Massenspektrometrie. Wenn zum Beispiel eine Population von verschiedenen Targetpolypeptiden in einem Raster auf einem Mikrochip vorkommt, oder auf einer anderen Art von festem Träger vorkommt, kann Multiplexing verwendet werden, um die Identität einer Vielzahl von Targetpolypeptiden zu bestimmen. Multiplexing kann beispielsweise durchgeführt werden, indem die Masse von jedem der unterschiedlichen interessierenden Polypeptiden differenziell modifiziert wird, anschließend Massenspektrometrie verwendet wird, um die Identität von jedem unterschiedlichen Polypeptid zu bestimmen. Multiplexing stellt den Vorteil bereit, daß eine Vielzahl von Targetpolypeptiden durch ein einziges Massenspektrum identifiziert werden kann, verglichen damit, daß eine separate massenspektrometrische Analyse für jedes individuelle Targetpolypeptid durchgeführt werden muß.
Der hier verwendete Begriff "Vielzahl" in bezug auf ein Polynukleotid oder ein Polypeptid verwendet, bedeutet zwei oder mehr Polynukleotide oder Polypeptide, von denen jedes eine unterschiedliche Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenz aufweist. Eine solche Differenz kann auf natürlich vorkommende Variationen zwischen den Sequenzen, beispielsweise auf eine allelische Variation in einem Nukleotid oder in einer kodierten Aminosäure zurückzuführen sein, oder kann auf die Einführung von besonderen Modifikationen in verschiedene Sequenzen, beispielsweise den differentiellen Einbau von massenmodifizierten Aminosäuren in jedes Polypeptid in einer Vielzahl, zurückzuführen sein.
Wie hier verwendet, bezieht sich "in vitro Transkriptionssystem" auf ein zellfreies System, das eine RNA- Polymerase und andere Faktoren und Reagenzien enthält, die für die Transkription eines DNA-Moleküls notwendig sind, das auf operable Weise mit einem Promotor verbunden ist, der spezifisch eine RNA-Polymerase bindet. Ein in vitro Transkriptionssystem kann ein Zellextrakt, beispielsweise ein eukaryontischer Zellextrakt sein. Der hier verwendete Begriff "Transkription" bedeutet im allgemeinen den Prozeß, durch den die Produktion von RNA-Molekülen auf Basis eines DNA-Templates initiiert, verlängert und terminiert wird. Darüber hinaus wird das Verfahren der "reversen Transkription", das im Stand der Technik wohl bekannt ist, so verstanden, daß es in der Bedeutung des hier verwendeten Begriffes "Transkription" eingeschlossen ist. Transkription ist eine Polymerisationsreaktion, die durch DNA-abhängige oder RNA- abhängige RNA-Polymerasen katalysiert wird. Beispiele von RNA- Polymerase schließen die bakteriellen RNA-Polymerasen, SP6-RNA- Polymerase, T3-RNA-Polymerase, T3-RNA-Polymerase sowie T7-RNA- Polymerase ein.
Der hier verwendete Begriff "Translation" beschreibt den Prozeß, durch den die Produktion eines Polypeptides auf Basis eines RNA-Templates initiiert, verlängert und terminiert wird. Damit ein Polypeptid auch ausgehend von DNA hergestellt wird, muß die DNA in RNA umgeschrieben werden, anschließend wird die RNA aufgrund von Wechselwirkungen von verschiedenen zellulären Komponenten in das Polypeptid translatiert. In prokaryontischen Zellen sind die Transkriptionen und Translationen "gekoppelt", was bedeutet, daß RNA in ein Polypeptid zu dem Zeitpunkt translatiert wird, zu dem sie aus der DNA transkribiert wird. In eukaryontischen Zellen, einschließlich Pflanzen- und Tierzellen, wird DNA in RNA im Zellkern transkribiert, anschließend die RNA in mRNA prozessiert, die in das Cytoplasma transportiert wird, wo sie in ein Polypeptid translatiert wird.
Der Ausdruck "Translationssystem" bezieht sich auf ein zelluläres oder zellfreies System zur Durchführung einer Translationsreaktion. Der Begriff "zelluläres Translationssystem" bezieht sich auf ein Translationssystem auf Basis einer permeabilisierten Zelle; der Begriff "zellfreies Translationssystem" oder "in vitro Translationssystem" bezieht sich auf ein Zellextrakt oder ein rekonstituiertes Translationssystem. Der Begriff "rekonstituiertes Translationssystem" bezieht sich auf ein System, das gereinigte oder teilweise gereinigte Translationsfaktoren wie Elongationsfaktoren enthält. Ein in vitro Translationssystem enthält zumindest die minimalen Elemente, die für die Translation eines RNA-Moleküls in ein Polypeptid notwendig sind. Ein in vitro Translationssystem, das ein eukaryontisches oder prokaryontisches System sein kann, enthält üblicherweise Ribosomen, tRNA-Moleküle, rRNA, eine Initiator-Methionyl- tRNAMet, Proteine oder Komplexe, die an der Translation beteiligt sind, beispielsweise eukaryontischer Initiationsfaktor 2 (elF2), elF3 und elF4F, sowie den Cap- Bindungs-Komplex, einschließlich des Cap-binding-Proteins.
Der hier in Bezug auf eine Nukleinsäure, einschließlich DNA und RNA, verwendete Begriff "isoliert" bezieht sich auf Nukleinsäuremoleküle, die im wesentlichen von anderen Makromolekülen separiert sind, die normalerweise mit der Nukleinsäure in ihrem natürlichen Zustand assoziert sind. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ist im wesentlichen von dem zellulären Material, das mit ihr normalerweise in einer Zelle assoziert ist, getrennt, oder kann, wenn dies relevant ist, im wesentlichen von bakteriellem oder viralem Material getrennt sein; oder bei Produktion durch rekombinante DNA-Techniken vom Kulturmedium; oder von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn die Nukleinsäure chemisch synthetisiert wird. Im allgemeinen ist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mindestens ungefähr 50% angereichert verglichen mit seinem natürlichen Zustand; und üblicherweise von ungefähr 70% bis ungefähr 80%, insbesondere ungefähr 90% oder 95% oder mehr angereichert. Vorzugsweise macht eine isolierte Nukleinsäure mindestens 50% einer die Nukleinsäure enthaltenden Probe aus und kann mindestens ungefähr 70% oder 80% des Materials in einer Probe sein, insbesondere mindestens ungefähr 90% bis 95% oder mehr der Probe. Eine isolierte Nukleinsäure kann ein Nukleinsäurefragment sein, das in der Natur nicht vorkommt, und daher nicht in einem natürlichen Zustand gefunden wird.
Der Begriff "isoliert" wird ebenfalls hier verwendet, um sich auf Polypeptide zu beziehen, die im wesentlichen von anderen Makromolekülen, die üblicherweise mit dem Polypeptid in seinem natürlichen Zustand assoziert sind, getrennt sind. Ein isoliertes Polypeptid kann identifiziert auf der Basis werden, das es bezogen auf die Materialien angereichert ist, mit denen es natürlicherweise assoziert ist, oder das es eine Fraktion einer Probe aufbaut, die das Polypeptid in demselben Grad enthält wie oben für eine "isolierte" Nukleinsäure definiert enthält, d. h., mindestens ungefähr 50% verglichen mit seinem natürlichen Zustand angereichert ist, oder mindestens ungefähr 50% der das Polypeptid enthaltenen Probe ausmacht. Ein isoliertes Polypeptid kann zum Beispiel aus einer Zelle gereinigt werden, die üblicherweise das Polypeptid exprimiert oder kann unter Verwendung rekombinanter DNA-Methoden hergestellt werden.
Der hier verwendete Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Polynukleotid, einschließlich einer Desoxyribonukleinsäure (DNA), eine Ribonukleinsäure (RNA) sowie einem Analogon von DNA oder RNA, das zum Beispiel ein Nukleotidanalogon oder eine andere "Rückgrat"-Bindung als eine Phosphordiesterbindung enthält, zum Beispiel eine Phosphortriesterbindung, eine Thioesterbindung oder eine Peptidbindung (Peptidnukleinsäure). Eine Nukleinsäure kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein und kann zum Beispiel ein DNA-RNA-Hybrid sein. Eine Nukleinsäure kann ebenfalls ein Teil eines längeren Nukleinsäuremoleküls sein, beispielsweise ein Teil eines Genes, das eine polymorphe Region enthält. Die molekulare Struktur einer Nukleotidsequenz, zum Beispiel eines Genes oder eines Teiles davon, wird durch ihren Nukleotidgehalt definiert, einschließlich Deletionen, Substitutionen oder Hinzufügungen von einem oder mehreren Nukleotiden; die Nukleotidsequenz, dem Methylierungszustand; oder anderen Modifikationen der Nukleotidsequenz.
Die Bezugnahme auf eine Nukleinsäure als ein "Polynukleotid" ist in ihren breitesten Sinne gemeint, um ein oder zwei Nukleotide oder Nukleotidanaloga, die durch eine kovalente Bindung verbunden sind, zu bezeichnen, einschließlich einzelsträngiger und doppelsträngiger Moleküle. Der Begriff "Oligonukleotide" wird ebenfalls hier verwendet, um zwei oder mehr Nukleotide oder Nukleotidanaloga, die durch eine kovalente Bindung verbunden sind, zu bezeichnen, obwohl der Fachmann erkennt, daß Oligonukleotide wie PCR-Primer im allgemeinen eine Länge von weniger als ungefähr 50 bis 100 Nukleotide aufweisen. Wenn im Bezug auf eine Nukleinsäure verwendet, bedeutet der Begriff "Amplifizieren" das wiederholte Kopieren einer DNA- Sequenz oder einer RNA-Sequenz durch die Verwendung von spezifischen oder nicht spezifischen Mitteln, was zu einer Zunahme der Menge der spezifischen DNA- oder RNA-Sequenzen, die kopiert werden sollen, führt.
Ein hier offenbartes Verfahren kann verwendet werden, um eine Nukleotidsequenz eines unbekannten Polynukleotid zu ermitteln, indem die Aminosäuresequenz eines Polypeptides, das von dem unbekannten Polynukleotid kodiert wird, mit der Aminosäuresequenz des Polypeptides, das durch ein korrespondierendes bekanntes Polynukleotid kodiert wird, verglichen wird. Die ermittelte Nukleotidsequenz des unbekannten Polynukleotids kann dieselbe sein wie eine natürlich vorkommende Nukleotidsequenz, die das Polypeptid kodiert, oder kann sich von der natürlich vorkommenden Sequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheiden.
Der hier verwendete Begriff "unbekanntes Polynukleotid" bezieht sich auf ein Polynukleotid, dessen dadurch kodiertes Polypeptid durch Massenspektrometrie untersucht wird. Im allgemeinen wird ein unbekanntes Polynukleotid aus einer biologischen Probe erhalten. Der Begriff "korrespondierendes bekanntes Polynukleotid" bedeutet ein definiertes Gegenstück des Polynukleotids. Ein korrespondierendes bekanntes Polynukleotid wird im allgemeinen als eine Kontrolle zum Vergleich des unbekannten Polynukleotids verwendet und kann beispielsweise die Nukleotidsequenz eines Allels des unbekannten Polynukleotids sein, das bei der Mehrzahl von Individuen in einer Population vorliegt. Zum Beispiel kann ein "unbekanntes Polynukleotid" eine DNA-Sequenz sein, die aus einem Patienten mit Prostatakrebs erhalten wird und die polymorphe Region einschließt, die die Amplifikation einer mit Prostatakrebs assoziierten Trinukleotidsequenz zeigt, und das "korrespondierende bekannte Polynukleotid" kann dieselbe polymorphe Region aus einem Individuum sein, das keinen Prostatakrebs hat, zum Beispiel aus einem weiblichen Individuum. Ein unbekanntes Polynukleotid kann ebenfalls ein mutiertes Gen sein, das den Phänotyp eines Individuums im Vergleich zu einem Individuum, das das mutierte Gen nicht besitzt, verändert. Ein mutiertes Gen kann rezessiv, dominant oder codominant sein, wie im Stand der Technik wohl bekannt ist.
Der Begriff "Plasmid" bezieht sich im allgemeinen auf eine zirkuläre DNA-Sequenz, die in ihrer Vektorform nicht an ein Chromosom gebunden ist. Die Begriffe "Plasmid" und "Vektor" werden hier gegeneinander austauschbar verwendet, da das Plasmid die am häufigsten gebrauchte Form eines Vektors ist. Vektoren wie ein Lambda-Vektor können linear sein, nichtsdestotrotz sind sie in der Bedeutung des hier verwendeten Begriffes "Plasmid" oder "Vektor" eingeschlossen. Expressionsvektoren und andere Vektoren, die äquivalenten Funktionen dienen, und die hiernach im Stand der Technik bekannt werden, sind ebenfalls in die Bedeutung des hier verwendeten Begriffes "Plasmid" oder "Vektor" eingeschlossen.
Im allgemeinen wird eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid von Interesse, zum Beispiel ein Targetpolypeptid kodiert, in ein Plasmid kloniert und mit regulatorischen Elementen, die für die Transkription oder Translation der klonierten Nukleinsäure erforderlich sind, auf operable Weise verknüpft. Der hier verwendete Begriff "auf operable Weise verknüpft" bedeutet, daß eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, mit einem regulatorischen Element, insbesondere einem Promotor, in der Art verbunden wird, daß das regulatorische Element seine Funktion bezüglich des Nukleinsäuremoleküls, mit dem es verbunden ist, erfüllt. Zum Beispiel erlaubt ein Promotorelement, das auf operable Weise mit einer Nukleinsäure verknüpft ist, die Transkription der Nukleinsäure, wenn das Konstrukt unter Bedingungen gestellt wird, die dafür geeignet sind, daß eine Transkription stattfindet. Es sollte klar sein, daß der Begriff "regulatorisches Element" hier so breit verwendet wird, um eine Nukleotidsequenz, entweder DNA oder RNA einzuschließen, die für Transkription oder Translation erforderlich ist, beispielsweise eine Nukleotidsequenz, die ein Stopcodon oder einer ribosomale Bindestelle kodiert.
Der Begriff "Targetnukleinsäure" bezieht sich auf jede Nukleinsäure von Interesse, einschließlich eines Bereiches einer größeren Nukleinsäure wie einem Gen oder einer mRNA. Eine Targetnukleinsäure kann eine polymorphe Region einer chromosomalen Nukleinsäure sein, beispielsweise ein Gen, oder eine Region eines Genes, das potentiell eine Mutation aufweist. Targetnukleinsäure schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt, Nukleotidsequenzmotive oder Patterns, die für eine besondere Krankheit spezifisch und ursächlich dafür sind, sowie Nukleotidsequenzen, die als ein Marker für eine Krankheit spezifisch, jedoch nicht notwendigerweise ursächlich für die Krankheit oder den Zustand sind. Eine Targetnukleinsäure kann ebenfalls eine Nukleotidsequenz sein, die für Forschungszwecke von Interesse ist, die jedoch keine direkte Verbindung zu einer Krankheit aufweist, oder die mit einer Krankheit oder einem Zustand assoziert ist, obwohl dies nur nicht bewiesen ist. Eine Targetnukleinsäure kann jede Region von aufeinanderfolgenden Nukleotiden sein, die ein Polypeptid von zumindest 2 Aminosäuren, im allgemeinen zumindest 3 oder 4 Aminosäuren, insbesondere zumindest 5 Aminosäuren kodiert. Eine Targetnukleinsäure kodiert ein Targetpolypeptid.
Der Begriff "Targetpolypeptid" bezieht sich auf jedes Polypeptid von Interesse, daß der Massenspektrometrie für die hier offenbarten Zwecke unterworfen wird, zum Beispiel um die Anwesenheit eines Polymorphismus oder einer Mutation zu identifizieren. Ein Targetpolypeptid enthält zumindest 2 Aminosäuren, üblicherweise zumindest 3 oder 4 Aminosäuren, und insbesondere zumindest 5 Aminosäuren. Ein Targetpolypeptid kann durch eine Nukleotidsequenz kodiert sein, die ein Protein kodiert, das mit einer spezifischen Krankheit oder einem Zustand assoziert ist, oder ein Bereich eines Proteins. Ein Targetpolypeptid kann ebenfalls von eine Nukleotidsequenz kodiert sein, die normalerweise kein translatiertes Polypeptid kodiert. Ein Targetpolypeptid kann beispielsweise von einer Sequenz von Dinukleotidwiederholungen oder Trinukleotidwiederholungen oder dergleichen kodiert sein, die in chromosomalen Nukleinsäuren vorkommen, beispielsweise einer kodierenden oder einer nicht kodierenden Region eines Genes, beispielsweise in der telomeren Region eines Chromosoms.
Ein hier offenbartes Verfahren stellt ebenfalls ein Mittel bereit, ein Targetpolypeptid durch massenspektrometrische Analyse von Peptidfragmenten des Targetpolypeptids zu identifizieren. Der hier verwendete Begriff "Peptidfragmente eines Targetpolypeptids" betrifft Spaltungsfragmente, die durch spezifischen chemischen oder enzymatischen Abbau des Polypeptids hergestellt werden. Die Erzeugung solcher Polypeptidfragmente eines Targetpolypeptids wird durch die primäre Aminosäuresequenz des Polypeptids definiert, da chemische und enzymatische Spaltung in einer sequenzspezifischen Weise geschehen. Peptidfragmente eines Targetpolypeptides können hergestellt werden, indem beispielsweise das Polypeptid, das auf einem festen Träger immobilisiert sein kann, mit einem chemischen Reagenz wie Cyanbromid in Kontakt gebracht wird, das ein Polypeptid an Methioninresten spaltet, oder Hydroxylamin bei hohem pH, das eine Asp-Gly-Peptidbindung spalten kann; oder mit einer Endopeptidase wie Trypsin, die ein Polypeptid bei Lys oder Arg Resten spaltet.
Die Identität eines Targetpolypeptids kann bestimmt werden, indem die molekulare Masse oder Sequenz mit der einer Referenz oder eines bekannten Polypeptides verglichen wird. Zum Beispiel können die Massenspektren des Target- und des bekannten Polypeptids verglichen werden.
Der hier verwendete Begriff "korrespondierendes oder bekanntes Polypeptids" ist ein bekanntes Polypeptid, das im allgemeinen als Kontrolle verwendet wird, um beispielsweise zu bestimmen, ob ein Targetpolypeptid eine allelische Variante des korrespondierenden bekannten Polypeptides ist. Es sollte deutlich sein, daß ein korrespondierendes bekanntes Protein im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie das Targetpolypeptid haben kann, oder im wesentlichen unterschiedlich sein kann. Wenn zum Beispiel ein Targetpolypeptid eine allelische Variante ist, die sich von einem korrespondierenden bekannten Protein durch einen einzelnen Aminosäureunterschied unterscheidet, sind die Aminosäuresequenzen der Polypeptide mit Ausnahme der einzigen Differenz dieselben. Wo eine Mutation in einer Nukleinsäure, die das Targetpolypeptid kodiert, zum Beispiel den Leserahmen der kodierenden Nukleinsäure verändert oder ein Stopcodon einführt oder deletiert, kann die Sequenz des Targetpolypeptids sich wesentlich von der des korrespondierenden bekannten Polypeptides unterscheiden.
Wie hier offenbart, kann ein Targetpolypeptid unter Verwendung eines Reagenzes isoliert werden, das spezifisch mit dem Targetpolypeptid interagiert, mit einem Peptidanhängsel, das mit dem Targetpolypeptid fusioniert wird, oder mit einem Anhängsel, das mit dem Targetpolypeptid verbunden wird. Der hier verwendete Begriff "Reagenz" bedeutet einen Liganden oder ein Liganden bindendes Molekül, das spezifisch mit einem besonderen Liganden bindenden Molekül bzw. Liganden interagiert. Der hier verwendete Begriff "Peptidanhängsel" bedeutet ein Peptid, das spezifisch durch ein Reagenz gebunden wird. Der Begriff "Anhängsel" bezieht sich allgemeiner gesagt auf jedes Molekül, das spezifisch durch ein Reagenz gebunden wird, und schließt daher ein Peptidanhängsel ein. Ein Reagenz kann beispielsweise ein Antikörper sein, der spezifisch mit einem Epitop eines Targetpolypeptides oder einem Epitop eines Peptidanhängsels interagiert. Zum Beispiel kann ein Reagenz ein Anti-myc-Epitop-Antikörper sein, der spezifisch mit einem Myc- Epitop, das an ein Targetpolypeptid fusioniert ist, interagiert. Ein Reagenz kann ebenfalls zum Beispiel ein Metall-Ion wie ein Nickel-Ion oder Cobalt-Ion sein, das spezifisch mit einem Polyhistidin-Peptidanhängsel interagiert; oder Zink, Kupfer oder beispielsweise eine Zinkfingerdomäne, die spezifisch mit einem Polyarginin oder Polylysin- Peptidanhängsel interagiert; oder ein Molekül wie Avidin, Streptavidin oder einem Derivat davon, das spezifisch mit einem Anhängsel wie Biotin oder einem Derivat davon interagiert (siehe, z. B. US-Anmeldung Seriennr. 08/649,876 und ebenfalls die korrespondierende veröffentlichte internationale PCT- Anmeldung Nr. WO 97/43617, welche Verfahren zur Dissoziation von Biotinverbindungen, einschließlich Biotin und Biotinanaloga, die mit dem Polypeptid konjugiert (biotinyliert) sind, von Biotin bindenden Verbindungen, einschließlich Avidin und Streptavidin, unter Verwendung von Aminen, insbesondere Ammoniak, beschreiben).
Wenn bezogen auf ein Reagenz und das Epitop, Peptidanhängsel oder Anhängsel, an welches das Reagenz bindet, verwendet, zeigt der Begriff "speziell interagiert" an, daß eine Bindung mit relativ hoher Affinität geschieht. Als solches hat ein Reagenz für ein besonderes Epitop, Peptidanhängsel oder Anhängsel eine Affinität von mindestens ungefähr 1 × 106 M-1, im allgemeinen von mindestens ungefähr 1 × 107 M-1 und insbesondere von mindestens ungefähr 1 × 108 M-1. Ein Reagenz, das beispielsweise spezifisch mit einem besonderen Peptidanhängsel interagiert, bindet vorrangig das Peptidanhängsel, unabhängig davon, ob andere nichtverwandte Moleküle vorkommen, und ist deshalb nützlich, das Peptidanhängsel insbesondere ein Targetpolypeptid, das an das Peptidanhängsel fusioniert ist, aus einer Probe, die das Targetpolypeptid enthält, beispielsweise aus einer in vitro Translationsreaktion, zu isolieren.
Es kann bei der Durchführung eines offenbarten Verfahrens vorteilhaft sein, eine Nukleinsäure, beispielsweise eine Targetnukleinsäure oder ein Polypeptid, beispielsweise ein Targetpolypeptid mit einem festen Träger wie einem Kügelchen, Mikrochip, Glas- oder Plastikkapillare oder jeder beliebiger Oberfläche, insbesondere einer flachen Oberfläche, die eine Struktur wie Vertiefungen (wells), Stifte oder dergleichen enthalten kann, zu konjugieren. Eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid kann mit einen festen Träger durch verschiedene Mittel konjugiert werden, einschließlich beispielsweise durch eine Interaktion von Streptavidin oder Avidin mit Biotin; eine hydrophobe Interaktion, durch eine magnetische Interaktion unter Verwendung beispielsweise von funktionalisierten magnetischen Kügelchen wie Dynabeads, die mit Streptavidin beschichtete magnetische Kügelchen sind (Dynal Inc.; Great Neck NY; Oslo Norway); durch eine polare Interaktion wie eine "befeuchtende" Assoziation zwischen zwei polaren Oberflächen oder' zwischen Oligo/Polyethylenglykol; durch die Bildung einer kovalenten Bindung wie einer Amidbindung, einer Disulfidbindung, eine Thioetherbindung; durch ein Vernetzungsmittel; und durch einen säurelabilen oder photospaltbaren Linker (siehe, zum Beispiel Hermanson, "Bioconjugate Techniques" (Academic Press 1996)). Des weiteren kann ein Anhängsel oder ein Peptid wie ein Peptidanhängsel mit einem Polypeptid von Interesse, insbesondere einem Targetpolypeptid, konjugiert werden.
Ein hier offenbartes Verfahren kann eingesetzt werden, um die Aminosäuresequenz eines Polypeptids von Interesse zu bestimmen, beispielsweise indem ein Mittel verwendet wird, das Aminosäuren von einem Terminus des Polypeptides abspaltet, um einen ineinandergreifendne Satz von Deletionsfragmenten des Polypeptides und abgespaltene Aminosäuren zu erzeugen, sowie durch Verwendung von Massenspektrometrie, um entweder die abgespaltenen Aminosäuren oder die Deletionsfragmente zu identifizieren. Der hier verwendete Ausdruck "Mittel, das Aminosäuren von einem Terminus des Polypeptides abspaltet", bezieht sich auf ein Mittel, das physikalisch, chemisch oder biologisch sein kann, um eine carboxyterminale oder eine aminoterminale Aminosäure von einem Polypeptid zu entfernen. Ein physikalisches Mittel wird durch eine Lichtquelle veranschaulicht, zum Beispiel einen Laser, der eine terminale Aminosäure abspalten kann, insbesondere wo die Aminosäure an das Polypeptid durch eine photolabile Bindung gebunden ist. Ein chemisches Mittel wird durch Phenylisothiocyanat (Edmans Reagenz) veranschaulicht, das in der Gegenwart einer Säure eine aminoterminale Aminosäure von einem Polypeptid abspaltet. Ein biologisches Mittel, das eine Aminosäure von einem Terminus eines Polypeptides abspaltet, wird durch Enzyme wie Aminopeptidasen und Carboxypeptidasen, die im Stand der Technik wohl bekannt sind (siehe, zum Beispiel US-Patent Nr. 5,792, 664; internationale Publikation Nr. WO 96/36732) veranschaulicht.
Der hier verwendete Ausdruck "Deletionsfragment" bezieht sich auf den Bereich eines Polypeptides, der nach der Abspaltung von einer oder mehrerer Aminosäuren verbleibt. Bei Verwendung in bezug auf ein sequenzierendes Polypeptid bedeutet der Ausdruck "ineinandergreifender Satz von Deletionsfragmenten" eine Population von Deletionsfragmenten, die von der sequenziellen terminalen Abspaltung der Aminosäuren des Polypeptides herrühren, und die mindestens ein Deletionsfragment enthält, das in jeder Aminosäure des Bereiches des zu sequenzierenden Polypeptides endet.
Ein hier offenbartes Verfahren kann verwendet werden, um ein Individuum zu identifizieren, das eine Krankheit oder einen Zustand aufweist, oder dieser(n) gegenüber prädisponiert ist. Der hier verwendete Ausdruck "Krankheit" besitzt seine üblicherweise verstandene Bedeutung eines pathologischen Zustandes in einem Individuum. Zum Zweck der vorliegenden Offenbarung kann eine Krankheit beispielsweise auf eine genetische Mutation, einen chromosomalen Defekt oder ein infektiösen Organismus zurückzuführen sein. Der Begriff "Zustand", der von dem Konditionieren eines Polypeptides zu unterscheiden ist, wird hier dahingehend verwendet, daß er jeden Zustand eines Individuums bedeutet, einschließlich beispielsweise eines pathologischen Zustandes oder eines Zustandes, der bestimmt, wie das Individuum auf eine Stimulation antworten wird. Der Zustand eines Individuums wird teilweise durch den Genotyp des Individuums bestimmt, der eine Indikation bereitstellen kann, wie das Individuum beispielsweise auf ein Transplantat oder eine Behandlung mit einem besonderen Medikament reagieren wird. Demzufolge kann die Bezugnahme auf ein Individuum, das gegenüber einem Zustand prädisponiert ist, beispielsweise anzeigen, daß das Individuum einen Genotyp besitzt, der darauf hinweist, daß das Individuum nicht vorteilhaft auf ein besonderes Medikament reagieren wird.
Bezugnahme hier auf ein Allel oder eine allelische Variante, die mit einer Krankheit oder einem Zustand "assoziert" ist, bedeutet, daß der besondere Genotyp charakteristisch, zumindest teilweise, für den Genotyp ist, der von einer Population von Individuen gezeigt werden, die eine Krankheit oder einen Zustand besitzen, oder dagegen predisponiert sind. Beispielsweise ist eine allelische Variante wie eine Mutation in dem MRCA1-Gen mit Brustkrebs assoziiert, und eine allelische Variante wie eine höhere als eine normale Zahl von Trinukleotidwiederholungen in einem bestimmtem Gen ist mit Prostatakrebs assoziiert. Der Fachmann erkennt, daß eine Assoziation einer allelischen Variante mittels wohlbekannter statistischer Verfahren zur Probenauswertung und Analyse einer Population identifiziert werden kann.
Der hier verwendete Ausdruck "konjugiert" betrifft eine stabile Verknüpfung, die eine kovalente Verknüpfung oder eine nicht kovalente Verknüpfung sein kann, vorausgesetzt, daß die nicht kovalente Verknüpfung unter dem Zustand stabil ist, dem die Bindung ausgesetzt ist. Insbesondere kann ein Polypeptid an einen festen Träger durch einen Linker konjugiert sein, der eine nicht spaltbare, spaltbare oder reversible Verknüpfung bereitstellen kann.
Der hier verwendete Begriff "fester Träger" bedeutet eine ebene Oberfläche oder eine Oberfläche mit Strukturen, mit der eine funktionelle Gruppe, einschließlich eines Polypeptides, das eine reaktive Gruppe enthält, konjugiert sein kann. Der Ausdruck "Oberfläche mit Strukturen" wird hier dahingehend verwendet, daß er einen Träger bedeutet, der beispielsweise Vertiefungen, Stifte oder dergleichen enthält, mit der eine funktionelle Gruppe, einschließlich eines eine reaktive Gruppe enthaltenen Polypeptides, verknüpft werden kann. Zahlreiche Beispiele von festen Trägern werden hier offenbart oder sind ansonsten im Stand der Technik bekannt.
Der hier verwendete Begriff "Ausgangs-Nukleinsäure" bezieht sich auf zumindest ein Molekül einer Targetnukleinsäure, die ein Targetpolypeptid kodiert. Die Ausgangs-Nukleinsäure kann DNA oder RNA, einschließlich mRNA, sein und kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, einschließlich eines DNA-RNA-Hybrides. Eine Mischung von jeder der Nukleinsäure kann ebenfalls als Ausgangs-Nukleinsäure zur Durchführung eines hier offenbarten Verfahrens verwendet werden, wie es die Nukleinsäuren können, die nachfolgend eine Amplifikationsreaktion hergestellt werden.
Es sollte selbstverständlich sein, daß der hier verwendete Begriff "Primer" sich auf mehr als einen Primer beziehen kann, insbesondere in dem Fall, bei dem eine Mehrdeutigkeit in der Information betreffend die terminale Sequenz einer zu amplifizierenden Nukleinsäure besteht. Wo beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz anhand von Proteinsequenz-Information abgeleitet wird, wird eine Zusammenstellung von Primern, die alle möglichen Codonvariationen auf Basis der Degeneriertheit des genetischen Codes repräsentieren, für jeden Strang verwendet. Es wird erwartet, daß ein Primer aus dieser Zusammenstellung identisch mit der Region der zu amplifizierenden Sequenz ist.
Ein Verfahren wird bereitgestellt, um die Identität eines Targetpolypeptides zu bestimmen, indem Massenspektrometrie verwendet wird, um die molekulare Masse des Targetpolypeptides zu ermitteln, und diese mit der molekularen Masse eines Polypeptides bekannter Identität zu vergleichen, wodurch die Identität des Polypeptides bestimmt wird. Die Identität des Targetpolypeptides kann beispielsweise die Masse oder Aminosäuresequenz von mindestens einem Bereich des Targetpolypeptides sein, oder, indem die Masse zu einem bekannten Polypeptid, das ein Wildtyp oder ein bekanntes Mutein ist, verglichen wird.
Ein Targetpolypeptid kann aus einem Individuum, insbesondere aus einer Zelle oder einem Gewebe des Individuum oder aus einer biologischen Flüssigkeit, erhalten werden. Ein Targetpolypeptid kann ebenfalls durch in vitro Translation eines RNA-Moleküls erhalten werden, das das Targetpolypeptid kodiert; oder durch in vitro Transkription einer Nukleinsäure, die das Targetpolypeptid kodiert, die von der Translation gefolgt wird, die in vitro oder in einer Zelle durchgeführt werden kann, worin die zu transkribierende Nukleinsäure aus einem Individuum erhalten wird. Kits zur Durchführung dieser Prozesse werden ebenfalls bereitgestellt.
Ein hier offenbartes Verfahren stellt ein schnelles und zuverlässiges Mittel bereit, um indirekt Information über die Nukleinsäuresequenz zu erhalten. Da die Masse des Polypeptides ungefähr nur 10% der Masse der entsprechenden DNA besitzt, ist das translatierte Polypeptid im allgemeinen massenspektrometrischer Detektion weitaus mehr zugänglicher als die korrespondierende Nukleinsäure. Darüber hinaus ergibt die massenspektrometrische Detektion von Polypeptiden analytische Signale von weit höherer Empfindlichkeit und Auflösung als Signale, die üblicherweise mit DNA erhalten werden, aufgrund der inherenten Instabilität von DNA gegenüber der Verflüchtigung und ihrer Affinität für nicht flüchtige kationische Verunreinigungen.
