DE19725133A1 - Immuno-cyto-chemical detection of target cells - Google Patents

Immuno-cyto-chemical detection of target cells

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Abstract

Method for detecting rarely occurring cells (i.e present in small numbers among other cells) comprises (i) preparing a test sample in the form of a cell suspension; (ii) incubating the cell suspension with at least one indicator antibody associated with the cells to be detected and a labelling group, optionally in the presence of a detergent that causes transient permeabilisation of cell membranes; (iii) fixing the cells on a solid phase; and (iv) analysing the cells by detecting the label.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum immuncytochemischen Nachweis von seltenen Zellen in einer Probe und einen dafür geeigneten Reagenzienkit. Insbesondere werden das Verfahren und der Reagenzienkit zum Nachweis von Tumorzellen eingesetzt.The present invention relates to a method for immunocytochemical Detection of rare cells in a sample and a suitable one Reagent kit. In particular, the method and reagent kit used for the detection of tumor cells.

Trotz einer stetigen Weiterentwicklung von Behandlungsmethoden in den letzten Jahren ist es nicht gelungen, die Mortalität von Patienten mit soliden Tumoren deutlich zu senken. Dies ist sehr wahrscheinlich auf eine frühzeitige minimale Tumorzelldisseminierung zurückzuführen, die durch konventionelle Nachweismethoden nicht erkannt wird. Im Laufe der vergangenen Jahre wurden deshalb sensitive Nachweisverfahren entwickelt, um einzelne hämatogen disseminierte Karzinomzellen nachzuweisen. Unter den Sekundärorganen hat sich dabei das Knochenmark als besonders geeignetes Indikatororgan erwiesen, da es relativ leicht zugänglich ist und somit neben einem erweiterten Tumorstaging ebenso ein Monitoring adjuvanter Therapien ermöglichen kann.Despite the constant development of treatment methods in the Recent years have not had solid mortality from patients To significantly reduce tumors. This is most likely due to one early minimal tumor cell dissemination due to conventional detection methods are not recognized. During the In recent years, sensitive detection methods have therefore been developed to detect single hematogenously disseminated carcinoma cells. Under The bone marrow has become special to the secondary organs suitable indicator organ, since it is relatively easily accessible and monitoring as well as extended tumor staging adjuvant therapies.

Die immuncytochemische Anfärbung von Tumorzellen und anderen seltenen Zellen ist ein bereits in vielen Laboratorien validiertes Standardverfahren, mit dem typischerweise eine Zelle in 106 Normalzellen nachgewiesen werden kann.Immunocytochemical staining of tumor cells and other rare cells is a standard method that has already been validated in many laboratories and can typically be used to detect a cell in 10 6 normal cells.

Die Veröffentlichung Pantel et al. (J. Hematotherapy 3 (1994), 165-173) beschreibt den immuncytochemischen Nachweis von disseminierten epithelialen Tumorzellen im Knochenmark. Die zu testende Probe wird dabei einer Cytozentrifugation auf einem geeigneten Träger unterzogen, gefolgt von einem Trocknen der Zellen. Anschließend wird mit einem Nachweisan­ tikörper und einer Markierungsgruppe inkubiert und die Zellen durch den Nachweis der Markierungsgruppe analysiert.The publication Pantel et al. (J. Hematotherapy 3 (1994), 165-173) describes the immunocytochemical detection of disseminated epithelial tumor cells in the bone marrow. The sample to be tested is included subjected to cytocentrifugation on a suitable support, followed from drying the cells. Subsequently, with a certificate  antibody and a marker group and the cells by the Analysis of the marker group analyzed.

