DE19823432A1 - Verfahren zur Templat-induzierten Strukturierung von Oberflächen und ihre reversible Stabilisierung durch Phasenübergänge des strukturierten Materials - Google Patents
Verfahren zur Templat-induzierten Strukturierung von Oberflächen und ihre reversible Stabilisierung durch Phasenübergänge des strukturierten MaterialsInfo
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- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
- B01J31/003—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2600/00—Assays involving molecular imprinted polymers/polymers created around a molecular template
Description
Proteine und andere Biomoleküle besitzen als Biokatalysatoren eine
zunehmende marktwirtschaftliche Bedeutung. Ihre katalytische Leistung
bezüglich Selektivität und Reaktionsgeschwindigkeit ist bislang
unübertroffen. Aus diesem Grund ist die Aufreinigung spezieller Biomoleküle
aus ihrer komplexen natürlichen Umgebung ein zentrales Thema, das
neben Forschung und Lehre vor allem die industrielle Biotechnologie
beschäftigt.
Ganz allgemein erfolgt die Aufreinigung von Proteinen durch eine auf das
jeweilige Trennproblem optimierte Kombination mehrerer Extraktions- und
Trennverfahren insbesondere unterschiedlicher Chromatographiemethoden
(Scopes, R.K. Protein Purification: Principles and Practice, Springer, New
York (1994)). Allgemeine Separationsverfahren (z. B. Gelpermeations
chromatographie, Ionenaustauschchromatographie) separieren nach Größe
oder Ladung eines Proteins. Wesentlich höhere Anreicherungsfaktoren
werden erzielt, wenn spezielle Bindungscharakteristika der Biomoleküle für
die Trennung genutzt werden können, wie dies bei der
Affinitätschromatographie geschieht.
Bei der herkömmlichen Affinitätschromatographie wird ein Ligand, zu dem
das interessierende Biomolekül erhöhte Affinität zeigt, kovalent an eine
vorher aktivierte Matrix gekoppelt. Dabei findet meist eine mehr oder
weniger gravierende lokale Konformationsänderung in der Umgebung der
Verknüpfungsstelle des Proteins statt. Außerdem bindet nur ein Bruchteil
(10%) der aktivierten Bindungsstellen auf dem ursprünglichen
Chromatographieträger in der richtigen Orientierung, um eine spezifische
Wechselwirkung mit weiteren Bindungspartnern zu gewährleisten.
Einen wesentlichen kozeptionellen Fortschritt stellt deshalb die Technik des
"Molecular Imprinting", speziell an Oberflächen, dar: Unter definierten
Reaktionsbedingungen kann der Abdruck eines Biomoleküls (Templat)
direkt in die Chromatographiematrix eingeprägt werden (Wulff, G. Molecular
imprinting in crosslinked materials with the aid of molecular templates - a
way towards artificial antibodies. Angewandte Chemie., Int. Ed. (Engl.), 34,
1812-1835 (1995)). Resultat ist letzlich ein Trägermaterial mit spezifischer
räumlicher Anordnung seiner funktionellen Gruppen in der Art
komplementärer Hohlräume, das demgemäß sehr hohe Affinität zum
Templat besitzt (Arnold, F. H.; Dhal, P.; Shnek, D.; Plunkett, S. "Composition
of Matter Comprising an Imprinted Matrix Exhibiting Selectice Binding
Interactions Through Chelated Metals"; US Patent No. US 5,310,648,
(1994)). Das Templat wird nach dem aktuellen Stand der Technik während
des Produktionsprozesses zum künftigen Chromatographiematerial
zugegeben. Bislang wird das Prägen in der Regel nicht an Oberflächen
sondern im Bulk durchgeführt, was zu großen Problemen beim Stofftransport
führt. Dabei wird die Prägung durch anschließende Vernetzung
(Polymerisation) der Chromatographiematrix irreversibel stabilisiert, bevor
das Templat wieder ausgewaschen wird (Steinke, J.; Sherrington, D. C.;
Dunkin, I. R. "Imprinting of Synthetic Polymers Using Molecular Templates";
in: Advances in Polymer Science, Vol. 123, (Ledwith, P., Ed.), Springer
Verlag: Berlin, Heidelberg, 81-125 (1995)). Organische Lösungsmittel und
drastische Reaktionsbedingungen schädigen dabei nicht unwesentlich die
Konformation und damit die Aktivität des Biomoleküls. Ein Löschen der
Prägung ist bisher mit äußerst wenigen Ausnahmen unmöglich, da nur eine
sehr kleine Zahl reversibler kovalenter Vernetzungsreaktionen bekannt ist.
Daher bleibt der Anwendungsbereich definierter "Molecular Imprint"
Materialien sehr eng bemessen.
Durch das im vorliegenden Antrag beschriebene neue Verfahren wird es
möglich, auf einer Oberfläche höchster Biokompatiblität, einen spezifischen
Abdruck (Molecular Imprint) eines vorherbestimmten biologischen Moleküls
oder Partikels kolloider Dimensionen (Templat) analog des molekularen
Schlüssel-Schloß-Prinzips zu erzeugen und für die spätere Erkennung und
selektive Bindung von Biomolekülen anzuwenden. Das neue Verfahren
nutzt das molekulare Selbstorganisationsprinzip amphiphiler Moleküle in
mono- und und bimolekularen Schichten, die auf einen festen Träger
aufgebracht wurden (sogenannte festkörperunterstützte Mono- bzw.
Doppelschichten), um die drastischen Reaktionsbedingungen während der
Prägung zu vermeiden. Erstmalig beschrieben wird der Einsatz
festkörperunterstützter Mono- bzw. Doppelschichten aus Lipiden und
lipidähnlichen Amphiphilen mit polaren oder ionischen Kopfgruppen zur
Ausprägung spiegelbildartiger, dreidimensionaler Muster durch Coulomb- und
andere, nicht-kovalente Wechselwirkungen mit einem zur Prägung
benutzten Biomolekül oder Teilchen (Templat). Die Stabilisierung einer
erfolgten Prägung wird erstmals temperaturgesteuert durch einen
reversiblen, thermischen Phasenübergang des Monolayers bzw. Bilayers
erreicht. Auf diese Weise bietet das neue Verfahren die vorteilhafte Option,
einen Imprint im Bedarfsfall auf einfache Weise und ohne chemische
Behandlung der Chromatographiematrix wieder zu löschen. Ein und
dasselbe Material kann somit mehrmals zum Imprint mit völlig
unterschiedlichen Templat-Molekülen verwendet werden.