Diese Verfahren und Kits sind insbesondere nützlich für eine Anzahl von Anwendungen wie die Identifizierung von Mutationen und somit das Screening auf gewisse genetische Störungen. Ein hier offenbartes Verfahren stellt ebenfalls ein effizientes Mittel bereit, die Anwesenheit einer einzelnen Base in einem Polynukleotid zu bestimmen, beispielsweise eine Mutation einer einzelnen Base, die ein Stopcodon in einen offenen Leserahmen eines Genes einführt, da solch eine Mutation zu einer prematuren Proteinverkürzung führt; oder eine Differenz in einer einzelnen Base, die zu einem Austausch in der kodierten Aminosäure in einer allelischen Variante eines polymorphen Genes führt, da unterschiedliche Aminosäuren auf Basis ihren Massen unterschieden werden können. Das Mutationsscreening durch direkte Analyse der Masse eines Genes wie p53 oder BRCA1 erfordert ein System, das die Detektion einer Mutation einer einzelnen Base erlaubt, was schwierig sein kann, wenn eine DNA-Sequenz direkt untersucht wird. Eine Mutation in einer einzelnen Base, die beispielsweise zu einem prematuren Stopcodon führt, kann die Masse des kodierten Proteins durch Verkürzung radikal verändern und ist daher mittels eines hier offenbarten Verfahrens leicht identifizierbar. Ein Austausch in einer einzelnen Base muß nicht zu einem Stopcodon führen, um dedektierbar zu sein, da ein Austausch einer einzelnen Base, die zu einem Aminosäureaustausch führt, beispielsweise Alanin zu Glycin, ebenfalls mittels eines hier offenbarten Verfahrens dedektierbar ist (siehe Beispiele).
Ein hier offenbartes Verfahren kann verwendet werden, um die Anwesenheit von Nukleotidwiederholungen, insbesondere einer anormalen Zahl von Nukleotidwiederholungen zu identifizieren, indem die Identität eines Targetpolypeptides, das durch solche Wiederholungen kodiert wird, bestimmt wird. Wie hier offenbart, kann eine anormale Zahl von Nukleotidwiederholungen mittels Massenspektrometrie identifiziert werden, um die Masse eines Targetpolypeptides mit dem eines korrespondierenden bekannten Polypeptides zu vergleichen.
In einer besonderen Anwendung können die offenbarten Verfahren und die für die Durchführung solcher Verfahren einsetzbaren Kits verwendet werden, um beispielsweise eine anormale Zahl von CAG-Wiederholungen in dem SCA-1 Gen zu dedektieren, oder um die Gegenwart einer Nukleotidsubstitution von einem C zu einem G in einer der Trinukleotidwiederholungen in einem Individuum mit spinozerebellarer Ataxie 1 (SCA-1) zu dedektieren. Massenspektrometrie wird verwendet, um die molekulare Masse eines Targetpolypeptides zu bestimmen, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die die Trinukleotid­ wiederholungen enthält, und indem die molekulare Masse des Targetpolypeptides mit der molekularen Masse eines Polypeptides verglichen wird, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die eine bekannte Anzahl von Trinukleotidwiederholungen sowie eine bekannte Nukleotidsequenz besitzt (siehe Beispiel 1). Die Identifikation der Nulkeotidsequenz der Targetnukleinsäure anhand dieses Verfahrens wird teilweise durch die erhöhte Massengenauigkeit ermöglicht, die bei Verwendung von Massenspektrometrie erhalten wird, um das Translationsprodukt zu detektieren, eher als direkt die Nukleinsäure durch Massenspektrometrie zu detektieren.
Zu Veranschaulichungszwecken ist der offene Leserahmen des Genes, das die (CAG)x-Wiederholungen, die mit SCA-1 assoziert sind, in Fig. 1 gezeigt. Die SCA-1 Sequenz enthält zusätzlich zu einem nicht variablen Bereich von 12 CAG-Wiederholungen einen variablen Bereich, von dem in Fig. 1A gezeigt wird, daß er 10 CAG-Wiederholungen enthält: Wie in Fig. 1A gezeigt ist, kodiert das SCA-1 Gen ein 7,5 kiloDalton (kDa) Protein, das 10 aufeinanderfolgende Glutamin-(Q) Reste enthält (Fig. 1B). Eine genaue direkte Massenanalyse des 60 kDa 200-mer, das in Fig. 1A gezeigt ist, mit der zur Zeit erhältlichen massenspektrometrischen Instrumentierung wäre eine Herausforderung. Eine kürzliche Studie des SCA-1 Genes zeigte, daß üblicherweise 25 bis 36 Wiederholungseinheiten in nicht betroffenen Individuen vorhanden sind, während betroffene Individuen 43 bis 81 wiederholende Einheiten besitzen. Bei Annahme des schlimmsten Falls von 81 Wiederholungseinheiten müßten 213 Basen zusätzlich zu dem 200-mer, das in Fig. 1A gezeigt ist, mit ausreichender Auflösung dedektiert werden. Eine Nukleotidsequenz, die größer als ungefähr ein 400-mer (< 20 kDa) ist, ist bis jetzt noch nicht auf befriedigende Weise mittels Massenspektrometrie dedektiert worden. Im Vergleich dazu erfordert die Analyse des Translationsproduktes für die Sequenz, die 81 Wiederholungen besitzt, eine Massenmessung von lediglich ungefähr 137 Aminosäureresten (ungefähr 15 kDa). Eine typische Massengenauigkeit von 0,3% für eine niedrig auflösende Instrumentierung führt zu einem maximalen Fehler von 13 Dalton, was weitaus niedriger ist als die Masse eines einzelnen Aminosäurerestes. Demzufolge kann eine Auflösung, die weitaus besser ist als eine einzelne Aminosäure, mit einem Verfahren zur Bestimmung der Identitiät eines Targetpolypeptides, wie es hier offenbart wird, erhalten werden.
Erhalten eines Targetpolypeptides
Jedes Polypeptid, für das Identifizierungsinformation erforderlich ist, wird hier als Targetpolypeptid betrachtet. Das Polypeptid kann aus jeder Quelle stammen. Ein Targetpolypeptid oder eine Targetnukleinsäure, die das Targetpolypeptid kodiert, kann von einem Individuum erhalten werden, das üblicherweise ein Säugetier, insbesondere ein Mensch ist. Im allgemeinen wird das Targetpolypeptid vor der Massenspektrometrie isoliert, um so die Bestimmung der molekularen Masse des Polypeptides durch massenspektrometrische Analyse zu erlauben. Der Grad, zu dem ein Polypeptid für die Massenspektrometrie isoliert werden muß, ist im Stand der Technik bekannt und variiert in Abhängigkeit von der Art der durchgeführten massenspektrometrischen Analyse.
Ein Targetpolypeptid kann ein Bereich eines Proteins sein, und kann mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren erhalten werden. Beispielsweise kann ein Protein mittels eines Antikörpers isoliert werden, anschließend mittels einer Proteinase, die selektiv an spezifischen Aminosäuresequenzen schneidet, gespalten werden und das Targetpolypeptid kann durch eine Methode wie Chromatographie oder Elektrophorese gereinigt werden. Daher kann ein hier offenbartes Verfahren durchgeführt werden, indem beispielsweise eine Protein, das ein Targetpolypeptid enthält, einer limitierten Proteolyse unterworfen wird; das Targetpolypeptid isoliert wird, und seine Masse durch massenspektrometrische Analyse untersucht wird, wodurch ein Mittel zur Bestimmung der Identität des Targetpolypeptids bereitgestellt wird.
Ein Antikörper, oder ein Antigen bindendes Fragment eines Antikörpers, der spezifisch mit einem Epitop wechselwirkt, das auf einen interessierenden Polypeptid vorkommt, ist dadurch gekennzeichnet, daß er eine spezifische Bindungsaktivität von mindestens ungefähr 1 × 106 M-1 im allgemeinen von mindestens 1 × 107 M-1 oder mehr aufweist. Demzufolge sind Fab, F(ab')2, Fd oder Fv Fragmente eines Antikörpers, die spezifische Bindungsaktivität für ein bestimmtes Epitop beibehalten, in der Bedeutung des Begriffes Antikörper eingeschlossen.
Ein Antikörper, der zur Isolierung eines interessierenden Polypeptides, insbesondere eines Targetpolypeptides nützlich ist, kann ein natürlich vorkommender Antikörper oder ein nicht natürlich vorkommender Antikörper sein, einschließlich beispielsweise eines single- chain-Antikörpers, eines chimeren Antikörpers, eines bifunktionellen Antikörper oder eines humanisierten Antikörper sowie eines Antigen bindenden Fragments solcher Antikörper. Solche nicht natürlich vorkommende Antikörper können unter Verwendung von Festphasen-Peptidsynthese hergestellt werden, können rekombinant produziert werden oder können beispielsweise durch das Screening von kombinatorischen Bibliotheken, die variable schwere Ketten und variable leichte Ketten enthalten, erhalten werden (siehe Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)). Diese und andere Methoden zur Herstellung von beispielsweise chimeren, humanisierten, CDR-grafted, single-chain- und bifunktionellen Antikörpern sind dem Fachmann wohl bekannt (Winter und Harris, Immunol. Today 14: 243-246 (1993); Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989); Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrebeck, Antibody Engineering, 2. Aufl.(Oxford Vjniversity Press 1995); Harlow und Lane, "Antibodies: A laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988)).
Ein Antikörper, der zur Isolierung eines Targetpolypeptides verwendbar ist, kann aus einer kommerziellen Quelle erhalten werden, oder kann unter Verwendung eines Proteins, das das Targetpolypeptid oder ein Peptidbereich davon enthält, als Immunogen erzeugt werden, oder unter Verwendung eines Epitopes, das an das Polypeptid fusioniert ist, beispielsweise einem myc-Epitop. Ein solches Immunogen kann aus natürlichen Quellen prepariert oder rekombinant produziert werden, oder kann unter Verwendung von chemischen Routineverfahren synthetisiert werden. Ein ansonsten nicht immunogenes Epitop kann immunogen gemacht werden, indem das Hapten mit einem Trägermolekül wie Rinderserumalbumin (BSA) oder Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) gekoppelt wird, oder indem das Epitop als ein Fusionsprotein exprimiert wird. Verschiedene Trägermoleküle und Verfahren zur Kopplung eines Haptens mit einem Trägermolekül sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe, z. B. Harlow und Lane, "Antibodies: A laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988)).
Ein Antikörper, der spezifisch mit einem interessierenden Polypeptid, insbesondere einem Targetpolypeptid oder einem Peptidbereich davon, interagiert, ist beispielsweise nützlich 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019882657 00004 99880, um zu bestimmen, ob das das Targetpolypeptid kodierende Nukleinsäuremolekül in einer biologischen Probe vorhanden ist. Die Identifikation der Gegenwart oder des Gehalt eines Targetpolypeptids kann unter Verwendung wohl bekannter Immungssays und immunhistochemischer Methoden (Harlow und Lane, "Antibodies: A laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988)) durchgeführt werden. Insbesondere kann ein Antikörper, der spezifisch mit einem an ein Targetpolypeptid fusioniertes Peptidanhängsel interagiert verwendet werden, um das Targetpolypetid aus einer Probe, die beispielsweise eine biologische Probe oder eine in vitro Translationsreaktion sein kann, zu isolieren.
Verfahren zur Erzeugung polyklonaler Antikörper, beispielsweise in einem Kaninchen, einer Ziege, einer Maus oder einem anderen Säugetier, sind im Stand der Technik wohlbekannt (Harlow und Lane, "Antibodies: A laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988)). Im wesentlichen können Milzzellen von einer mit dem interessierenden Polypeptid immunisierten Maus oder einem Peptidbereich davon, mit einer geeigneten Myelomzellinie wie SP/02-Myelomzellen zur Erzeugung von Hybridomzellen fusioniert werden. Klonierte Hybridomzellinien können unter Verwendung des Immunisierungs-polypeptides gescreent werden, um Klone zu identifizieren, die geeignete spezifische Antikörper sekretieren. Hybridomzellen, die Antikörper mit einer wünschenswerten Spezifität und Affinität exprimieren, können isoliert und als kontinuierliche Quelle für die Antikörper verwendet werden, welche beispielsweise zur Aufnahme in einem hier bereitgestellten Kit verwendbar sind. Auf ähnliche Weise stellt ein rekombinanter Phage, der beispielsweise einen interessierenden single-chain-Antikörper exprimiert, einen monoklonalen Antikörper bereit, der zur Herstellung von standardisierten Kits verwendet werden kann.
Die Isolierung und Identifikation eines Targetpolypeptides kann erleichtert werden, indem ein Anhängsel an ein Polypeptid verbunden wird, beispielsweise indem das Polypeptid mit einem Peptidanhängsel fusioniert wird. Solch ein Fusionspolypeptid kann beispielsweise durch in vitro-Transkription und Translation einer Nukleotidsequenz erhalten werden, die das Targetpolypeptid verbunden im Rahmen mit einer Nukleotidsequenz, die das Peptidanhängsel kodiert, erhalten werden, anschließend das Fusionspolypeptid aus der Translationsreaktion unter Verwendung eines Reagenzes, das spezifisch mit dem Affinitätspeptid interagiert, isoliert wird. Das Peptidanhängsel kann beispielsweise ein myc-Epitop sein oder ein Peptidbereich des Haemophilus influenza Hemagglutinin Proteins, gegen das spezifische Antikörper hergestellt werden können und ebenfalls kommerziell erhältlich sind. Ein Peptidanhängsel kann auch eine Polyhistidinsequenz, beispielsweise eine Hexahistidinsequenz (His-6) sein, die spezifisch mit Metall-Ionen wie Zink-, Nickel- oder Cobalt-Ionen interagiert, oder eine Polylysin- oder Polyargininsequenz, die zumindest vier Lysin- bzw. vier Argininreste umfaßt, die spezifisch mit Zink, Kupfer oder beispielsweise einem Zinkfingerprotein interagiert.
Ein Anhängsel kann ebenfalls an das Polypeptid entweder durch chemische Modifikation des Polypeptides während oder nach seiner Synthese gefügt werden. Beispielsweise kann ein Targetpolypeptid, das ein Anhängsel enthält, durch Isolierung aus einer in vitro-Translationsreaktion eines Targetnukleinsäuremoleküls erhalten werden, wobei die Translationsreaktion in der Gegenwart einer modifizierten Aminosäure durchgeführt wird, und, falls angemessen, mis­ aminoacylierten tRNA, die die modifizierte Aminosäure trägt. Die Modifikation der Aminosäure wird so ausgewählt, daß sie ein Anhängsel enthält, das die Isolierung des Polypeptids, das die modifizierte Aminosäure enthält, erlaubt. Beispielsweise kann ein Lysinrest mit einem biotinyliertem Lysinanalogon (oder einem anderen Lysinanalogon, das ein Anhängsel enthält) in der Translationsreaktion ersetzt werden, was zu einem translatiertem Polypeptid führt, das biotinylierte Lysinreste enthält. Ein solches getagtes Polypeptid kann durch Affinitätschromatographie oder beispielsweise auf einem Bett von immobilisiertem Avidin oder Streptavidin isoliert werden. Andere modifizierte Aminosäuren sind im US-Patent Nr. 5,643,722 offenbart.
Ein Targetpolypeptid kann durch Affinitätsreinigung unter Verwendung beispielsweise eines Antikörpers, Avidin oder eines anderen spezifischen Reagenzes, das mit einem festen Träger verbunden ist, isoliert werden. Bei solch einer Methode wird die Translationsreaktion auf den Träger aufgegeben, der zum Beispiel in einer Säule vorliegen kann, und das Polypeptid wird aufgrund seiner spezifischen Interaktion mit dem Reagenz gebunden. Beispielsweise kann ein mit einem Polyhistidin-peptidanhängsel fusioniertes Targetpolypeptid auf einer Säule oder einem Bett mit chelatisierten Nickel-Ionen isoliert werden, wohingegen ein Targetpolypeptid, das mit einem Polylysin oder Polyargininanhängsel fusioniert ist, auf einer Säule oder einem Bett von chelatisiertem Zink- oder Kupfer-Ionen isoliert werden kann. Betten oder Säulen, die solche daran chelatisierten divalenten Metall-Ionen besitzen, können von einer kommerziellen Quelle erhalten werden, oder mittels im Stand der Technik bekannter Methoden hergestellt werden. Das Polypeptid kann anschließend von der Säule in einer isolierten Form eluiert werden und der Massenspektrometie unterworfen werden.
Isolierung einer Nukleinsäure, die ein Targetpolypeptid kodiert
Das Polypeptid wird aus Nukleinsäuren hergestellt werden, die dieses kodieren. Daher kann das Targetpolypeptid aus einer Zelle oder einem Gewebe eines Individuums isoliert werden, oder es kann in vitro aus einem RNA-Molekül synthetisiert werden, beispielsweise durch in vitro- Translation oder von einem DNA-Molekül durch in vitro- Transkription und Translation; oder es kann in einer eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtzelle synthetisiert werden, die mit der Targetnukleinsäure transformiert ist, die das Targetpolypeptid kodiert.
In hier bevorzugten Ausführungsformen wird das Targetpolypeptid aus einer Zelle, einem Gewebe oder einem in vitro-Translationssystem, beispielsweise einem Retikulozyten­ lysatsystem, isoliert. Die In vitro-Translation oder in vitro-Transkription, die von Translation gefolgt wird, befinden sich unter den bevorzugten Herstellungsverfahren der Polypeptide. Die Polypeptide können nach der Translation unter Verwendung jeder dem Fachmann im Stand der Technik bekannten Reinigungsmethode gereinigt werden. Beispielsweise kann das Polypeptid mittels eines Reagenzes isoliert werden, das spezifisch mit dem Targetpolypeptid interagiert, oder mit einem Protein, das das Targetpolypeptid enthält. Ein solches Reagenz kann ein Antikörper sein, der spezifisch mit einem Epitop der Targetpolypeptides interagiert, beispielsweise ein Antikörper gegen ein Epitop, das von einer Trinukleotidwiederholungs­ sequenz kodiert wird. Wenn das Targetpolypeptid eine Aminosäure enthält, die eine von mehreren Aminosäuren sein kann, beispielsweise, wo das Targetpolypeptid aus einem mutierten Protein stammt, interagiert der Antikörper vorzugsweise mit einem Epitop, das nicht ein Epitop einschließt, das die mutierte(n) Aminosäure(n) enthält. Antikörper, die spezifisch mit einem das Targetpolypeptid enthaltenen Protein oder mit dem Targetpolypeptid interagieren, können unter Verwendung von im Stand der Technik wohlbekannter Methoden hergestellt werden (Harlow und Lane, "Antibodies: A laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988)).
Ein Targetpolypeptid kann aus einem RNA-Molekül erhalten werden, beispielsweise durch in vitro-Translation des RNA- Moleküls. Das Targetpolypeptid kann ebenfalls von einem DNA- Molekül erhalten werden, wo in vitro-Translation von zumindest einem Bereich des DNA-Moleküls vor der Translation durchgeführt wird. Insbesondere kann zumindest ein Bereich des DNA-Moleküls, das die Nukleotidsequenz, die das Targetpolypeptid kodiert, amplifiziert werden, beispielsweise mittels PCR vor der Durchführung der in vitro-Transkription oder -Translation. Demzufolge kann ein hier offenbartes Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptides einen Schritt einschließen, ein Targetnukleinsäuremolekül zu isolieren, das DNA oder RNA sein kann, und von dem das Targetpolypeptid erhalten wird.
Eine Nukleinsäureprobe, in isolierter oder nichtisolierter Form, kann als die Ausgangs-Nukleinsäure in einem hier offenbarten Verfahren eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß vermutet wird, daß die Probe die Targetnukleinsäure enthält. Die Targetnukleinsäure kann ein Teil eines längeren Moleküls sein oder kann anfangs als ein diskretes Molekül vorliegen, so daß die spezifische Sequenz die gesamte Nukleinsäure darstellt.
Es ist nicht notwendig, daß eine Ausgangs-Nukleinsäure nur die Targetnukleinsäure in einer isolierten Form enthält. Vorausgesetzt, daß die Ausgangs-Nukleinsäure in einer isolierten Form vorliegt, kann die Targetnukleinsäure eine kleine Fraktion einer komplexen Mischung sein, beispielsweise ein Bereich des β-Globin Genes, das in der gesamten humanen DNA enthalten ist, oder ein Bereich einer Nukleinsäuresequenz eines bestimmten Mikroorganismuses, der nur eine kleine Fraktion einer bestimmten biologischen Probe ausmacht. Eine Ausgangs- Nukleinsäure kann ebenfalls mehr als eine Population von Targetnukleinsäuren enthalten.
Die Ausgangs-Nukleinsäure kann aus jeder Quelle erhalten werden, einschließlich einer natürlichen Quelle wie Bakterien, Hefen, Viren, Protisten sowie höheren Organismen, einschließlich Pflanzen oder Tieren, insbesondere aus Geweben, Zellen oder Organellen solcher Quellen, oder kann aus Plasmiden wie pBR322 erhalten werden, in denen die Nukleinsäure vorher kloniert wurde. Die Ausgangs-Nukleinsäure kann beispielsweise eine DNA-Probe darstellen, die aus einem Tier isoliert wird, insbesondere einem Säugetier wie einem menschlichen Individuum, und kann aus jeder Zellquelle oder Körperflüssigkeit erhalten werden. Beispiele von Zellquellen, die in der klinischen Praxis erhältlich sind, schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Blutzellen, buccale Zellen, cervico-Vaginalzellen, Epithelialzellen aus dem Urin, oder Zellen, die in einem zum Beispiel durch Biopsie erhaltenen Gewebe vorkommen. Körperflüssigkeiten schließen Blut, Urin und Cerebrospinalflüssigkeit sowie Gewebeexudate aus einer Infektions- oder Entzündungsstelle ein.
Ein Nukleinsäuremolekül kann aus einer Zellquelle oder Körperflüssigkeit unter Verwendung jedes der zahlreichen im Stand der Technik und als Routine bekannten Verfahren extrahiert werden, und die besondere Methode, die zur Extraktion der Nukleinsäure verwendet wird, wird als die für die besondere biologische Probe angemessene ausgewählt, einschließlich, ob die zu isolierende Nukleinsäure DNA oder RNA ist (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)). Zum Beispiel können Einfrier-Auftau- und alkalische Lyseprozeduren verwendbar sein, um Nukleinsäuremoleküle aus festen Materialen wie Zell- oder Gewebeproben zu erhalten. Hitze und alkalische Lyseverfahren können verwendbar sein, um Nukleinsäuremoleküle aus Urin zu erhalten; und Proteinase K- Extraktion oder Phenolextraktion kann verwendbar sein, um Nukleinsäuren aus Zellen oder Geweben wie Blutproben zu erhalten (Rolff et al., "PCR: Clinical diagnostics and research" (Springer Verlag Publ. 1994)).
Für den Einsatz einer Targetnukleinsäure aus Zellen können die Zellen in einem hypotonischen Puffer suspendiert werden und auf ungefähr 90°C bis 100°C für ungefähr 1 bis 15 Minuten erhitzt werden, bis die Zellyse und Dispersion von intrazellulären Komponenten stattfindet. Nach dem Hitzeschritt können Amplifikationsreagenzien, falls gewünscht, direkt zu dem Lysat hinzugegeben werden. Eine solche direkte Amplifikationsmethode kann beispielsweise bei peripheren Blutlymphozyten oder Amniozyten verwendet werden. Die Menge an DNA, die für die Analyse von humaner genomischer DNA extrahiert wird, beträgt im allgemeinen mindestens ungefähr 5 pg, was ungefähr einem Zelläquivalent einer Genomgröße von 4 × 109 Basenpaare entspricht. Bei einigen Anwendungen, beispielsweise der Detektion von Sequenzveränderungen in dem Genom eines Mikroorganismusses, können variable Mengen an DNA extrahiert werden.
Im allgemeinen sind die ein Polynukleotid bildenden Nukleotide natürlich vorkommende Desoxyribonukleotide wie Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymidin, die mit 2'-Deoxyribose verbunden sind, oder Ribonukleotide wie Adenin, Cytosin, Guanin oder Uracil, die mit Ribose verbunden sind. Ein Polynukleotid enthält ebenfalls Nukleotidanaloga, einschließlich nicht natürlich vorkommender synthetischer Nukleotide oder modifizierte natürlich vorkommene Nukleotide. Solche Nukleotidanaloga sind im Stand der Technik wohlbekannt und kommerziell erhältlich, wie auch Polynukleotide, die solche Nukleotidanaloga enthalten (Lin et al., Nucl. Acids Res. 22: 5220-5234 (1994); Jellinek et al., Biochemistry 34: 11 363-­ 11 372 (1995); Pagratis et al., Nature Biotechnol. 15: 68-73 (1997)). Die kovalente Bindung, die die Nukleotide eines Polynukleotids miteinander verknüpft, ist üblicherweise eine Phosphordiesterbindung. Die kovalente Bindung kann ebenfalls eine der zahlreichen anderen Bindungen sein, einschließlich einer Thiodiesterbindung, einer Phosphorthioatbindung, einer peptidähnlichen Bindung oder jede andere dem Fachmann bekannte Bindung, die verwendbar ist, um Nukleotide zur Erzeugung von synthetischen Polynukleotiden zu verknüpfen (siehe z. B. Tarn et al., Nucl. Acids Res. 22: 977-986 (1994); Ecker und Crooke, BioTechnology 13: 351-360 (1995)).
Wo es gewünscht wird, ein Polynukleotid zur Verwendung in einem hier offenbarten Verfahren oder zur Aufnahme in einem Kit zu synthetisieren, kennt der Fachmann die Auswahl der bestimmten Nukleotide oder Nukleotidanaloga und die kovalente Bindung, die zur Verknüpfung der Polynukleotide verwendet wird, hängt teilweise von dem Zweck ab, für den das Polynukleotid hergestellt wird. Wo beispielsweise ein Polynukleotid einer Umgebung ausgesetzt wird, die wesentliche Nukleaseaktivität enthält, wählt der Fachmann Nukleotidanaloga oder kovalente Bindungen aus, die relativ resistent gegenüber Nukleasen sind. Ein Polynukleotid, daß natürlich vorkommende Nukleotide und Phosphordiesterbindungen enthält, kann chemisch synthetisiert werden, oder kann unter Verwendung eines geeigneten Polynukleotids als Template mittels rekombinanter DNA-Methoden hergestellt werden. Im Vergleich dazu wird ein Polynukleotid, das Nukleotidanaloga oder andere kovalente Bindungen als Phosphordiesterbindungen üblicherweise chemisch synthetisiert, obwohl ein Enzym wie T7 Polymerase gewisse Arten von Nukleotidanaloga einbauen kann und daher verwendet werden kann, um solch ein Polynukleotid rekombinant von einem geeigneten Template ausgehend herzustellen (Jellinek et al., Biochemistry 34: 11 363-11 372 (1995)).
Ein Polynukleotid, beispielsweise ein Oligonukleotid, das spezifisch an eine Nukleinsäure hybridisiert, insbesondere an eine Targetnukleinsäure oder an eine Targetnukleinsäure flankierender Sequenzen, ist besonders nützlich. Ein solches Hybridisierungs-Polynukleotid ist teilweise dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest 9 Nukleotide lang ist, wobei solche Sequenzen besonders nützlich als Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) sind und zumindest 14 Nukleotide lang sein oder, falls gewünscht, zumindest 17 Nukleotide lang sein können. Solche Nukleotidsequenzen sind besonders als Hybridisierungssonden sowie für PCR nützlich. Es sollte klar sein, daß die Bedingungen, die für die spezifische Hybridisierung eines ersten Polynukleotides, beispielsweise eines PCR-Primers, mit einem zweiten Polynukleotid, beispielsweise einer Targetnukleinsäure, zum Teil von dem Grad, der zwischen den Sequenzen geteilten Komplementarität abhängt, dem GC-Gehalt der hybridisierenden Moleküle und der Länge der Antisense-Nukleinsäuresequenz, und daß Bedingungen, die geeignet sind, eine spezifische Hybridisierung zu erhalten, auf Basis von leicht erhältlichen Formeln berechnet werden können oder empirisch bestimmt werden können (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publ., NY 1989)).
Transkription und Translation einer Targetnukleinsäure
Ein Targetpolypeptid kann erhalten werden, indem ein RNA- Molekül, das das Targetpolypeptid kodiert, in vitro translatiert wird. Falls gewünscht, kann das RNA-Molekül durch in vitro-Transkription einer Nukleinsäure, im allgemeinen DNA, die das Targetpolypeptid kodiert, erhalten werden. Die Translation eines Targetpolypeptides kann beeinflußt werden, indem ein RNA-Molekül, das das Polypeptid kodiert, direkt in eine in vitro-Translationsreaktion eingeführt wird, oder indem ein DNA-Molekül, das das Polypeptid kodiert, in eine in vitro- Transkription/Translationsreaktion eingeführt wird oder in eine in vitro-Transkriptionsreaktion, und anschließend die RNA in eine in vitro-Translationsreaktion überführt wird.
Für die in vitro-Transkription wird die Target-DNA auf operable Weise mit einem. Promotor verknüpft, von dem aus die Transkription in der Gegenwart einer RNA-Polymerase initiiert wird, die fähig ist mit dem Promotor, Ribonukleotiden und anderen für die in vitro-Transkription notwendigen Reagenzien zu interagieren. Die in vitro-Transkription kann als ein separater Schritt aus einer in vitro-Translationsreaktion durchgeführt werden, oder kann in einer einzigen Reaktion unter Verwendung von wohlbekannten Verfahren durchgeführt werden (siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); siehe ebenfalls US-Patent Nr. 4,766,072, das zur in vitro- Transkription verwendbare Vektoren beschreibt). In vitro- Transkriptionskits sind ebenfalls wohlbekannt und sind kommerziell erhältlich (Promega Corp.; Madison WI).
Eine in vitro-Transkriptionsreaktion wird durchgeführt, indem eine Template-DNA, die im allgemeinen die Targetnukleinsäure einschließt, für ungefähr eine Stunde bei 37°C oder 40°C, abhängig von der Polymerase, in der Gegenwart von Ribonukleotiden, einem Cap-Analogon wie GpppG oder einem methyliertem Derivat davon, einem RNAase-Inhibitor, einer RNA- Polymerase, die den Promotor erkennt, der stromaufwärts auf operable Weise mit der zu transkribierenden DNA verbunden ist, erkennt, und einem geeigneten Puffer, der Tris-HCl, MgCl2, Spermidine und NaCl enthält, inkubiert wird. Nach der Transkriptionsreaktion kann RNAase freie DNAase hinzugegeben werden, um das DNA-Template zu entfernen und die RNA, beispielsweise durch Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt werden (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)). Üblicherweise werden ungefähr 5 bis 10 µg RNA pro Mikrogramm Template-DNA erhalten.
Wo RNA in einer prokaryontischen in vitro-Transkription hergestellt wird, kann die RNA in einer uncapped-Form hergestellt werden, wie durch in vitro-Transkription in der Abwesenheit eines Cap-Analogons, da die Translation von RNA in einem prokaryontischen System nicht die Anwesenheit eines Caps wie N7-Methyl-G, das kovalent zu dem 5'Ende der mRNA verbunden ist, erfordert. Capped-RNA wird viel effizienter als uncapped- RNA in eukaryontischen Systemen translatiert und deshalb kann es wünschenswert sein, die RNA während der Transkription oder während der Translation zu cappen, wenn ein eukaryontisches Translationssystem verwendet wird. Die in vitro transkribierte RNA kann beispielsweise durch Ethanolfällung isoliert werden, und anschließend für die in vitro-Translation verwendet werden.
Translationssysteme können zellulär oder zellfrei sein und können prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Zelluläre Translationssyteme verwenden im allgemeinen intakte Zellen, beispielsweise Oocyten oder verwenden permeabilisierte Zellen, wohingegen zellfreie (in vitro) Translationssysteme Zell- oder Gewebelysate oder -extrakte verwenden, gereinigte oder partiell gereinigte Komponenten oder Kombinationen davon.
In vitro-Translationssysteme sind wohlbekannt und kommerziell erhältlich und viele unterschiedliche Arten und Systeme sind wohlbekannt und routinemäßig eingesetzt. Beispiele von in vitro-Translationssystemen schließen eukaryontische Zellysate wie Kaninchenretikulocytenlysate, Kaninchenoocyten­ lysate, humane Zellysate, Insektenzellysate oder Weizen­ keimextrakte ein. Solche Lysate und Extrakte können hergestellt werden oder sind kommerziell erhältlich (Promega Corp.; Stratagene, La Jolla CA; Amersham, Arlington Heights IL; und GIBCO/BRL, Grand Island NY). In vitro-Translationssysteme enthalten im allgemeinen Makromoleküle wie Enzyme; Translations-, Initiations- und Elongationsfaktoren; chemische Reagenzien; und Ribosomen. Mischungen von gereinigten Translationsfaktoren sowie Kombinationen von Lysaten oder Lysaten, die mit gereinigten Translationsfaktoren wie Initiationsfaktor-1 (IF-1), IF-2, IF-3 (alpha oder beta), Elongationsfaktor T (EF-Tu) oder Terminationsfaktoren supplementiert sind, können ebenfalls für die mRNA-Translation in vitro verwendet werden.