Als Nachweismethode wird bei Pantel et al. die in der Immuncytochemie weit verbreitete APAAP-Technik verwendet, wobei der tumorspezifische Nachweisantikörper (Primärantikörper), z. B. ein monoklonaler Mausantikör­ per, über einen Brückenantikörper, z. B. einen Anti-Maus-Antikörper, mit einem Komplex aus alkalischer Phosphatase (AP) und einem monoklonalen Mausantikörper gegen AP versetzt wird. Die APAAP-Technik zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität aus, hat aber den Nachteil, daß bei ca. 5% der analysierten Patientenproben falsch positive Zellen gefunden werden (Pantel et al., supra). Somit ist die Spezifität nicht optimal.Pantel et al. those in immunocytochemistry widely used APAAP technique, the tumor-specific Detection antibodies (primary antibodies), e.g. B. a monoclonal mouse antibody per, over a bridge antibody, e.g. B. an anti-mouse antibody with a complex of alkaline phosphatase (AP) and a monoclonal Mouse antibody against AP is added. The APAAP technology stands out due to a high sensitivity, but has the disadvantage that in about 5% of the Analyzed patient samples found false positive cells (Pantel et al., supra). The specificity is therefore not optimal.

In anderen Nachweisverfahren werden Direktkonjugate aus Antikörper und Nachweisgruppe zur Verbesserung der Spezifität verwendet. Doch auch diese Verfahren weisen Nachteile auf, da hier die Zellen vor der Inkubation mit dem Antikörper einer Cytozentrifugation unterzogen, getrocknet, permeabilisiert und fixiert werden müssen. Dies hat zur Folge, daß der Erhalt der Zellmorphologie nicht optimal ist. Darüber hinaus bewirkt die Permeabili­ sierung und Fixierung der Zellen mit aggressiven Reagenzien eine Ver­ änderung der Struktur der Zelloberfläche und des Zellinhalts, durch die die Spezifität und Sensitivität des Nachweises beeinträchtigt wird. Außerdem sind diese Verfahren durch die vielen Arbeitsschritte relativ zeitaufwendig.In other detection methods, direct conjugates of antibodies and Detection group used to improve specificity. But also these methods have disadvantages, since the cells are here before the incubation subjected to cytocentrifugation with the antibody, dried, must be permeabilized and fixed. As a result, the preservation cell morphology is not optimal. In addition, the permeabili effects Fixation and fixation of the cells with aggressive reagents a ver Change in the structure of the cell surface and the cell content by which the Specificity and sensitivity of the detection is impaired. Furthermore these procedures are relatively time-consuming due to the many work steps.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren zum immuncytochemischen Nachweis von Tumorzellen und anderen selten vorkommenden Zellen bereitzustellen, bei dem die Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise beseitigt sind. Insbesondere soll durch das erfindungsgemäße Verfahren ein besserer Erhalt der Zellmorphologie, eine bessere Differenzierung zwischen positiven und negativen Zellen, eine Vereinfachung des Verfahrensprotokolls und eine bessere Bereitstellung von Einzelzellen ermöglicht werden. The object underlying the present invention was therefore therein, a method for the immunocytochemical detection of tumor cells and other rare cells in which the Disadvantages of the prior art are at least partially eliminated. In particular, the method according to the invention is intended to provide better preservation cell morphology, better differentiation between positive and negative cells, a simplification of the procedure protocol and a better provision of single cells are made possible.  

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum immuncytochemischen Nachweis von selten vorkommenden Zellen, umfassend
The object of the invention is achieved by a method for immunocytochemical detection of rarely occurring cells, comprising