Die Mehrzahl aller biologischen Moleküle oder Partikel besitzt in Lösung bei
neutralem pH eine elektrische Nettoladung mit spezifischer räumlicher
Verteilung der elektrisch geladenen und sonstigen funktionellen Gruppen.
Anziehende Coulomb-Wechselwirkungen finden statt zwischen den Teilen
des Moleküls oder Partikels, die diese Ladungen auf der Oberfläche im
Überschuß exponieren und einer Oberfläche entgegengesetzter Ladung. Im
speziellen Fall von Proteinen ist die Oberflächenladungsverteilung bestimmt
durch die Aminosäuresequenz und die räumliche Faltung der Peptidkette.
Myelin Basic Protein (MBP) kann z. B. mit unterschiedlichen
Bindungskonstanten sowohl an Kationen- als auch an
Anionenaustauschergele binden. Diese Coulomb-Wechselwirkungen sind
schwach im Vergleich zu dem, was mit spezifischen "Haftgruppen" erzielt
wird, aber ausreichend, um die Moleküle in Kontakt mit der Oberfläche zu
halten.
Weitere relativ unspezifische und vergleichsweise schwache
Wechselwirkungen sind van-der-Waals Kräfte, hydrophobe
Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrückenbindungen. Voraussetzung für
die Ausbildung eines molekularen Imprints ist jedoch allein die Adsorption
des biologischen Moleküls oder Partikels an die Oberfläche der
Chromatographiematrix, so daß jeder der erwähnten unspezifischen
Wechselwirkungsmechanismen ausreichend sein kann.
Lipiddoppelschichten sind selbstorganisierte bimolekulare Schichtstrukturen
und werden durch Quellung von Lipiden oder Lipidanaloga in wäßrigem
Milieu bei Temperaturen oberhalb der Phasenübergangstemperatur Tm
hergestellt (Sackmann, E. "Polymorphism of Lipid/water systems" in
"Biophysics" (Hoppe, W., Lohmann, W., Markl, H., Ziegler, H., eds) pp. 425.
Springer Verlag Berlin, Heidelberg (1983)). Der Einsatz kat- bzw.
anionischer Amphiphile vorzugsweise im Gemisch mit zwitterionischen,
elektrisch neutralen Amphiphilen erzeugt Bilayer mit einer elektrischen
Überschußladung. Neben der elektrisch geladenen oder neutralen
hydrophilen Komponente der Moleküle spielt darüber hinaus die
Verwendung von Amphiphilen unterschiedlicher Moleküllänge eine Rolle.
Es können z. B. Lipide mit unterschiedlicher Länge der hydrophoben
Alkylketten eingesetzt werden, die somit einen Bilayer mit lokalen
Dickenvariationen ergeben. Die Anordnung der Moleküle strebt dabei nach
einer Minimierung der gesamten freien Wechselwirkungsenergie im System
unter den gegebenen geometrischen Bedingungen. Auf diese Weise
entsteht eine auf molekularer Ebene dreidimensional strukturierte
Oberfläche der Lipiddoppelschicht, lange Amphiphile "überragen" die
Oberfläche, kürzere bilden "Einstülpungen". Abb. 1a zeigt die
schematische Darstellung einer derart (auf molekularer Ebene) strukturierten
Lipidschicht. Das Aufbringen der Lipiddoppelschicht auf eine feste, planare
Unterlage kann die Amplitude dieser dreidimensionalen Struktur senkrecht
zur Bilayeroberfläche auf der dem Festkörper abgewandten Seite weiter
vergrößern. Der resultierende festkörperunterstützte Bilayer ist durch einen
ultradünnen Wasserfilm von 10-30 Å Dicke von der Festkörperoberfläche
getrennt und durch van der Waals Wechselwirkungen fest an sie gebunden
(Bayerl, T.M., Bloom, M. "Physical properties of single phospholipid bilayers
adsorbed to micro glass beads", Biophysical Journal 58: 357-362
Rockefeller Press, New York (1990)). In der schematischen Darstellung von
Abb. 1b ist diese Erhöhung der Amplitude durch die
Festkörperunterstützung übertrieben dargestellt. Im Realfall wird sie partiell
kompensiert durch die Minimierung der gesamten freien Energie des
Systems. Die zeitliche Größenordnung, innerhalb der eine derartige lokale
Strukturierung stabil bleibt, hängt vom dynamischen Status des gesamten
Bilayers ab. Befindet sich der Bilayer in der fluiden Phase, so kann die
laterale Diffusion der Lipide mit typischen Diffusionskonstanten in der
Größenordnung von 10-12 m2/s lokale Abweichungen der Bilayerdicke durch
Diffusionssprünge benachbarter Lipide mit einer Frequenz in der
Größenordnung von 108 Hz ausgleichen. Dieser Prozeß kann als
Dickenfluktuation betrachtet werden. In der Gel- oder kristallinen Phase, die
unterhalb der Phasenübergangstemperatur Tm eintritt, ist die laterale
Diffusion hingegen nahezu "eingefroren", die lokale Strukturierung kann
somit als stationär und über einen längeren Zeitraum als stabil betrachtet
werden.
Adsorbiert ein Templat an die dem Festkörper abgewandte Seite des
festkörperunterstützen Bilayers in der fluiden Phase über mindestens eine
der erwähnten unspezifischen, anziehenden Wechselwirkungen (Coulomb,
van-der-Waals oder hydrophobe Wechselwirkungen), so induziert dies eine
Neuordnung lateral mobiler Lipide oder Amphiphile in den mit adsorbiertem
Templat bedeckten Bereichen des Bilayers nach folgenden Kriterien:
- (a) Ein bestimmter Teil des Bilayers befindet sich in einer Art Sandwich- Struktur zwischen glatter fester Unterlage (Festkörperunterstützung) und der dreidimensional strukturierten Oberfläche des Templats. Die neutralen (zwitterionischen) Amphiphile im Bilayer passen sich an diese Situation durch Umordnung mit Hilfe thermischer Bewegungen wie z. B. lateraler Diffusion unter Minimierung ihrer freien Energie an. Lange Amphiphile ordnen sich dabei bevorzugt in Bereichen an, in denen das Templat "Einstülpungen" oder "Faltungen" zeigt, kurze Amphiphile konzentrieren sich dort, wo "Ausstülpungen" des Templats Druck auf den Bilayer ausüben (grenzflächenkonforme Abbildung).