Inkubationszeiten für die in vitro-Translation liegen im Bereich von ungefähr 5 Minuten bis viele Stunden, betragen üblicherweise jedoch ungefähr 30 Minuten bis 5 Stunden, üblicherweise ungefähr 1 bis 3 Stunden. Die Inkubation kann auf kontinuierliche Weise durchgeführt werden, wobei Reagenzien in das System eingespült werden und naszierende Polypeptide entfernt oder zur Akkumulation unter Verwendung eines kontinuierliches Flußsystems wie von Spirin et al. (Science 242: 1162-64 (1988) beschrieben verbleiben gelassen werden. Ein solcher Prozeß kann wünschenswert für die Produktion von naszierenden Polypeptiden im großen Maßstab sein. Die Inkubationszeiten variieren beträchtlich mit dem Volumen der Translationsmischung und der Inkubationstemperatur. Inkubationstemperaturen können zwischen ungefähr 4°C bis 60°C liegen, im allgemeinen zwischen ungefähr 15°C bis 50°C und üblicherweise zwischen ungefähr 25°C bis 45°C, insbesondere ungefähr 25°C oder ungefähr 37°C.
Translationsreaktionen enthalten im allgemeinen einen Puffer wie Tris-HCl, HEPES oder andere geeignete Puffermittel, um die Lösung bei ungefähr pH 6 bis pH 8, im allgemeinen ungefähr pH 7, zu halten. Andere Komponenten eines Translationssystems können Dithiothreitol (DTT) oder 2- Mercaptoethanol als Reduktionsmittel enthalten, RNasin, um RNA- Abbau zu inhibieren, sowie Nukleosidtriphosphate oder Kreatinphosphat und Kreatinkinase, um chemische Energie für den Translationsprozeß bereitzustellen.
Ein in vitro-Translationssystem kann ein Retikulocytenlysat sein, das kommerziell erhältlich ist, oder gemäß den hier offenbarten oder anderweitig im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden kann. Kommerziell erhältliche Retikulocytenlysate sind beispielsweise von New England Nuclear and Promega Corp. (Kat. #L4960, L4970 und L4980) erhältlich. Ein in vitro-Translationssystem kann ebenfalls ein Weizenkeim-Translationssystem sein, das kommerziell erhältlich ist, oder gemäß wohlbekannter Methoden hergestellt werden kann. Kommerziell erhältliche Weizenkeimextrakte können beispielsweise von Promega Corp. erhalten werden (beispielsweise Kat. #L4370). Ein in vitro- Translationssystem kann ebenfalls eine Mischung eines Retikulocytenlysates und eines Weizenkeimextraktes sein sowie kommerziell erhalten werden, zum Beispiel von Promega Corp. (Kat. #L4340). Andere verwendbare in vitro-Translationssysteme schließen E. coli-Extrakte, Insektenzellextrakte und Froschoocytenextrakte ein.
Ein Kaninchenretikulocytenlysat kann wie folgt hergestellt werden. Kaninchen werden durch Inokulation mit Acetylphenylhydrazin anämisch gemacht. Ungefähr sieben Tage später werden die Kaninchen zur Ader gelassen und das Blut wird gesammelt und mit einer eiskalten Salzlösung, die NaCl, Magnesiumacetat (MgAc), KCl sowie Heparin enthält, gemischt. Die Blutmischung wird durch Mull gefiltert, zentrifugiert und der Buffy Coat der weißen Zellen wird entfernt. Das Pellet, das Erythrocyten und Retikulocyten enthält, wird mit der Salzlösung gewaschen, anschließend durch die Zugabe eines gleichen Volumens kalten Wassers lysiert. Endogene RNA wird durch Behandlung des Lysats mit mikroccokaler Nuklease und Calcium- Ionen, die für die Nukleaseaktivität notwendig sind, abgebaut und die Reaktion wird durch die Zugabe von EGTA, das die Calciumionen chelatisiert und die Nuklease inaktiviert, beendet. Hemin (ungefähr 20 bis 80 µM), das ein starker Suppressors eines Inhibitors des Initiationsfaktors elF-2 ist, kann ebenfalls zu dem Lysat gegeben werden. Die Translationsaktivität des Lysates kann durch die Zugabe eines energieerzeugenden Systems, beispielsweise Phosphorcreatinkinase und Phosphorcreatin optimiert werden. Die Lysate können anschließend aliquotiert und bei -70°C oder in flüssigen Stickstoff aufbewahrt werden. Weitere Details betreffend eines solchen Protokolles sind bekannt (siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)).
Eine in vitro-Translationsreaktion unter Verwendung eines Retikulocytenlysates kann wie folgt durchgeführt werden. Zehn µl eines Retikulocytenlysates, das wie oben offenbart hergestellt werden kann oder käuflich erworben werden kann, wird mit Spermidin, Creatinphosphat, Aminosäuren, HEPES-Puffer (pH 7,4), KCl, MgAc und der zu translatierenden RNA gemischt und für eine geeignete Zeitdauer, im allgemeinen ungefähr eine Stunde bei 30°C inkubiert. Die optimale Menge an MgAc zum Erzielen einer effizienten Translation variiert von einer Reticulozytenlysat-Präparation zur anderen und kann mittels einer Standardpräperation von RNA und einer Konzentration an MgAc, die von 0 bis 1 mM variiert wird, bestimmt werden. Die optimale Konzentration an KCl kann ebenfalls in Abhängigkeit von der spezifischen Reaktion variieren. Beispielsweise sind 70 mM KCl optimal für die Translation von capped RNA, wohingegen 40 mN im allgemeinen optimal für die Translation von uncapped RNA sind. Gegebenenfalls wird der Translationsprozess mittels eines Verfahrens wie die massenspektrometrische Analyse überwacht. Die Überwachung kann ebenfalls durchgeführt werden, indem beispielsweise eine oder mehrere radioaktive Aminosäuren sowie 35S-Methionin hinzugegeben werden, und der Einbau der Radiomarkierung in die Translationsprodukte gemessen wird, indem die Proteine in dem Lysat mit beispielsweise TCA präzipitiert werden und die Menge der Radioaktivität, die in dem Präzipitat zu verschiedenen Zeitpunkten während der Inkubation vorhanden sind, gezählt wird. Die Translationsprodukte können ebenfalls durch Immunopräzipitation oder durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert werden (siehe zum Beispiel, Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989; Harlow and Lane, "Antibodies: A labroatory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988)).
Ein Weizenkeimextrakt kann ebenfalls wie von Roberts und Paterson (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 70: 2330-2334 (1973)) beschrieben, hergestellt werden, und kann, falls gewünscht, wie von Anderson (Meth. Enzymol. 101: 635 (1983)) beschrieben modifiziert werden. Das Protokoll kann ebenfalls, gemäß dem Herstellerprotokoll L418 (Promega Corp.) modifiziert werden. Im allgemeinen wird Weizenkeimextrakt hergestellt, indem Weizenkörner in einem Extraktionspuffer vermahlen werden, gefolgt von Zentrifugation, um Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wird durch Chromatographie von endogenen Aminosäuren und von Pflanzenpigmenten, die für die Translation inhibitorisch sind, abgetrennt. Der Extrakt wird mit mikroccocaler Nuklease behandelt, um endogene mRNA zu zerstören, wodurch die Hintergrund-Translation auf ein Minimum reduziert wird. Der Weizenkeimextrakt enthält die zellulären Komponenten, die zur Proteinsynthese notwendig sind, einschließlich tRNA, rRNA sowie Initiations-, Elongations- und Terminationsfaktoren. Der Extrakt kann weiterhin optimiert werden, indem ein energieerzeugendes System wie Phosphorkreatinkinase und Phosphorkreatin hinzugegeben wird; MgAc wird zu einem Gehalt, der für die Translation der meisten mRNA-Spezies empfohlen wird, im allgemeinen ungefähr 6,0 bis 7,5 mM Magnesium, hinzugefügt.
Die in vitro Translation in Weizenkeimextrakten kann ebenfalls, wie zum Beispiel von Erickson und Blobel (Meth. Enzymol. 96: 38 (1982)) beschrieben, durchgeführt werden, und kann beispielsweise modifiziert werden, indem die endgültige Ionenkonzentration auf 2,6 mM Magnesium und 140 mM Kalium eingestellt wird und der pH auf 7.5 (US-Patent Nr. 4,983,521). Die Reaktionsmischungen können bei 24°C für 60 Minuten inkubiert werden. Translationen in Weizenkeimextrakten können ebenfalls, wie im US-Patent Nr. 5,492,817 beschrieben, durchgeführt werden.
In vitro Translationsreaktionen können durch die Zugabe von Ionen oder anderen Reagenzen optimiert werden. Beispielsweise ist Magnesium für die optimale Translation wichtig, da es die Stabilität von assemblierten Ribosomen verstärkt und ihrer Bindung aneinander während der Translation dient. Magnesium scheint ebenfalls die Polymerasebindung zu erleichtern. Kalium ist ebenfalls zur Optimierung der Translation wichtig, allerdings darf anders als Magnesium, für gekoppelte Transkriptions- und Translationsreaktionen die Kaliumionen-Konzentration nicht über den Gehalt für Standardtranslations-Präparationen geändert werden.
Kalium und Magnesium kommen in dem Standardkaninchen- Reticulozytenlysat vor und ihre Gehalte stammen teilweise von dem endogenen Lysatgehalt und teilweise von den Zugaben, die bei der Präparation des Lysats gemacht werden, wie sie für Translationslysate vorgenommen werden. Da die Magnesiumkonzentration innerhalb eines eher schmalen Bereichs für eine optimale Translation angepaßt werden sollte, sollten die Magnesiumgehalte im Lysat direkt durch die Verwendung eines Magnesiumtests vor der Zugabe von zusätzlichem Magnesium gemessen werden, so daß die Menge an Magnesium in einer Reaktion von einem Lysatansatz zum nächsten standardisiert werden kann. Der Lancer "Magnesium Rapid State Diagnostic Kit" (Oxford Lab Ware Division, Sherwood Medical Co.; St. Louis MO) ist ein hilfreicher Test zur genauen Messung der Magnesiumgehalte in einer biologischen Flüssigkeit. Sobald die Magnesiumkonzentration für einen ausgewählten Lysatansatz bestimmt ist, kann zusätzliches Magnesium, beispielsweise in der Form einer konzentrierten Magnesiumsalzlösung, auf bekannte Art zugefügt werden, um die Magnesiumkonzentration des Lysats innerhalb des optimalen Bereichs zu bringen, oder im Falle einer modifizierten Lysatpräparation, als eine Hälfte einer Reaktionsmischung verwendet werden, um innerhalb zweimal des optimalen Bereichs zu sein. Die Endkonzentration an Magnesium des Kaninchenretikulozytenlysate wird beispielsweise angepaßt, indem eine konzentrierte Lösung von MgCl2 oder MgAc auf eine Konzentration größer als 2,5 mM, jedoch geringer als 3,5 mM, üblicherweise zwischen 2,6 mM und 3,0 mM, hinzugefügt wird.
Eine übliche Zugabe zu einer in vitro Translationsreaktion ist eine Menge an Polyamin, die ausreichend ist, eine effiziente Kettenverlängerung zu stimulieren. Demzufolge kann Spermidin zu einer Translationreaktion mit einem Retikulozytenlysat bis zu einer Endkonzentration von ungefähr 0,2 mN hinzugefügt werden. Spermidin kann ebenfalls zu Weizenkeimextrakten hinzugegeben werden, im allgemeinen zu einer Konzentration von ungefähr 0,9 mM. Da die Konzentration von Polyaminen die effektive Magnesiumkonzentration in einer Reaktion erniedrigt, sollte die Gegenwart von Spermidin in einer Translationsreaktion in Betracht gezogen werden, wenn die zur Verwendung geeignete Konzentration an Magnesium bestimmt wird. DTT wird ebenfalls zu der Translationsmischung hinzugegeben, üblicherweise bei einer Endkonzentration von ungefähr 1,45 mM in Retikulozyten-Lysaten und ungefähr 5,1 mM in Weizenkeimextrakten.
Translationssysteme können mit zusätzlichen Faktoren, wie tRNA-Molekülen, die kommerziell erhältlich sind (Sigma Chemical, St. Louis MO; Promega Corp., Madison WI; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis IN), supplementiert werden, oder können aus E. coli, Hefe, Kalbsleber oder Weizenkeim mittels wohlbekannter Methoden, hergestellt werden. Die Isolierung und Reinigung von tRNA-Molekülen schließt Zellyse und Phenolextraktion ein, die von Chromatographie auf DEAE- Cellulose gefolgt wird. Aminosäure spezifische tRNA, beispielsweise tRNA<fMet<, kann durch Expression von klonierten Genen isoliert werden und in Wirtszellen überexprimiert und separiert aus Gesamt-tRNA in hohen Ausbeuten und hoher Reinheit mittels beispielsweise präparativer polyakrylamider Gelelektrophorese werden, was durch das Ausschneiden von Banden und Elution gefolgt wird (Seong and RajBhandary, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84: 334-338, (1987)).
Die Translationseffizienz kann verbessert werden, indem RNAase-Inhibitoren, wie RNASIN oder Heparin, zu der Translationsreaktion gegeben werden. RNASIN kann beispielsweise von Promega Corp. (Katalognr. N2514) erhalten werden. Es werden ungefähr 40 Einheiten RNASIN zu einer 50 µl-Reaktion hinzugegeben. Obwohl die Zugabe eines RNAase-Inhibitors zu Retikulozytenlysaten nicht entscheidend ist, tritt nur eine limitierte Translation auf, wenn ein RNAase-Inhibitor nicht zu einer Translationreaktion mit einem Weizenkeimextraktion hinzugegeben wird.
Der Translationsprozess, einschließlich der Bewegung der Ribosomen auf den RNA-Molekülen wird zu einem geeigneten Zeitpunkt durch die Zugabe eines Inhibitors der Translation, beispielsweise Cycloheximid bei einer Endkonzentration von 1 µg/ml, inhibiert. Magnesium-Ionen, beispielsweise MgCl2 können bei einer Konzentration von ungefähr 5 mM ebenfalls hinzugegeben werden, um die Komplexe aus mRNA-80S-Ribosom­ naszierendem Polypeptid (Polysome) beizubehalten.
Zur Bestimmung der optimalen in vitro Translationsbedingungen kann die Translation von mRNA in einem in vitro System, beispielsweise durch massenspektrometrische Analyse, überwacht werden. Alternativ dazu kann eine markierte Aminosäure wie 35S-Methionin in die Translationsreaktion, zusammen mit einer Aminosäuremischung, der diese spezifische Aminsosäure fehlt (zum Beispiel Methionin), aufgenommen werden. Eine markierte nicht radioaktive Aminosäure kann ebenfalls in ein naszierendes Polypeptid eingebaut werden. Beispielsweise kann die Translationsreaktion eine mis-aminoacylierte tRNA enthalten (US-Patent Nr. 5,643,722). Beispielsweise kann ein nicht radioaktiver Marker an ein tRNA-Molekül mis-aminoacyliert werden und der tRNA-Aminosäurekomplex wird zu dem Translationssystem hinzugegeben. Das System wird inkubiert, um den nicht radioaktiven Marker in das naszierende Polypeptid einzubauen, und Polypeptide, die den Marker enthalten, können unter Verwendung von für den Marker geeignete Nachweisverfahren detektiert werden. Mis-Aminoacylierung eines tRNA-Moleküls kann ebenfalls verwendet werden, um eine Marker zu einem Polypeptid hinzuzufügen, um die Isolierung des Polypeptids zu erleichtern. Solche Marker schließen beispielsweise Biotin, Streptavidin und Derivate davon ein (siehe US-Patent Nr. 5,643,722). Der Translationsprozess kann durch massenspektrometrische Analyse verfolgt werden, was nicht die Verwendung von Radioaktivität oder anderer Markierung erfordert.
Die in vitro Transkription- und Translationsreaktionen können simultan durchgeführt werden, beispielsweise mittels eines kommerziell erhältlichen Systems wie dem gekoppelten Transkriptions-/Translationssystem (Promega Corp., Katalognr. L4606, 4610 oder 4950). Gekoppelte Transkriptions- und Translationssysteme, die RNA-Polymerase und eukaryontische Lysate verwenden, sind im US-Patent Nr. 5,324,637 beschrieben. Eine gekoppelte in vitro Transkription und Translation kann ebenfalls mittels eines prokaryontischen Systems, wie einem bakteriellen System, beispielsweise E. coli S30 zellfreien Extrakten (Zubay, Ann. Rev. Genet. 7: 267 (1973)), durchgeführt werden. Obwohl solche prokaryontischen Systeme eine gekoppelte in vitro Transkription und Translation ermöglichen, können sie ebenfalls nur für die in vitro Translation verwendet werden. Wenn ein prokaryontisches Translationssystem verwendet wird, sollte die RNA-Sequenzelemente enthalten, die für die Translation einer RNA in einem prokaryontischen System erforderlich sind. Beispielsweise sollte die RNA prokaryontische ribosomale Bindungsstellen enthalten, die in eine Targetnukleinsäure während der Amplifikation mittels eines Primers, der die prokaryontische Ribosomenbindungssequenz enthält, eingebaut werden können. Die Ribosomenbindungssequenz ist stromabwärts eines Promotors zur Verwendung bei der in vitro Transkription angeordnet.
Zelluläre Translationssysteme können wie folgt hergestellt werden. Zellen werden durch Inkubation über einen kurzen Zeitraum, in einer Lösung, die niedrige Konzentrationen an Detergenz in einem hypotonischen Medium enthält, permeabilisiert. Verwendbare Detergenzien schließen Nonidet-P 40 (NP40) Triton X-100 (TX-100) oder Desoxycholat in Konzentrationen von ungefähr 0,01 nM bis 1,0 mM ein, im allgemeinen zwischen ungefähr 0,1 µm bis ungefähr 0,01 mM, insbesondere ungefähr 1 µM. Solche Systeme können aus intakten Zellen in Kultur gebildet werden, einschließlich bakteriellen Zellen, Primärzellen, immortalisierten Zellinien, humanen Zellen oder gemischten Zellpopulationen.
Ein Targetpolypeptid kann aus einer Wirtszelle erhalten werden, die mit einer Nukleinsäure, die als Targetpolypeptid transformiert ist und dieses exprimiert. Die Targetnukleinsäure kann beispielsweise durch PCR amplifiziert werden, in einem Expressionsvektor inseriert werden und der Expressionsvektor in einer Wirtszelle eingeführt werden, die für die Expression des durch die Targetnukleinsäure kodierten Polypeptids geeignet ist. Wirtszellen können eukaryontische Zellen, insbesondere Säugerzellen, wie humane Zellen, sein oder prokaryontische Zellen, einschließlich beispielsweise E. coli. Eukaryontische und prokaryontische Expressionsvektoren sind im Stand der Technik wohlbekannt und können aus kommerziellen Quellen erhalten werden. Nach der Expression in einer Wirtszelle kann das Targetpolypeptid mittels hier offenbarter Verfahren isoliert werden. Beispielsweise kann das Targetpolypeptid durch Affinitätschromatographie auf einer mit Nickel-Ionen chelatisierten Säule gereinigt werden, wenn das Targetpolypeptid mit einem His-6-Peptid fusioniert ist.
Amplifikation der Targetnukleinsäuresequenz
Mindestens ein Bereich der Targetnukleinsäure kann amplifiziert werden, bevor das Targetpolypeptid, das von der Nukleinsäure kodiert wird, erhalten wird. PCR kann beispielsweise vor der in in vitro Transkription und Translation einer Targetnukleinsäure durchgeführt werden. Amplifkationsverfahren schließen die Polymerasekettenreaktion (Newton and Graham, "PCR" (BIOS Publ. 1994)) ein; nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation, transkriptionsbasierte Amplifikationssysteme, selbsterhaltende Sequenzreplikation; Q-beta-Replikase-basierte Amplifikation; Ligation-Amplifikationsreaktion; Ligasekettenreaktion (Wiedemann et al., PCR Meth. Appl. 3: 57-64 (1994); Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88, 189-93 (1991)); Strang-Verdrängungs- Amplifikation (Walker et al Nucl. Acids Res. 22: 2670-77 (1994)); sowie Variationen dieser Methoden, einschließlich beispielsweise reverser Transkriptions-PCR (RT-PCR; Higuchi et al., Bio/Technology 11: 1026-1030 (1993)), sowie allelspezifische Amplifikation.
Wo eine Nukleotidsequenz der Targetnukleinsäure durch PCR amplifiziert wird, werden wohlbekannte Reaktionsbedingungen verwendet. Die minimalen Komponenten einer Amplifikationsreaktion schließen Template-DNA-Molekül ein; einen Forward Primer und einen Reversen Primer, von denen jeder fähig ist, an das Template-DNA-Molekül oder eine damit verbundene Nukleotidsequenz zu hybridisieren; alle der vier unterschiedlichen Nukleosidtriphosphate oder geeignete Analoga davon; ein Mittel für die Polymerisation wie DNA-Polymerase; und einen Buffer, der den geeigneten pH, Ionenstärke, Co- Faktoren und dergleichen aufweist. Im allgemeinen werden ungefähr 25 bis 30 Amplifikationszyklen durchgeführt, wobei jeder einen Denaturierungsschritt, einen Annealing-Schritt und einen Verlängerungsschritt einschließt, allerdings können weniger Zyklen ausreichen oder mehr Zyklen können erforderlich sein, in Abhängigkeit beispielsweise von der Menge der Template-DNA-Moleküle, die in der Probe vorhanden sind. Beispiele von PCR-Reaktionsbedingungen werden im US-Patent Nr. 5,604,099 beschrieben.
Eine Nukleinsäuresequenz kann unter Verwendung von PCR, wie im US-Patent Nr. 5,545,539 beschrieben, amplifiziert werden, das eine Verbesserung der grundlegenden Prozedur zur Amplifizierung einer Targetnukleotidsequenz bereitstellt, indem eine effektive Menge eines Osmolyts auf Glycinbasis in dem Amplifikations-Reaktionsgemisch eingeschlossen wird. Die Verwendung eines Osmolyten auf Glycinbasis verbessert die Amplifikation von Sequenzen, die viele G und C Reste aufweisen, und kann deshalb beispielsweise verwendet werden, um Trinukleotid-Wiederholungssequenzen wie diejenigen zu amplifizieren, die mit fragilem X-Syndrom (CGG-Wiederholungen) und myotonische Dystrophie (CTG-Wiederholungen) assoziiert sind.
Ein Primer kann von einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure hergestellt werden, beispielsweise durch Reinigung einer Restriktionsverdau der Nukleinsäure, oder kann synthetisch hergestellt werden. Ein Primer ist in der Lage als Initiationspunkt der Nukleinsäuresynthese zu wirken, wenn er untern Bedingungen, die für die Synthese eines Primer- Verlängerungsprodukts ausreichen, gebracht wird. Besonders nützliche Primer können spezifisch an die Targetsequenz oder an Sequenzen, die zur Targetsequenz benachbart sind, hybridisieren.
Jede spezifische Nukleinsäuresequenz kann mittels PCR amplifiziert werden. Es ist lediglich notwendig, daß eine ausreichende Anzahl von Basen an den Enden der Targetsequenz oder in der Targetsequenz bekannt sind, um so die Präparation von zwei Oligonukleotid-Primern zu ermöglichen, die an die Termini der zu amplifizierenden Sequenz und deren Komplement bei relativen Positionen entlang jeder Sequenz zu hybridisieren, so daß ein Verlängerungsprodukt, das von einem Primer synthetisiert wird, wenn es von seinem Template (Komplement) separiert wird, es als Template zur Verlängerung des anderen Primers zu einer Nukleinsäure mit definierter Länge dienen kann. Je größer die Kenntnis über die Basen an beiden Enden der Sequenz, desto größer kann die Spezifität der Primer für die Targetnukleinsäure sein und daher, desto größer die Effizienz des Amplifikationsprozesses. Falls gewünscht, kann jedoch ein Primer, der spezifisch für ein Ende der Targetnukleinsäure ist, verwendet werden und ein zweiter Primer auf Basis einer bekannten Sequenz, die mit dem gegenüberliegenden Terminus der Targetnuleinsäure verknüpft ist, für die Amplifikation des komplementären Stranges verwendet werden.
Ein Primer muss auch lang genug sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in der Gegenwart eines Polymerisationsmittels zu primen. Die genaue Länge des Primers hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Temperatur, bei der Hybridisierung und Primerverlängerung durchgeführt werden soll; der Zusammensetzung der Primer und des verwendeten Verfahrens. Abhängig von der Komplexität der Targetsequenz, enthält ein Primer üblicherweise ungefähr 9 bis ungefähr 25 Nukleotide, obwohl er mehr Nukleotide enthalten kann. Im Vergleich zu längeren Primern benötigen kürzere Primer im allgemeinen niedrigere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybridkomplexe mit einer Template-Nukleinsäure zu bilden (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989).
Hier offenbarte Primer werden ausgewählt, um im wesentlichen komplementär zu den unterschiedlichen Strängen von jeder spezifischen, zu amplifizierenden Sequenz zu sein. Als solche können die Primer spezifische, mit ihrem entsprechenden komplementären Strängen unter definierten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Eine Primersequenz muß nicht die exakte Sequenz des Templates wiederspiegeln. Beispielsweise kann ein nicht komplementäres Nukleotidfragment an das 5'-Ende des Primers angefügt werden, wobei der Rest der Primersequenz komplementär zu dem Templatestrang ist. Primer sollten im allgemeinen eine exakte Komplementarität mit einer Sequenz aus einer Target-Nukleinsäure, oder einem Komplement davon aufweisen, so daß eine optimale Amplifikation erhalten werden kann.
Ein Forward oder ein Reverse Primer kann, falls gewünscht, eine Nukleotidsequenz eines Promotors, beispielsweise einem bakteriophagen Promotor, wie einem SP6-, T3- oder T7-Promotor enthalten. Die Amplifikation einer Target-Nukleinsäuresequenz mittels eines solchen Primers erzeugt eine amplifizierte Targetnukleinsäure, die auf operabler Weise mit dem Promotor verknüpft ist. Eine solche Nukleinsäure kann in einer in vitro Transkription eingesetzt werden, um die amplifizierte Target- Nukleinsäuresequenz zu transkribieren. Nukleotidsequenzen des SP6, T3 und T7 Promotors sind wie folgt dargestellt:
  • - SP6 Promotorsequenzen:
    5'd(CATACGATTTAGGTGACACTATAG)3' SEQ ID NO: 1;
    5'd(ATTTAGGTGACACTATAG)3' SEQ ID NO: 2;
  • - T3 Promotorsequenz:
    5'd(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)3' SEQ ID NO: 3; und
  • - T7 Promotorsequenz:
    5'd(TAATACGACTCACTATAGGG)3' SEQ ID NO: 4.
Ein Primer; der einen Promotor enthalten kann, kann ebenfalls ein Initations-(ATG)Codon oder das Komplement davon enthalten, falls geeignet, stromabwärts des Promotors gelegen, so daß eine Amplifikation der Target-Nukleinsäure zu einer amplifizierten Targetsequenz führt, die ein ATG-Kodon im Rahmen mit dem gewünschten Leserahmen enthält. Der Leserahmen kann ein natürlicher Leserahmen oder jeder andere Leserahmen sein. Wo das Targetpeptid nicht natürlich existiert, erlaubt eine operable Verknüpfung des Initiationskodon mit der Nukleinsäure, die das Targetpolypeptid kodiert, eine Translation des Targetpolipeptids in den gewünschten Leserahmen.
Ein Forward oder Reverse Primer kann ebenfalls eine Nukleotidsequenz oder das Komplement einer Nukleotidsequenz (falls es in dem Reverse Primer vorkommt), die ein zweites Polypeptid kodiert. Das zweite Polypeptid kann ein Affinitätspeptid sein, das spezifisch mit einem bestimmten Reagenz, beispielsweise einem Antikörper, interagiert. Ein zweites Polypeptid kann ebenfalls einen nicht blockierten und reaktiven Aminoterminus oder Carboxyterminus besitzen.
Die Fusion eines Peptidanhängsels an ein Targetpolypeptid, oder ein anderes Polypeptid von Interesse erlaubt die Detektion und Isolierung des Polypeptids. Ein Targetpolypeptid, das von einer Target-Nukleinsäure kodiert wird, die an eine Sequenz fusioniert ist, die ein Peptidanhängsel kodiert, kann aus einer in vitro Reaktionsmischung mittels eines Reagenzes, das spezifisch mit dem Peptidanhängsel interagiert, isoliert werden, anschließend kann das isolierte Targetpolypeptid, wie hier offenbart, der Massenspektrometrie unterworfen werden. Es sollte deutlich sein, dass ein isoliertes Targetpolypeptid, das mit einem Peptidanhängsel oder einem zweiten Polypeptid fusioniert ist, in einer ausreichend gereinigten Form vorliegt, um die massenspektrometrische Analyse zu erlauben, da die Masse des Peptidanhängsels bekannt ist und bei der Bestimmung berücksichtigt werden kann.
Zahlreiche Peptidanhängsel sowie die Nukleinsäuresequenzen, die solche Peptidanhängsel kodieren, üblicherweise in einem Plasmid enthalten, sind bekannt und, kommerziell erhältlich (z. B. NOVAGEN). Jedes Peptid kann als Anhängsel verwendet werden, vorausgesetzt, daß ein Reagenz wie ein Antikörper, der spezifisch mit dem Peptidanhängsel interagiert, erhältlich ist, oder hergestellt und identifiziert werden kann. Häufig verwendete Peptidanhängsel schließen ein myc-Epitop, das eine 10 Aminosäurensequenz aus c-myc enthält (siehe Ellison et al., J. Biol. Chem. 266: 21 150-21 157 (1991)), das pFLAG-System (International Biotechnologies, Inc.); das pEZZ-Protein A-System (Pharmacia); ein 16 Aminosäure Peptidanteil des Haemophilus influenza Hemagglutinin Proteins, ein Gluthathion-S-Transferase-(GST)-Protein sowie ein His-6- Peptid ein. Reagenzien, die spezifisch mit einem Peptidanhängsel interagieren, sind ebenfalls bekannt und einige sind kommerziell erhältlich und schließen Antikörper und verschiedene andere Moleküle, in Abhängigkeit von dem Anhängsel, beispielsweise Metall-Ionen wie Nickel- oder Cobalt- Ionen ein, die spezifisch mit einem Polyhistidinpeptid wie His- 6 interagieren, oder Glutathion, das zu einem festen Träger, wie Agarose, konjugiert werden kann und spezifisch mit GST interagiert.
Ein zweites Polypeptid kann ebenfalls designed werden, um als Massenmodifikator des Targetpolypeptids, das von der Target-Nukleinsäure kodiert wird, zu dienen. Demzufolge kann die Masse eines Targetpolypeptid modifiziert werden, indem ein das Targetpolypeptid kodierendes RNA-Molekül translatiert wird, das auf operable Weise mit einer die Masse modifizierenden Aminosäuresequenz verknüpft ist, wobei die massenmodifizierende Sequenz am Aminoterminus oder am Carboxyterminus des Fusionspolypeptids sich befinden kann. Die Modifikation der Masse des Polypeptids, das von der Target-Nukleinsäure abgeleitet ist, ist beispielsweise nützlich, wenn verschiedene Peptide in einer einzigen massenspektrometischen Analyse analysiert werden, da die Massenmodifikation die Auflösung eines Massenspektrums erhöhen kann und die Analyse von zwei oder mehreren unterschiedlichen Targetpolypeptiden durch Multiplexing erlaubt.
Eine Massenmodifikation schließt Modifikationen wie die Zugabe eines Peptids oder Peptidfragments zu dem Targetpolypeptid ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Beispielsweise kann ein Targetpolypeptid massenmodifiziert werden, indem das Targetpolypeptid translatiert wird, um zusätzliche Aminosäuren wie Polyhistidin, Polylysin oder Polyarginin einzuschließen. Diese Modifikationen dienen nicht nur als Hilfe bei der massenspektrometrischen Analyse, sondern können ebenfalls bei der Reinigung, Identifikation und Immobilisierung helfen. Die Modifikationen können posttranslational hinzugefügt werden oder können in die Nukleinsäure eingeführt werden, die das sich ergebende Polypeptid kodiert.
Wo eine Vielzahl von Targetpolypeptiden differentiell massenmodifiziert werden soll, kann darüber hinaus jedes Polypeptid in der Vielzahl mittels einer unterschiedlichen Polyhistidinsequenz, beispielsweise His-4, His-5, His-6 usw. massenmodifiziert werden. Die Verwendung einer solchen die Masse modifizierenden Einheit stellt den weiteren Vorteil bereit, daß die Einheit als Peptidanhängsel wirkt, was beispielsweise zur Isolierung des damit verknüpften Targetpolypeptids hilfreich sein kann.