  • (a) Bereitstellen einer zu testenden Probe in Form einer Zellsuspension,(a) providing a sample to be tested in the form of a cell suspension,
  • (b) Inkubieren der Zellsuspension mit mindestens einem, mit den nachzuweisenden Zellen assoziierten Nachweisantikörper und einer Markierungsgruppe gegebenenfalls in Gegenwart eines Detergens, welches eine transiente Permeabilisierung von Zellmembranen bewirkt,(b) incubating the cell suspension with at least one with the Detection antibody associated with the cells to be detected and one Labeling group optionally in the presence of a detergent, which is a transient permeabilization of cell membranes causes
  • (c) Fixieren der Zellen auf einer Festphase und(c) fixing the cells on a solid phase and
  • (d) Analysieren der Zellen durch Nachweis der Markierungsgruppe.(d) Analyze the cells by detecting the labeling group.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zum Nachweis seltener Zellen in einer zu testenden Probe. "Selten vorkommend" im Sinne der vor­ liegenden Erfindung bedeutet dabei, daß die erwartete Häufigkeit der nachzuweisenden Zellen im Bereich von 1 : 104 bis 1 : 107 der gesamten in der zu testenden Probe vorhandenen Zellen ist. Beispiele für solche selten vorkommenden Zellen sind Tumorzellen in einer Blut- oder Knochenmarks­ probe, virusinfizierte periphere Blutzellen oder fetale Erythroblasten im mütterlichen Blut. Bei entsprechender Auswahl von zellassoziierten Antigenen und dagegen gerichteten Nachweisantikörpern können selbstver­ ständlich auch andere Arten selten vorkommender Zellen durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesen werden.The method according to the invention is suitable for the detection of rare cells in a sample to be tested. "Rarely occurring" in the sense of the present invention means that the expected frequency of the cells to be detected is in the range from 1:10 4 to 1:10 7 of the total cells present in the sample to be tested. Examples of such rare cells are tumor cells in a blood or bone marrow sample, virus-infected peripheral blood cells or fetal erythroblasts in the mother's blood. With an appropriate selection of cell-associated antigens and detection antibodies directed against them, other types of rarely occurring cells can of course also be detected by the method according to the invention.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird aufgrund der Inkubation mit dem Antikörper in Suspension eine intensivere Färbung erreicht, da die Zellmarker von allen Seiten aus zugänglich sind. Dies führt zu einer verbesserten positiv/negativ-Differenzierung. Die Inkubation in Suspension kann - wenn der verwendete Nachweisantikörper ein intrazellulär lokalisier­ tes Antigen erkennt - in Gegenwart von milden Detergenzien erfolgen, die eine transiente Permeabilisierung von Zellmembranen bewirken und nicht zu einer dauerhaften Denaturierung führen. Ein weiterer Vorteil des erfindungs­ gemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Zahl der Arbeitsschritte verringert wird, was zu einer Vereinfachung und zu einer erheblichen Zeitersparnis von ca. 50% gegenüber dem APAAP-Verfahren führt. Darüber hinaus wird ein besserer Erhalt der Zellmorphologie gewährleistet, da die mechanische Belastung durch die Cytozentrifugation wegfallen kann.Due to the incubation with the method according to the invention the antibody in suspension achieves a more intense staining because the Cell markers are accessible from all sides. This leads to a improved positive / negative differentiation. Incubation in suspension can - if the detection antibody used locates an intracellularly antigen recognizes - in the presence of mild detergents that occur cause a transient permeabilization of cell membranes and not to permanent denaturation. Another advantage of the invention  According to the procedure is that the number of steps is reduced, which leads to simplification and considerable Time savings of approx. 50% compared to the APAAP process. About that In addition, a better preservation of the cell morphology is guaranteed because the mechanical stress due to cytocentrifugation can be eliminated.

Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt das Bereitstellen einer zu testenden Probe in Form einer Zellsuspension. Hierzu wird eine Probe dem Patienten, z. B. aus einer Körperflüssigkeit wie etwa Blut oder aus dem Knochenmark entnommen. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis disseminierter Tumorzellen im Knochenmark verwendet. Dabei wird das Knochenmark vorzugsweise beidseitig aus dem oberen Beckenkamm abgenommen. Die Probe wird dann vorzugsweise auf mononukleare Zellen einschließlich Tumorzellen angereichert. Diese Anreicherung kann durch Dichtegradienten-Zentrifugation, z. B. mit Ficoll- oder Percoll-Trennlösung erfolgen, wobei eine Abtrennung von Erythrozyten und Granulozyten erfolgt.Step (a) of the method according to the invention comprises providing one sample to be tested in the form of a cell suspension. This will be a sample the patient, e.g. B. from a body fluid such as blood or from the Bone marrow taken. The invention is particularly preferred Method for the detection of disseminated tumor cells in the bone marrow used. The bone marrow is preferably removed from both sides of the upper iliac crest removed. The sample is then preferably on enriched mononuclear cells including tumor cells. This Enrichment can be done by density gradient centrifugation, e.g. B. with Ficoll or Percoll separation solution take place, with a separation of Erythrocytes and granulocytes occur.