- (b) Geladene Lipide aus den Bilayerbereichen, die mit dem Templat in Kontakt stehen, konzentrieren sich durch laterale Diffusion an den Orten, wo sie entgegengesetzte Oberflächenladungen des Templats optimal kompensieren können. Dies gilt in gleicher Weise auch für die andren oben genannten Arten schwacher intermolekularer Wechselwirkungen.
Durch diese Anpassungsprozesse realisierte, lokale Erhöhungen der freien
Energie des Bilayers stehen den Prozessen (a) und (b) zu einem gewissen
Grad entgegen. Dies führt zu einem Nicht-Gleichgewichtszustand der
entsprechenden Bilayerfläche, die als dynamische Struktur (dynamische
Prägung bzw. Imprint) bezeichnet werden kann. Abb. 2a zeigt die
lokale partielle Entmischung der Amphiphile im fluiden Bilayer die durch die
Anwesenheit der Templatoberfläche induziert wird.
Um ausgehend von dieser dynamischen Struktur einen dauerhaften
molekularen Imprint im Bilayer zu erzeugen, muß ein Übergang in einen
stabileren Zustand erfolgen, in der thermische Bewegungen der Lipide und
insbesondere die laterale Diffusion minimiert werden. Dies wird durch einen
Phasenübergang von der fluiden in die kristalline Phase erreicht. Ein
einfacher (wenn auch nicht der einzige) Weg, um dies zu erreichen, ist
Temperaturerniedrigung unter die Phasenübergangstemperatur Tm des
Bilayers. Die hydrophoben Alkylketten der Amphiphile nehmen dabei eine
all-trans Konformation an, dadurch erhöht sich die Bilayerdicke um bis zu 10 Å,
diffusive Bewegungen langer Reichweite werden reduziert auf
intramolekulare Lipidbewegungen hoher Frequenz. Abb. 2b zeigt
diese Situation und verdeutlicht gleichzeitig die Tatsache, daß die
Konformationsänderung Längenunterschiede der hydrophoben
Schwanzgruppen der Amphiphile zusätzlich verstärkt und damit zu einer
noch schärfer ausgeprägten Oberflächenstruktur führt. Das Ergebnis ist nun
ein statischer molekularer Imprint eines Teiles der Templatkontur in der
Bilayeroberfläche.
Im letzten Schritt zur molekular geprägten Oberfläche wird nun das
biologische Molekül bzw. das Partikel entfernt, welches als Templat
fungierte. Dies muß unter Bedingungen geschehen, bei denen der
molekulare Abdruck, das heißt die in der Lipiddoppelschicht durch das
Templat induzierte Ordnung nicht verloren geht. Man wendet dazu gängige
Methoden wie z. B. die Applikation von Salzgradienten zum Lösen
elektrostatischer Wechselwirkungen, proteolytische Zersetzung, oder
chaotropische Elution etc., an.
Der nun freigelegte molekulare Imprint bleibt stabil, solange der Bilayer in
der kristallinen Phase erhalten wird (Abb. 3). Da der gesamte
Imprintprozeß in wäßrigem Milieu stattfindet und mit den Lipiden als
Amphiphile Bestandteile natürlicher Membranen verwendet werden,
entsteht wiederum eine Oberfläche von höchster Biokompatibilität. Dies
verhindert im Falle von Proteinen als Templat Denaturierungsprozesse
während des Imprintprozesses aber auch bei nachfolgenden Bindungs- und
Erkennungsphänomenen an der molekular geprägten Oberfläche.
Die selektive Trennung von Biomolekülen auf dem molekular geprägten
Material muß analog unter Gelphasenbedingungen erfolgen. Dazu kann das
Trägermaterial z. B. gemeinsam mit dem Biomolekül-Gemisch in einen
thermostatierbaren Container abgefüllt werden, wobei die Temperatur unter
der Phasenübergangstemperatur Tm liegen soll. Moleküle mit
Templatstruktur binden nun mit verstärkter Affinität an die Oberfläche.
Anschließend wird der flüssige Überstand entfernt und die Oberfläche mit
Puffer gewaschen, um jegliche ungebundenen Bestandteile zu entfernen.
Zurück bleibt eine molekular geprägte Oberfläche, die selektiv das
biologische Zielmolekül, welches zuvor als Templatstruktur verwendet
wurde, mit erhöhter Affinität an die Oberfläche binden kann und damit aus
einem Biomolekülgemisch bevorzugt das Zielmolekül zu separieren
vermag. Durch Einsatz eines geeigneten Puffersystems (z. B. Salz- oder pH-
Gradient) kann dieses Molekül nun im Anschluß von der Oberfläche eluiert
werden.
Wird später ein molekularer Imprint anderer Spezifität benötigt oder soll der
Imprint mit demselben Templat erneut durchgeführt werden, so ist es
notwendig, den ursprünglichen Imprint zunächst zu löschen. Dies geschieht
durch Überführung der Lipiddoppelschicht in die fluide Phase, z. B. durch
Temperaturerhöhung über die Phasenübergangstemperatur Tm. Die hierbei
einsetzende laterale Diffusion und die Tendenz der Lipide zur homogenen
Verteilung über den Bilayer führt zum gleichzeitigen Verlust der
eingeprägten Oberflächenstruktur. Nach Entfernung etwaiger Templatreste
in der fluiden Phase des Bilayers resultiert eine dem nativen Material
vergleichbare unstrukturierte Oberfläche (Abb. 1b). Das Molecular
Imprint Verfahren kann nun analog von vorne beginnen. Im Prinzip kann
diese Form der Informationsspeicherung und Löschung unbegrenzt oft
stattfinden, da der thermisch induzierte Phasenübergang einen perfekt
reversiblen Prozeß darstellt.