Ein Vorteil der obigen Verfahren ist, daß sie erlauben, daß ein Mulitplexing mit einer Vielzahl von Polypeptiden durchgeführt werden kann und deshalb nützlich sind, um die Aminosäuresequenzen von jedem der Vielzahl von Polypeptiden, insbesondere einer Vielzahl von Targetpolypeptiden zu bestimmen.
Es können mehr als eine Target-Nukleinsäure in derselben Reaktion mittels verschiedener Primerpaare amplifiziert werden, wobei jedes Paar eine unterschiedliche Target- Nukleinsäuresequenz, in einer Mischung aus Ausgangs- Nukleinsäuren amplifiziert. Die Amplifikation kann simultan durchgeführt werden, vorausgesetzt, daß die Annealing- Temperatur von allen Primerpaaren ausreichend ähnlich ist, oder kann sequentiell durchgeführt werden, wobei mit dem ersten Paar von Primern, das die niedrigste Annealing-Temperatur von verschiedenen Primerpaaren aufweist, begonnen wird, anschließend, nach Amplifikation der ersten Target- Nukleinsäure, ein zweites Primerpaar, das eine höhere Annealingtemperatur aufweist, hinzugefügt wird, und die zweite Amplifikation bei der höheren Temperatur durchgeführt wird, usw.. Individuelle Reaktionen mit unterschiedlichen Primerpaaren können ebenfalls durchgeführt werden, anschließend können die Reaktionsprodukte vereinigt werden. Die Verwendung solcher Verfahren stellt ein Mittel zur simultanen Bestimmung der Identität von mehr als einer allelischen Variante einer oder mehrerer polymorpher Regionen von einem oder mehreren Genen oder genetischen Läsionen bereit.
Ein Primer, beispielsweise der Forward Primer kann ebenfalls regulatorische Sequenzelemente, die zur Translation von RNA in einem prokaryontischen oder eukaryontischen System erforderlich ist, enthalten. Wo es wünschenswert ist, eine Translation in einem prokaryontischen Translationssystem durchzuführen, kann der Primer insbesondere eine prokaryontische ribosomale Bindungsstelle (Shine-Dalgarno- Sequenz) enthalten, die stromabwärts der Promotorsequenz und ungefähr 5 bis 10 Nukleotide stromaufwärts des Initiationskodons angeordnet ist. Eine prokaryontische ribosomale Bindungsstelle kann beispielsweise die Nukleotidsequenz TAAGGAGG (SEQ ID NO: 5) besitzen.
Ein Primer, im allgemeinen der Reverse Primer, kann ebenfalls eine Sequenz enthalten, die ein Stopcodon in einem oder mehreren Leserahmen kodiert, um eine geeignete Termination des Targetpolypeptids sicherzustellen. Darüber hinaus können, indem in den reversen Primer Sequenzen eingebaut werden, die drei Stopcodons kodieren, in einem von jedem der drei möglichen Leserahmen, gegebenenfalls durch einige Reste separiert, zusätzliche Mutationen, die stromabwärts (3') von einer Mutation auftreten, die andernfalls zu einer prämaturen Termination des Polypeptide führt, detektiert werden.
Zur Präparation der Primer für den Amplifikationsprozess können die Nukleotidsequenzen von zahlreichen Target- Nukleinsäuren von GenBank oder aus relevanten Zeitschriftenartikeln, Patenten oder veröffentlichten Patentanmeldungen erhalten werden. Oligonukleotidprimer können mittels jeder geeigneter Methode, einschließlich beispielsweise organischer Synthese einer Nukleinsäure aus Nukleosidderivaten hergestellt werden, und kann in Lösung oder auf einem festen Träger durchgeführt werden. Beispielsweise ist die Phosphortriester-Methode eingesetzt worden, um Genfragmente oder kurze Gene herzustellen. Bei der Phosphortriester-Methode werden Oligonukleotide hergestellt, anschließend miteinander verbunden, um längere Nukleinsäuren zu bilden (siehe Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90 (1979); US-Patent Nr. 4,356,270). Primer können ebenfalls, wie im US-Patent Nr. 5,547,835; US- Patent Nr. 5,605,798 oder US-Patent Nr. 5,622,824 beschrieben, synthetisiert werden.
Die Primer zur Amplifikation werden so ausgewählt, daß die Amplifikationsreaktion eine Nukleinsäure erzeugt, die nach Transkription und Translation zu einem nicht natürlich auftretenden Polypeptid führen kann, beispielsweise einem Polypeptid, das durch einen offenen Leserahmen kodiert wird, der nicht der offene Leserahmen ist, der das natürliche Protein kodiert. Demzufolge kann durch geeignetes Primerdesign, insbesondere durch Aufnahme eines Initiationskodons in den gewünschten Leserahmen, und falls vorhanden, stromabwärts eines Promotors in dem Primer, kann ein Polypeptid, das von einer Target-Nukleinsäure hergestellt wird, durch einen der zwei nicht kodierenden Leserahmen der Nukleinsäure kodiert werden. Eine solche Methode kann verwendet werden, um Stopcodons aus dem Leserahmen zu verschieben, die das Protein verkürzen vor der Maturierung und relevante Aminosäuren ausschließen, oder, um ein Polypeptid, das eine Aminosäurewiederholung enthält, löslicher zu machen.
Ein nicht natürlich vorkommendes Targetpolypeptid kann ebenfalls durch eine 5' oder 3' nicht kodierende Region einer Exon-Region einer Nukleinsäure kodiert werden; durch ein Intron; oder durch ein regulatorisches Element wie eine Promotorsequenz, die in einem der sechs Rahmen (drei Rahmen pro Strang) zumindest ein Teil eines offenen Leserahmens enthält. Bei diesen Situatioen enthält ein Primer zur Amplifikation der Target-Nukleinsäure einen Promotor und ein Initiationscodon, so daß die amplifizierte Nukleinsäure transkribiert und in vitro translatiert werden kann. Daher erlaubt ein wie hier offenbartes Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptids die Bestimmung der Identität einer Nukleotidsequenz, die in jedem Bereich eines Chromosoms lokalisiert ist, vorausgesetzt, daß ein Polypeptid von zumindest 2 Aminosäuren, üblicherweise zumindest 3 oder 4 Aminosäuren, insbesondere zumindest 5 Aminosäuren durch einen der sechs Leserahmen des Polynukleotids kodiert wird.
Immobilisierung des Polypeptids auf einem festen Träger
Für die massenspektrometrische Analyse kann ein Targetpolypeptid, oder ein anderes interessierendes Polypeptid, auf einem festen Träger konjugiert und darauf immobilisiert werden, um die Manipulation des Polypeptids zu erleichtern. Solche Träger sind dem Fachmann wohlbekannt und schließen jede Matrix ein, die als fester Träger zur Verknüpfung von Proteinen verwendet wird. Der Träger wird so ausgewählt, dass er undurchlässig gegenüber den Bedingungen der massenspektrometrischen Analyse ist. Träger, die eine flache Oberfläche oder eine Oberfläche mit Strukturen aufweisen können, schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Kügelchen wie Silicagel-Kügelchen, Glaskügelchen mit kontrollierten Poren, magnetische Kügelchen, Dynabeads, Wang- Harz, Merrifield-Harz, SEPHADEX/SEPHAROSE-Kügelchen oder Cellulose-Kügelchen; Kapillaren, ebene Träger wie Glasfaser- Filter, Glasoberflächen, Metalloberflächen (einschließlich Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Silicium und Kupfer), Plastikmaterialien (einschließlich Platten mit Mehrfachvertiefungen oder Membranen (die beispielsweise aus Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid gebildet werden), Wafer, Kämme, Stifte oder Nadeln (einschließlich Anordnungen von Stiften, die für die kombinatorische Synthese oder Analyse geeignet sind) oder Kügelchen in einer Raster von Grübchen, Vertiefungen, insbesondere Nanoliter-Vertiefungen in flachen Oberflächen, einschließlich Wafer, wie Siliciumwafer; und Wafer mit Vertiefungen mit oder ohne Filterboden. Ein fester Träger wird auf geeignete Weise für die Konjugation des Polypeptids funktionalisiert und kann jede für den Träger geeignete Form aufweisen.
Ein fester Träger wie ein Kügelchen kann für die Immobilisierung von Polypeptiden funktionalisiert werden, und das Kügelchen kann weiter mit dem festen Träger, falls gewünscht, assoziiert werden. Wenn ein Kügelchen an ein zweiten, festen Träger konjugiert werden soll, können Polypeptide auf dem funktionalisierten Träger vor, während oder nachdem das Kügelchen mit dem zweiten Träger konjugiert wird, immobilisiert werden.
Ein interessierendes Polypeptid kann direkt an einen festen Träger konjugiert werden oder kann indirekt durch eine funktionelle Gruppe konjugiert werden, die entweder auf dem Träger vorkommt oder durch einen Linker, der an dem Träger angefügt ist, oder dem Polypeptid, oder beidem. Beispielsweise kann ein Polypeptid auf einem festen Träger aufgrund einer hydrophoben, hydrophilen oder ionischen Interaktion zwischen dem Träger und dem Polypeptid immobilisiert werden. Obwohl eine solche Methode nützlich für gewisse Manipulationen, wie der Konditionierung des Polypeptids vor der Massenspektrometrie ist, ist eine solche direkte Interaktion dahingehend limitiert, daß die Orientierung des Polypeptids nicht bekannt ist, und auf Basis der Position der interagierenden Aminosäuren, beispielsweise hydrophober Aminosäuren in dem Polypeptid, zufällig sein kann. Daher wird ein Polypeptid im allgemeinen durch Konjugation durch eine funktionelle Gruppe entweder auf den festen Träger oder dem Polypeptid oder beidem, in einer definierten Orientierung immobilisiert.
Ein interessierendes Polypeptid kann modifiziert werden, indem eine geeignete funktionelle Gruppe an dem Carboxyterminus oder Aminoterminus des Polypeptids oder an einer Aminosäure in dem Peptid, beispielsweise an eine reaktive Seitenkette oder dem Peptidrückgrat, angefügt wird. Es sollte allerdings deutlich sein, daß eine natürlich vorkommende Aminosäure, die üblicherweise in dem Polypeptid vorkommt, ebenfalls eine funktionelle Gruppe enthalten kann, die zur Konjugation des Polypeptids mit den festen Träger geeignet ist. Beispielsweise kann ein Cysteinrest, der in dem Polypeptid vorkommt, verwendet werden, um das Polypeptid mit einem festen, eine Sulfhydrylgruppe enthaltenden Träger zu konjugieren, beispielsweise einem Träger, der durch einen Disulfid-Linker daran angeheftete Cysteinreste aufweist. Andere Bindungen, die zwischen zwei Aminosäuren ausgebildet werden können, schließen beispielsweise ein Monosulfidbindungen zwischen zwei Lanthioninresten, welche nicht natürlich vorkommende Aminosäuren sind, die in ein Polypeptid eingebaut werden können; eine Lactambindung, die durch eine Transamidierungsreaktion zwischen den Seitenketten einer sauren Aminosäure und einer basischen Aminosäure gebildet wird, wie zwischen der γ-Carboxylgruppe von Glu (oder der β- Carboxylgruppe von Asp) und der ε-Aminogruppe von Lys; oder eine Lactonbindung, die beispielsweise durch eine Vernetzung zwischen der Hydroxygruppe von Ser und der γ-Carboxylgruppe von Glu (oder β-Carboxylgruppe von Asp) gebildet wird. Daher kann ein fester Träger modifiziert werden, um einen gewünschten Aminosäurerest, beispielsweise einen Glu-Rest zu enthalten, und ein Polypeptid mit einem Ser-Rest, insbesondere einem Ser-Rest an dem Carboxyterminus oder Aminoterminus, kann mit dem festen Träger durch die Bildung einer Lactonbindung konjugiert werden. Es sollte jedoch deutlich sein, daß der Träger nicht modifiziert zu werden braucht, um die bestimmte Aminosäure, beispielsweise Glu, zu enthalten, wo es gewünscht wird, eine lactonartige Bindung mit einem Ser in einem Polypeptid zu bilden, sondern kann anstelle dessen modifiziert werden, um eine zugängliche Carboxylgruppe zu enthalten, wodurch eine Funktion bereitgestellt wird, die der γ-Gruppe von Glu entspricht.
Ein interessierendes Polypeptid kann ebenfalls modifiziert werden, um die Konjugation an einem festen Träger zu erleichtern, beispielsweise durch Einbau einer chemischen oder physikalischen Einheit an einer geeigneten Position in dem Polypeptid, im allgemeinen dem C-Terminus oder N-Terminus. Der Fachmann erkennt allerdings, daß eine solche Modifikation, beispielsweise der Einbau einer Biotin-Einheit, die Fähigkeit des jeweiligen Reagenzes beeinflussen kann, spezifisch mit dem Polypeptid zu interagieren und wird demzufolge, falls relevant, diesen Faktor bei der Auswahl berücksichtigen, wie ein interessierendes Polypeptid am besten zu modifizieren ist.
In einem Aspekt der hier bereitgestellten Verfahren kann ein interessierendes Polypeptid kovalent mit einem festen Träger konjugiert werden, und das immobilisierte Polypeptid kann verwendet werden, ein Targetpolypeptid einzufangen, das das immobilisierte Polypeptid bindet. Das Targetpolypeptid kann anschließend von dem immobilisierten Polypeptid für die Massenspektrometrie durch Ionisation oder Verflüchtigung freigesetzt werden, während das kovalent konjugierte Polypeptid an den Träger gebunden bleibt.
Demzufolge wird ein Verfahren zur Bestimmung der Identität von Polypeptiden bereitgestellt, die spezifisch mit einem interessierenden Polypeptid interagieren. Beispielsweise kann ein solches Verfahren verwendet werden, um die Identität von Targetpolypeptiden zu bestimmen, die aus einer oder mehreren biologischen Proben erhalten werden, die spezifisch mit dem immobilisierten, interessierenden Polypeptid interagieren. Ein solches Verfahren kann beispielsweise ebenfalls verwendet werden, um die Identität von Bindungsproteinen wie Antikörper, die an das immobilisierte Polypeptid-Antigen von Interesse binden oder Rezeptoren, die an immobilisierte Polypeptidliganden von Interesse binden, oder dergleichen zu bestimmen. Ein solches Verfahren kann beispielsweise verwendet werden, um eine kombinatorische Bibliothek von modifizierten Targetpolypeptiden wie modifizierten Antikörpern, Antigenen, Rezeptoren, Hormonen oder anderen Polypeptiden zu screenen, um die Identität von solchen Targetpolypeptiden zu bestimmen, die spezifisch mit dem immobilisierten Polypeptid interagieren.
In einem Aspekt der hier bereitgestellten Verfahren kann ein Polypeptid von Interesse kovalent an einen festen Träger konjugiert werden und das immobilisierte Polypeptid kann verwendet werden, um ein Targetpolypeptid einzufangen, das das immobilisierte Polypeptid bindet. Das Targetpolypeptid kann anschließend von dem immobilisierten Polypeptid für die Massenspektrometrie durch Ionisation oder Verflüchtigung freigesetzt werden, während das kovalent konjugierte Polypeptid an den Träger gebunden bleibt.
Demzufolge wird ein Verfahren bereitgestellt, um die Identität von Polypeptiden zu bestimmen, die mit einem Polypeptid von Interesse interagieren. Beispielsweise kann ein solches Verfahren verwendet werden, um die Identität von Targetpolypeptiden zu bestimmen, die aus einer oder mehrerer biologischer Proben erhalten werden, die spezifisch mit dem immobilisierten Polypeptid von Interesse interagieren. Ein solches Verfahren kann ebenfalls verwendet werden, um beispielsweise die Identität von Bindungsproteinen wie Antikörper, die an das immobilisierte Polypeptid-Antigen von Interesse binden, oder Rezeptoren, die an einen immobilisierten Polypeptidliganden von Interesse binden, oder dergleichen zu bestimmen. Solch ein Verfahren kann eingesetzt werden, um beispielsweise eine kombinatorische Bibliothek von modifizierten Targetpolypeptiden, wie modifizierte Antikörper, Antigene, Rezeptoren, Hormone oder andere Polypeptide zu screenen, um die Identität derjenigen Polypeptide zu bestimmen, die spezifisch mit dem immobilisierten Polypeptid interagieren.
Ein Polypeptid von Interesse kann mit einem festen Träger konjugiert werden, der auf Basis der Vorteile ausgewählt werden kann, die bereitgestellt werden können. Die Konjugation eines Polypeptids an einen Träger bietet beispielsweise den Vorteil, daß ein Träger einen relativ großen Oberflächenbereich zur Immobilisierung von Polypeptiden aufweist. Ein Träger wie ein Kügelchen kann jede dreidimensionale Struktur besitzen, einschließlich einer Oberfläche, auf die ein Polypeptid, funktionelle Gruppe oder ein anderes Molekül angeheftet werden kann. Falls gewünscht kann ein Träger wie ein Kügelchen, das zusätzliche Charakteristikum haben, daß es weiterhin mit einem unterschiedlichen festen Träger konjugiert werden kann, beispielsweise an die Wände eines Kapillarröhrchens. Ein für die offenbarten Verfahren oder Kits verwendbarer Träger besitzt üblicherweise eine Größe im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 100 µm im Durchmesser; kann aus jedem unlöslichen oder festen Material, wie oben offenbart, hergestellt werden, und kann ein quellfähiges Kügelchen, beispielsweise ein Polymerkügelchen wie ein Wang-Harz oder ein nicht quellfähiges Kügelchen wie ein Glas mit kontrollierten Poren sein.
Eine feste Oberfläche kann ebenfalls modifiziert werden, um die Konjugation eines Polypeptids von Interesse zu erleichtern. Eine thiolreaktive Funktionalität ist besonders nützlich, um ein Polypeptid mit einem festen Träger zu konjugieren. Eine thiolreaktive Funktionalität ist eine chemische Gruppe, die rasch mit einer nukleophilen Thiolgruppe reagieren kann, um eine kovalente Bindung, beispielsweise eine Disulfidbindung oder eine Thioetherbindung, zu erzeugen. Im allgemeinen sind Thiolgruppen gute Nukleophile und daher sind thiolreaktive Funktionalitäten im allgemeinen reaktive Elektrophile. Eine Vielzahl von thiolreaktiven Funktionalitäten sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich beispielsweise Haloacetyle, wie Iodacetyl; Diazoketone, Epoxyketone, α- und β-ungesättigte Carbonyle wie α-Enone und β- Enone; und andere reaktive Michael-Akzeptoren wie Maleinimid, Säurehalogene, Benzylhalogene und dergleichen. Eine freie Thiolgruppeeines Disulfides kann beispielsweise mit einer freien Thiolgruppe durch Ausbildung einer Disulfidbindung, einschließlich eines Disulfidaustausches, reagieren. Die Reaktion einer Thiolgruppe kann temporär durch Blockierung mit einer geeigneten Schutzgruppe, wie sie im Stand der Technik üblich ist (siehe Greene und Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis" 2. Aufl. (John Wiley & Sons 1991)) verhindert werden.
Reduktionsmittel, die zur Reduktion eines eine Disulfidbindung enthaltenden Polypeptids verwendbar sind, schließen Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) ein, das üblicherweise in einer Konzentration von ungefähr 1 bis 100 mM, üblicherweise ungefähr 10 mM verwendet wird, und bei einem pH von ungefähr 3 bis 6, üblicherweise ungefähr pH 4,5, einer Temperatur von ungefähr 20°C bis 45°C, üblicherweise 37°C, für ungefähr 1 bis 10 Stunden, üblicherweise ungefähr 5 Stunden umgesetzt wird; Dithiothreitol, das im allgemeinen in einer Konzentration von 25 bis 100 mM und bei einem pH von ungefähr 6 bis 10 umgesetzt wird, üblicherweise ungefähr pH 8, einer Temperatur von ungefähr 25°C bis 45°C, üblicherweise ungefähr 37°C, für ungefähr 1 bis 10 Stunden, üblicherweise ungefähr 5 Stunden eingesetzt wird. TCE bietet dahingehend einen Vorteil, das es bei niedrigem pH reaktiv ist, was Thiole effektiv protoniert, wodurch nukleophile Reaktionen von Thiolen unterdrückt, und deshalb zu weniger Nebenreaktionen als mit anderen Disulfidreduktionsmitteln führt.
Eine thiolreaktive Funktionalität wie 3-Mercaptopropyltriethoxysilan kann verwendet werden, um eine Siliciumoberfläche mit Thiolgruppen zu funktionalisieren. Die aminofunktionalisierte Siliciumoberfläche kann anschließend mit einem heterobifunktionellen Reagenz wie N-Succinimidyl(4- iodacetyl)aminobenzoat (STAB) (Pierce; Rockford IL) umgesetzt werden. Falls gewünscht, können die Thiolgruppen mit einer photospaltbaren Schutzgruppe blockiert werden, die anschließend beispielsweise durch Photolitographie selektiv abgespalten werden kann, um Bereiche einer Oberfläche zur Immobilisierung eines interessierenden Polypeptids bereitzustellen. Photospaltbare Schutzgruppen sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise die veröffentlichte internationale PCT- Anmeldung Nr. WO 92/10092; McCray et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 18: 39-270 (1989)) und können durch Bestrahlung von ausgewählten Bereichen der Oberfläche beispielsweise mittels einer Photolitographie-Maske selektiv deblockiert werden.
Linker
Wie hier erläutert, kann das Polypeptid entweder direkt an den Träger oder mittels einer Verknüpfungseinheit oder -einheiten verbunden werden. Es kann jeder Träger, von dem der Fachmann weiß, das er zur Verknüpfung von Peptiden oder Aminosäuren mit Trägern geeignet ist, entweder direkt oder mittels eines Spacers, verwendet werden. Linker schließen Rink- Amidlinker (siehe beispielsweise Rink (1976) Tetrahedron Letters 28: 787), Tritylchloridlinker (siehe z. B., Leznoff (1978) ACe. Chem. Res. 1: 27), Merrifield-Linker (siehe beispielsweise, Bodansky et al. 1976) Peptide Synthesis, Academic Press, 2. Auflage, New York) ein. Beispielsweise sind Trityllinker bekannt (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,410,068 und US-Patent Nr. 5,612,474). Aminotrityllinker (siehe Fig. 3) sind ebenfalls bekannt (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,198,531). Linker, die geeignet sind, Peptide chemisch mit Trägern zu verbinden, schließen Disulfidbindungen, Thioetherbindungen, gehinderte Disulfidbindungen und kovalente Bindungen zwischen freien reaktiven Gruppen wie Amin- und Thiolgruppen ein. Diese Bindungen können mittels heterobifunktioneller Reagenzen hergestellt werden, um reaktive. Thiolgruppen auf einem oder beiden Polypeptiden zu erzeugen und anschließend die Thiolgruppen auf einem Polypeptid mit reaktiven Thiolgruppen oder Amingruppen auf dem anderen zu reagieren. Andere Linker schließen ein säurespaltbare Linker wie Bismaleinimideothoxypropan, säurelabile Transferrin- Konjugate und Adipinsäuredihydrazide, die in saureren intrazellulären Kompartimenten gespalten werden photospaltbare Quervernetzer, die durch sichtbares oder UV-Licht gespalten werden, RNA-Linker, die durch Ribozyme oder andere RNA-Enzyme spaltbar sind, sowie Linker, wie die verschiedenen Domänen wie CH1, CH2 und CH3 der konstanten Region von humanem IgG1 (siehe Batra et al (1993) Molecular Immunol. 30: 379-386).
Es kann jeder Linker, der dem Fachmann für die Immobilisierung eines Polypeptids mit einem festen Träger bekannt ist, in einem hier offenbarten Verfahren verwendet werden. Kombinationen von beliebigen Linkem werden hier ebenfalls betrachtet. Beispielsweise kann ein Linker wie eine Silylverbindung, der unter massenspektrometrischen Bedingungen spaltbar ist, oder eine photospaltbare Verbindung kombiniert werden mit einem Linker wie eine Avidin-Biotin-Verknüpfung, die unter diesen Bedingungen nicht gespalten wird, jedoch unter anderen Bedingungen gespalten werden kann.
Ein Polypeptid von Interesse kann direkt mit einem Träger oder mittels eines Linkers verbunden werden. Beispielsweise kann das Polypeptid mit einem Träger wie einem Kügelchen mittels eines variablen Spacers konjugiert werden. Darüber hinaus kann die Konjugierung direkt spaltbar sein, beispielsweise durch eine photospaltbare Verbindung wie eine Streptavidin oder Avidin zu Biotin Wechselwirkung, die mittels eines Lasers gespaltet werden kann, wie es bei der Massenspektrometie geschieht, oder indirekt durch einen photospaltbaren Linker (siehe US-Patent Nr. 5,643,722) oder einen säurelabilen Linker, wärmeempfindlichen Linker, enzymatisch spaltbaren Linker oder einen anderen solcher Linker.
Ein Linker kann eine reversible Verbindung bereitstellen, so daß diese unter den Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten wird. Ein solcher Linker kann beispielsweise eine photospaltbare Bindung wie ein Ladungstransferkomplex oder eine labile Bindung, die zwischen relativ stabilen organischen Resten gebildet wird, sein. Ein Linker (L) an einem Polypeptid kann eine Verbindung, die im allgemeinen eine temporäre Verbindung ist, mit einer zweiten funktionellen Gruppe (L') auf dem festen Träger erzeugen. Wenn das Polypeptid von Interesse eine negative Nettoladung besitzt oder konditioniert ist, um eine solche Ladung aufzuweisen, kann die Verbindung, die mit L' gebildet wird, des weiteren beispielsweise eine quaternäre Ammoniumgruppe sein. In diesem Fall trägt die Oberfläche des festen Trägers eine negative Ladung, die das negativ geladene Polypeptid abstößt, wodurch die Desorption des Polypeptids für die massenspektrometrische Analyse erleichtert wird. Die Desorption kann aufgrund der Wärme geschehen, die von einem Laserpuls erzeugt wird, oder, wenn L' ein Chromophor ist, durch spezifische Absorption von Laserenergie, die sich in Resonanz mit dem Chromophor befindet.
Eine Verbindung (L-L') kann beispielsweise eine Disulfidbindung sein, die chemisch durch Mercaptoethanol oder Dithioerythrol spaltbar ist; eine Biotin-/Streptavidin-Bindung, die photospaltbar sein kann; ein heterobifunktionelles Derivat einer Tritylethergruppe, die durch Exposition zu sauren Bedingungen oder unter Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten werden kann (Köster et al., "A Versatile Acid-Labile Linker for Modification of Synthetic Biomolecules," Tetrahedron Lett. 31: 7095 (1990)), eine Lävulinyl-vermittelte Bindung, die unter annähernd neutralen Bedingungen mit einem Hydrazin- /Acetat-Buffer gespaltet werden kann, eine Arginin-Arginin- oder eine Lysin-Lysin-Bindung, von jede durch eine Endopeptidase wie Trypsin gespalten werden kann, eine Pyrophosphatbindung, die durch eine Pyrophosphatase gespalten werden kann; oder eine Ribonukleotidbindung, die mittels einer Ribonuklease oder durch Exposition zu alkalischen Bedingungen gespalten werden kann.
Die Funktionalitäten L und L' können ebenfalls einen Ladungstransferkomplex ausbilden, wodurch eine temporäre L-L'- Verbindung gebildet wird. Da das "Ladungstransferband" durch UV/vis-Spektrometrie bestimmt werden kann (siehe Foster, "Organic Charge Transfer Complexes" (Academic Press 1969)) kann die Laserenergie auf die korrespondierende Energie der Ladungstransfer-Wellenlänge eingestellt werden und die spezifische Desorption von dem festen Träger kann initiiert werden. Es ist klar, daß verschiedenen Kombinationen von L und L' diesem Zweck dienen können, und daß die Donor-Funktionalität sich auf dem festen Träger befinden kann, oder an das zu detektierende Polypeptid gekoppelt sein kann, oder umgekehrt.
Eine reversible L-L'-Verbindung kann ebenfalls erzeugt werden, indem relativ stabile Radikale homolytisch gebildet werden. Unter dem Einfluß eines Laserpulses kann die Desorption sowie Ionisation an der radikalischen Position stattfinden. Verschiedene organische Radikale können so ausgewählt werden, daß in Relation zu der Dissoziationsenergie, die erforderlich ist, um die Bindung zwischen den Radikalen homolytisch zu spalten, eine korrespondierende Laserwellenlänge ausgewählt werden kann (siehe Wentrup, "Reactive Molecules" (John Wiley & Sons 1984)).
Andere Linker schließen diejenigen ein, die in Fusionsproteine eingebaut und in einer Wirtszelle expremiert werden können. Solche Linker können ausgewählte Aminosäuren, Enzymsubstrate oder jedes geeignete Peptid sein. Der Linker kann beispielsweise durch geeignete Auswahl von Primern hergestellt werden, wenn die Nukleinsäure isoliert wird. Alternativ dazu können sie durch posttranslationale Modifikation des interessierenden Proteins hinzugefügt werden.
Inbesondere sind selektiv spaltbare Linker, einschließlich photospaltbarer Linker, säurespaltbarer Linker; säurelabiler Linker und wärmeempfindlicher Linker verwendbar. Säurespaltbare Linker schließen beispielsweise Bismaleimideothoxypropan ein, Adipinsäuredihydrazid-Linker (siehe Fattom et al., Infect. Immun. 60: 584-589 (1992)) sowie säurelabile Transferrin- Konjugate, die einen ausreichenden Anteil an Transferrin enthalten, um den Eintritt in den intrazellulären Transferrin- Cycling-Pathway zu ermöglichen (siehe Welhöner et al., J. Biol. Chem. 266: 4309-4314 (1991)).
Fig. 2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens des orthogonalen Einfangens, Spalten und MALDI- Analyse eines Peptids. Diese Ausführugsform demonstriert das Einfangen durch den Aminoterminus des Peptids. Wie gezeigt, wird das Polypeptid auf einer Oberfläche eines Trägers durch die Verwendung einer Diisopropylsilyldiethergruppe eingefangen. Andere Silyldiethergruppen, einschließlich Diallkylsilyl, Diarylsilyl und Alkylarylsilyl, können ebenfalls verwendet werden, sind jedoch darauf nicht beschränkt. Reaktionen einer hydroxylierten Trägeroberfläche mit Diisopropylsilylchlorid und einem Hydroxyester stellt die Ausgangsoberfläche, die mit Diisopropylsilyldietherester gebunden ist, bereit.
Unter Bezugnahme auf die Figur ist R3 jede Verknüpfungseinheit, die von einem Träger stammt, der für die Verknüpfung mit einer Derivatisierungsgruppe derivatisiert wurde, die eine zur Reaktion verfügbare Hydroxylgruppe aufweist. R3 kann ebenfalls eine Verknüpfung wie Biotin- Streptavidin oder Biotin-Avidin sein. R3 schließt Gruppen wie Polyethylenglycol (PEG), eine Alkylen- oder eine Arylengruppe ein.
Die hydroxylierte Trägeroberfläche kann mittels Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, hergestellt werden. Zum Beispiel N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat (SIAB). Andere Mittel als Linker (R3) schließen ein Dimaleimid, Dithio-bis- nitrobenzoesäure (DTNB), N-Succinimidyl-S-acetyl-thioacetat (SATA), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Succinimidyl-4-(N-Maleimidmethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), ist jedoch nicht auf diese beschränkt. 6- Hydrazinonicotimid (HYNIC) kann ebenfalls in dem neuen Verfahren verwendet werden. Für weiter Beispiele von Vernetzungsmitteln siehe beispielsweise Wong "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking", CRC Press (1991) und Hermanson, "Bioconjugate Techniques" Academic Pres (1995). Hydroxyester, die verwendet werden können, schließen ein Hydroxyacetat (Glycolat), α-, β-, γ-, . . . ω-Hydroxyalkanoate, ω-Hydroxy(polyethylenglycol)COOH, Hydroxybenzoate, Hydroxyarylalkanoate sowie Hydroxyalkylbenzoate, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Unter Bezugnahme auf Fig. 2 kann deshalb R4 jede divalente Gruppe sein, die eine Länge von 2 oder mehr Bindungen aufweist, so wie (CH2)n, worin n 2 oder größer ist, und Polyethylenglycol. Der derivatisierte Träger wird anschließend mit dem gewünschten Peptid umgesetzt, um das Peptid auf den Träger unter Verlust von R1OH, einzufangen. In Ausführungsformen, in denen COOR1 eine aktive Estergruppe ist, kann das Peptid direkt mit der Estergruppe umgesetzt werden. In diesen bevorzugten Ausführungsformen wird R1 von Gruppen wie N- Succinimidyl, Natrium-3-sulfo-N-succinimidyl und 4-Nitrophenyl ausgewählt, ist jedoch nicht darauf beschränkt. In anderen Ausführungsformen wird der Ester verseift, zum Beispiel mit Hydroxid, um die entsprechende Säure zu erhalten. Diese Säure wird anschließend mit dem Aminoterminus des Peptids unter Standardbedingungen zur Peptidkopplung gekoppelt (z. B. 1-(3- Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS). Das eingefangene Peptid wird anschließend mittels Reaktion mit einem Enzym oder einem Reagenz, das für eine vorgegebene Amidbindung des Peptids spezifisch ist, verkürzt (fragmentiert). Die Spaltung des verkürzten ein N-terminales Fragment des Originalpeptids enthaltenden Peptids von dem Träger wird anschließend durch Reaktion mit milder Säure erreicht. Für diese Abspaltung geeignete Säure schließen Essigsäure, Trifluoressigsäure, Paratoluolsulfonsäure und Mineralsäuren ein, sind jedoch darauf nicht beschränkt. Eine bevorzugte Säure ist 3-Hydroxypicolinsäure, die ebenfalls eine geeignete Matrix für die nachfolgende MALDI-Analyse ist.