Ein weiteres Beispiel zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Nachweis von fetalen Erythroblasten im mütterlichen Blut über die Detektion fetaler Antigene im Rahmen einer pränatalen Diagnostik. Auf diese Weise können die Risiken einer Chorionbiopsie bzw. einer Frucht­ wasserpunktion für die Mutter und vor allem für das Kind vermieden werden. Als Zielzellen sind fetale Erythroblasten besonders geeignet, weil sie anhand von spezifischen Unterschieden ihres Hämoglobins (embryonales Hämoglobin) von Blutzellen der Mutter unterschieden werden können (diese enthalten adultes Hämoglobin) und weil die fetalen Erythroblasten schon nach relativ kurzer Zeit wieder aus dem Blut der Mutter eliminiert werden. Diese Eigenschaft verringert das Risiko falschpositiver Ergebnisse aufgrund der irrtümlichen Analyse fetaler Zellen, die bereits aus einer früheren Schwangerschaft stammen. Another example of using the method according to the invention is the detection of fetal erythroblasts in the maternal blood via the Detection of fetal antigens as part of a prenatal diagnosis. On this can reduce the risk of a chorionic biopsy or fruit water puncture avoided for the mother and especially for the child will. Fetal erythroblasts are particularly suitable as target cells because based on specific differences in their hemoglobin (embryonic Hemoglobin) can be distinguished from the mother's blood cells (this contain adult hemoglobin) and because the fetal erythroblasts already can be eliminated from the mother's blood after a relatively short time. This property reduces the risk of false positive results due to the erroneous analysis of fetal cells from a previous one Pregnancy.  

Noch ein weiteres Beispiel für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Nachweis von virusinfizierten peripheren Blutzellen, z. B. von Cytomegalovirus-infizierten peripheren Blutzellen bei Transplantatem­ pfängern über die Detektion viraler Antigene wie etwa dem viralen Phosphoprotein 65.Yet another example of the application of the invention The procedure is the detection of virus-infected peripheral blood cells, e.g. B. of cytomegalovirus-infected peripheral blood cells in grafts capture through the detection of viral antigens such as the viral Phosphoprotein 65.

Die resultierende Zellsuspension wird in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem oder mehreren zellassoziierten Nachweisantikörpern und entsprechenden Markierungsgruppen gegebenenfalls in Gegenwart eines geeigneten Detergens inkubiert. Der zellassoziierte Nachweisantikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper und besonders bevorzugt ein monoklonales Antikörperfragment, z. B. ein Fab-Fragment.The resulting cell suspension is in step (b) of the invention Method with one or more cell-associated detection antibodies and corresponding labeling groups, if appropriate in the presence a suitable detergent. The cell-associated detection antibody is preferably a monoclonal antibody and particularly preferably a monoclonal antibody fragment, e.g. B. a Fab fragment.

Die Anwesenheit von Detergenzien ist zweckmäßig, wenn ein Nachweisanti­ körper verwendet wird, der ein intrazellulär lokalisiertes Antigen erkennt. Bei zelloberflächenassoziierten Antigenen ist die Verwendung von Detergenzien nicht zwingend erforderlich. Vorzugsweise wird jedoch ein Nachweisantikör­ per, der ein intrazellulär lokalisiertes Antigen erkennt, in Kombination mit einem Detergenz verwendet.The presence of detergents is useful if a detection body that recognizes an intracellularly located antigen. At cell surface associated antigens is the use of detergents not mandatory. However, a detection antibody is preferred per who recognizes an intracellularly located antigen in combination with a detergent.