Die Vorteile des Verfahrens zur Erzeugung von molekularen Abdrücken in
Oberflächen können wie folgt zusammengefaßt werden: (1) Die Oberfläche
ist von höchster Biokompatibilität durch Verwendung von Lipiden und
lipidähnlicher Moleküle im Bilayer. (2) Die Fixierung des Imprints erfolgt
durch einen temperaturinduzierten Phasenübergang und nicht durch
Chemikalien oder andere, die Templatstruktur gefährdende Methoden. (3)
Die eingeprägte Struktur kann wegen der Reversibilität des
Phasenüberganges wieder von der Oberfläche entfernt werden. (4) durch
molekulares Prägen an Oberflächen unter Einsatz großflächiger
Chromatographiegele als Trägermaterial werden Probleme durch limitierten
Stofftransport, wie sie bei allen kovalent vernetzenden Matrix-Imprinting
Verfahren auftreten, vermieden.
Abb. 1:
Schematische Schnittdarstellung der aus den unterschiedlichen molekularen Längen der amphiphilen Moleküle im Bilayer resultierenden molekularen Rauhigkeit seiner Oberfläche für den Fall des freien Bilayers (a) und für den Fall des festkörperunterstützten Bilayers (b).
Schematische Schnittdarstellung der aus den unterschiedlichen molekularen Längen der amphiphilen Moleküle im Bilayer resultierenden molekularen Rauhigkeit seiner Oberfläche für den Fall des freien Bilayers (a) und für den Fall des festkörperunterstützten Bilayers (b).
Abb. 2:
- a) Schematische Schnittdarstellung eines fluiden festkörperunterstützten Bilayers aus amphiphilen Molekülen unterschiedlicher molekularer Längen nach der Anlagerung eines Templates (Entstehung der Prägung).
- b) Der Bilayer von a) nach der Überführung in den gel- bzw. kristallinen Phasenzustand (Fixierung der Prägung).
Abb. 3:
Schematische Schnittdarstellung des Bilayers von Abb. 2b) im gel- bzw. kristallinen Phasenzustand nach der Entfernung des Templates.
Schematische Schnittdarstellung des Bilayers von Abb. 2b) im gel- bzw. kristallinen Phasenzustand nach der Entfernung des Templates.
Das Beispiel beschreibt die Präparation von Bilayerstrukturen mit und ohne
Festkörperunterstützung bezogen auf ein ternäres Gemisch aus 1,2-
Dielaidoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DEPC, synthetisches,
zwitterionisches Phospholipid), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phos
phocholine (DMPC, synthetisches, zwitterionisches Phospholipid) und
Di-tetradecyl-dimethyl-ammonium-bromid (DTDAB, synthetisches,
kationisches Lipidanalogon). Die Zusammensetzung betrug 20 Mol%
DTDAB, 30 Mol% DEPC und 50 Mol% DMPC. Somit besaßen 30% der
Lipide Fettsäuren mit 18 Kohlenstoffatomen, 70% trugen C-14 Reste.
Die lyophilisierten Lipide wurden im entsprechenden Gewichtsverhältnis in
10 ml Puffer A (20 mM HEPES, pH 7.2, 20 mM NaCl) gelöst. Die
Lipidkonzentration betrug 15 mg Lipid pro Milliliter Puffer A; der
Quellvorgang wurde bei 30°C durchgeführt. Die Dispersion wurde unter
leichtem Rühren für 15 Minuten inkubiert. Anschließend wurde sie mit einem
Stabultraschallgerät für weitere 10-15 Minuten mit hoher Leistung
beschallt, bis die ehemals milchige Dispersion optisch klar erschien. Die
Ultraschallbehandlung führte zu einer Lösung kleiner unilamellarer Vesikel
(SUV) mit einem Durchmesser von 40-100 nm (mit Hilfe von
Elektronenmikroskopie bestimmt). Die Phasenübergangstemperatur Tm der
Dispersion wurde mit Hilfe von Differentialkalorimetrie (DSC) auf 24°C
bestimmt.
Zur Präparation festkörperunterstützte Lipidmembranen wurde die SUV-
Lösung mit einem geeigneten Träger versetzt und für eine weitere Stunde
bei 30°C unter leichtem Rühren inkubiert. Als Trägerkerne kamen poröse,
kugelförmige Silikatstrukturen, sogenannte Silikat-Gele zum Einsatz, um ein
möglichst großes Oberflächen/Volumenverhältnis zu erzielen. Die
Silikatgele besaßen 10-15 µm Durchmesser, die Porengröße (Durchmesser)
betrug 400 nm (Herstellerangaben). Somit waren die Poren für ein
Hineindiffundieren der SUV's ausreichend groß dimensioniert. Vor dem
Mischen mit der SUV-Lösung wurden die Silikatgele mit einem zehnfachen
Volumen an Methanol gewaschen und danach im Vakuum für 12 h bei
80°C getrocknet. Bei Kontakt mit der Silikatoberfläche kollabieren die
SUV's und bilden eine einzelne Lipiddoppelschicht, die die gesamte
Geloberfläche vollständig bedeckt. Ausgehend von einem Flächenbedarf
eines Lezithinmoleküls von 80 Å2 wurde Lipid in 50%igem Überschuß
eingesetzt, um die exponierte Silikatoberfläche einschließlich der inneren
Porenoberfläche komplett mit einer einzelnen Lipiddoppelschicht bedecken
zu können. Dementsprechend wurden 5 g Silikat mit 150 mg Lipidmischung
versetzt. Überschüssige Lipidvesikel wurden nach einer Stunde Inkubation
durch dreimaliges Waschen mit je 100 ml Puffer A bei 30°C entfernt. Die
resultierende wäßrige Silikatgeldispersion weist nun eine
festkörperunterstützte Lipiddoppelschicht (Bilayer) an ihrer Oberfläche auf,
die das Silikat von der wäßrigen Phase trennt. Die
Phasenübergangstemperatur dieses Silikatgels wurde mit DSC auf 24°C
bestimmt.
In diesem Beispiel wird demonstriert, wie ein nach Beispiel l präparierter
festkörperunterstützter Lipidbilayer mit einer Proteinmatrix (Templat)
spezifisch geprägt werden kann.
Eine thermostatierbare Standardchromatographiesäule (Durchmesser 10 mm)
von 20 cm Länge wurde mit 5 g der festkörpterunterstützten
Lipidmembran (Präparation wie in Beispiel I beschrieben) gefüllt. Das
Packen der Säule verläuft dabei analog wie bei anderen
Chromatographieanwendungen. Die Säule wurde eine Stunde lang mit
Puffer A bei einer Flußrate von 2 ml/min gespült. Der thermostatierbare
Säulenmantel wurde dabei mit Hilfe zirkulierenden Wassers auf 4°C
gekühlt. Danach wurde die Säulentemperatur auf 30°C erhöht und der Fluß
bei gleicher Flußrate für eine weitere Stunde kontrolliert.