Fig. 3 illustriert weitere bevorzugte Linker und Einfangstrategien für die MALDI-Analyse von Peptiden. Wie gezeigt, kann das Peptid durch den Carboyxterminus eingefangen werden, indem ein aminoderivatisierter Träger eingesetzt wird. Der aminoderivatisierte Ausgangsträger kann hergestellt werden, indem eine hydroxylierte Oberfläche des Trägers mit Diisopropylsilyldichlorid und einem Aminoalkohol umgesetzt wird. Aminoalkohole, die verwendet werden können, schließen α-, β-, γ-, . . ., ω-Aminoalkanole, ω-Hydroxy(polyethylenglykol)NH2, Hydroxyaniline, Hydroxyarylalkylamine sowie Hydroxyalkylaniline ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Daher kann unter Bezugnahme auf Fig. 3 R4 jede divalente Gruppe sein, deren Länge 2 oder mehr Bindungen beträgt. Das Einfangen des Peptids durch den aminoderivatisierten Träger wird durch dehydrative Kopplung des Peptids mit der Aminogruppe erreicht. Solche Bedingungen zur Peptidkopplung sind dem Fachmann wohlbekannt. Illustriert ist ein Satz von Bedingungen zum Einfangen des Peptids (d. h. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid­ hydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS)). Das eingefangene Peptid kann anschließend verkürzt, vom Träger abgespalten und wie in Fig. 2 gezeigt, analysiert werden.
Ebenfalls sind in Fig. 3 andere für das Einfangen von Peptiden auf Trägern für die MALDI-Analyse verwendbare Linker veranschaulicht. Beispielsweise können Trityl-enthaltende Linker, die entweder mit Ester- oder Aminoeinheiten funktionalisiert sind, verwendet werden, um Peptide am Amino- bzw. Carboxyterminus einzufangen. Andere, dem Fachmann bekannte Linker, zum Beispiel photospaltbare Linker, sind ebenfalls für die Verwendung zum Einfangen der Peptide auf der Trägeroberfläche erhältlich.
Photospaltbare Linker
Es werden photospaltbare Linker bereitgestellt. Die Linker enthalten O-Nitrobenzyleinheiten und Phosphatbindungen, die eine vollständige photolytische Spaltung der Konjugate innerhalb von Minuten nach UV-Einstrahlung ermöglichen. Die UV- Wellenlängen werden so ausgewählt, daß die Strahlung die Polypeptide nicht beschädigt und beträgt üblicherweise ungefähr 350 bis 380 nm, üblicherweise ungefähr 365 nm.
Ein photospaltbarer Linker kann die allgemeine Struktur gemäß Formel I aufweisen:
wobei R20 ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl oder ω-Hydroxyalkyl ist; R21 aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl und Carboxy ausgewählt wird; R22 Wasserstoff oder (Dialkylamino) ω-cyanoalkoxy)P- ist; t 0-3 ist; sowie R50 Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy ist.
Ein photospaltbarer Linker kann ebenfalls die Formel II aufweisen:
wobei R20 ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl, ω-Hydroxyalkyl oder Alkyl ist; R21 aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl und Carboxy ausgewählt wird; R22 Wasserstoff oder (Dialkylamino) ω-cyanoalkoxy)P- ist; und X20 Wasserstoff, Alkyl oder OR20 ist.
Bei einem bestimmten photospaltbaren Linker ist R20 3- (4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl, 3-Hydroxypropyl oder Methyl; R21 wird aus Wasserstoff, Methyl und Carboxy ausgewählt; R22 ist Wasserstoff oder (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und X20 ist Wasserstoff, Methyl oder OR20. Bei einem anderen photospaltbaren Linker ist R20 3-(4,4'- Dimethoxytrityloxy)propyl; R21 ist Methyl; R22 ist (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und X20 ist Wasserstoff. Bei noch einem weiteren photospaltbaren Linker ist R20 Methyl; ist R21 Methyl; ist R22 (Diisopropylamino) (2-cyanoethoxy) P-; und ist X20 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy.
Ein photospaltbarer Linker kann ebenfalls die allgemeine Formel gemäß Formel III besitzen:
wobei R23 Wasserstoff oder (Dialkylamino) ω-cyanoalkoxy)P- ist; und R24 aus ω-Hydroxyalkoxy, ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkoxy, ω-Hydroxyalkyl und ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl ausgewählt wird und unsubstituiert ist oder an der Alkyl- oder Alkoxykette mit einer oder mehrerer Alkylgruppen substituiert; r und s jeweils unabhängig 0-4 sind; und R50 Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy ist.
Bei bestimmten photospaltbaren Linkem ist R24 ω-Hydroxyalkyl oder ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl und ist an der Alkylkette mit einer Methylgruppe substituiert. Bei einem weiteren photospaltbaren Linker ist R23 Wasserstoff oder (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und R24 wird aus 3-Hydroxypropoxy, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy, 4- Hydroxybutyl, 3-Hydroxy-1-propyl, 1-Hydroxy-2-propyl, 3-Hydroxy-2-methyl-1-propyl, 2-Hydroxyethyl, Hydroxymethyl, 4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)- 1-propyl, 2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl, 1-(4,4'- Dimethoxytrityloxy)-2-propyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2- methyl-1-propyl und 4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl ausgewählt. Bei noch einem weiteren photospaltbaren Linker ist R23 (Diisopropylamino)(2-Cyanoethoxy)P-; sind r und s 0; und R24 wird aus 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy, 4-(4,4'- Dimethoxytrityloxy)butyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl, 2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl, 1-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)- 2-propyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-methyl-1-propyl und 4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl ausgewählt. R24 ist besonders bevorzugt 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy.
Herstellung der photospaltbaren Linker Herstellung der photospaltbaren Linker der Formel I oder II
Photospaltbare Linker gemäß Formeln I oder II können mittels der unten beschriebenen Verfahren, durch geringfügige Modifikation der Verfahren, indem die geeigneten Ausgangsmaterialien ausgewählt werden, oder durch jede andere dem Fachmann bekannte Methode hergestellt werden. Detaillierte Vorgehensweisen für die Synthese von photospaltbaren Linker der Formel II sind im Beispiel 2 und 3 angegeben.
Bei den photospaltbaren Linkem von Formel II, worin X20 Wasserstoff ist, können die Linker auf die folgende Weise hergestellt werden. Alkylierung von 5-Hydroxy-2- nitrobenzaldehyd mit einem ω-Hydroxyalkylhalogenid, beispielsweise 3-Hydroxypropylbromid, gefolgt von dem Schutz des resultierenden Alkohols, beispielsweise als ein Silylether, ergibt einen 5- ω-Silyloxyalkoxy)-2-nitrobenzaldehyd. Zugabe einer organometallischen Verbindung zu dem Aldehyd ergibt einen benzylischen Alkohol. Organometallische Verbindungen, die verwendet werden können, schließen Trialkylverbindungen (für Linker, bei denen R21 Alkyl ist) wie Trimethylaluminium ein; Borhydride (für Linker, bei denen R21 Wasserstoff ist) wie Natriumborhydrid; oder Metallcyanide (für Linker, bei denen R21 Carboxy oder Alkoxycarbonyl ist) wie Kaliumcyanid. Im Falle der Metallcyanide wird das Reaktionsprodukt, ein Cyanohydrin, entweder unter sauren oder basischen Bedingungen in der Gegenwart von entweder Wasser oder Alkohol hydrolysiert, um die interessierende Verbindung zu ergeben.
Die Silylgruppe der Seitenkette des resultierenden Benzylalkohols kann gegen eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe durch Desilylierug, beispielsweise unter Verwendung von Tetrabutylammoniumfluorid, ausgetauscht werden, um den entsprechenden Alkohol zu ergeben, gefolgt von Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid. Die Reaktion beispielsweise mit 2- Cyanoethyl-diisopropylchlorphosphoramidit ergibt den Linker, bei dem R22 (Dialkylamino) ω-Cyanoalkoxy)P- ist.
Ein spezielles Beispiel einer Synthese eines photospaltbaren Linkers der Formel II ist dem folgenden Schema gezeigt, das ebenfalls die Verwendung des Linkers bei der Oligonukleotidsynthese demonstriert. Das Schema soll lediglich veranschaulichend sein und in keiner Weise den Umfang der Methoden hier einschränken. Experimentielle Details der Synthesetransformationen werden in den Beispielen angegeben.
Die Synthese der Linker von Formel II, worin X20 OR20, 3,4-Dihydroxyacetophenon ist, wird selektiv an dem 4-Hydroxyl durch Reaktion, beispielsweise mit Kaliumcarbonat und einem Silylchlorid geschützt. Benzoatester, Propionphenon, Butyrophenone und dergleichen können anstelle des Acetophenons verwendet werden. Das sich ergebende 4-Silyloxy-3- hydroxyacetophenon wird anschließend mit einem Alkylhalogenid (für Linker, in denen R20 Alkyl ist) an dem 3-Hydroxy alkyliert und, beispielsweise mit Tetrabutylammoniumfluorid, desyliert, um ein 3-Alkoxy-4-Hydroxyacetophenon zu ergeben. Diese Verbindung wird anschließend am 4-Hydroxyl durch Reaktion mit einem ω-Hydroxyalkylhalogenid, beispielsweise 3- Hydroxypropylbromid, alkyliert, um ein 4-(ω-Hydroxyalkoxy)-3- alkoxyacetophenon zu ergeben. Der Seitenkettenalkohol wird anschließend als ein Ester, beispielsweise ein Acetat, geschützt. Diese Verbindung wird anschließend an der 5-Position beispielsweise mit konzentrierter Salpetersäure nitriert, um das entsprechende 2-Nitroacetophenon zu ergeben. Verseifung des Seitenkettenesters, beispielsweise mit Kaliumcarbonat, und Reduktion des Ketons, beispielsweise mit Natriumborhydrid, in beliebiger Reihenfolge ergibt ein 2-Nitro-4-(ω-Hydroxyalkoxy)- 5-alkoxybenzylalkohol.
Der selektive Schutz des Seitenkettenalkohols als der korrespondierende 4,4'-Dimethoxytritylether wird anschließend durch Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid erreicht. Weitere Reaktion, beispielsweise mit 2-Cyanoethyl-diisopropyl­ chlorphosphoramidit ergibt die Linker, bei denen R22 (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist.
Ein spezielles Beispiel der Synthese eines photospaltbaren Linkers von Formel II ist im folgenden Schema gezeigt. Das Schema soll lediglich eine Veranschaulichung sein und in keiner Weise den Umfang der Methoden hier einschränken.
Herstellung von photospaltbaren Linkem von Formel III
Photospaltbare Linker von Formel III können durch die hier offenbarten Verfahren, durch geringfügige Modfikation der Verfahren, indem geeignete Ausgangsmaterialien gewählt werden, oder durch andere dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden.
Im allgemeinen werden photospaltbare Linker gemäß Formel III aus ω-Hydroxyalkyl- oder Alkoxyarylverbindungen hergestellt, insbesondere aus ω-Hydroxy-alkyl oder Alkoxybenzolen. Diese Verbindungen sind kommerziell erhältlich oder können entweder aus einem ω-Hydroxyalkylhalogenid, beispielsweise 3-Hydroxypropylbromid, hergestellt werden oder aus Phenyllithium (für die ω-Hydroxyalkylbenzole) oder Phenol (für die ω-Hydroxyalkoxybenzole). Acylierung der ω-Hydroxygruppe, beispielsweise als ein Acetatester, gefolgt von Friedel-Crafts-Acylierung des aromatischen Rings mit 2- Nitrobenzoylchlorid stellt ein 4-(ω-Acetoxy-alkyl oder Alkoxy)- 2-Nitrobenzophenon bereit. Reduktion des Ketons, beispielsweise mit Natriumborhydrid, und Verseifung des Seitenkettenesters werden in beliebiger Reihenfolge durchgeführt, um ein 2- Nitrophenyl-4-(hydroxy-alkyl oder Alkoxy)phenylmethanol zu ergeben. Schutz der terminalen Hydroxylgruppe als der entsprechende 4,4'-Dimethoxytritylether wird durch Reaktion mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid erreicht. Anschließend wird die benzylische Hydroxylgruppe umgesetzt, beispielsweise mit 2- Cyanoethyl-diisopropyl-chlorphosphoramidit, um Linker gemäß Formel III zu ergeben, in denen R23 (Dialkylamino)-(ω- Cyanoalkoxy)P- ist.
Andere photospaltbare Linker gemäß Formel III können hergestellt werden, indem 2-Phenyl-1-propanol oder 2- Phenylmethyl-1-propanol durch die ω-Hydroxy-alkyl- oder Alkoxybenzole in der obigen Synthese ersetzt werden. Diese Verbindungen sind kommerziell erhältlich, können jedoch ebenfalls durch Reaktion, beispielsweise von Phenylmagnesiumbromid oder Benzylmagnesiumbromid mit dem erforderlichen Oxiran (Propylenoxid) in der Gegenwart von katalytischen Kupferionen hergestellt werden.
Chemisch spaltbare Linker
Eine Vielzahl chemisch spaltbarer Linker kann ebenfalls verwendet werden, um ein Polypeptid mit einem festen Träger zu verbinden. Säurelabile Linker sind besonders verwendbare, chemisch spaltbare Linker für die Massenspektrometrie, insbesondere für MALDI-TOF, da die säurelabile Bindung während des Konditionieren des Targetpolypeptids nach Zugabe einer 3- HPA Matrixlösung gespalten wird. Die säurelabile Bindung kann als separate Linkergruppe eingeführt werden, beispielsweise eine säurelabile Tritylgruppe, oder kann in einen synthetischen Linker eingebaut werden, indem eine oder mehrere Silylbrücken mittels Diisopropylsilyl eingeführt werden, wodurch eine Diisopropyl-silylverbindung zwischen dem Polypeptid und dem festen Träger gebildet wird. Die Diisopropylsilylverbindung kann mittels mild saurer Bedingungen, wie 1,5% Trifluoressigsäure (TFA) oder 3-HPA/1% TFA MALDI-TOF- Matrixlösung gespalten werden. Verfahren für die Herstellung von Diisopropylverbindungen und Analoga davon, sind im Stand der Technik wohlbekannt (siehe zum Beispiel Saha et al., J. Org. Chem. 58: 7827-7831 (1993)).
Wie hier offenbart wird, kann ein interessierendes Polypeptid mit einem festen Träger wie einem Kügelchen, konjugiert werden. Des weiteren kann ein erster fester Träger wie ein Kügelchen ebenfalls, falls gewünscht, durch jedes geeignete Mittel, einschließlich derjenigen, die hier für die Konjugation eines Polypeptids mit einem Träger offenbart sind, mit einem zweiten festen Träger konjugiert werden, der ein zweites Kügelchen oder ein anderer Träger sein. Demzufolge kann jedes der Konjugationsverfahren und Mittel, die hier bezogen auf die Konjugation eines Polypeptids mit einem festen Träger offenbart sind, ebenfalls für die Konjugation eines ersten Trägers mit einem zweiten Träger angewandt werden, wobei der erste und der zweite feste Träger dieselben oder unterschiedlich sein können.
Geeignete Linker, die Quervernetzungsmittel sein können, zur Verwendung für die Konjugation eines Polypeptids mit einem festen T 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019882657 00004 99880räger schließen eine Vielzahl von Reagenzien ein, die mit einer funktionellen Gruppe, die auf der Oberfläche des Trägers vorkommt, oder mit dem Polypeptid oder beiden reagieren kann. Als Quervernetzungsmittel verwendbare Reagenzien schließen homobifunktionelle und insbesondere heterobifunktionelle Reagenzien ein. Verwendbare bifunktionelle Quervernetzungsmittel schließen N-Succinimidyl(4- iodacetyl)aminobenzoat (STAB), Dimaleimid, Dithio-bis- nitrobenzoesäure (DTNB), N-Succinimidyl-S-acetyl-thioacetat (SATA), N-Succinimidyl-3-(2-Pryridyldithio)propionat (SPDP), Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) und 6-Hydrazino-Nicotimid (HYNIC) ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Ein Quervernetzungsmittel kann ausgewählt werden, um eine selektiv spaltbare Bindung zwischen einem Polypeptid und dem festen Träger bereitzustellen. Beispielsweise kann ein photolabiler Linker wie 3-Amino-(2-nitrophenyl)propionsäure (Brown et al., Molec. Divers. 4-12 (1995); Rothschild et al. Nucl. Acids Res. 24: 351-66 (1996); US-Patent Nr. 5,643,722) als ein Mittel zum Abspalten eines Polypeptids von einem festen Träger verwendet werden. Andere Quervernetzungsmittel sind im Stand der Technik wohlbekannt (siehe zum Beispiel, "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking" (CRC Press 1991); Hermanson, supra, 1996).
Ein Polypeptid kann auf einem festen Träger wie einem Kügelchen durch eine kovalente Amidbindung immobiliert werden, die zwischen einem mit einer Carboxylgruppe funktionalisiertem Kügelchen und dem Aminoterminus des Polypeptids gebildet wird, oder umgekehrt durch eine kovalente Amidbindung, die zwischen einem mit einer Aminogruppe funktionalisiertem Kügelchen und dem Carboxyterminus des Polypetids gebildet wird.
Des weiteren kann ein bifunktioneller Trityllinker an den Träger angefügt werden, beispielsweise an einen 4-Nitrophenyl aktiven Ester auf einem Harz wie ein Wang-Harz durch eine Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe auf dem Harz mittels eines Aminoharzes. Unter Verwendung einer bifunktionellen Trityl- Vorgehensweise kann der feste Träger die Behandlung mit einer flüchtigen Säure, wie Ameisensäure oder Trifluoressigsäure erfordern, um sicherzustellen, daß das Polypeptid gespalten wird und entfernt werden kann. In solch einem Fall kann das Polypeptid als Patch ohne Kügelchen auf dem Boden einer Vertiefung eines festen Trägers oder auf der ebenen Oberfläche eines festen Trägers, abgeschieden werden. Nach Zugabe einer Matrixlösung kann das Polypeptid in ein Massenspektrometer hinein desorbiert werden.
Hydrophobe Trityllinker können ebenfalls als säurelabile Linker ausgenutzt werden, indem eine flüchtige Säure oder eine geeignete Matrixlösung, beispielsweise eine 3-HTA enthaltende Matrixlösung verwendet wird, um eine aminoverküpfte Tritylgruppe von dem Polypeptid abzuspalten. Die Säurelabilität kann ebenfalls verändert werden. Beispielsweise kann Trityl, Monomethoxytrityl, Dimethoxytrityl oder Trimethoxytrityl zu dem geeigneten p-substituierten oder säurelabileren Tritylaminderivaten des Polypeptids verändert werden; d. h. Tritylether- und Tritylaminbindungen können zu dem Polypeptid ausgebildet werden. Demzufolge kann ein Polypeptid von einem hydrophoben Linker entfernt werden, beispielsweise indem die hydrophobe Anziehung auseinandergetissen wird oder indem Tritylether- oder Tritylaminbindungen unter sauren Bedingungen gespalten werden, einschließlich, falls gewünscht, unter typischen massenspektrometrischen Bedingungen, bei denen eine Matrix wie 3-HTA als Säure wirkt.
Wie hier offenbart, kann ein Polypeptid mit einem festen Träger, beispielsweise einem Kügelchen, konjugiert werden und das Kügelchen kann, entweder vor, während oder nach der Konjugation des Polypeptids mit einem zweiten festen Träger konjugiert werden, wobei eine oder beide Konjugationen zu der Ausbildung einer säurelabilen Bindung führt. Beispielsweise kann die Verwendung eines Trityllinkers eine kovalente oder eine hydrophobe Konjugation bereitstellen und unabhängig von der Art der Konjugation wird die Tritylgruppe bereitwillig unter sauren Bedingungen abgespalten. Orthogonal spaltbare Linker können ebenfalls zum Binden eines ersten festen Trägers, beispielsweise eines Kügelchens, an einen zweiten festen Träger oder für die Bindung eines Polypeptids von Interesse an einen festen Träger, verwendbar sein. Unter Verwendung eines solchen Linkers kann ein erster fester Träger, beispielsweise ein Kügelchen, selektiv von einem zweiten festen Träger, abgespalten werden, ohne das Polypeptid von dem Träger abzuspalten. Das Polypeptid kann von dem Kügelchen zu einem späteren Zeitpunkt abgespalten werden. Beispielsweise kann ein Disulfidlinker, der unter Verwendung eines Reduktionsmittels wie DTT abgespalten werden kann, verwendet werden, um ein Kügelchen an einen zweiten festen Träger zu binden, und eine säurespaltbare, bifunktionelle Tritylgruppe kann verwendet werden, um ein Polypeptid auf dem Träger zu immobilisieren. Wenn gewünscht, kann die Verbindung des Polypeptids mit dem festen Träger zuerst gespalten werden, was beispielsweise die Verbindung zwischen dem ersten und dem zweiten Träger intakt läßt. Trityllinker können eine kovalente oder hydrophobe Konjugation bereitstellen und unabhängig von der Art der Konjugation wird die Tritylgruppe bereitwillig unter sauren Bedingungen gespalten.
Ein erster fester Träger wie ein Kügelchen kann mit einem zweiten festen Träger mittels der Verfahren, Verbindungen und Konjugationsmittel, die hier offenbart sind, konjugiert werden. Darüber hinaus kann ein Kügelchen beispielsweise an einen zweiten Träger durch eine Verbindungsgruppe gebunden werden, die so ausgewählt werden kann, daß sie eine Länge und eine chemische Natur aufweist, damit eine Bindung der Kügelchen mit hoher Dichte an den festen Träger oder eine Bindung mit hoher Dichte des Polypeptids an den Kügelchen, gefördert wird. Eine solche Verknüpfungsgruppe kann beispielsweise eine "baumartige" Struktur haben, wodurch eine Vielzahl von funktionellen Gruppen pro Verknüpfungsstelle auf dem festen Träger bereitgestellt wird. Beispiele von solchen Verknüpfungsgruppen schließen Polylysin, Polyglutamihsäure, Pentaerythrol und Tris-Hydroxy- Aminomethan ein.
Ein Polypeptid kann mit einem festen Träger konjugiert werden, oder ein erster fester Träger kann ebenfalls zu einem zweiten festen Träger durch eine nicht kovalente Interaktion konjugiert werden. Beispielsweise kann ein magnetisches Kügelchen, das aus einem ferromagnetischen Material hergestellt ist, das fähig ist, magnetisiert zu werden, von einem magnetischen, festen Träger angezogen werden, und kann von dem Träger durch Entfernen des Magnetfelds freigegeben werden.
Alternativ dazu kann der feste Träger mit einer ionischen oder hydrophoben Einheit ausgestattet werden, die die Interaktion einer ionischen bzw. hydrophoben Einheit mit einem Polypeptid, beispielsweise einem Polypetid, das eine angefügte Tritylgruppe enthält, oder mit einem zweiten festen Träger, der hydrophoben Charakter aufweist, erlauben kann.
Ein fester Träger kann ebenfalls mit einem Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ausgestattet werden, und daher mit einem Polypeptid oder einem zweiten festen Träger konjugiert werden, der eine komplementäre Bindungseinheit enthält. Beispielsweise kann ein mit Avidin oder mit Streptavidin beschichtetes Kügelchen an ein Polypeptid gebunden werden, das eine Biotineinheit darin eingebaut hat, oder mit einem zweiten festen Träger, der mit Biotin oder einem Derivat von Biotin wie Iminobiotin beschichtet ist.
Es sollte klar sein, daß jedes der Bindungspaare, die hier offenbart oder anderweitig im Stand der Technik bekannt sind, in Bezug auf die hier angegebenen Beispiele, vertauscht werden kann. Daher kann beispielsweise Biotin entweder in ein Polypeptid oder einen festen Träger eingebaut werden und umgekehrt, eine Avidin oder eine andere Biotin bindende Einheit könnte in den Träger bzw. das Polypeptid eingebaut werden. Andere spezifische Bindungspaare, deren Verwendung hier betrachtet wird, schließen Hormone und deren Rezeptoren, Enzyme und deren Substrate, eine Nukleotidsequenz und deren komplementäre Sequenz, einen Antikörper und ein Antigen, mit dem er spezifisch interagiert und andere solche Paare, die dem Fachmann bekannt sind, ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Die Immobilisierung von einem oder mehreren Polypeptiden von Interesse, insbesondere Targetpolypeptide, erleichtert die Manipulation der Polypeptide. Beispielsweise erleichtert die Immobilisierung der Polypeptide auf einem festen Träger die Isolierung der Polypeptide aus einer Reaktion oder den Transfer der Polypeptide während der Durchführung einer Serie von Reaktionen. Als solche kann die Immobilisierung von Polypeptiden die Konditionierung der Polypeptide, oder die Massenmodifikation der Polypeptide vor der Durchführung der massenspektrometrischen Analyse, erleichtern.
Beispiele von bevorzugten Bindungspaaren oder Linker- Interaktionen werden in der Tabelle angegeben.
Tabelle
Konditionieren eines Polypeptids
Das Konditionieren eines Polypeptids vor der Massenspektrometrie kann die Auflösung eines Massenspektrums des Polypeptids erhöhen, wodurch die Bestimmung der Identität eines Targetpolypetids erleichtert wird. Ein Polypetid kann beispielsweise konidtioniert werden, indem das Polypeptid mit einem Kationen-Austauschermaterial oder einem Anionen- Austauschermaterial behandelt wird, welches die Ladungsheterogenität des Polypeptids verringern kann, wodurch die Peak-Verbreiterung reduziert oder eliminiert wird. Darüber hinaus kann das in Kontakt bringen eines Polypeptids mit einem Alkylierungsmittel wie beispielsweise Alkyliodid, Iodacetamid, Iodethanol oder 2,3-Epoxy-1-propanol die Ausbildung von Disulfidbindungen in dem Polypeptid verhindern, wodurch die Auflösung eines Massenspektrums des Polypeptids erhöht wird. Auf ähnliche Weise können geladene Aminosäuren in ungeladene Derivate umgewandelt werden, indem die Polypeptide mit Trialkylsilyl-chloriden in Kontakt gebracht werden, was die Ladungsheterogenität reduziert und die Auflösung des Massenspektrums erhöht.
Es gibt ebenfalls Mittel die Auflösung zu verbessern, insbesondere für kürzere Peptide, indem modifizierte Aminosäuren eingebaut werden, die basischer als die entsprechenden unmodifizierten Reste sind. Eine solche Modifikation erhöht im allgemeinen die Stabilität des Polypeptids während der massenspektrometrischen Analyse. Ebenfalls können Kationen-Austausch-Chromatographie sowie allgemeine Wasch- und Reinigungsprozeduren, die Proteine und andere Reaktions-Mischungs-Komponenten von dem Targetpolypeptid entfernen, verwendet werden, um das Peptid nach einer in vitro- Translation zu reinigen, und dadurch die Auflösung des Spektrums, das von einer massenspektrometrischen Analyse des Targetpolypeptids resultiert, zu erhöhen.
Die Konditionierung kann ebenfalls den Einbau modifizierter Aminosäuren in das Polypeptid einschließen, beispielsweise von massenmodifizierten Aminosäuren, die die Auflösung eines Massenspektrums erhöhen können. Beispielsweise kann der Einbau eines massenmodifizierten Leucin-Restes in einem interessierenden Polypeptids nützlich sein, um die Auflösung (zum Beispiel durch Erhöhen der Massendifferenz) eines Leucin-Restes von einem Isoleucin-Rest zu erhöhen, wodurch die Bestimmung einer Aminosäuresequenz des Polypeptids erleichtert wird. Eine modifizierte Aminosäure kann ebenfalls eine Aminosäure sein, die eine bestimmte Blockierungsgruppe enthält, wie diejenigen Gruppen, die bei chemischen Verfahren der Aminosäuresynthese verwendet werden. Beispielsweise kann der Einbau eines Glutaminsäure-Rests mit einer Blockierungsgruppe, die an die Carboxylgruppe der Seitenkette angefügt ist, die Masse des Glutaminsäure-Rests modifizieren und bietet den zusätzlichen Vorteil, eine geladene Gruppe aus dem Polypeptid zu entfernen, wodurch die Auflösung eines Massenspektrums eines Polypeptids, das die blockierte Aminosäure enthält, weiter erhöht wird.
Verwendung eines Stiftwerkzeugs zur Immobilisierung eines Polypeptids
Die Immobilisierung eines Polypeptids auf einem festen Träger unter Verwendung eines Stiftwerkzeugs kann besonders vorteilhaft sein. Stiftwerkzeuge schließen die hier offenbarten oder anderweitig im Stand der Technik bekannten, ein (siehe zum Beispiel die anhängige US-Anmeldungen Serien Nr. 08/786, 988 und 08/787, 638 sowie die internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 98/20166).
Ein Stiftwerkzeug in einem Raster, beispielsweise einem 4 × 4 Raster, kann auf Vertiefungen, die Polypeptide von Interesse enthalten, angewendet werden. Wenn das Stiftwerkzeug eine funktionelle Gruppe aufweist, die an jede Stiftspitze angeheftet ist, oder ein festen Träger, beispielsweise funktionalisierte Kügelchen oder paramagnetische Kügelchen, an jeden Stift angeheftet ist, kann das Polypeptid in einer Vertiefung eingefangen werden (≦ 1 pmol Kapazität). Während des Einfangschrittes können die Stifte in Bewegung gehalten werden (vertikal, 1-2 mm Entfernung), um die Effizienz des Einfangens zu erhöhen. In Fällen, wo eine Reaktion wie eine in vitro Transkription, in den Vertiefungen durchgeführt wird, kann die Bewegung der Stifte die Effizienz der Reaktion erhöhen.
Polypetide von Interesse, insbesondere Targetpolypeptide, werden aufgrund des Kontaktes mit dem Stiftwerkzeug immobilisiert. Eine weitere Immobilisierung kann sich ergeben, indem ein elektrisches Feld an das Stiftwerkzeug angelegt wird. Wenn eine Spannung an das Stiftwerkzeug angelegt wird, werden die Polypeptide, abhängig von ihrer Nettoladung, von der Anode oder der Kathode angezogen. Ein solches System kann zur Isolierung der Polypeptide verwendbar sein, da ungeladenen Moleküle in Lösung verbleiben, und Moleküle, die eine zur Nettoladung der Polypeptide entgegengesetzte Ladung aufweisen, werden zu dem gegenüberliegenden Pol (Anode oder Kathode) angezogen. Für eine größere Spezifität kann das Stiftwerkzeug (mit oder ohne Spannung) so modifiziert werden, daß ein für ein Polypeptid von Interesse spezifisches Reagenz daran konjugiert wird, so daß nur die Polypeptide von Interesse, an die Stifte gebunden werden. Beispielsweise können die Stifte angefügte Nickel-Ionen aufweisen, so daß nur Peptide, die eine Polyhistidinsequenz enthalten, gebunden werden. Auf ähnliche Weise können die Stifte für ein Targetpolypeptid spezifische Antikörper daran angeheftet haben, oder an Kügelchen, die wiederum an die Stifte angeheftet sind, so daß nur die Targetpolypeptide, die das Epitop enthalten, das von dem Antikörper erkannt wird, von den Stiften gebunden wird.
Verschiedene Stift-Konfirmationen schließen beispielsweise eine Konfiguration fester Stifte ein, oder Stifte mit einem Kanal oder einem Loch durch das Zentrum, das eine optische Faser zur massenspektrometrischen Detektion beherbergen kann. Der Stift kann eine flache Spitze haben oder jeder der Zahl von Konfigurationen, einschließlich Nanovertiefungen, konkav, konvex, verkürzt konisch oder verkürzt pyramidal, beispielsweise eine Größe von 4 bis 800 µm quer × 100 µm in der Tiefe. Die einzelnen Stifte, die jede gewünschte Größe haben können, sind im allgemeinen ungefähr 10 mm lang, üblicherweise 5 mm lang, und insbesondere ungefähr 1 mm lang. Die Stifte und die Mounting-Platte können aus Polystyrol hergestellt werden, das ein einzelnes durch Spritzguß erhaltenes Teil sein kann. Polystyrol ist für diese Verwendung nützlich, da es leicht funktionalisiert werden kann und mit hohen Toleranzen geformt werden kann. Die Stifte in einer Vorichtung des Stiftwerkzeugs können einknickbar sein, beispielsweise gesteuert durch einen scherenartigen Mechanismus, so daß die Nadeln in größere Nähe gebracht werden, was die Größe insgesamt reduziert.