Beim Nachweis von Tumorzellen ist der Nachweisantikörper gegen ein Antigen gerichtet, das in der zu testenden Probe nur in Tumorzellen, aber nicht in normalen Zellen nachweisbar ist. Vorzugsweise ist das Antigen eine Struktur aus dem Inneren der Zelle, z. B. ein Cytokeratin. Cytokeratine sind für Epithelzellen spezifische Bestandteile des Cytoskeletts und werden in mononuklearen Zellen aus Blut oder Knochenmark, die mesenchymalen Ursprungs sind, nicht exprimiert. Die Anwesenheit von Cytokeratinen in Zellen, die aus Blut und Knochenmark entnommen wurden, weist somit auf das Vorhandensein epithelialer Tumorzellen hin. Beispiele für geeignete Anti- Cytokeratinantikörper sind der Antikörper CK2, der gegen Cytokeratin-18 gerichtet ist, oder der Antikörper A45-B/B3, der gegen ein in allen bisher untersuchten Epithelien exprimiertes Cytokeratin-Epitop gerichtet ist (Kasper et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 2 (1987), 137-147). Besonders bevorzugt als Nachweisantikörper ist das Fab-Fragment von A45-B/B3. Weitere tumorassoziierte Antigene und dagegen gerichtete Nachweisantikörper sind bei Pantel und Riethmüller (Oncology Today 11 (1994), 4-9) und darin enthaltenen Zitaten beschrieben und sind kommerziell z. B. von Ortho Diagnostic Systems GmbH, Neckargmünd, Deutschland, Dako Diagnostika GmbH, Hamburg, Deutschland, Biotest AG, Dreieich, Deutschland oder Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland erhältlich.When detecting tumor cells, the detection antibody is against one Antigen directed in the sample to be tested only in tumor cells, however is not detectable in normal cells. Preferably the antigen is one Structure from inside the cell, e.g. B. a cytokeratin. Are cytokeratins components of the cytoskeleton specific for epithelial cells and are described in mononuclear cells from blood or bone marrow, the mesenchymal Are of origin, not expressed. The presence of cytokeratins in Cells that were taken from blood and bone marrow thus have the presence of epithelial tumor cells. Examples of suitable anti Cytokeratin antibodies are the antibody CK2, which is against cytokeratin-18 is directed, or the antibody A45-B / B3, against one in all so far investigated epithelia expressed cytokeratin epitope (Kasper  et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 2: 137-147 (1987). Particularly preferred the Fab fragment of A45-B / B3 is the detection antibody. Further are tumor-associated antigens and detection antibodies directed against them in Pantel and Riethmüller (Oncology Today 11 (1994), 4-9) and therein contained citations described and are commercially z. B. from Ortho Diagnostic Systems GmbH, Neckargmünd, Germany, Dako Diagnostika GmbH, Hamburg, Germany, Biotest AG, Dreieich, Germany or Becton Dickinson, Heidelberg, Germany available.

Beim Nachweis von Erythroblasten ist der Nachweisantikörper gegen ein Antigen gerichtet, das in der zu testenden Probe nur in den fetalen Zellen, aber nicht in mütterlichen Zellen nachweisbar ist. Vorzugsweise ist das Antigen fetales Hämoglobin. Beispiele für geeignete Antikörper gegen fetales Hämoglobin sind bei Muensch et al. (Blut 49 (1984), 203-211), Moscoso et al. (Clin. Chem. 35 (1989), 2066-2069) und Turpeinen und Stenman (Clin. Chem. 38 (1992), 2013-2018) beschrieben.When detecting erythroblasts, the detection antibody is against one Antigen directed in the sample to be tested only in the fetal cells, but is not detectable in maternal cells. Preferably that is Antigen fetal hemoglobin. Examples of suitable antibodies against fetal hemoglobin are described in Muensch et al. (Blut 49 (1984), 203-211), Moscoso et al. (Clin. Chem. 35 (1989), 2066-2069) and Turpeinen and Stenman (Clin. Chem. 38 (1992), 2013-2018).