Als Prägemolekül (Templat) wurde in diesem Beispiel Trypsin Inhibitor aus
Rinderpankreas benutzt. Das Protein besitzt einen isoelektrischen Punkt von
4.6 und ist deshalb bei neutralem pH negativ geladen. Trypsin Inhibitor
wurde entsprechend einer Konzentration von 2 mg/ml in Puffer A gelöst. Da
die festkörperunterstützte Lipidmembran mit DTDAB kationische Amphiphile
enthält, kann von einer anziehenden Coulomb zwischen Protein und
Chromatographiematerial (festkörperunterstützter Bilayer) ausgegangen
werden.
Bei einer Säulentemperatur von 30°C (fluider Phasenzustand des Bilayers)
wurden 2 ml der Templatlösung (4 mg Protein) mit einer Flußrate von 2
ml/min auf die Säule appliziert. Das Auftragen des Proteins verlief dabei wie
auch sonst in der Proteinchromatographie üblich. Anschließend wurde der
Fluß sofort gestoppt und die Säule für weitere 12 h bei 30°C inkubiert, um
optimale Anordnungsverhältnisse zwischen festkörperunterstützter
Lipidmembran und Protein-Templat zu ermöglichen. Die Säule wurde
anschließend schnell auf 4°C gekühlt (Abkühlgeschwindigkeit 5°C/s).
Damit wurde in der festkörperunterstützten Lipidmembran, an die zu diesem
Zeitpunkt noch das Templatmolekül gekoppelt war, ein Phasenübergang
von der fluiden in die Gel- bzw. kristalline Phase induziert. Überschüssiges
Protein (das heißt schwach und unspezifisch adsorbiertes Protein), wurde
nun durch Spülen (1 h) bei 4°C mit einer Flußrate von 2 ml/min entfernt.
Die Kontrolle mit einem UV-Detektor bei 280 nm am Säulenausgang ergab,
daß nach einer Spüldauer von 15 min kein weiteres Protein im Eluat mehr
auszumachen war. Um das Templat von der geprägten Oberfläche, dem
Bilayer in kristalliner Phase, zu entfernen, wurde - wiederum bei 4°C - ein
Salzgradient angelegt (gängiges Verfahren in der Proteinchromatographie).
Bei 410 mM NaCl konnte die Elution des Templats über ein deutliches UV-
Signal am Säulenausgang detektiert werden. Eine zusätzliche Erhöhung
der Salzkonzentration im Waschpuffer auf 500 mM führte zu keiner weiteren
Elution an Templat-Protein.
Die molekular geprägte, festkörperunterstützte Lipidmembran wurde vor
ihrer weiteren Verwendung für 12 h bei 4°C direkt in der Säule gelagert.
Dieses Beispiel zeigt, daß die Bindungsaffinität einer festkörperunterstützten
Lipidmembran nach molekularer Prägung für das Templat-Protein signifikant
höher ist als im festkörperunterstützen Lipidbilayer ohne Imprint.
Analog wie in Beispiel II beschrieben, wurde eine Kontrollsäule präpariert
und parallel denselben Waschvorgängen und Temperaturänderungen
unterzogen. Der einzige Unterschied lag darin, daß diese Säule nicht mit
einem Templat Protein inkubiert wurde. Dementsprechend befand sich am
Ende der Präparation der festkörperunterstützte Lipidbilayer der
Kontrollsäule ebenfalls in der Gel- bzw. kristallinen Phase, die
Lipidverteilung war jedoch unbeeinflußt von der Anwesenheit eines
Templat-Proteins. Diese Kontrollsäule, gepackt mit einem
festkörperunterstützten Lipidbilayer ohne molekulare Prägung, wurde vor
ihrer weiteren Verwendung für 12 h bei 4°C gelagert.
Um die Bindungsaffinitäten des Trypsin Inhibitors an festkörperunterstützte
Lipidmembranen mit und ohne molekulare Prägung vergleichen zu können,
wurden auf beide Säulen bei 4°C und einer Flußrate von 2 ml/min die
Menge von 0,5 ml (= 1 mg) Trypsin Inhibitor Stammlösung aufgetragen.
Nach der Proteinapplikation wurden beide Säulen 1 h lang mit Puffer A
gespült, um ungebundenes Protein vollständig von den Säulen zu
entfernen. Anschließend wurde ein identischer Salzgradient an beide
Säulen angelegt. UV-Monitoring des Säuleneluats wies die Elution des
Trypsin Inhibitors von der Säule mit spezifischer molekularer
Oberflächenprägung bei 420 mM NaCl nach, von der Kontrollsäule wurde
das Protein bereits bei 270 mM NaCl eluiert. Eine Integration der UV
Adsorptionssignale ergab analoge Peakflächenintegrale und zeigte, daß bei
den jeweiligen Salzkonzentrationen dieselbe Menge an Protein eluiert
worden war. Eine Erhöhung der Salzkonzentration bis zu 1M führte in
keinem der Fälle zu einer weiteren Proteinelution. Mit Hilfe von SDS
Gelektrophorese der Proteinfraktionen aus beiden
Chromatographieexperimenten wurde nachgewiesen , daß das UV-Signal
bei Elution von der geprägten Säule und der Kontrollsäule tatsächlich vom
selben Protein verursacht war. Nach Färbung mit Coomassie Blau zeigte
sich jeweils eine einzige Bande, die der des Trypsin Inhibitors entsprach.
Der Chromatographieprozeß - Beladen der Säulen mit anschließender
Elution mittels eines Salzgradienten - wurde bei beiden Säulen fünfmal
wiederholt, wobei die Elutionskonzentrationen bis auf eine Schwankung um
10 mM konstant blieben.
Die molekulare Oberflächenprägung auf festkörperunterstützten
Lipidbilayern kann durch Temperaturerhöhung über die
Phasenübergangstemperatur Tm gelöscht werden.
Die in Beispiel II beschriebene, mit Trypsin-Inhibitor geprägte Säule wurde
nach erfolgtem Imprint mit 0.1°C/s bei einer Flußrate von 2 ml/min auf
30°C erwärmt.