Eingefangene Polypeptide können durch eine Vielzahl von Mitteln analysiert werden, einschließlich beispielsweise spektrometrischer Techniken, wie UV/VIS, IR, Fluoreszenz, Chemilumineszenz, NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie oder anderen im Stand der Technik bekannte Verfahren sowie Kombinationen davon. Falls Bedingungen die direkte Analyse von eingefangenen Polypeptiden ausschließen, können die Polypeptide von den Stiften unter Bedingungen freigegeben oder überführt werden, so daß die Vorteile der Probenkonzentrierung nicht vorlorengehen. Demzufolge können die Polypeptide von den Stiften mittels eines minimalen Volumens eines Elutionsmittel und ohne Verlust von Probe entfernt werde. Wo die Polypeptide an die Kügelchen gebunden sind, die an die Stifte angefügt sind, können die die Polypeptide enthaltenden Kügelchen von den Nadeln entfernt werden und Messungen direkt von den Kügelchen aus durchgeführt werden.
Vor der Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptids durch Massenspektrometrie kann ein Stiftwerkzeug, das das Polypeptid daran angeheftet hat, entfernt werden und mehrmals gewaschen werden, beispielsweise in Amoniumcitrat, um das Polypeptid vor der Zugabe von Matrix zu konditionieren. Die Stifte können anschließend in eine Matrixlösung getaucht werden, deren Matrixkonzentration so eingestellt ist, daß die Matrixlösung nur genau an die Spitzen der Nadeln anhaftet. Alternativ dazu kann das Stiftwerkzeug umgedreht werden und die Matrixlösung auf die Spitze von jeder Nadel mittels einer Miktrotropfen-Vorrichtung gesprüht werden. Die Polypeptide können ebenfalls von den Stiften in eine Nanovertiefung oder einen Chip abgespalten werden, beispielsweise vor der Zugabe von Matrix. Für die direkte Analyse von den Stiften kann eine Edelstahl-"Masken"-Sonde über den. Stiften befestigt werden, anschließend kann die Masken-Sonde in dem Massenspektrometer installiert werden.
Es können zwei Massenspektrometer-Geometrien verwendet werden, um eine Vorrichtung mit dem Stiftwerkzeug aufzunehmen. Eine erste Geometrie beherbergt feste Stifte. Effektiv schmilzt der Laser eine Materialschicht von der Oberfläche der Kristalle ab, so daß die sich ergebenden Ionen beschleunigt werden und durch die Ionenoptik fokussiert werden. Eine zweite Geometrie beherbergt Stifte mit optischen Fasern, in denen der Laser die Proben von hinten trifft. Effektiv wird der Laser auf die rückseitige Platte des Stiftwerkzeugs fokussiert und in eine kurze optische Faser mit einem Durchmesser von ungefähr 100 µm und einer Länge von ungefähr 7 mm, um die Dicke der Rückplatte einzuschließen. Diese Geometrie erfordert, dass die verflüchtigte Probe durch die Tiefe der Matrix/Kügelchen- Mischung hindurchtritt, die Ionen verlangsamt und abkühlt, und zu einer Art von verzögerter Extraktion führt, was die Auflösung der Untersuchung erhöhen kann (siehe zum Beispiel Juhasz et al. (1996) Analysis, Anal. Chem. 68: 941-946, siehe ebenfalls beispielsweise US-Patent Nr. 5,777,325, US-Patent Nr. 5,742,049, US-Patent Nr. 5,654,545, US-Patent Nr. 5,641,959 und US-Patent Nr. 5,760,393 zu Beschreibungen von MALDI und Protokollen zur verzögerten Extraktion.
Die Sonde, durch die die Stifte geführt werden, kann ebenfalls verschiedene Geometrien aufweisen. Beispielsweise kann eine große Sonde mit mehreren Löchern, mit einem für jede Nadel, über das Stiftwerkzeug gebracht werden und der ganze Aufbau wird in der X-Y-Achse in dem Massenspektrometer verschoben. Die Sonde kann ebenfalls eine befestigte Sonde mit einem einzelnen Loch sein, das groß genug ist, um ein adequates elektrisches Feld zu ergeben, jedoch klein genug, um zwischen die Stifte zu passen. Das Stiftwerkzeug wird dann in allen drei Achsen verschoben, wobei jeder Stift durch das Loch zur sequentiellen Analyse eingeführt wird. Das letztere Format ist für ein Stiftwerkzeug mit hoher Dichte geeigneter, beispielsweise einem Stiftwerkzeug auf Basis eines 384- Vertiefungs- oder einem Mikroplatten-Format mit höherer Dichte. Diese beiden Sonden sind für die zwei oben offenbarten Massenspektrometergeometrien geeignet.
Stiftwerkzeuge können zur Immobilisierung von Polypeptiden von Interesse auf eine räumlich adressierbare Weise auf einem Raster verwendbar sein. Solche räumlich adressierbaren oder vor-adressierbaren Raster sind bei einer Vielzahl von Verfahren verwendbar, einschließlich beispielsweiseder Qualitätskontrolle und Diagnose der Aminosäuresequenzierung. Die Stiftwerkzeuge, die in den anhängigen US-Anmeldungen, Seriennummern 08/786,988 und 08/787, 639 sowie der internationalen PCT-Anmeldung Nr. WO 98/20166 beschrieben sind, sind serielle und parallele Verteilungswerkzeuge, die eingesetzt werden können, um Multi- Element-Raster von Polypeptiden auf einer Oberfläche eines festen Trägers zu generieren. Die Raster-Oberfläche kann eben sein, mit Kügelchen oder geometrisch verändert, um Vertiefungen aufzuweisen, die Kügelchen enthalten können. Ein Stiftwerkzeug, das die parallele Entwicklung eines Proben-Raster ermöglicht, wird bereitgestellt. Ein solches Werkzeug ist ein Zusammenbau von Vesikel-Elementen oder Stiften, wobei jeder der Stifte eine enge Innenkammer einschließen kann, die zum Aufbewahren von Nanoliter-volumina von Flüssigkeiten geeignet ist. Jede der Nadeln paßt in ein Gehäuse, das eine Innenkammer besitzt. Das Innengehäuse kann mit einer Druckquelle verbunden sein, die den Druck innerhalb der Innengehäusekammer kontrollieren kann, um den Fluß von Flüssigkeit durch die Innenkammer der Nadel zu regulieren, wodurch eine kontrollierte Verteilung von definierten Flüssigkeitsvolumina aus dem Vesikel erlaubt wird.
Das Stiftwerkzeug kann ebenfalls eine Düseneinheit aufweisen, die einen Kapillarstift mit einer Innenkammer einschließen kann sowie ein Wandlerelement, das an dem Stift montiert ist und in der Lage ist, Flüssigkeit durch die Innenkammer des Stiftes zu treiben, um die Flüssigkeit aus dem Stift auszustoßen. Auf diese Weise kann das Werkzeug einen Spot (Fleck) der Flüssigkeit auf einer Trägeroberfläche verteilen, indem es die Flüssigkeit aus dem Stift heraussprüht. Das Wandlerelement kann ebenfalls bewirken, daß ein Tropfen der Flüssigkeit aus der Kapillare austritt, so daß Flüssigkeit auf das Raster oder eine anderen festen Träger übertragen werden kann, indem der Tropfen mit der Oberfläche des Rasters in Kontakt tritt. Das Stiftwerkzeug kann ebenfalls ein Rasrer von Polypeptiden ausbilden, indem die Polypeptide in eine Serie von Schritten verteilt werden, während sich der Stift zu unterschiedlichen Stellen oberhalb der Rasteroberfläche bewegt, um das Probenraster auszubilden. Das Stiftwerkzeug kann anschließend präparierte Polypeptidraster auf eine Plattenanordnung übertragen, die die Raster für die Analyse durch Massenspektrometrie abgibt, was einen Satz von Spektralsignalen erzeugt, die die Zusammensetzung der zu analysierenden Polypeptide anzeigt.
Das Stiftwerkzeug kann ebenfalls ein Gehäuse aufweisen, das eine Vielzahl von Seiten- und Bodenbereichen hat, in denen eine Vielzahl von Öffnungen gebildet sind, wobei die Wände und der Bodenbereich des Gehäuses ein Innenvolumen definieren; ein oder mehrere flüssigkeitsdurchlässige Vesikel oder Stifte, die innerhalb der Öffnungen montiert sind, die eine für Nanovolumen ausgebildete Flüssigkeitsaufbewahrungskammer zum Aufbewahren von Nanovolumina von Flüssigkeit aufweisen, wobei die Flüssigkeitsaufnahmekammer in Flüssigskommunikation mit dem Innenvolumen des Gehäuses steht, und ein Abgabeelement, das in Verbindung steht mit dem Innenvolumen des Gehäuses, um selektiv Nanovolumina von Flüssigkeit aus den flüssigkeitsdurchlässigen Vesikeln mit Nanovolumengröße abzugeben, wenn sich die Flüssigkeit in den Flüssigkeitsaufnahmekammern der Vesikel befindet. Dies ermöglicht dem Abgabeelement, Nanovolumina der Flüssigkeit auf der Oberfläche des Trägers zu verteilen, wenn die Vorrichtung oberhalb und passgenau mit dem Träger angeordnet ist.
Das flüssigkeitsdurchlässige Vesikel kann ein offenes proximales Ende aufweisen und einen distalen Spitzenbereich, der sich überhalb des Bodenbereiches des Gehäuses erstreckt, wenn er innerhalb der Öffnungen montiert ist. Dadurch kann das offene proximale Ende die Flüssigkeitsaufbewahrungskammer in Flüssigkeitsverbindung mit dem inneren Volumen bringen, wenn es an die Öffnungen montiert ist. Gegebenenfalls sind die Vielzahl von flüssigkeitsdurchlässigen Vesikel entfernbar und auswechselbar innerhalb der Öffnungen des Gehäuses montiert oder können alternativ eine Klebstoffabdichtung zur festen Montage der Vesikel innerhalb des Gehäuses aufweisen.
Die Flüssigkeitsaufnahmekammer kann ebenfalls eine enge Bohrung aufweisen, die in ihren Abmessungen so angepaßt ist, daß sie mit Flüssigkeit durch Kapillarwirkung gefüllt wird und kann so bemessen sein, um im wesentlichen vollständig mit der Flüssigkeit durch Kapillarwirkung gefüllt zu werden. Die Vielzahl von flüssigkeitsdurchlässigen Vesikeln schließen eine Anordnung (Array) von flüssigkeitsabgebenden Nadeln ein, die aus Metall, Glas, Silicium, polymerem Material oder jedem geeigneten Material ausgebildet sein können, und daher wie hier offenbart, ebenfalls als ein fester Träger dienen können.
Das Gehäuse kann ebenfalls einen oberen Bereich aufweisen und mechanische Vorspannelemente, um die Mehrzahl von flüssigkeitsdurchlässigen Vesikeln in Dichtungskontakt mit dem unteren Gehäusebereich vorzuspannen. Darüber hinaus kann jedes flüssigkeitsdurchlässige Vesikel einen proximalen Endabschnitt aufweisen, der einen Flansch aufweist und ferner ein Dichtungselement aufweist, das zwischen dem Flansch und einer inneren Oberfläche des Bodenbereiches des Gehäuses angeordnet ist, um eine Abdichtung zwischen dem Innenvolumen und einer externen Umgebung zu bilden. Die Vorspannelemente können mechanisch sein und können eine Vielzahl von Federelementen aufweisen, von denen jedes mit einem Ende an das proximale Ende von jeder der Vielzahl von flüssigkeitsdurchlässigen Vesikeln gekoppelt ist, und am anderen Ende mit einer inneren Oberfläche des oberen Bereiches des Gehäuses. Die Federn können eine mechanische Vorspannkraft auf das proximale Ende der Vesikel ausüben, um die Dichtung zu bilden.
Das Gehäuse kann ebenfalls einen oberen Bereich aufweisen sowie ein Befestigungselement, um den oberen Bereich des Gehäuses an dem unteren Bereich des Gehäuses zu befestigen. Das Befestigungselement kann eine Vielzahl von Öffnungen zur Aufnahme von Befestigungselementen aufweisen, die innerhalb des oberen und unteren Bereiches des Gehäuses ausgebildet sind, und eine Vielzahl von Befestigungselementen, um den oberen Abschnitt und den unteren Bereich des Gehäuses aneinander zu befestigen.
Das Abgabeelement kann eine Druckquelle aufweisen, die in Flüssigkeitsverbindung mit dem Innenvolumen des Gehäuses steht, um das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen. Wo die flüssigkeitsdurchlässigen Vesikel durch Kapillarwirkung gefüllt werden sollen, kann das Abgabeelement außerdem eine Druck-Steuereinrichtung aufweisen, die die Druckquelle variieren kann, um das Innenvolumen des Gehäuses in variierende Druckzustände zu bringen. Dies ermöglicht dem Regelelement der Steuereinrichtung das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen, der ausreicht, um die Kapillarwirkung zu kompensieren und die Fluidaufnahmekammer jeder Vesikel bis zu einer vorgegebenen Höhe zu füllen, die einer vorgegebenen Fluidmenge entspricht. Außerdem kann die Steuereinrichtung ein Fluidauswahlelement zum selektiven Entleeren einer ausgewählten Nanovolumen-Fluidmenge aus der Kammer jeder Vesikel aufweisen. Weiterhin wird eine Drucksteuereinrichtung bereitgestellt, die unter der Steuerung eines Computerprogramms arbeitet, das in einem Datenverarbeitungssystem abläuft, um eine variable Steuerung über den an der Innenkammer des Gehäuses anliegenden Druck bereitzustellen.
Das fluiddurchlässige Vesikel kann ein proximales Ende aufweisen, das sich zum Innenvolumen des Gehäuses hin öffnet, und die Fluidaufnahmekammern der Vesikel sind so bemessen, daß sie sich im wesentlichen vollständig durch Kapillarwirkung mit dem Fluid füllen, ohne am proximalen offenen Ende einen Meniskus zu bilden. Wahlweise kann die Vorrichtung mehrere Vesikeln aufweisen, wobei ein erster Teil der mehreren Vesikeln Fluidaufnahmekammern einer ersten Größe und ein zweiter Teil Fluidaufnahmekammern einer zweiten Größe aufweist, wodurch mehrere Fluidvolumina abgegeben werden können.
Die Vorrichtung kann ebenfalls ein Fluidauswahlelement mit einer Druckquelle aufweisen, die mit dem Gehäuse gekoppelt ist und in Verbindung mit dem Innenvolumen steht, um das Innenvolumen in einen ausgewählten Druckzustand zu bringen, sowie ein mit der Druckquelle gekoppeltes Einstellelement zum Variieren des Drucks im Innenvolumen des Gehäuses, um an die Fluidkammer jeder der fluiddurchlässigen Vesikeln einen Überdruck anzulegen und die daraus abgegebene Fluidmenge zu variieren. Das Auswahlelement und das Einstellelement können Computerprogramme sein, die in einem Datenverarbeitungssystem ablaufen, das den Betrieb einer mit der Innenkammer verbundenen Drucksteuereinrichtung lenkt.
Die Vorrichtung mit Stiftwerkzeug kann zur Abgabe eines Fluids, das ein Polypeptid, insbesondere ein Targetpolypeptid von Interesse enthält, in eine oder mehrere Vertiefungen eines Mehrkavitätensubstrats verwendet werden. Die Vorrichtung kann ein Gehäuse mit mehreren Seiten und einem unteren Abschnitt, in dem mehrere Öffnungen ausgebildet sind, aufweisen, wobei die Wände und der untere Abschnitt ein Innenvolumen definieren; eine Mehrzahl von fluiddurchlässige Vesikeln, die innerhalb der Öffnungen montiert sind und eine Fluidaufnahmekammer aufweisen, die mit dem Innenvolumen des Gehäuses in Verbindung steht, und eine Fluidauswahl- und Abgabeeinrichtung, die mit dem Innenvolumen des Gehäuses in Verbindung steht, zur variablen Auswahl einer in die Fluidaufnahmekammern der Vesikeln eingefüllten Fluidmenge, die aus einer einzigen Gruppe der mehreren fluiddurchlässigen Vesikeln abzugeben ist. Demzufolge geben die Abgabemittel eine ausgewählte Menge der Flüssigkeit in die Vertiefungen einer Vorrichtung mit mehreren Kavitäten ab, wenn die Vorrichtung oberhalb und passgenau mit der Vorrichtung angebracht wird.
Die Flüssigkeitsabgabevorrichtung zum Abgeben einer ein Polypeptid von Interesse enthaltenden Flüssigkeit in eine oder mehrere Vertiefungen einer Vorrichtung mit mehreren Kavitäten kann ein Gehäuse aufweisen, das eine Vielzahl von Seiten-, oberen und unteren Bereichen aufweist, wobei im Bodenbereich eine Vielzahl von Öffnungen ausgebildet sind, und die Wände und oberen und Bodenbereiche des Gehäuses ein Innenvolumen definieren, eine Vielzahl von flüssigkeitsdurchlässigen Vesikeln, die innerhalb der Öffnung montiert sind, mit einer Flüssigkeitsaufnahmekammer, die ausgelegt ist, um Nanovolumina der Flüssigkeit aufzubewahren, wobei die Flüssigkeitsaufbewahrungskammer in Flüssigkeitsverbindung mit dem Volumen des Gehäuses angebracht ist und mechanische Vorspannelemente, um die Vielzahl von flüssigkeitsdurchlässigen Vesikeln in abdichtendem Kontakt mit dem Bodenbereich des Gehäuses mechanisch zu verspannen.
Bestimmung des Masse des Polypeptides durch Massenspektrometrie
Die Identität eines isolierten Targetpolypeptides wird mittels Massenspektrometrie bestimmt. Für die massenspektrometrische Analyse kann das Targetpolypeptid in einem geeigneten Lösungsmittel- oder Reagenziensystem solubilisiert werden. Die Auswahl eines Lösung- oder des Reagenziensystems, beispielsweise einem organischen oder anorganischen Lösungsmittel, hängt von den Eigenschaften des Targetpolypeptides und der Art der durchgeführten Massenspektrometrie ab und fußt auf im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren (siehe z. B., Vorm et al., Anal. Chem. 66: 3281 (1994) für MALDI; Valaskovic et al., Anal. Chem. 67: 3802 (1995) für ESI). Die Massenspektrometrie von Peptiden wird ebenfalls beispielsweise in der internationalen PCT- Anmeldung WO 93/24834 von Chait et al. sowie im US-Patent 5,792,664 beschrieben.
Ein Lösungsmittel wird so ausgewählt, um das Risiko, daß das Targetpolypeptid durch die für den Verdampfungsprozeß zugeführten Energie zersetzt wird, beträchtlich zu reduzieren oder gänzlich auszuschließen. Ein verringertes Risiko der Zersetzung des Targetpolypeptides kann beispielsweise erreicht werden, indem die Probe in eine Matrix eingebettet wird, die eine organische Verbindung wie ein Zucker, beispielsweise eine Pentose oder Hexose, oder ein Polysaccharid wie Cellulose sein kann. Solche Verbindungen werden thermolytisch in CO2 und H2O zersetzt, so daß keine Reste gebildet werden, die zu chemischen Reaktionen führen können. Die Matrix kann ebenfalls eine anorganische Verbindung wie Ammoniumnitrat sein, daß zersetzt wird, ohne im wesentlichen Rückstände zu hinterlassen. Die Verwendung von diesen und anderen Lösungsmitteln ist dem Fachmann bekannt (siehe z. B. US-Patent 5,062,935).
Massenspektrometer-Formate zur Verwendung in der Analyse eines Targetpolypeptides schließen Ionisations (I) Techniken wie matrixunterstützte Laserdesorptionen (MALDI), kontinuierliche oder gepulste Elektronenspray (ESI) und verwandte Verfahren wie Ionenspray oder Thermospray und Massive Cluster Impact (MCI) ein ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Solche Ionenquellen können mit Detektionsformaten abgeglichen werden, die lineare oder nicht lineare Reflektron-Flugzeit (TOF), Einfach- oder Mehrfach-Quadrupol, Einfach- oder Mehrfach-Magnetischer-Sektor, Fourier Transforma-Ionen- Cyclotron-Resonanz (FTICR), Ionenfallen, und Kombinationen davon wie Ionenfalle/Flugzeit einschließen. Für die Ionisation können zahlreiche Matrix/Wellenlängenkombinationen (MALDI) oder Lösungsmittelkombinationen (ESI) verwendet werden. Sub-Attomol- Gehalte von Proteinen sind beispielsweise mittels ESI- Massenspektrometrie (Valaskovic, et al., Science 273: 1199-1202 (1996)) und MALDI-Massenspektrometrie ((Li et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 1662-1663 (1996)) detektiert worden.
Die Elektronenmassenspektrometrie ist ebenfalls von Fenn et al., (J. Phys. Chem. 88: 4451-59 (1984); PCT Anmeldung Nr. WO 90/14148) beschrieben worden und jüngste Anmendungen sind in Übersichtsartikeln zusammengefaßt (Smith et al., Anal. Chem. 62: 882-89 (1990); Ardrey, Electrospray Mass Spectrometry, Snectroscopy Europe 4: 10-18 (1992)). MALDI-TOF- Massenspektrometrie ist von Hillenkamp et al., ("Matrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization; A New Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules, Biological Mass Spectrometry", (Burlingame and McClosey, Hrsg., Elsevier Science Publ. 1990), Seiten 49-60) beschrieben worden. Mit ESI ist die Bestimmung von Molekulargewichten in femtomol Probenmengen aufgrund der Anwesenheit von Mehrfach-Ionen-Peaks, von denen alle für die Massenberechnung verwendet werden können, sehr genau.
Die durch Massenspektrometrie bestimmte Masse eines Targetpolypeptides kann mit der Masse eines korrespondierenden bekannten Polypeptides verglichen werden. In dem Fall in dem das Targetpolypeptid ein mutiertes Protein ist, kann beispielsweise das korrespondierende bekannte Polypeptid das korrespondierende normale Protein sein. Auf ähnliche Weise kann in den Fällen, in denen angenommen wird, daß das Targetpolypeptid von einen Gen translatiert wird, das eine anormal hohe Anzahl von Trinucleotidwiederholungen besitzt, das korrespondierende bekannte Polypeptid das korrespondierende Protein mit einer Wildtyp-Anzahl an Wiederholungen, falls es diese gibt, sein. Wo das Targetpolypeptid eine Reihe von sich, wiederholenden Aminosäuren enthält, die direkt mit der Anzahl von Trinukleotidwiederholungen korreliert sind, die von der DNA transkribiert und translatiert werden, kann die Anzahl der sich wiederholenden Trinucleotidwiederholungen in der DNA, die das Polypeptid codiert, von der Masse des Polypeptides abgeleitet werden. Falls gewünscht, kann das Polypeptid vor der Massenspektrometrie wie hier offenbart konditioniert werden, was die Identifizierung des Polypeptides erleichtert.
MALDI
Matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) wird unter dem massenspektrometrischen Verfahren bevorzugt. Verfahren zur Durchführung von MALDI sind dem Fachmann wohl bekannt (siehe beispielsweise). Zahlreiche Methoden zur Verbesserung der Auflösung sind ebenfalls bekannt. Beispielsweise kann die Auflösung bei der MALDT-TOF Massenspektrometrie verbessert werden, indem die Anzahl von hochenergetischen Kollisionen während der Ionenextraktion verringert wird (siehe z. B. Juhasz et al., (1996) Analysis, Anal. Chem. 68: 941-946, siehe z. B. ebenfalls US-Patent 5,777,325, US-Patent Nr. 5,742,049, US-Patent Nr. 5,654,545, US-Patent Nr. 5,641,959, US-Patent Nr. 5,645,545, US-Patent 5,760,393 sowie US-Patent Nr. 5,760,393 für Beschreibungen von MALDI und Protokollen zur verzögerten Extraktion).
Aminosequenzierung von Targetpolypeptiden
Ein hier offenbarten Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptides mittels Massenspektrometrie kann durchgeführt werden, indem die Aminosäuresequenz eines Targetpolypeptides oder ein Bereich davon bestimmt wird. Die Aminosäuresequenzierung kann beispielsweise vom Carboxyterminus mittels einer Carboxypeptidase wie Carboxypeptidase Y, Carboxypeptidase P, Carboxypeptidase A, Carboxypeptidase G oder Carboxypeptidase B oder einem anderen Enzym durchgeführt werden, das ein Polypeptid fortschreitend von seinem Carboxyterminus verdaut, oder von N-Terminus des Targetpolypeptides mittels des Verfahrens des Edmann-Abbaus oder mittels einer Aminopeptidase wie Alanin-Aminopeptidase, Leucin-Aminppeptidase, Pyroglutamat-Peptidase, Dipeptidylpeptidase, microsomale Peptidase oder einem anderen Enzym, das ein Polypeptid fortschreitend von seinem Aminotherminus verdaut. Falls gewünscht, kann das Targetpolypeptid mittels eines Enzyms wie Trypsin, Chymotrypsin, Asp-N, Thrombin oder einem anderen geeigneten Enzym zuerst in Peptidfragmente gespalten werden. Die Fragmente können anschließend isoliert werden und der Aminosäuresequentierung durch Massenspektrometrie unterworfen werden, oder es kann ein ineinandergreifender Satz von Deletionsfragmenten des Polypeptides hergestellt werden, indem das Polypeptid für verschiedene Zeiträume in der Gegenwart einer Aminopeptidase oder einer Carboxypeptidase inkubiert wird, und, falls gewünscht, in der Gegenwart von Reagenzien, die die Aktivität einer Peptidase gegenüber dem Polypeptid modifizieren (siehe zum Beispiel US-Patent 5,792,664; internationale Publikation WO 96/36732). Falls gewünscht, kann ein Anhängsel, beispielsweise ein Peptipanhängsel mit einem Fragment eines Targetpolypeptides konjugiert werden. Eine solche Konjugation kann vor oder nach der Spaltung des Polypeptides durchgeführt werden.
Die Aminosäuresequenzierung eines Targetpolypetides kann entweder mit dem freien Polypeptid oder nach der Immobilisierung des Polypeptides auf einem festen Träger durchgeführt werden. Ein Targetpolypeptid kann auf einem festen Träger beispielsweise durch Verbinden des Polypeptides mit dem Träger durch seinen Aminoterminus oder seinem Carboxyterminus immobilisiert werden, oder direkt oder mittels eines Linkers oder Linkern durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, oder hier beschrieben werden, anschließend Behandeln des immobilisierten Polypeptides mit einer für den ungebundenen Therminus spezifischen Exopeptidase. Wo ein Targetpolypeptid an einen festen Träger durch seinen Aminoterminus verbunden ist, kann beispielsweise das immobilisierte Polypeptid mit einer Carboxypeptidase behandelt werden, die das Polypeptid von seinem Carboxyterminus sequenziell abbaut. Wenn das Targetpolypeptid mit einem festen Träger durch seinen Carboxyterminus verbunden ist, kann alternativ dazu das Polypeptid von seinem Aminoterminus, beispielsweise mittels Edmanns Reagenz verdaut werden.
Für die Aminosäuresequenzierung wird das Targetpolypeptid mit der Protease in einer zeitabhängigen Weise behandelt und freigesetzte Aminosäuren werden durch Massenspektrometrie identifiziert. Falls gewünscht, kann der Abbau eines Targetpolypeptides in einer Reaktorvorrichtung durchgeführt werden (siehe internationale Publikation WO 94/21822, veröffentlicht am 29.09.1994), in der das Polypeptid frei in Lösung vorliegen kann und die Protease mobilisiert sein kann, oder in der die Protease frei in Lösung vorliegen kann und das Polypeptid immobilisiert sein kann. Die Reaktionsmischung, die eine freigesetzte Aminosäure enthält, wird in Zeitintervallen oder als ein kontinuierlicher Strom zu einem Massenspektrometer für die Analyse transportiert. Vor der massenspektrometrischen Analyse können die freigesetzten Aminosäuren in ein Reaktionsgefäß zur Konditionierung transportiert werden, die durch Massenmodifikation geschehen kann. Die Bestimmung der Aminosäuresequenz des Targetpolypeptides, insbesondere die Identifizierung einer allelischen Variation in dem Targetpolypeptid, verglichen mit dem korrespondierenden bekannten Polypeptid, kann beispielsweise nützlich sein, um zu bestimmen, ob das Individuum, von dem das Targetpolypeptid erhalten wurde, eine besondere Krankheit oder einen Zustand hat, oder dafür prädispositoniert ist.
Das Polypeptid kann falls gewünscht beispielsweise vor der Sequenzierung durch Massenmodifizierung konditioniert werden. Es sollte allerdings klar sein, daß die Massenmodifikation eines Polypeptides vor dem chemischen oder dem enzymatischen Abbau beispielsweise die Grade oder den Grad des Abbaus beeinflussen kann. Demzufolge weiß der Fachmann, daß der Einfluß der Konditionierung und Massenmodifikation auf den Polypeptidabbau vor dem Beginn der Aminosäuresequenzierung charakterisiert werden sollte.
Ein hier offenbartes Verfahren wird bequemerweise in einem Multiplexingformat durchgeführt, wodurch eine Bestimmung der Identität einer Vielzahl von 2 oder mehreren Targetpolypeptiden in einer einzelnen Prozedur ermöglicht wird. Für das Multiplexing kann eine Population von Targetpolypeptiden durch in vitro Translation synthetisiert werden, wobei jede der Targetnukleinsäuren, die jedes der Targetpolypeptide kodiert, in einer separaten Reaktion, in der Gegenwart von einer oder mehreren massenmodifizierenden Aminosäuren translatiert wird. Die Population von Targetpolypeptiden kann beispielsweise von Targetnukleinsäuren kodiert werden, die verschiedene polymorphe Regionen eines bestimmten Genes repräsentieren. Jede der individuellen Reaktionen kann mittels einer oder mehrerer Aminosäuren durchgeführt werden, die differenziell massenmodifiziert sind, beispielsweise insbesondere unter Verwendung basischer Reste, die differenziell massenmodifiert sind. Nach der Translation ist jedes Targetpolypetid durch die bestimmte massenmodifizierte Aminosäure unterscheidbar.
Eine Vielzahl von Targetpolypeptiden kann ebenfalls beispielsweise aus natürlich vorkommenden Proteinen erhalten werden und durch Multiplexing untersucht werden, vorausgesetzt, daß jede der Vielzahl von Targetpolypeptiden differenziell massenmodifiert ist. Wo beispielsweise eine Vielzahl von Targetpolypeptiden untersucht werden soll, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Polypeptid eine allelische Variante ist, die entweder einen Gly-Rest oder einen Ala-Rest enthält, können die Gly- und Ala-Reste in jedem Polypeptid in der Vielzahl mit einem Massenmarker massenmodifiziert werden, der für das Polypeptid spezifisch ist. Die Identifizierung eines Gly- oder Alarestes mit einer besonderen Masse kann verwendet werdet, um das bestimmte Polypeptid und die Natur des Polymorphismus zu bestimmen.
Aminosäuremodifikationen können während oder nach der in vitro Translation des Targetpolypeptides beeinflußt werden. Beispielsweise kann jede Aminosäure mit einer funktionellen Gruppe an einer Seitenkette mittels dem Fachmann bekannter Verfahren derivatisiert werden. Beispielsweise kann N- Succinimedyl-3(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) verwendet werden, um Sulfhydrylgruppen in Lysinresten einzuführen, wodurch die Masse des Polypeptides im Vergleich zu den unbehandelten Polypeptiden verändert wird.
Identifizierung des Polypeptides durch Vergleich der Masse des Targetpolypeptides mit einem bekannten Polypeptid
Bei anderen Verfahren als demjenigen, bei denen das Polypeptid sequenziert und dadurch identifiziert wird, wird die Identifikation eines Polypeptides durch den Vergleich mit einem Referenz- (oder bekannten) Polypeptid bewirkt. Der die Identität anzeigende Vergleich ist eine Funktion des ausgewählten Referenz-Polypeptides. Das Referenz-Polypeptid kann so ausgewählt werden, daß das Targetpolypeptid entweder eine Masse besitzt, die im wesentlichwn gleich (identisch innerhalb des experimentellen Fehlers) mit dem Referenz- Polypeptid ist, oder eine Masse hat, die sich von dem Referenz- Polypeptid unterscheidet.
Wenn das Referenzpolypeptid durch ein Wildtyp-Allel eines Genes kodiert Wird, das als genetischer Marker dient und die Methode zum Screening auf die Anwesenheit einer Krankheit oder eines Zustandes dient, die (der) durch eine Mutation in diesem Allel angezeigt wird, kann beispielsweise die Anwesenheit der Mutation durch Beobachten einer Differenz zwischen der Masse des Targetpolypeptides und des Referenz-Polypeptides identifiziert werden. Die Beobachtung einer solchen Differenz "identifiziert" dadurch das Polypeptid und zeigt die Anwesenheit des Markers für die Krankheit oder des Zustandes an. Das Ergebnis zeigt die Anwesenheit einer Mutation an.