Für den Nachweis viraler Zellen wird ein Antikörper verwendet, der gegen ein virusspezifisches Antigen gerichtet ist. Beispiele für Nachweisantikörper, welche für die Detektion von Cytomegalovirus-infizierten Zellen geeignet sind, sind beispielsweise bei Halwachs et al. (Transplantation 56 (1993), 338-342), Jiwa et al. (J. Clin. Pathol. 42 (1989), 749-754, Jiwa (Histoche­ mistry 91 (1989), 345-349), Musiani et al. (Histochemistry 94 (1990), 21-25) und Jiwa et al. (Cytometry 16 (1994), 69-73) beschrieben. Darüber hinaus sind solche Nachweisantikörper kommerziell z. B. von Biotest AG, Dreieich, Deutschland erhältlich.An antibody is used for the detection of viral cells a virus-specific antigen is targeted. Examples of detection antibodies which are suitable for the detection of cytomegalovirus-infected cells are, for example, in Halwachs et al. (Transplantation 56 (1993), 338-342), Jiwa et al. (1989, J. Clin. Pathol. 42: 749-754, Jiwa (Histoche mistry 91 (1989), 345-349), Musiani et al. (Histochemistry 94 (1990), 21-25) and Jiwa et al. (Cytometry 16 (1994), 69-73). About that In addition, such detection antibodies are commercially available e.g. B. from Biotest AG, Dreieich, Germany available.

Die Markierungsgruppe zum Nachweis der Zellen kann grundsätzlich jede beliebige dem Stand der Technik bekannte Markierungsgruppe sein. Bevorzugt ist die Markierungsgruppe jedoch ein Enzym, insbesondere die alkalische Phosphatase (AP). Der Nachweisantikörper kann indirekt mit der Markierungsgruppe gekoppelt sein, z. B. über einen oder mehrere Brücken­ antikörper wie bei der APAAP-Methode oder aber mit der Markierungs­ gruppe direkt verbunden sein. Besonders bevorzugt verwendet man eine direkte Markierung, d. h. der Nachweisantikörper liegt als Konjugat, z. B. als kovalentes Konjugat mit der Markierungsgruppe vor.The marker group for the detection of the cells can basically be any any marker group known in the art. However, the labeling group is preferably an enzyme, in particular that alkaline phosphatase (AP). The detection antibody can indirectly with the Marking group be coupled, e.g. B. over one or more bridges  antibodies as with the APAAP method or with the marker group directly connected. One is particularly preferably used direct marking, d. H. the detection antibody is a conjugate, e.g. B. as covalent conjugate with the labeling group.

Für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Verwendung eines Detergens bevorzugt, welches eine transiente Permeabilisierung von Zellmembranen bewirkt, die ein Eindringen des Nachweisantikörpers in das Innere der Zelle ermöglicht, ohne die Morphologie der Zelle signifikant zu beeinträchtigen. Vorzugsweise verwendet man ein Detergens aus der Klasse der Saponine. Saponine sind im allgemeinen pflanzliche Steroid- oder Triterpenoid- Glykoside, die in Wasser kolloidale, seifenartige Lösungen bilden. Saponine können beispielsweise aus Seifenkraut, Kastanien, Efeu, Primeln, Ringel­ blumen, Kornraden, Rüben, Sojabohnen, Ahorn, Seifenbohnenbaum, Ruscus, Ginseng und Panamarinde, aber auch aus tierischen Quellen, beispielsweise aus Seegurken gewonnen werden. Neben den Saponinen sind auch ihre Aglykone, die Sapogenine geeignet. Besonders bevorzugt wird Saponin aus Seifenwurzel oder Panamarinde verwendet.The use of a detergent is for the method according to the invention preferred, which is a transient permeabilization of cell membranes causes the detection antibody to penetrate into the interior of the cell enables without significantly affecting the morphology of the cell. A detergent from the class of saponins is preferably used. Saponins are generally herbal steroid or triterpenoid Glycosides that form colloidal, soap-like solutions in water. Saponins can be made of soapwort, chestnuts, ivy, primroses, marigolds, for example flowers, grain wheels, beets, soybeans, maple, soap bean tree, Ruscus, ginseng and panamarind, but also from animal sources, for example from sea cucumbers. In addition to the saponins their aglycons, the sapogenins, are also suitable. Particularly preferred Soap root or panamarind saponin is used.