Analog wie in Beispiel II beschrieben wurden auf die Säule 2 ml (= 4 mg)
Trypsin Inhibitor appliziert und die Säule anschließend eine Stunde lang mit
einer Flußrate von 2 ml/min gespült. Danach wurde bei derselben
Temperatur mit Hilfe eines Salzgradienten eluiert. Der UV Monitor Peak des
Proteins wurde bei einer Salzkonzentration von 280 mM detektiert.
Erhöhung der NaCl Konzentration auf 1 M führte zu keiner weiteren
Proteinelution. Damit entsprachen die Elutionsbedingungen für den Trypsin
Inhibitor denen der Chromatographie auf festkörperunterstützten
Lipidbilayern ohne molekulare Oberflächenprägung (siehe Beispiel III). Der
Prozeß des Erwärmens über die Phasenübergangstemperatur führte
demnach zum Verlust der zuvor durch molekulare Oberflächenprägung
induzierten erhöhten Bindungsaffinität (Beispiel II).
Eine festkörperunterstützte Lipidmembran, bei der eine molekulare
Oberflächenprägung wie in Beispiel IV beschrieben wieder gelöscht wurde,
kann erneut mit einer spezifischen Oberflächenprägung versehen werden.
Die Säule aus Beispiel IV wurde ein weiteres Mal mit 0.1°C/min und einer
Flußrate von 2 ml/min auf 30°C erwärmt und bei dieser Temperatur und
gleicher Flußrate für 1 Stunde mit Puffer A gespült. Anschließend begann
der Vorgang der molekularen Oberflächenprägung mit der Applikation von 2
ml (= 4 mg) Trypsin Inhibitor wie detailliert in Beispiel II beschrieben. Auch
alle weiteren Schritte wurden in genauer Analogie zur Prozedur in Beispiel II
durchgeführt.
Zum Test auf erhöhte Bindungsaffinität auf Grund der molekularen
Oberflächenprägung wurden bei 4°C und einer Flußrate von 2 ml/min 0.5
ml (= 1 mg) Trypsin Inhibitor Stammlösung (siehe Beispiel II) appliziert. Um
ungebundenes Protein vollständig zu entfernen, wurde die Säule
anschließend 1 Stunde lang mit Puffer A gespült. Danach wurde wiederum
ein Salzgradient angelegt. Bei einer NaCl Konzentration von 430 mM
konnte die Elution von Trypsin Inhibitor mit Hilfe von UV Monitor Kontrolle
detektiert werden. Dieser Wert korrespondiert innerhalb der Fehlergrenzen
mit dem für eine Elution von Säulen mit spezifischer molekularer
Oberflächenprägung (siehe Beispiel III). Erhöhung der Salzkonzentration auf
1 M führte auch hier zu keiner weiteren Proteinelution.
Der Einbau elektrisch geladener Lipide in den festkörperunterstützten
Lipidbilayer allein reicht nicht aus, um eine molekulare Oberflächenprägung
mit erhöhter Bindungsaffinität für das Templat zu erzeugen.
In den Beispielen I-V wurde ein festkörperunterstützter Lipidbilayer
untersucht, der zu 30% aus Lipiden mit C-18 Ketten, sowie zu 70% aus
Lipiden mit einer Kettenlänge von 14 C-Atomen bestand. Solche
Bilayerstrukturen weisen zwangsweise mit C-18 angereicherte Regionen
auf, in denen der Bilayer im Vergleich zu einer Lipiddomäne mit C-14 Resten
3-5 Å dicker ist. Das Oberflächenprofil eines solchen festkörperunterstützen
Lipidbilayers kann man sich auf molekularer Ebene somit als flache
Lipidplateaus vorstellen, die von den 70% C-14 Lipiden gebildet werden.
Gelegentlich ragen Domänen der C-18 Lipide (30%) als erhöhte Plateaus
oder Peaks hervor. Verwendet man Lipidbilayer mit 70% C-18 Ketten und
30% C-14 Resten, so sollte sich das umgekehrte Bild ergeben, d. h. flache
Regionen an C-18 Lipiden mit gelegentlichen Einstülpungen der C-14
Domänen. In diesem Beispiel wurde Silikatgel analog wie in Beispiel I
beschrieben mit einer Mischung aus 70% DEPC, 20% DTDAB und 10%
DMPC beschichtet. Diese Mischung zeigt in DSC-Untersuchungen einen
Phasenübergang bei 18°C. An diesem festkörperunterstützten Lipidbilayer
wurde mit Trypsin Inhibitor als Templat das Verfahren der molekularen
Oberflächenprägung wie in Beispiel II beschrieben durchgeführt und danach
die Bindungsaffinität analog wie in Beispiel III beschrieben bestimmt. Die
Elution des Proteins nach Anlegen des Salzgradienten wurde bei 280 mM
NaCl detektiert. Dieser Wert entspricht innerhalb des Meßfehlers dem für
eine Säule ohne molekulare Oberflächenprägung. Damit ist belegt, daß trotz
Anwesenheit geladener Lipide kein molekularer Imprint auf dieser
festkörperunterstützten Lipidmembran erreicht werden konnte. Die Molecular
Imprint Prozedur bei der Säule aus Beispiel II hatte dagegen zu einer
signifikant erhöhten Bindungsaffinität für Trypsin Inhibitor geführt.
Das Prinzip der in den Beispielen II-V dargelegten neuen Form der
molekularen Oberflächenprägung ist nicht auf Trypsin Inhibitor als Templat
beschränkt. Tabelle l zeigt die Salzkonzentrationen bei Elution weiterer
Makromoleküle von festkörperunterstützten Lipidmembranen ohne bzw. mit
spezifischer Oberflächenprägung. Dabei ist hervorzuheben, daß in allen
Fällen dieselbe Lipidzusammensetzung (siehe Beispiel I) und sogar ein und
dieselbe Säule verwendet wurde. Die Säulen (Säule mit molekularem
Imprint und Kontrollsäule) wurden zwischen den Testreihen mit
unterschiedlichen Makromolekülen 1 Stunde lang mit 1M NaCl in Puffer A
(Flußrate 2 ml/min) gespült. Nach diesen Waschvorgängen wurde von
beiden Säulen (Imprint und Kontrolle) mit Hilfe einer Mikroliterspritze jeweils
vorsichtig vom oberen Ende der Säule ca. 100 µl Säulenmaterial
entnommen. Mit Hilfe von SDS-Page (einem biochemischen Standard-
Elektrophoreseverfahren zur Proteinanalyse nach Molekulargewicht) und
anschließender Coomassie-Blau-Färbung wurden die Proben auf
Kontaminationen an Test-Makromolekülen untersucht. Für keines der in
Tabelle I dokumentierten Beispiele konnte eine solche Ablagerung am
Säulenmaterial detektiert werden. Die Makromoleküle waren in Analogie
zum Trypsin Inhibitor (Beispiel II-V) bei diesem Versuch in Puffer A (gleiche
Konzentration der Stammlösungen) gelöst.