Wenn alternativ das Referenzpolypeptid durch ein mutiertes Allel eines Genes kodiert wird, das als genetischer Marker dient, und das Verfahren zum Screening auf die Anwesenheit einer Krankheit oder eines Zustandes dient, die (der) durch eine Mutation in demjenigen Allel angezeigt wird, wird die Anwesenheit der Mutation identifiziert, indem kein Unterschied zwischen der Masse des Targetpolypeptides und dem Referenzpolypeptid beobachtet wird. Die Beobachtung von keiner Differenz "identifiziert" dadurch das Polypeptid und zeigt die Gegenwart des Markers der Krankheit oder des Zustandes an. Weiterhin kann dieses Ergebnis Information über die spezifische Mutation bereitstellen.
Identifikation eines Targetpolypeptides auf Basis von Peptidfragmenten des Targetpolypeptides
Ein hier offenbartes Verfahren kann ebenfalls ein Mittel zur Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptides bereitstellen, indem die Massen von definierten Peptidfragmenten des Targetpolypeptides mit den Massen von korrespondierenden Peptidfragmenten eines bekannten Polypeptides verglichen werden. Ein solches Verfahren kann durchgeführt werden, indem beispielsweise das Targetpolypeptid durch in vitro Transiation erhalten wird oder durch in vitro Transkription, gefolgt von Translation einer Nukleinsäure, die das Targetpolypeptid kodiert; in Kontakt bringen des Targetpolypeptides mit mindestens einem Mittel, das zumindest eine Peptidbindung in dem Targetpolypeptid spaltet, beispielsweise einer Endopeptidase wie Trypsin oder einem chemischen Spaltungsmittel wie Cyanbromid, um Peptidfragmente des Targetpolypeptides zu erzeugen; Bestimmen der molekularen Masse von mindestens einem der Peptidfragmente des Targetpolypeptides durch Massenspektrometrie; und Vergleichen der molekularen Masse der Peptidfragmente des Targetpolypeptides mit der molekularen Masse von Peptidfragmenten des korrespondierenden bekannten Polypeptides. Die Massen der Peptidfragmente des korrespondierenden bekannten Polypeptides können entweder in einer parallelen Reaktion mit dem Targetpolypeptid bestimmt werden, wobei das korrespondierende bekannte Polypeptid ebenfalls mit den Mitteln in Kontakt gebracht wird; können mit bekannten Massen für Peptidfragmente des korrespondierenden bekannten Peptides verglichen werden, das mit dem bestimmten Spaltungsmittel in Kontakt gebracht wurde; oder kann aus einer Datenbank mit Sequenzinformationen über Polypeptide mittels Algorithmen, die die molekulare Masse von Peptidfragmenten eines Polypeptides bestimmen, erhalten werden.
Das offenbarte Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptides mittels Durchführung von Massenspektrometrie mit definierten Peptidfragmenten des Targetpolypeptides ist insbesondere auf ein Multiplexingformat anpaßbar. Demzufolge wird ein Verfahren zur Bestimmung der Identität von jedem Targetpolypeptid in einer Vielzahl von Targetpolypeptiden bereitgestellt, indem die Vielzahl von Targetpolypeptiden erhalten wird; jedes Targetpolypeptid mit zumindest einem Mittel in Kontakt gebracht wird, das zumindest eine Peptidbindung in jedem Targetpolypeptid spaltet, um Peptidfragmente von jedem Targetpolypeptid zu erzeugen; Bestimmen der molekularen Masse von zumindest einem der Peptidfragmente von jedem Targetpolypeptid in der Vielzahl durch Massenspektrometrie; und Vergleichen der molekularen Masse der Peptidfragmente von jedem Targetpolypeptid mit der molekularen Masse von Peptidfragmenten eines korrespondierenden bekannten Polypeptides.
Bei der Durchführung eines offenbarten Verfahrens kann es wünschenswert sein, die Targetpolypeptide zu konditionieren. Die Polypeptide können vor der Spaltung konditioniert werden, oder die Peptidfragmente des Targetpolypeptides, das durch Massenspektrometrie untersucht wird, können vor der Massenspektrometrie konditioniert werden. Es kann ebenfalls wünschenswert sein, die Masse des Targetpolypeptids zu modifizieren, insbesondere durch differenzielle Massenmodifikation von jedem Targetpolypeptid, wenn eine Vielzahl von Targetpolypeptiden in einem Multiplexingformat untersucht wird. Die Massenmodifikation kann entweder mit jedem Polypeptid vor dem Inkontaktbringen des Polypeptides mit dem Spaltungsmittel durchgeführt werden, oder mit den Peptidfragmenten des Polypeptides, die durch Massenspektrometrie untersucht werden.
Ein Targetpolypeptid, insbesondere jedes Targetpolypeptid einer Vielzahl von Targetpolypeptiden kann vor der Konditionierung oder Massenmodifizierung des Polypeptides oder vor dem Inkontaktbringen des Polypeptides mit einem Spaltungsmittel auf einem festen Träger immobilisiert werden. Insbesondere kann der feste Träger eine flache Oberfläche sein, oder eine Oberfläche mit Strukturen wie Vertiefungen, so daß jedes der Targetpolypeptide in der Vielzahl in einem Raster angeordnet werden kann, jedes an einer bestimmten Adresse. Im allgemeinen wird ein Targetpolypeptid auf dem festen Träger durch einen spaltbaren Linker wie einem säurelabilen Linker, einen chemisch spaltbaren Linker oder einem photospaltbaren Linker immobilisiert. Nach der Behandlung des Targetpolypeptides können die freigesetzten Peptidfragmente durch Massenspektrometrie analysiert werden, oder die freigesetzten Peptidfragmente können aus der Reaktion gewaschen werden und die verbleibenden immobilisierten Peptidfragmente können beispielsweise durch chemische Spaltung oder Photospaltung, falls geeignet, freigesetzt werden und können durch Massenspektrometrie analysiert werden.
Es kann ebenfalls nützlich sein, ein bestimmtes Targetpolypeptid auf einem Träger sowohl durch den Aminoterminus und den Carboxyterminus beispielsweise mittels eines chemisch spaltbaren Linkers an einem Terminus und einem photospaltbaren Linker an der anderen Ende zu immobilisieren. Auf diese Weise können die Targetpolypeptide, die beispielsweise in einem Raster in Vertiefungen immobilisiert sein können, mit einem oder mehreren Mitteln in Kontakt gebracht werden, die zumindest eine Peptidbindung in den Polypeptiden spalten, anschließend können die internen Peptidfragmente aus den Vertiefungen gewaschen werden, zusammen mit dem Mittel und jedem Reagenz in den Vertiefungen, wodurch ein Peptidfragment des Targetpolypeptides, das auf dem festen Träger durch den chemisch spaltbaren Linker immobilisiert ist und ein zweites Peptidfragment von der entgegengesetzten Seite des Targetpolypeptides, das durch den photospaltbaren Linker immobilisiert ist, zurücklassen wird. Jedes Peptidfragment kann anschließend durch Massenspektrometrie nach der sequenziellen Spaltung der Fragmente untersucht werden, beispielsweise nachdem zuerst der chemisch spaltbare Linker gespalten wird, und anschließend der photospaltbare Linker gespalten wird. Ein solches Verfahren stellt ein Mittel bereit, beide Termini eines Polypeptides zu analysieren, wodurch die Identifikation des Targetpolypeptides erleichtert wird. Es sollte deutlich sein, daß die Immobilisierung eines Targetpolypeptides an beiden Termini durchgeführt werden kann, indem beide Enden des Targetpolypeptides modifiziert werden, wobei ein Terminus modifiziert wird, um die Bildung einer chemisch spaltbaren Verbindung mit dem festen Träger zu ermöglichen und der andere Terminus modifiziert wird, um die Bildung einer photospaltbaren Verbindung mit dem festen Träger zu ermöglichen. Alternativ dazu können die Targetpolypeptide in zwei Bereiche gespalten werden, einen Bereich, der an einem Terminus so modifiziert ist, daß er die Bildung beispielsweise einer chemisch spaltbaren Verbindung ermöglicht, und den zweiten Bereich, der an dem anderen Terminus so modifiziert ist, daß er die Bildung beispielsweise einer photospaltbaren Verbindung ermöglicht. Die zwei Populationen der modifizierten Targetpolypeptide können zusammen auf einem festen Träger immobilisiert werden, der die geeigneten funktionellen Gruppen zur Vervollständigung der Immobilisierung enthält.
Beispielhafte Verwendungen
Es werden hier Verfahren zur Bestimmung der Identität eines Targetpolypeptides offenbart. Die Identität des Targetpolypeptides ermöglicht es, Informationen betreffend die DNA Sequenz, die das Targetpolypeptid kodiert, zu erhalten. Das Targetpolypeptid kann aus einem Eukaryonten wie einem Vertebraten, insbesondere einem Säugetier wie einem Menschen stammen, oder kann aus einem Prokaryonten, einschließlich eines Bakteriums oder eines Virus stammen. Im allgemeinen kann das Polypeptid aus jedem Organismus, einschließlich einer Pflanze stammen.
Ein Targetpolypeptid kann auf einem festen Träger immobilisiert werden, wodurch die Manipulation des Polypeptides vor der Massenspektrometrie erleichtert wird. Ein Targetpolypeptid kann beispielsweise in vitro translatiert werden. Ein solches Verfahren zum Erhalten eines Targetpolypeptides erlaubt auf einfache Weise das Anfügen eines Anhängsels an das Polypeptid, beispielsweise indem ein Fusionspolypeptid des Targetpolypeptides mit einem Peptidanhängsel wie ein Polyhistidinanhängsel hergestellt wird. Die Anwesenheit eines Peptidanhängsel wie ein Polyhistidinanhängsel stellt ein Mittel bereit, das Targetpolypeptid beispielsweise aus der in vitro Translationsreaktion zu isolieren, indem die Mischung über eine Nickelchelatsäule gegeben wird, da Nickel-Ionen spezifisch mit einer Polyhistidinsequenz interagieren. Das Targetpolypeptid kann dann durch Konjugation mit einem festen Träger eingefangen werden, wodurch das Targetpolypeptid immobilisiert wird. Im allgemeinen kann die Konjugation des Polypeptides mit einem festen Träger durch einen Linker vermittelt werden, der wünschenswerte Eigenschaften bereitstellt, wie daß er leicht spaltbar ist, beispielsweise chemisch spaltbar, wärmespaltbar oder photospaltbar. Wie in Fig. 2 gezeigt, kann beispielsweise das Targetpolypeptid an seinem Aminoterminus mit einem festen Träger durch einen Diisopropyllinker immobilisiert werden, der unter sauren Bedingungen wie bei Exposition zu der Matrixlösung 3-HPA für die Massenspektrometrie leicht spaltbar ist. Das weiteren kann die Konjugation eines Polypeptides an einen festen Träger durch Engineering des Polypeptides erleichtert werden, um beispielsweise einen Strang von Lysinresten zu enthalten, die die Konzentration von Aminogruppen erhöht, die verfügbar sind, um mit einem aktivierten Carboxylträger zu reagieren. Natürlich kann ein Polypeptid durch seinen Carboxyterminus mittels eines modifizierten Linkers, der in Fig. 2 gezeigt ist, (siehe Fig. 3) konjugiert werden, oder kann unter Verwendung anderer, hier offenbarter oder anderweitig bekannter Linker konjugiert werden. Das immobilisierte Targetpolypeptid kann anschließend manipuliert werden, beispielsweise durch protolytische Spaltung mittels einer Endopeptidase oder eines chemischen Mittels, wie Cyanbromid, durch sequenzielle Verkürzung von seinem freien Ende mittels einer Exopeptidase oder einer chemischen Reagenz wie Edmanns Reagenz oder durch Konditionierung bei der Präparation für die massenspektrometrische Analyse, beispielsweise durch Kationenaustausch, um die massenspektrometrische Analyse zu verbessern. Ein Vorteil, solche Manipulationen mit einem immobilisierten Polypeptid durchzuführen, ist, daß die Reagenzen und unerwünschten Reaktionsprodukte von dem zurückbleibenden immobilisierten Polypeptid weg gewaschen werden können, das anschließend von dem festen Träger in einer separaten Reaktion abgespalten werden kann, oder das der Massenspektrometrie, insbesondere MALDI-TOF unter Bedingungen unterworden werden kann, die das Polypeptid von dem Träger abspalten, beispielsweise Exposition eines Polypeptides, das mit dem Träger durch einen photospaltbaren Linker verbunden ist, gegenüber dem MALDI-Laser.
Zum Zweck der Konjugationsreaktionen sowie der enzymatischen Reaktionen wird aufgrund sterischer Betrachtungen angenommen, daß die Termini des Targetpolypeptides reaktiver sind als die Seitengruppen der Aminosäuren. Allerdings ist deutlich, daß Aminosäureseitengruppen reaktiver als der relevante Terminus sein können, in einem solchen Fall weiß der Fachmann, daß die Seitengruppe vor der Durchführung der interessieren Reaktion blockiert werden sollte. Verfahren zur Blockierung einer Aminosäureseitengruppe sind wohlbekannt und blockierte Aminosäurenreste sind leicht erhältlich und werden beispielsweise für die chemische Synthese von Peptiden verwendet. In ähnlicher Weise ist deutlich, daß ein interessierender Terminus des Polypeptides beispielsweise aufgrund einer posttranslationalen Modifikation blockiert sein kann, oder innerhalb eines Polypeptides aufgrund einer Sekundär- oder Tertiärkonformation verborgen sein kann. Demzufolge erkennt der Fachmann, daß beispielsweise ein blockierter Aminoterminus eines Polypeptides reaktiv gemacht werden muß, entweder durch Abspaltung der aminoterminalen Aminosäuren oder durch Entfernen der Blockierung der Aminosäure. Wenn der interessierende Terminus innerhalb der Polypeptidstruktur verborgen ist, weiß der Fachmann darüber hinaus, daß das Polypeptid in Lösung auf ungefähr 70 bis 100°C vor der Durchführung einer Reaktion erhitzt werden kann. Es ist beispielsweise deutlich, daß, wenn die durchzuführende Reaktion eine enzymatischen Spaltung ist, die ausgewählten Enzyme bei erhöhten Temperaturen stabil sein sollten. Solche temperaturstabilen Enzyme, beispielsweise thermostabile Peptidasen, einschließlich Carboxypeptidasen und Aminopeptidasen werden aus thermophilen Organismen erhalten und sind kommerziell erhältlich. Wenn es nicht wünschenswert ist, wärme zu verwenden, um einen ansonsten vergrabenen Terminus eines Polypeptides zu exponieren, kann darüber hinaus die Veränderung der Salzbedingungen ein Mittel zur Exposition des Terminus bieten. Beispielsweise kann ein Polypeptidterminus mittels Bedingungen von hoher Ionenstärke exponiert werden, in solchen Fällen wird ein Enzym wie eine Exopeptidase auf Grundlage seiner Toleranz gegenüber Bedingung hoher Ionenstärke ausgewählt.
Abhängig von dem zu detektierenden Targetpolypeptid ermöglichen die offenbarten Verfahren die Diagnose beispielsweise einer genetischen Krankheit oder einer chromosomalen Anormalität; einer Prädisposition gegenüber oder eine frühe Indikation einer Gen beeinflußten Krankheit oder eines Zustandes wie Fettleibigkeit, Artheriosklerosis, Diabetes oder Krebs oder einer Infektion durch einen pathogenen Organismus einschließlich eines Virus, Bakteriums, Parasiten oder Pilzes; oder um Informationen bezüglich der Identität oder der zugrundeliegenden Vererbung bereitzustellen, die beispielsweise auf der einer Analyse von Minisatelliten und Mikrosatelliten basiert, oder bezüglich Kompatiblität, beispielsweise auf Basis der HLA-Phänotyp-Bestimmung.
Ein Verfahren wird hier bereitgestellt zur Detektion von genetischen Läsionen, die durch eine anormale Zahl von Trinukleotidwiederholungen charakterisiert sind, die im Bereich von weniger als 10 bis mehr als 100 zusätzlichen Trinukleotidwiederholungen bezogen auf die Anzahl von Wiederholungen, falls vorhanden, in einem Gen in einem nicht betroffenen Individuum. Krankheiten mit solchen genetischen Läsionen schließen beispielsweise ein Huntingtons Krankheit, Prostatakrebs; SCA-1, fragiles X-Syndrom (Kremer et al., Science 252: 1711-14 (1991); Fu et al., Cell 67: 1047-58 (1991); Hirst et al., J. Med. Genet., 28: 824-29 (1991); myotonische Dystrophie Typ I (Mahadevan et al., 255: 1253-55 (1992); Brook et al., Cell 68: 799-808 (1992)), Kennedys Krankheit (die ebenfalls spinale und bulbäre Muskelatrophie bezeichnet wird; La Spada et al., Nature 352: 770-79 (1991)); Machado-Joseph- Krankheit sowie dentatorubrale und pallidolyusiane Atrophie. Die anormale Anzahl von Tripletwiederholungen kann sich in jeder Region eines Genes befinden, einschließlich einer kodierenden Region, einer nicht kodierenden Region eines Exons, eines Introns oder einem Promoter oder einem anderen regulatorischen Element. Beispielsweise tritt die ausgedehnte Trinucleotidwiederholung, die mit myotonischer Dystrophie assoziiert ist, in der 3' nicht translatierten Region (UTR) des MtPK-Genes auf Chromosom 19 auf. Bei einigen dieser Krankheiten, beispielsweise Prostatakrebs, ist die Anzahl der Trinukleotidwiederholungen positiv mit der Prognose der Krankheit so korreliert, daß eine höhere Anzahl von Trinukleotidwiederholungen mit einer schlimmeren Prognose korreliert.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Identität einer allelischen Variante einer polymorphen Region eines Genes, insbesondere eines humanen Genes, wird ebenfalls bereitgestellt. Alliche Varianten können in der Identität eines einzigen Nukleotids oder Basenpaares differieren, beispielsweise durch Subsitution eines Nukleotides; in zwei oder mehr Nukleotiden oder Basenpaaren; oder in der Anzahl von Nukleotiden beispielsweise aufgrund von Deletionen von Nukleotiden oder von Trinukleotidwiederholungen; oder aufgrund chromosomaler Umlagerungen, wie Translokationen. Spezifische allelische Varianten von polymorphen Regionen sind mit spezifischen Krankheiten assoziiert und korrelieren in einigen Fällen mit der Prognose der Krankheit. Eine spezifische allelische Variante einer polymorphen Region, die mit einer Krankheit assoziiert ist, wird hier als eine "mutierte allelische Variante" bezeichnet und wird als "genetische Läsion" betrachtet.
Ebenfalls wird ein Verfahren zur Bestimmung der genetischen Natur eines Phänotyps oder zur Identifizierung einer Prädisposition gegenüber diesem Phenotyp bereitgestellt. Beispielsweise kann bestimmt werden, ob ein Individuum eine Prädisposition gegenüber einer spezifischen Krankheit oder einem Zustand aufweist, daß heißt, ob das Individuum ein Risiko besitzt oder dieses hat, eine Krankheit oder einen Zustand zu entwickeln, der mit einer spezifischen oder allelischen Varianten einer polymorphen Region eines Genes assoziiert ist. Ein solches Individuum kann identifiziert werden, indem bestimmt wird, ob das Individuum eine allelische Variante trägt, die mit der spezifischen Krankheit oder dem Zustand assoziiert ist. Wenn die Krankheit eine rezessive Krankheit ist, kann weiterhin bestimmt werden, ob das Individuum ein Träger eines rezessiven Alleles, eines Genes ist, das mit der spezifischen Krankheit oder dem Zustand assoziiert ist.
Zahlreiche Krankheiten oder Zustände sind mit einem spezifischen Gen verbunden worden und insbesondere mit einer spezifischen Mutation unter genetischer Läsion eines Genes. Beispielsweise sind hyperproliferatorische Krankheiten wie Krebsarten mit Mutationen in spezifischen Genen assoziiert. Solche Krebsarten schließen Brustkrebs ein, der mit Mutationen in BRCA 1 oder BRCA 2 in Verbindung gebracht worden ist. Mutierte Allele von BRCA 1 sind beispielsweise im US-Patent 5,622,829 beschrieben. Andere Gene wie Tumor-Suppressor-Gene, die bei Mutation mit der Entwicklung von Krebs assoziiert werden, schließen p53 (assoziiert mit vielen Krebsformen); Rb (Retinoblastom); WT1 (Wilms Tumor) and verschiedene Proto- Onkogene wie c-myc und c-fos (siehe Thompson und Thompson, "Genetics in Medicine" 5. Aufl.; Nora et al., "Medical Genetics" 4. Aufl. (Lea und Febiger, Hrsg)). ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Ein hier offenbartes Verfahren kann verwendet werden, DNA- Mutationen zu detektieren, die zu der Translation eines verkürzten Polypeptides führen, wie es zum Beispiel für BRCA 1 und BRCA 2 vorkommt. Die Translation von Nukleinsäureregionen, die eine solche Mutation enthalten, führt zu einem verkürzten Peptid, das leicht von dem korrespondierenden, nicht verkürzten Polypeptid mittels Massenspektrometrie unterschieden werden kann.
Ein hier offenbartes Verfahren kann ebenfalls verwendet werden, um den Genotyp eines Individuums zu bestimmen, beispielsweise eines Individuums, das als Empfänger oder ein Spender eines Organes oder eines Knochenmarktransplantates in Betracht gezogen wird. Beispielsweise kann die Identität von MHC-Allelen, insbesondere HLA-Allelen in einem Individuum bestimmt werden. Die mittels einer solchen Methode erhaltene Information ist nützlich, da die Transplantation eines Transplantates in einem Empfänger, der unterschiedliche Transplantations-Antigene als das Transplatat besitzt, zu einer Abstoßung des Transplantates führen kann und zu "graft versus host disease" bei einer Knochenmarktransplantation führen kann.
Die Antwort eines Individuum auf Medikamente kann durch Variationen in Wirkstoff modifizierenden Systemen wie dem Cytochrom P450 System beeinflußt werden, und die Suszeptibilität gegenüber bestimmten infektiösen Krankheiten kann durch den genetischen Status beeinflußt werden. Daher kann die Identifikation von bestimmten allelischen Varianten verwendet werden, um die potentielle Antwort eines Individuums auf bestimmte Wirkstoffe oder die Empfänglichkeit eines Individuums gegenüber einer Infektionskrankheit vorherzusagen. Gene, die in Pharmacogenetics involviert sind, sind bekannt (siehe z. B., Nora et al., "Medical Genetics" 4. Aufl. (Lea und Febiger, Hrsg.).
Einige polymorphe Regionen müssen nicht mit einer Krankheit oder einem Zustand verbunden sein. Beispielsweise enthalten viele Loci im humanen Genom eine polymorphe Region mit kurzen Tandern-Repeats (STR). STR-Loci enthalten kurze, sich wiederholende Sequenzelemente von 3 bis 7 Basenpaaren Länge. Es wird geschätzt, daß es 200 000 erwartete trimere und tetramere STR s gibt, die in einer Häufigkeit von einem pro 15 kb im humanen Genom vorkommen (siehe z. B. internationale PCT- Anmeldung WO 92/13969 A1; Edward et al., Nucl. Acids Res. 19: 4791 (1991); Beckmann et al., (1992) Genomics 12: 627-631). Annähernd die Hälfte dieser STR-Loci sind polymorph, und stellen daher eine reiche Quelle an genetischen Markern bereit. Die Variation in der Anzahl von Wiederholungseinheiten bei einem bestimmten Locus ist für die beobachtete Polymorphismus- Reminiszenz von variablen Nukleotidtandern-Wiederholungs-(VNTR) Loci verantwortlich (Nakamura et al., (1987) Science 235: 1616-1622); sowie Minisatelliten-Loci (Jeffreys et al. (1985) Nature 314: 67-73), die längere Repeat-Einheiten enthalten und Mikrosatelliten oder Dinukleotid-Wiederholungs-Loci (Luty et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4308; Litt et al. Nucleic Acids Res. 18: 4301;. Litt et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 5921; Luty et al. (1990) Am. J. Genet. 46: 776-783; Tautz (1989) Nucl. Acids Res. 17: 6463-6471; Weber et al. (1989) Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396; Beckmann et al. (1992) Genomics 12: 627-631).
Polymorphe STR-Loci und andere polymorphe Regionen von Genen sind extrem nützliche Marker für die humane Identifikation, Vaterschafts- und Mutterschaftstest, genetische Kartierung, Wanderungs- und Vererbungsstreite, Zygotentest bei Zwillingen, Test auf Inzucht beim Menschen, Qualitätskontrolle von kultivierten Humanzellen, Identifikation von menschlichen Überresten und der Überprüfung von Samenproben, Bluttropfen und anderem Material in der forensischen Medizin. Solche Loci sind ebenfalls nützliche Marker bei der kommerziellen Tierzüchtung in Pflanzenarten und Tieren können durch die Verbindungsanalyse mittels polymorpher DNA-Marker identifiziert werden. Effiziente Verfahren zur Bestimmung der Identität solcher Loci werden hier offenbart.
STR-Loci können mittels PCR unter Verwendung spezifischer Primer-Sequenzen amplifiziert werden, die in den Regionen identifiziert sind, die aufzuspürenden Tandemrepeat flankieren. Allelische Formen dieser Loci werden durch die Anzahl von Kopien der Wiederholungssequenz, die in der amplifizierten Region enthalten ist, unterschieden. Beispiele von STR-Loci schließen Pentanukleotidwiederholungen im humanen CD4 Locus (Edwards et al., Nucl. Acids Res. 19: 4791 (1991); Tetranukleotidwiederholungen in dem humanen Aromatase Cytochrom P-450 Gen (CYP19; Polymeropoulos et al., Nucleic Acids Res. 19: 195 (1991)); Tetranucleotide im Gen der Untereinheit A des humanen Koagulationsfaktor XIII (F13A1; Polymeropoulos et al., Nucl. Acids. Res. 19: 4306 (1991)); Tetranucleotidwiederholungen im F13B Locus (Nishimura et al., Nucl. Acids Res. 20: 1167 (1992)) Tetranucleotidwiederholungen im humanen c-les/fps Proto-Onkogen (FES; Polymeropoulos et al., Nucl. Acids Res. 19: 4018 (1991)); Tetranucleotidwiederholungen im LFL-Gen (Zuliane et al., Nucl. Acids Res. 18: 4958 (1990)); Polymorphismus der Trinucleotidwiederholungen im humanen pankreatischen Phospolipase A-2 Gen (PLA2; Polymeropoulos et al. Nucl. Acids Res. 18: 7468 (1990)); Polymorphismen der Tetranucleotidwiederholungen im VWF Gen (Ploos et al., Nucl. Acids Res. 18: 4957 (1990)); und Tetranucleotidwiederholungen im humanen Thyriod-Peroxidase (hTPO) Locus (Anker et al., Hum. Mol. Genet. 1: 137 (1992)) ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Eine Target-DNA-Sequenz kann Teil einer fremden genetischen Sequenz wie dem Genom eines eindringenden Mikroorganismusses, einschließlich beispielsweise Bakterien und deren Phagen, Viren, Pilze, Protozoen und dergleichen, sein. Die hier bereitgestellten Verfahren sind insbesondere anwendbar, um zwischen verschiedenen Varianten oder Stämmen eines Mikroorganismuses zu unterscheiden, beispielsweise um einen geeigneten therapeutischen Eingriff auszuwählen. Beispiele von krankheitsverursachenden Viren, die Menschen und Tiere infizieren und die mittels eines offenbarten Verfahrens selektiert werden können, schließen ein Retroviridae (zum Beispiel humane Immun-Defizienzviren wie HIV-1, das ebenfalls als HTLV-III, LAV oder HTLV-III/LAV bezeichnet wird; Ratner et al., Nature, 313: 227-284 (1985); Wain Hobson et al. Cell, 40: 9-17 (1985) HIV-2 (Guyader et al., Nature, 328: 662-669 (1987); europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 655 501), sowie andere Isolate wie HIV-LP (internationale Veröffentlichung WO 94/00562), Picornaviridae (Polioviren, Hepatitis A Virus, (Gus et al., I, Intervirology, 20: 1-7 (1983)); Enteroviren, humane Coxsackie-Viren, Rhino-Viren, Echo-Viren, Calcivirdae (z. B. Stämme, die Gastroenteritis verursachen), Togaviridae (z. B. Encephalitis-Viren), Flaviridae (z. B. Dengue-Viren, Enzephalitis-Viren, Gelbfieber-Viren), Coronaviridae (z. B. Corona-Viren), Rhabdoviridae (z. B. vesikuläre Stomatitis- Viren, Tollwut-Viren), Filoviridae (z. B. Ebola-Viren); Paramyxoviridae (z. B. Parainfluenza-Viren, Mumps-Virus, Masern-Virus, respiratorisches Syncytial-Virus); Orthomyxoviridae (z. B. Influenza-Viren); Bungaviridae (z. B. Hantaan-Viren, Bunga-Viren, Phlebo-Viren und Nairo-Viren); Arenaviridae (z. B. Hemoragische Fieber-Viren); Reoviridae (z. B. Reo-Viren, Orbi-Viren und Rota-Viren); Birnaviridae; Hepadnaviridae (z. B. Hepatitis B Virus); Parvoviridae (z. B. Parvo-Viren); Papovaviridae; Hepadnaviridae (Hepatitis B Virus); Parvoviridae (die meisten Adeno-Viren); Papovaviridae (Papillom-Viren, Polyoma-Viren); Adenoviridae (die meisten Adeno-Viren); Herpesviridae (Herpes simplex Virus Typ 1 (HSV-1) und HSV-2, Varicella Zaster Virus, Cytomegalovirus, Herpesviren); Poxviridae (Variola-Viren, Vaccina-Viren, Pocken- Viren); Iridoviridae (z. B. afrikanisches Schweinefieber- Virus); und unklassifizierte Viren (z. B. die ätiologischen Mittel der Spongiform-Enzephalophathien, das Mittel von Delta Hepatitis, von dem angenommen wird, daß es ein zerstörerischer Satellit des Hepatitis B Virus ist), die Mittel von nicht-A, nicht-B Hepatitis (Klasse 1 = intern übertragen; Klasse 2 = parenteral übertragen, d. h. Hepatitis C); Norwalk und verwandte Viren sowie Astro-Viren, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Beispiele von infektiösen Bakterien schließen Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sp. (z. B. M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Gruppe A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Gruppe B Streptococcus), Streptococcus sp. (Viridans-Gruppe), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus sp. (anaerobie Spezies), Streptococcus pneumoniae, Pathogene Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphteriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, und Actinomyces israelli ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Beispiele von infektiösen Pilzen schließen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Andere infektiöse Organismen schließen Protisten wie Plasmodium falciparum und Toxoplasma gondii ein.
Die hier bereitgestellten Verfahren und Kits werden anhand der folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, die in keiner Weise als einschränkend verstanden werden sollen. Der Inhalt aller zitierten Referenzen, einschließlich Literaturstellen, veröffentlichten Patenten, veröffentlichten Patentanmeldungen, die in dieser Anmeldung zitiert sind, werden ausdrücklich durch Bezugnahme darauf hier einbezogen. Die Durchführung der Verfahren verwenden, solange nicht anderweitig angezeigt, übliche Techniken der Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, transgenen Biologie, Mikrobiologie, rekombinanter DNA und Immunologie, die im Bereich des Fachwissens liegen. Solche Techniken sind ausführlich in der Literatur erklärt, siehe z. B., DNA Coning, Band I und II (D. N. Glover Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait Hrsg., 1984); Mullis et al. US-Patent Nr. 4,683,194; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg., 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg., 1984); Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors Mammalian Cells (J. H. Miller und M. P. Calos Hrsg., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Band 154 und 155 (Wu et al., Hrsg.), Immunochemical Methods In Cell Molecular Biology (Mayer und Walker, Hrsg. Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Band I-IV (D. M. Weir und C. C. Blackwell, Hrsg., 1986); Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986). Die folgenden Beispiele sind lediglich zum Zweck der Veranschaulichung aufgenommen und sollen den Umfang der Erfindung nicht beschränken.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt, das genomische DNA, die von Patienten mit spinaler, zerebellarer Ataxie 1 (SCA-1) erhalten worden ist, verwendet werden kann, um Targetpolypeptide zu identifizieren, die durch Trinucleotidwiederholungen kodiert sind, die mit SCA-1 assoziiert sind.
Genomische DNA-Amplifikation
Humane genomische DNA wurde mittels des QIAMP Blut Kits (Qulagen) gemäß Herstellerprotokoll extrahiert. Eine Region der extrahierten DNA, die die mit SCA-1 assoziierte (CAG)- Wiederholung enthält, wurde mittels PCR unter Verwendung von Primern, die modifiziert waren, um eine Transkription-Promotor- Sequenz und eine Region, die für ein His-6 Peptidanhängsel kodiert, zu enthalten, amplifiziert. Der Forward Primer hatte die folgende Nukleotidsequenz, in dem die T7 Promotorsequenz kursiv dargestellt ist und die Basen auf der 5'-Seite des Promotors zufällig sind:
5'-d(GAC TTT ACT TGT ACG TGC ATA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CTG ACC ATG GGC AGT CTG AGC CA) (SEQ ID NO: 6).