Das Detergens wird in einer ausreichenden Menge verwendet, um eine transiente Permeabilisierung der Zellmembran zu bewirken, die das Eindringen des Nachweisantikörpers in die Zelle ermöglicht. Die bevorzugte Detergenskonzentration in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt im Allgemeinen im Bereich von 0,001 bis 0,5% (Gew/Vol), besonders bevorzugt beträgt die Detergenskonzentration ca. 0,01% (Gew./Vol.).The detergent is used in an amount sufficient to produce a to effect transient permeabilization of the cell membrane, which Allows detection antibody to enter the cell. The preferred Detergent concentration in step (b) of the method according to the invention is generally in the range of 0.001 to 0.5% (w / v), especially the detergent concentration is preferably approximately 0.01% (w / v).

Das Fixieren der Zellen im erfindungsgemäßen Verfahren kann grundsätzlich nach allen aus dem Stand der Technik bekannten Methoden erfolgen, z. B. mit Formaldehyd. Überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren auch schonendere Fixierungsmittel verwendet werden können, wie beispielsweise Glutardialdehyd. In principle, the cells can be fixed in the method according to the invention by all methods known from the prior art, for. B. with formaldehyde. Surprisingly, however, it was found that the The method according to the invention also uses gentler fixing agents can be, such as glutardialdehyde.  

Die Fixierung der Zellen auf einer Festphase kann ebenfalls nach bekannten Methoden erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Fixierung auf Objektträgern, z. B. auf Adhäsionsobjektträgern, d. h. auf Objektträgern, die mehrere Reaktionsfelder mit hydrophiler Oberfläche enthalten, auf denen die Zellen durch elektrostatische Kräfte verankert werden können. Diese Reaktions­ felder sind durch eine hydrophobe Beschichtung begrenzt, auf der eine Adhäsion der Zellen nicht erfolgt. Solche Adhäsionsobjektträger werden beispielsweise von der Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Bad Mergentheim, Deutschland vertrieben.The fixation of the cells on a solid phase can also be done according to known Methods are done. The fixation is preferably carried out on slides, e.g. B. on adhesion slides, d. H. on slides that have multiple Contain reaction fields with a hydrophilic surface on which the cells can be anchored by electrostatic forces. This reaction fields are delimited by a hydrophobic coating on which one Cell adhesion did not occur. Such slides will be for example from Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Bad Mergentheim, Germany expelled.

Nach der Fixierung werden die Zellen durch Nachweis der Markierungs­ gruppen analysiert. Bei enzymatischen Markierungsgruppen wird vor der Analyse noch ein Farbreagenz den Zellen zugesetzt, um eine Anfärbung zu erreichen.After fixation, the cells are identified by detection of the label groups analyzed. In the case of enzymatic labeling groups, the Analysis added a color reagent to the cells to stain them to reach.

Die Analyse der Zellen kann durch mikroskopische Auswertung, z. B. mit einem Durchlichtmikroskop, vorzugsweise mit Phasenkontrast, gegebenen­ falls in einem automatischen Bildanalysesystem erfolgen. Solche Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt.The analysis of the cells can be done by microscopic evaluation, e.g. B. with a transmitted light microscope, preferably with phase contrast if done in an automatic image analysis system. Such procedures are known from the prior art.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können wertvolle diagnostische Daten an Tumorpatienten gewonnen werden, z. B. an Patienten mit Karzinomen des Colorectums, der Brustdrüse, des Magens, der Prostata, der Niere, der Harnblase, des Ösophagus und des Kopf-Hals-Bereiches.Valuable diagnostic Data can be obtained from tumor patients, e.g. B. to patients with Carcinomas of the colorectum, breast, stomach, prostate, Kidney, bladder, esophagus and head and neck.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich selbstverständlich auch zur Durchführung von Mehrfachfärbetechniken, bei denen eine weitere Charakterisierung der nachzuweisenden Tumorzellen erfolgen kann. So kann beispielsweise ein Anti-Cytokeratin-Antikörper mit einem Antikörper kombiniert werden, der gegen ein weiteres tumorrelevantes Antigen gerichtet ist, z. B. das erbB2 Antigen oder das Ki-67 Antigen. Bei solchen Mehrfachfärbetechniken wird zweckmäßigerweise für jeden Antikörper eine unterschiedliche Nachweisgruppe verwendet, wobei die Kombination eines Enzyms mit einem Partikel, der einen fluoreszierenden Farbstoff trägt, besonders bevorzugt ist.The method according to the invention is of course also suitable for Implementation of multiple staining techniques, where another Characterization of the tumor cells to be detected can take place. So can for example an anti-cytokeratin antibody with an antibody can be combined against another tumor-relevant antigen is directed, e.g. B. the erbB2 antigen or the Ki-67 antigen. In such Multiple staining techniques are conveniently used for each antibody  different detection group used, the combination of one Enzyme with a particle that carries a fluorescent dye, is particularly preferred.