NaCl Konzentrationen (in mM) bei der Elution von Makromolekülen von
festkörperunterstützten Lipidmembranen ohne bzw. mit spezifischer
Oberflächenprägung
| Makromoleküle | Molecular Imprint |
| Kontrolle | |
| Katalase | 380 |
| 250 | |
| b-Lactoglobulin | 430 |
| 280 |
Das Beispiel zeigt, daß durch molekulare Oberflächenprägung selektiv die
Bindungsaffinität für das Templat-Protein steigt, während die Adsorptions
eigenschaften anderer Makromoleküle unbeeinflußt bleiben.
Eine Säule, bei der eine molekulare Prägung mit Trysin Inhibitor als Templat
(siehe Beispiel I-II) durchgeführt worden war, wurde analog wie in Beispiel III
beschrieben auf resultierende Änderung der Bindungseigenschaften für das
Templat-Protein untersucht. Die Elution des Trypsin Inhibitors wurde bei
einer NaCl Konzentration von 410 mM detektiert, was eine gelungene
spezifische Oberflächenprägung nachweist. Die Säule wurde anschließend
bei 4°C mit 1M NaCl gespült (Flußrate von 2 ml/min) und wieder salzfrei
gewaschen. Anschließend wurden bei gleicher Temperatur und Flußrate 0,5
ml (= 1 mg) Katalase, gelöst in Puffer A, appliziert. Die Elution der Katalase
erfolgte wie in Beispiel III beschrieben und wurde bei einer NaCl
Konzentration von 240 mM detektiert. Ein Vergleich mit den Werten aus
Tabelle l zeigt, daß dies dem Wert für Elution der Katalase von einer
Kontrollsäule ohne molekulare Oberflächenprägung entspricht. Es sollte nun
überprüft werden, ob nach Chromatographie von Katalase die molekulare
Prägung für Trypsin Inhibitor weiterhin vorhanden war. Dazu wurde die
Säule 1 Stunde lang mit 1M NaCl gewaschen und wieder salzfrei gespült.
Das Chromatographieexperiment wurde nun für Trypsin Inhibitor wiederholt.
Hier ergaben sich analoge Elutionsbedingungen wie vor der Katalase-
Applikation; d. h. Trypsin Inhibitor eluierte bei 420 mM NaCl von der Säule.
Anschließend wurde die molekulare Oberflächenprägung wie in Beispiel IV
beschrieben gelöscht. Zum Nachweis wurde erneut bei 4°C
Säulentemperatur Trypsin Inhibitor appliziert, dessen Elution nun wieder bei
280 mM NaCl erfolgte.
Die in Beispiel I beschriebene ternäre Lipidmischung wird auf das ebenfalls
in Beispiel l verwendete Silikatgel als Monolayer aufgebracht. Hierzu wird
das Silikatgel in der kommerziell verfügbaren silanisierten Form (mit
Octadecylsilan, Hersteller Fa. Macherey-Nagel, Düren) verwendet. Die
Aufbringung der Lipidmischung als Monolayer auf die hydrophobe
Silanoberfläche erfolgt nach in der Literatur beschriebenen Techniken
(Linseisen, F.; Hetzer, M.; Brumm, T.; Bayerl, T. M. Differences in the physical
properties of lipid monolayers and bilayers on a spherical solid support.
Biophysical Journal, 72, 1659-1667 (1997)). Das Ergebnis ist ein
beschichtetes Silikatgel, welches von Seiten der wäßrigen Phase praktisch
nicht von einem Bilayer zu unterscheiden ist und auch einen ähnlichen
Phasenübergang aufweist. Das Gel wurde analog zu den in den Beispielen
II bis VIII beschiebenen Imprinting-Anwendungen eingesetzt und lieferte
innerhalb der Meßfehler analoge Ergebnisse.
Claims (14)
1. Verfahren zur Templat-induzierten Strukturierung von Oberflächen und
ihre reversible Stabilisierung durch Phasenübergänge des strukturierten
Materials, dadurch gekennzeichnet, daß
ein Substanzgemisch, welches einen durch einen oder mehrere physikalische Parameter kontrollierbaren, reversiblen Phasenübergang zwischen einem hochbeweglichen, flüssigkeitsähnlichen Zustand (fluider Zustand) und einem festkörperartigen, kristallinen Zustand (gel- oder kristalliner Zustand) aufweist und welches sich zusammensetzt aus
ein Substanzgemisch, welches einen durch einen oder mehrere physikalische Parameter kontrollierbaren, reversiblen Phasenübergang zwischen einem hochbeweglichen, flüssigkeitsähnlichen Zustand (fluider Zustand) und einem festkörperartigen, kristallinen Zustand (gel- oder kristalliner Zustand) aufweist und welches sich zusammensetzt aus
- - einer Oberfläche an einer fest/flüssigen Grenzfläche, aufgebaut aus partiell orientierten, amphiphilen Molekülen (Amphiphile) unterschiedlicher chemischer Struktur,
- - einer Matrix (Templat) mit geometrischen Abmessungen, die größer sind als der Abstand zwischen zwei in der Oberfläche benachbarten Amphiphilen, die in engen Kontakt mit der Oberfläche gebracht wird unter Vermittlung nichtspezifischer , d. h. nicht von der spezifischen Templatstruktur abhängiger, Wechselwirkungen
- - und einer räumlichen Anordnung der Amphiphile innerhalb der Oberfläche, die so beschaffen ist, daß sie ein komplementäres Abbild eines Teils der äußeren, dreidimensionalen Kontour des Templates an den Stellen der Oberfläche ermöglicht, wo Templat und Oberfläche in besagten engen Kontakt gebracht wurden, und somit eine dreidimensional molekular geprägte Oberfläche darstellt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte
molekular geprägte Oberfläche durch folgende Schritte realisiert wird:
- a) Die im fluiden Zustand befindliche Oberfläche aus Amphiphilen wird mit dem Templat in engen Kontakt gebracht, der fluide Zustand ermöglicht hierbei eine langreichweitige laterale Diffusivität der Amphiphile in der Ebene der Oberfläche.