Der Rückwärts-Primer hatte die folgende Nukleotidsequenz, in der die Nukleotidsequenz, die das His-6 Peptidanhängsel kodiert, in Fettdruck dargestellt ist, und die ersten sechs 5'- Basen zufällig sind:
Das Reaktionsvolumen betrug insgesamt 50 µl mit 20 µmol Primer pro Reaktion. Taq-Polymerase, einschließlich 10x Puffer, wurde von Boehringer Mannheim erhalten und dNTPs wurden von Pharmacia erhalten. Die Zyklusbedingungen schlossen 5 Minuten bei 94°C ein, gefolgt von 35 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 53°C, 30 Sekunden bei 72°C, mit einer letzten Verlängerungszeit von 2 Minuten bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden mittels des Qiagen QUIAQUICK Kits gereinigt, und die Elution der gereinigten Produkte wurde mittels 50 µl 10 mM Tris- HCl (pH 8) durchgeführt.
Gekoppelte In vitro Transkription und Translation
Die gekoppelte Transkription und Translation wurde unter Verwendung des TNT-Reaktionspuffers (Promega) durchgeführt. Die Reaktionskomponenten wurden in einem Gesamtvolumen von 50 µl aufgetaut und gemäß dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung von 1 µl T7-RNA-Polymerase und 1 pmol-amplifizierter DNA vermischt, mit der Ausnahme, daß unmarkiertes Methionin anstelle von 35S-Methionin verwendet wurde. Die Reaktionsmischung wurde für 90 Minuten bei 30°C inkubiert.
Reinigung des Targetpolypeptids
Das translatierte Polypeptid mit einem His-6 Anhängsel wurde aus der Weizenkeimextrakt-Mischung unter Verwendung des Qiagen QIAEXPRESS Ni-NTA Proteinreinigungssystem gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Kurz gesagt, wurde die Extraktmischung durch Zentrifugation durch eine Spin-Säule gewaschen, die ein Nickel-Nitriloessigsäure-Harz enthält, das das His-6 Peptidanhängsel des Polypeptids durch Affinität einfängt. Das Polypeptid wurde von der Säule mit 100 mM Imidazol eluiert.
Massenspektrometrie
Das translatierte Polypeptid wurde entweder direkt mit Matrix aus der Elutionslösung vermischt oder wurde zuerst lyophilisiert und in 5 µl H2O resuspendiert. Diese Lösung wurde 1 : 1 (v : v) mit Matrixlösung vermischt (konzentrierte Sinnapinsäure in 50/50 v : v Ethanol/H2O) und 0,5 µl der Mischung wurde zu einer Probensonde zur Analyse in einem linearen Fluzeit-Massenspektrometer hinzugegeben, das in verzögertem Ionenextraktionsmodus mit einem Quellenpotential von 25 kV betrieben wurde. Eine interne Kalibrierung wurde für alle Spektren mittels dreier intensiver Matrixionen-Signale erreicht.
Ergebnisse
Genomische DNA wurde wie oben beschrieben von 4 Patienten mit SCA-1 erhalten. Drei der Patienten hatten 10, 15 oder 16 CAG-Wiederholungen und der vierte Patient hatte eine unbekannte Anzahl von Trinukleotid-Wiederholungen.
Eine Region, die die Trinukleotid-Wiederholungen enthält, wurde mittels PCR, unter Verwendung von Primern (SEQ ID Nr. 6 und 7), die an Sequenzen auf jeweils einer Seite der Wiederholungen hybridisierten, amplifiziert. Die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 8) eines PCR-Produkts, das von einer Region, die 10 CAG-Wiederholungen enthielt, ist in Fig. 1A gezeigt und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 8) eines Polypeptids, das von der amplifizierten Nukleinsäure kodiert wird, ist in Fig. 1B gezeigt (SEQ ID Nr. 9).
Die amplifizierte DNA jedes Patienten wurde einer in vitro Transkription und Translation unterworfen, und die Targetpolypeptide wurden auf einer Nickelchromatographie-Säule isoliert. Die massenspektrometrische Analyse der durch die Targetpolypeptide kodierten Peptiden, die durch die 10, 15 und 16 CRG-Wiederholungen kodiert waren, zeigten an, daß diese Peptide eine molekulare Masse von 8238,8, 8865,4 bzw. 8993,6 Dalton besaßen. Das Polypeptid, das von der Nukleinsäure des vierten Patienten kodiert wurde, mit einer unbekannten Anzahl von Trinukleotidwiederholungen, besaß ein Molekulargewicht von 8224,8. Während dieser Wert nicht genau einer Einheitenzahl von Wiederholungen entspricht (10 ist die näheste), ist er konsistent mit der Detektion einer Punkt-Mutation; d. h., der -14-Dalton-Shift für dieses Polypeptid korrespondiert zu einer Ala → Gly-Mutation aufgrund einer C → G-Mutation in einer der Wiederholungen. Dieses Ergebnis zeigt an, daß das offenbarte Verfahren die Identifikation eines Targetpolypeptids ermöglicht, das durch eine genetische Läsion kodiert wird, die mit einer Krankheit assoziiert ist. Des weiteren zeigen die Ergebnisse, daß ein solches Verfahren die Detektion eines Unterschieds einer einzigen Base zwischen zwei Nukleinsäuren ermöglicht.
Die Detektion solcher subtiler Differenzen in den Proteinlängen werden mit elektrophoretischen Methoden selbst bei Verwendung von multiplen, internen Standards nicht reproduzierbar erhalten. Selbst MS-Instrumentierung mit niedrigem Wirkungsgrad ist für ein weitaus bessere Massengenauigkeit als 0,1% in diesem Massenbereich mittels interner Kalibierung befähigt; Instrumentierung mit höheren Witkungsgrad, wie Fourier-Transformations-MS ist zu einer ppm- Massengenauigkeit mit interner oder externer Kalibrierung fähig. Es sei angemerkt, daß der Massenunterschied zwischen den 15 und den 16 Wiederholungseinheiten-Polypeptiden 1,4% beträgt und der 14 Dalton Massen-Shift aufgrund der Punkt-Mutation zwischen den 10 Wiederholungs-Patienten 0,17% beträgt. Es ist deutlich, daß jede dieser Situationen routinemäßig erfolgreich analysiert werden kann.
Beispiel 2 1-(2-Nitro-5-(3-0-4-,4'-dimethoxypropoxy)phenyl)-1-O-((2- cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino)ethan A. 2-Nitro-5-(3-Hydroxypropoxy)benzaldehyd
3-Brom-1-propanol(3,34 g, 24 mmol) wurde in 80 ml wasserfreiem Acetonitril mit 5-Hydroxy-2-nitrobenzaldehyd (3,34 g, 20 mmol), K2CO3 (3, 5 g) sowie KI (100 mg) über Nacht (15 Std.) am Rückfluß erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 150 ml Methylenchlorid wurden hinzugefügt. Die Mischung wurde filtriert und der feste Rückstand wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigte, organische Lösung wurde bis zur Trockne eingedampf und in 100 ml Methylenchlorid gelöst. Die sich ergebende Lösung wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels im Vakkum wurden 4,31 g (96%) des gewünschten Produkts erhalten.
Rf = 0,33 (Dichloromethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol) Maximum: 313, 240 (Schulter), 215 nm; Minimum: 266 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 10.28 (s, 1H), 8.17 (d, 1H), 7.35 (d, 1H), (s, 1H), 4.22 (t, 2H), 3.54 (t, 2H), 1.90 (m, 2H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 189.9, 153.0, 141.6, 134.3, 127.3, 118.4, 114.0, 66.2, 56.9, 31.7.
B. 2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy) benzaldehyd
2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)benzaldehyd (1 g, 4,44 mmol) wurde in 50 ml wasserfreiem Acetonitril aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde 1 ml Triethylamin, 200 mg Imidazol und 0,8 g (5,3 mmol) tBDMSCl hinzugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Methanol (1 ml) wurde zur Beendigung der Reaktion hinzugefügt. Das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt und der feste Rückstand wurde in 100 ml Methylenchlorid gelöst. Die sich ergebende Lösung wurde mit gesättigter Natriumbicarboriatlösung und anschließend mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt. Die Rohmischung wurde mit Methylenchlorid einer Silicagel-Schnell- Säule unterworfen, um 1,44 g (96%) 2-Nitro-5-(3-O-t- butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd zu ergeben.
Rf = 0,67 (Hexan/Ethylacetat, 5/1).
UV (Methanol), Maximum: 317, 243, 215 nm; Minimum: 235, 267 nm
1H NMR (DMSO-d6) δ 10,28 (s, 1H), 8,14 (d, 1H), 7,32 (d, 1H), 7,20 (s, 1H), 4,20 (t, 2H), 3,75 (t, 2H), 1,90 (m, 2H), 0,85 (s, 9H), 0,02 (s, 6H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 189,6, 162,7, 141,5, 134,0, 127,1, 118,2 113,8, 65,4, 58,5, 31,2, 25,5, -3,1, -5,7.
C. 1-(2-Nitro-5-(3-O-butyldimethylsilylpropoxy)phenyl) ethanol
Im Hochvakkuum getrockneter 2-Nitro-5-(3-O-t- butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd (1,02 g, 3 mmol) wurde in 50 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. 2M Trimethyl­ aluminium in Toluol (3 ml) wurde tropfenweise innerhalb 10 Minuten hinzugefügt und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur gehalten. Es wurde für weitere 10 Minuten gerührt und die Mischung wurde in 10 ml eiskaltes Wasser gegoßen. Die Emulsion wurde von der Wasserphase abgetrennt und über 100 g Natriumsulfat getrocknet, um das verbleibende Wasser zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt und die Mischung wurde auf eine Silicagel-Säule mit Gradienten- Methanol in Methylenchlorid aufgetragen. Es wurden 0,94 g (86%) des gewünschten Produkts isoliert.
Rf = 0,375 (Hexan/Ethylacetat, 5/1)
UV (Methanol), Maximum: 306, 233, 206 nm; Minimum: 255, 220 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 8,00 (d, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,00 (d, 1H), 5,49 (b, OH), 5,31 (q, 1H), 4,19 (m, 2H), 3,77 (t, 2H), 1,95 (m, 2H), 1,37 (d, 3H), 0,86 (s, 9H), 0,04 (s, 6H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 162,6, 146,2, 139,6, 126,9, 112,9, 112,5, 64,8, 63,9, 58,7, 31,5, 25,6, 24,9, -3,4, -5,8.
D. 1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol
1-(2-Nitro-5-(3-O-t-butyldimethylsilylpropoxy)phenyl)- ethanol (0,89 g, 2,5 mmol) wurden in 30 ml THF gelöst und 0,5 mmol nBu4NF wurden unter Rühren hinzugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt und das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt. Der zurückbleibende Rest wurde auf eine Silicagel-Säule mit einem Gradienten- Methanol in Methylenchlorid aufgetragen. 1-(2-Nitro-5-(3- hydroxypropoxy)phenyl)ethanol (0,6 g (99%)) wurde erhalten.
Rf = 0,17 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 304, 232, 210 nm; Minimum: 255, 219 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 8,00 (d, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,00 (d, 1H), 5,50 (d, OH), 5,28 (t, OH), 4,59 (t, 1H), 4,17 (t, 2H), 3,57 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,36 (d, 2H).
13C NMR (DMOS-d6) δ 162,8, 146,3, 139,7, 127,1, 113,1, 112,6, 65,5, 64,0, 57,0, 31,8, 25,0.
E. 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'Dimethoxytritylpropoxy) phenyl)ethanol
1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol (0,482 g, 2 mmol) wurde zweimal mit wasserfreiem Pyridin verdampft und in 20 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wurde in einem Eis-Wasserbad abgekühlt und 750 mg (2,2 mmol) DMTCl wurden hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und 0,5 ml Methanol wurden zur Beendigung der Reaktion hinzugegeben. Das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt und der Rückstand wurde zweimal mit Toluol co- verdampft, um Spuren von Pyridin zu entfernen. Der verbleibende Rückstand wurde auf einer Silicagel-Säule mit einem Gradienten- Methanol, in Methylenchlorid, das Tropfen von Trimethylamin enthielt, aufgetragen, um 0,96 g (89%) des gewünschten Produkts 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)phenyl)ethanol zu erhalten.
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 350 (Schulter), 305, 283, 276 (Schulter), 233, 208 nm; Minimum: 290, 258, 220 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 8,00 (d, 1H), 6,82-7, 42 (ArH), 5, 52 (d, OH), 5,32 (m, 1H), 4,23 (t, 2H), 3,71 (s, 6H), 3,17 (t, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
13C NMR (DMOS-d6) δ 162,5, 157,9, 157,7, 146,1, 144,9, 140,1, 139,7, 135,7, 129,5, 128,8, 127,6, 127,5, 127,3, 126,9, 126,4, 113,0, 112,8, 112,6, 85,2, 65,3, 63,9, 59,0, 54,8, 28,9, 24,9.
F. 1-(2-Nitro-5-(3-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-1-O- ((2-cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino)ethan
1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)- phenyl)ethanol (400 mg, 0,74 mmol), wurde im Hochvakkuum getrocknet und in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,5 ml N,N-Diisopropylethylamin und 0,3 ml (1,34 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-Diisopropylchlorphosphoramidit hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und 0,5 ml Methanol wurden zur Beendigung der Reaktion hinzugegeben. Die Mischung wurde mit gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakkuum, entfernt und eine Silicagel-Schnell-Säule mit 1% Methanol in Methylenchlorid, das Tropfen von Triethylamin enthielt, ergab 510 mg (93%) des gewünschten Phosphoramidits.
Rf 0,87 (Dichlormethan/Methan, 99/1).
Beispiel 3 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6- nitrophenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylamino­ phosphino) ethan A. 4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxyacetophenon
3-brom-1-propanol (53 ml, 33 mmol) wurden in 100 ml wasserfreiem Acetonitril, mit 4-Hydroxy-3-methoxyacetophenon (5 g, 30 mmol), K2CO3 (5 g) und KI (300 mg) über Nacht (15 Std.) am Rückfluß erhitzt. Methylenchlorid (150 ml) wurden zu der Reaktionsmischung nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde gefiltert und der feste Rückstand wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigte, organische Lösung wurde bis zur Trocknung verdampft und in 100 ml Methylenchlorid gelöst. Die sich ergebende Lösung wurde mit gesättigter NaCl- Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels im Vakkuum, wurden 6,5 g (96,4%) des gewünschten Produktes erhalten.
Rf = 0,41 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum; 304, 273, 227, 210 nm: Minimum: 291, 244, 214 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 7,64 (d, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,04 (d, 1H), 4,58 (b, OH), 4,12, (t, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,56 (t, 2H), 2,54 (s, 3H), 1,88 (m, 2H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 196,3, 152,5, 148,6, 129,7, 123,1, 111,5, 110,3, 65,4, 57,2, 55,5, 31,9, 26,3.
B. 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon
4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,5 g, 15,6 mmol) wurde getrocknet und in 80 ml wasserfreiem Acetonitril aufgelöst. Zu dieser Mischung wurden 6 ml Triethylamin und 6 ml Essigsäureanhydrid hinzugegeben. Nach 4 Stunden wurden 6 ml Methanol hinzugegeben und das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml Dichlormethan aufgelöst und die Lösung wurde mit verdünnter Natriumbicarbonat-Lösung, anschließend mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde entfernt. Der feste Rückstand auf eine Silicagel-Säule mit Methylenchlorid aufgetragen, um 4,1 g 4-(3-Acetoxypropoxy)-3- methoxyacetophenon (98,6%) zu ergeben.
Rf = 0,22 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 303, 273, 227, 210 nm; Minimum: 290, 243, 214 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 7,62 (d, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,08 (d, 1H), 4,12 (m, 4H), 3,82 (s, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,04 (m, 2H), 2,00 (s, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 195,3, 170,4, 152,2, 148,6, 130,0, 123,0, 111,8, 110,4, 65,2, 60,8, 55,5, 27,9, 26,3, 20,7.
C. 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6-nitroacetophenon
4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,99 g, 15 mmol) wurde portionsweise zu 15 ml, 70% HNO3 in einem Wasserbad hinzugegeben; die Reaktionstemperatur wurde bei Raumtemperatur gehalten. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und 30 g zerstoßenes Eis wurden hinzugefügt. Diese Mischung wurde mit 100 ml Dichlormethan extrahiert und die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumbicarbonat- Lösung gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt. Die Rohmischung wurde auf eine Silicagel-Säule mit einem Gradienten Methanol in Methylenchlorid aufgetragen, um 3,8 g (81,5%) des gewünschten Produkts 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6- nitroacetophenon und 0,38 g (8%) Ipso-substituiertes Produkt 5- (3-Acetoxypropoxy-methoxy-1,2-Dinitrobenzol zu ergeben. Ipso- substituiertes Nebenprodukt 5-(3-Acetoxypropoxy)-4-methoxy-1, 2- dinitrobenzol:
Rf = 0,47 (Dichlormethan/Methanol, 99/1)
UV (Methanol), Maximum: 334, 330, 270, 240, 212 nm; Minimum: 310, 282, 263, 223 nm.
1H NMR (CDCl3) δ 7,36 (s, 1H), 7,34 (s, 1H), 4,28 (t, 2H), 4,18 (t, 2H), 4,02 (s, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
13C NMR (CDCl3) δ 170,9, 152,2, 151,1, 117,6, 111,2, 107,9, 107,1, 66,7, 60,6, 56,9, 28,2, 20,9.
Gewünschtes Produkt 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6- nitroacetophenon
Rf
= 0,29 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 246, 213 nm; Minimum: 320, 270, 227 nm.
1
H NMR (CDCl3
) δ 7,62 (s, 1H), 5,74 (s, 1H), 4,28 (t, 2H), 4,20 (t, 2H), 3,96 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
13
C NMR (CDCl3
) δ 200,0, 171,0, 154,3, 148,8, 138,3, 133,0, 108,8, 108,0, 66,1, 60,8, 56,6, 30,4, 28,2, 20,9.
D. 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol
4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6-nitroacetophenon (3,73 g, 12 mmol) wurde zu 150 ml Ethanol und 6,5 g K2CO3 hinzugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt und TLC mit 5% Methanol in Dichlormethan zeigte die Vervollständigung der Reaktion an. Zu demselben Reaktions­ gemisch wurden 3,5 g NaBH4 hinzugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Aceton (10 ml) wurden hinzugefügt, um mit dem verbleibenden NaBH4 zu reagieren. Das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt und der Rest wurde in 50 g Silicagel aufgenommen. Die Silicagel-Mischung wurde auf das obere Ende einer Silicagel-Säule mit 5% Methanol in Methylenchlorid gegeben, um 3,15 g (97%) des gewünschten Produkts 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6- nitrophenyl)ethanol zu ergeben.
Zwischenprodukt 4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6- nitroacetophenon nach der Entschützung
Rf
= 0,60 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
Endprodukt 1-(4-(3-Hydroxypropoxy))-3-methoxy-6- nitrophenyl)ethanol
Rf
= 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 243, 219 nm; Minimum: 317,264, 233 nm.
1
H NMR (DMSO-d6
) δ 7,54 (s, 1H), 7,36 (s, 1H), 5,47 (d, OH), 5,27 (m, 1H), 4,55 (t, OH), 4,05 (t, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,55 (q, 2H), 1,88 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
13
C NMR (DMSO-d6
) δ 153,4, 146,4, 138,8, 137,9, 109,0, 108,1, 68,5, 65,9, 57,2, 56,0, 31,9, 29,6.
E. 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6- nitrophenyl)ethanol
1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol (0,325 g, 1,2 mmol) wurde mit wasserfreiem Pyridin zweimal co- verdampft und in 15 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wurde in einem Eis-Wasserbad abgekühlt und 450 mg (1,33 mmol) DMTCl wurden hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und 0,5 ml Methanol wurden zur Beendigung der Reaktion hinzugegeben. Das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt und der Rückstand wurde zweimal mit Toluol co-verdampft, um Spuren von Pyridin zu entfernen. Der verbleibende Rückstand wurde auf eine Silicagel-Säule gegeben mit einem Gradienten Methanol in Methylenchlorid, der Tropfen von Triethylamin enthielt, um 605 mg (88%) des gewünschten Produkts 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6- nitrophenyl)ethanol zu ergeben.
Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
UV (Methanol), Maximum: 354, 302, 282, 274, 233, 209 nm; Minimum: 322, 292, 263, 222 nm.
1H NMR (DMSO-d6) δ 7,54 (s, 1H), 6,8-7,4 (ArH), 5,48 (d, OH) 5,27 (m, 1H), 02225 00070 552 001000280000000200012000285910211400040 0002019882657 00004 02106 4,16 (t, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,72 (s, 6H), 3,15 (t, 2H), 1,98 (t, 2H), 1,37 (d, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) δ 157,8, 153,3, 146,1, 144,9, 138,7, 137,8, 135,7, 129,4, 128,7, 127,5, 127,4, 126,3, 112,9, 112,6, 108,9, 108,2, 85,1, 65,7, 63,7, 59,2, 55,8, 54,8, 29,0, 25,0.
F. 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6- nitrophenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino) ethan
1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6- nitrophenyl)ethanol (200 mg, 3,5 mmol) wurde unter Hochvakkuum getrocknet und in 15 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,5 ml N,N-Diisopropylethylamin und 0,2 ml (0,89 mmol) 2-Cyaonoethyl-N,N-Diisopropylchlorphosphoramidit hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt und 0,5 ml Methanol wurden zur Beendigung der Reaktion hinzugegeben. Die Mischung wurde mit gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakkuum entfernt und eine Silicagel-Schnell-Säule mit 1% Methanol in Methylenchlorid, das Tropfen von Triethylamin enthielt, ergab 247 mg (91,3%) des gewünschten Phosphoramidits 1-(4-(3-O-4,4'- dimethoxytrityl propoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-O-((2- cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino)ethan.
Rf = 0,87 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
Da Modifikationen dem Fachmann ersichtlich sind, ist beabsichtigt, daß diese Erfindung lediglich durch den Umfang der nachfolgenden Ansprüche begrenzt ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (49)

1. Verfahren zum Erhalten von Information betreffend die Sequenz eines Targetnukleinsäuremoleküls relativ zur Sequenz eines Referenznukleinsäuremoleküls, das ein Referenz- Polypeptid kodiert, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
  • a) Präparieren des von dem Targetnukleinsäuremolekül kodierten Polypeptids ausgehend von dem Targetnukleinsäuremolekül durch in vitro Translation oder durch in vitro Transkription, gefolgt von Translation, des Targetnukleinsäuremoleküls;
  • b) Bestimmen der molekularen Masse des kodierten Polypeptids durch Massenspektrometrie; und
  • c) Vergleichen der molekularen Masse des kodierten Polypeptids mit der molekularen Masse des korrespondierenden, bekannten Referenz-Polypeptids, wodurch Information über die Sequenz von Nukleotiden im Targetnukleinsäuremolekül erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Information über die genetische Natur eines Phänotyps eines Individuums gewonnen wird, wobei das Targetnukleinsäuremolekül aus dem Individuum erhalten wird, wobei der Vergleich des kodierten Polypeptides mit dem Referenz-Polypeptid zur Identifizierung einer allelische Variante einer polymorphen Region eines Chromosoms in dem Individuum dient.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Targetnukleinsäuremolekül, das das kodierte Polypeptid kodiert, RNA ist, und wobei das kodierte Polypeptid durch in vitro Translation erhalten wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine RNA, die das kodierende Polypeptid kodiert, durch in vitro Transkription des Nukleinsäuremoleküls, die das kodierte Poylpeptid kodiert, hergestellt wird, und wobei das kodierte Polypeptid durch in vitro Translation der RNA erhalten wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, das weiterhin das Amplifizieren des Targetnukleinsäuremoleküls, das das kodiererte Polypeptid kodiert, umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Amplifizieren unter Verwendung eines Primers durchgeführt wird, der eine Nukleotidsequenz umfaßt, die einen RNA-Polymerase-Promotor kodiert, wobei nach der Amplifikation der Promotor auf operable Weise mit dem Targetnukleinsäuremolekül, das das kodierente Polypeptid kodiert, verbunden ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der RNA-Polymerase- Promotor aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus SP6- Promotor, T3-Promotor und T7-Promotor besteht.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, wobei das kodierte Polypeptid ein Anhängsel umfaßt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, wobei die Transkription und/oder Translation in vivo durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, wobei das kodierte Polypeptid vor der Massenspektrometrie isoliert wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, wobei das kodierte Polypeptid auf einem festen Träger immobilisiert wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, wobei das Massenspektrometrieformat aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus matrixunterstützter Laserdesorption/Ionisation (MALDI) MALDI mit verzögerter Extraktion, kontinuierlicher oder gepulster Elektronenspray-, Ionenspray-, Thermospray- oder Massive Cluster Impact-Spektrometrie besteht und einem Detektionsformat, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus linearem Flugzeit, Reflektron- Flugzeit, Einfach-Quadrupol, Mehrfach-Quadrupol, Einfach- Magnetischem Sektor, Mehrfach- Magnetischem Sektor, Fourier-Transform-Ionencyclotron- Resonanz, Ion-Trap und Kombinationen davon besteht.
13. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Phänotyp die Antwort des Individuums auf einen Wirkstoff betrifft, und wobei die genetische Natur des Phänotyps mit der Antwort verbunden ist.
14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das kodierte Polypeptid durch eine allelische Variante einer polymorphen Region eines Chromosoms in einem Individuum kodiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die polymorphe Region sich in einem Gen befindet.
16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die allelische Variante mit einer Krankheit oder einem Zustand verbunden ist, wodurch angezeigt wird, daß das Individuum die Krankheit oder den Zustand hat oder ein Risiko besitzt, diese(n) zu entwickeln.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Krankheit oder der Zustand mit einer anormalen Zahl von Nukleotid- Wiederholungen in der allelischen Variante assoziiert ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Nukleotid- Wiederholungen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Dinukleotid-, Trinukleotid, Tetranukleotid und Pentanukleotid-Wiederholungen besteht.
19. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Krankheit oder der Zustand aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Huntingtons Krankheit, Prostatakrebs, fragiles X Syndrom Typ A, myotonische Dystrophie Typ 1, Kennedy Krankheit, Machado- Joseph-Krankeit, dentatorubrale und pallidolyusiane Atrophie, spinobulbäre Muskelatrophie und Alterung besteht.
20. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Gen aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus BRCA1, BRCA2, APC, Dystrophin-Gen, β-Globin, Faktor IX, Faktor VIIc, Ornithin-d- Aminotransferase, Hypoxanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase, CFTR, p53 und einem Proto-Onkogen besteht.
21. Verfahren nach Anspruch 2 oder 16, wobei die allelische Variante auf eine Punktmutation zurückzuführen ist.
22. Verfahren flach Anspruch 1 oder 2, wobei das Targetnukleinsäuremolekül ein mitochondriales Gen ist.
23. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die polymorphe Region mit Transplantatabstoßung assoziiert ist und das Verfahren zur Bestimmung der Kompatibilität zwischen einem Spender und einem Empfänger eines Transplantats dient.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die polymorphe Region der Haupt-Histokompatibilitäts-Locus ist.
25. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das kodierte Polypeptid von einem Targetnukleinsäuremolekül kodiert wird, das Nukleotid-Wiederholungen umfaßt, und das Verfahren einer Verwendung dient, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Bestimmung des Genotyps des Individuums, forensischer Analyse und Vaterschaftstest besteht.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Bestimmung des Genotyps durchgeführt wird, indem die Anzahl von Nukleotid- Wiederholungen quantifiziert wird.
27. Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Nukleotid- Wiederholungen Dinukleotid-, Trinukleotid-, Tetranukleotid- oder Pentanukleotid-Wiederholungen sind.
28. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Targetnukleinsäuremolekül aus einem infektiösen Organismus erhalten wird.
29. Verfahren nach Anspruch 2 oder 16, wobei die allelische Variante eine Mutation ist, die zu einem Stop- Codon führt, die anhand der molekularen Masse des kodierten Polypeptids, was ein verkürztes Polypeptid anzeigt, identifiziert wird.
30. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren durchgeführt wird mit
einer Vielzahl von Targetnukleinsäuremolekülen, die eine Vielzahl von kodierten Polypeptiden kodieren, und
die Vielzahl von kodierten Polypeptiden vor dem Schritt b) differentiell massenmodifiziert wird.
31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei vor der Bestimmung der molekularen Masse von jedem differentiell massenmodifizierten kodierten Polypeptid durch Massenspektrometrie jedes kodierte Polypeptid mittels eines spaltbaren Linkers auf dem festen Träger immobilisiert wird.
32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der spaltbare Linker aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem säurespaltbaren Linker, säurelabilen Linker, wärmelabilen Linker und einem photospaltbaren Linker besteht.
33. Verfahren nach Anspruch 31, wobei der feste Träger aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Träger, der eine flache Oberfläche aufweist und einen Träger, der eine Oberfläche mit einer Struktur aufweist, besteht.
34. Verfahren nach Anspruch 31, wobei jedes kodierte Polypeptid in einer Anordnung (Array) auf dem festen Träger immobilisiert wird.
35. Verfahren nach Anspruch 32, wobei jedes kodierte Polypeptid aufgrund seiner spezifischen Interaktion mit einem weiteren Polypeptid immobilisiert wird, wobei das weitere Polypeptid in einer Anordnung (Array) auf dem festen Träger konjugiert ist.
36. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das kodierte Polypeptid
vor dem Schritt b) in Kontakt gebracht wird mit zumindest einem Mittel, das zumindest eine Peptidbindung in dem kodierten Polypeptid spaltet, um Peptidfragmente des kodierten Polypeptids zu erzeugen; und
die molekulare Masse von zumindest einem der Peptidfragmente des kodierten Polypeptids durch Massenspektrometrie in Schritt b) bestimmt wird; und
die molekulare Masse des zumindest einen Peptidfragments des kodierten Polypeptids mit der molekularen Masse von Peptidfragmenten eines korrespondierenden bekannten Polypeptids in Schritt c) verglichen wird.
37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei das kodierte Polypeptid auf einem festen Träger vor dem in Kontakt bringen des kodierten Polypeptids mit dem Spalt-Mittel immobilisiert wird.
38. Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Spalt-Mittel, das zumindest eine Peptidbindung in dem kodierten Polypeptid spaltet, eine Endopeptidase ist.
39. Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Verfahren mit einer Vielzahl von Targetnukleinsäuremolekülen durchgeführt wird.
40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Masse jedes kodierten Polypeptids vor dem in Kontakt bringen in modifiziert wird, oder die Masse des zumindest einen Peptidfragments von jedem kodierten Polypeptid vor der Bestimmung der molekularen Masse modifiziert wird.
41. Verfahren nach Anspruch 39 oder 40, wobei jedes kodierte Polypeptid in der Vielzahl auf einem festen Träger vor dem in Kontakt bringen jedes Targetpolypeptids mit dem Spalt-Mittel immobilisiert wird.
42. Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Vielzahl der kodierten Polypeptide in einer Anordnung (Array) immobilisiert wird.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 39-42, wobei das Mittel, das zumindest eine Peptidbindung in jedem kodierten Polypeptid spaltet, eine Endopeptidase ist.
44. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Massenspektrometrie matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI)-time of flight- Massenspektrometrie ist.
45. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Targetnukleinsäuremolekül, das das Polypeptid kodiert, aus einer biologischen Probe erhalten wird, und das kodierte Polypeptid oder das Targetnukleinsäuremolekül, das das Polypeptid kodiert, ein Marker für eine Krankheit oder einen Zustand ist, wodurch bestimmt wird, ob das Individuum diese Krankheit oder diesen Zustand besitzt oder dagegen prädispositioniert ist.
46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Probe aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus eine Gewebeprobe, einer Zellprobe und einer biologischen Flüssigkeit besteht.
47. Verfahren nach Anspruch 45, wobei das Targetnukleinsäuremolekül, das das Polypeptid kodiert, zumindest einen Bereich eines Genes aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus BRCA1, BRCA2, APC, Dystrophin-Gen, β-Globin, Faktor IX, Faktor VIIc, Ornithin-d- Aminotransferase, Hypoxanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase, CFTR, p53 und einem Proto-Onkogen besteht.
48. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Krankheit oder der Zustand aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Huntingtons Krankheit, Prostatakrebs, fragiles X Syndrom Typ A, myotonische Dystrophie Typ 1, Kennedy Krankheit, Machado- Joseph-Krankeit, dentatorubrale und pallidolyusiane Atrophie, spinobulbäre Muskelatrophie und Alterung besteht.
49. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Krankheit oder der Zustand durch einen Organismus verursacht wird, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Virus, einem Bakterium, einem Pilz und einem Protisten besteht.
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