- b) Der Kontakt zwischen Oberfläche und Templat wird durch die Diffusion
der Amphiphile im Sinne einer Minimierung der freien Energie der
Wechselwirkung zwischen der dreidimensionalen Templatkontur und der
Oberfläche unter folgenden Gesichtspunkten selbstorganisierend optimiert:
- - Amphiphile mit größerer molekularer Länge reichern sich sich in Bereichen unterhalb des Templates an, welche durch Einstülpungen (negativ gekrümmte Oberflächenkontur) der Templatkontur gekennzeichnet sind, in die die Amphiphile partiell eindringen können wohingegen Amphiphile mit kürzerer molekularer Länge sich in solchen Bereichen anreichern, die durch Ausstülpungen (positiv gekrümmte Oberflächenkontur) der Templatkontur gekennzeichnet sind, die partiell in die Oberfläche eindringen können.
- - Amphiphile mit unterschiedlichen elektrischen Ladungen ihrer hydrophilen Gruppen reichern sich durch anziehende Coulomb-Wechselwirkung in jenen Bereichen unterhalb der Templatkontur an, wo sie optimal die von der Templatkontur zur Oberfläche exponierten entgegengesetzten Ladungen kompensieren können.
- c) Die Immobilisierung bzw. Stabilisierung der Oberfläche nach Optimierung des Kontaktes zwischen Templatkontur und Oberfläche erfolgt mittels Herbeiführung eines Phasenüberganges der Oberfläche von der fluiden in die gel-oder kristalline Phase durch die Veränderung eines physikalischen Parameters, wie zum Beispiel der Temperatur der Oberfläche. Dadurch werden langreichweitige laterale Diffusionsbewegungen der Amphiphile in der Oberfläche gestoppt.
- d) Die Entfernung des Templates von der Oberfläche erfolgt anschließend unter Bedingungen, bei denen die Oberfläche im gel-oder kristallinen Zustand verbleibt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte
molekular geprägte Oberfläche in ihren ungeprägten Ausgangszustand
durch folgende Schritte überführt werden kann:
- a) Überführung der molekular geprägten Oberfläche in Abwesenheit des Templates vom gel- oder kristallinen Zustand in den fluiden Zustand durch Veränderung eines physikalischen Parameters, wodurch die langreichweitige laterale Diffusion der Lipide wieder aktiviert wird.
- b) Inkubation der Oberfläche unter Bedingungen des fluiden Zustandes für eine Zeit, die ausreichend ist, um die homogene Verteilung aller Amphiphile über die Oberfläche durch Diffusion zu ermöglichen.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der besagte
physikalische Parameter die Temperatur der Oberfläche ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagten
Amphiphile aus Substanzen bestehen, die spontan Doppelschichtstrukturen
(Bilayer) bei Mischung mit einer wäßrigen Phase bilden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagten
Amphiphile zu der Stoffklasse der Lipide gehören, insbesondere Dialkyl
phosphatidylcholin, Dialkylphosphatidylethanolamin, Dialkylphosphatidyl
phosphatidsäure, Dialkylphosphatidylserin, Dialkylphosphatidylglycerol mit
gesättigten oder ungesättigten hydrophoben Alkyl oder Fettsäureketten, aber
auch Lipide welche hydrophile Bereiche mit carboxy-, amino- oder
tetraalkylammonium Gruppen, insbesondere N,N-dialkyl, N,N-di
methylammonium Gruppen, aufweisen, sowie alle Lipidkopfgruppen die
Zuckerverbindungen, Polyoxyethylenoxide oder derivatisierte Peptid-Reste
enthalten.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte
Oberfläche eine Doppelschicht (Bilayer) aus Lipiden ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte
Oberfläche eine Doppelschicht (Bilayer) aus Amphiphilen auf einem festen
Träger ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte
Oberfläche eine monomolekulare Schicht (Monolayer) aus Amphiphilen auf
einem hydrophoben festen Träger ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Templat
ein Makromolekül, insbesondere ein Protein, ein Enzym, ein Peptid, ein
Antigen, eine DNA, eine RNA, ist oder zu den Stoffklassen der
Polyampholyte, Polyelektrolyte, Co-Polymere von Polyionen oder
Polyzwitterinonen gehört.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Templat
eine biologische Zelle, eine Zellorganelle, ein Virus oder ein Teil eines Virus
ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagten
Wechselwirkungen sämtliche nicht-kovalenten Wechselwirkungen zwischen
Templat und Oberfläche umfassen, die von ihrer physikalischen Natur her
elektrostatisch attraktiv oder repulsiv, sterisch repulsiv, vom van-der-Waals
Typ oder Wasserstoffbrückenbindungen sind oder aus Kombinationen
dieser Wechselwirkungen bestehen.
13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der besagte
feste Träger ein Partikel kolloider Dimensionen ist, insbesondere ein
poröses oder nichtporöses Silikagel und ganz besonders zu einem Typ von
Silikagelen gehört, der üblicherweise in der Flüssigkeitschromatographie
Anwendung findet.
14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der besagte
hydrophobe feste Träger durch eine chemische Behandlung einer
Festkörperoberfläche, die in einer hydrophoben Beschichtung der
Oberfläche resultiert, erzeugt wird, wobei die hydrophobe Schicht kovalent
an die Oberfläche gebunden ist, wie dies beispielsweise durch die
Behandlung von Silikatoberflächen mit Organosilanen erreicht wird.
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Legal Events
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| 8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: NIMBUS BIOTECHNOLOGIE GMBH, 04299 LEIPZIG, DE |
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Free format text: BAYERL, THOMAS, PROF. DR., 97074 WUERZBURG, DE DECHER, GERO, PROF. DR., 77694 KEHL, DE BRAUNSCHWEIG, THOMAS, DR., 04279 LEIPZIG, DE |
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| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
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Ipc: B01J 2030 |
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