Weiterhin kann Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Isolierung der Zellen oder/und darin enthaltener Nukleinsäuren umfassen. Die im erfindungsgemäßen Verfahren angewandten schonenden Techniken zur Färbung und Fixierung der Zellen erlauben die anschließende Abnahme einzelner Zellen (Picken) von der Festphase, z. B. von einem Adhäsions­ objektträger, mit Hilfe eines Mikromanipulators. Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß einzelne Zellen relativ leicht wieder von der Festphase abgelöst werden können, ohne daß die Zellen dabei beschädigt werden. Nach konventioneller Cytozentrifugation auf Objektträger ist dies nicht möglich, da hier die Zellen sehr starken Kräften ausgesetzt und in ihrer Struktur verändert werden. Sie werden regelrecht plattgedrückt und sitzen sehr fest auf dem Objektträger. Die Zellen können nur sehr schwer in intakter Form wieder isoliert werden und zerreißen in der Regel beim Versuch der Abnahme. Dadurch ist es praktisch nicht möglich, Nukleinsäuren aus den Zellen ohne Verluste und in intakter Form zu gewinnen.Furthermore, step (d) of the method according to the invention can be a Isolation of the cells and / or nucleic acids contained therein include. The gentle techniques used in the method according to the invention for staining and fixation of the cells allow the subsequent removal single cells (picking) from the solid phase, e.g. B. from an adhesion slide, using a micromanipulator. The special advantage of The method according to the invention is that individual cells are relatively light can be detached from the solid phase again without the cells thereby being damaged. After conventional cytocentrifugation This is not possible for slides, since the cells have very strong forces exposed and changed in their structure. You become real flattened and sit very firmly on the slide. The cells can very difficult to isolate intact form and tear in the Usually when trying to take off. This makes it practically impossible Nucleic acids from the cells without loss and intact win.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden insbesondere bei Ver­ wendung von Adhäsionsobjektträgern die Zellen vollständig in ihrer dreidimensionalen Form erhalten und können ohne Rückstände intakt abgelöst werden. An den so gewonnenen Einzelzellen können weitere Analysen, wie etwa genomische Analysen, z. B. mit der Technik der Interphase-FISH vorgenommen werden. Weiterhin ist sichergestellt, daß auch die in den Zellen enthaltenen Nukleinsäuren, z. B. DNA, komplett und unversehrt isoliert werden können. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß durch Anwendung der erfindungsgemäßen Färbetechnik keine negativen Auswirkungen auf die Gewinnung und weitere Analyse der Nukleinsäuren auftreten. Nach Amplifikation von in den Zellen enthaltenen Nukleinsäuren, z. B. mit Einzelzell-PCR, können genomische Analysen beispielsweise mit der Technik der vergleichenden genomischen Hybridi­ sierung (CGH) durchgeführt werden.The method according to the invention, in particular with Ver using adhesion slides, the cells completely in their three-dimensional shape and can be left intact without residue be replaced. Additional cells can be obtained from the individual cells obtained in this way Analyzes, such as genomic analyzes, e.g. B. with the technique of Interphase-FISH can be made. It is also ensured that also the nucleic acids contained in the cells, e.g. B. DNA, complete and can be isolated intact. Surprisingly, it was found that by using the dyeing technique according to the invention none negative effects on the extraction and further analysis of the Nucleic acids occur. After amplification contained in the cells  Nucleic acids, e.g. B. with single cell PCR, genomic analyzes can for example with the technique of comparative genomic hybridi be carried out (CGH).

Weiterhin betrifft die Erfindung auch einen Reagenzienkit zum immuncyto­ chemischen Nachweis von selten vorkommenden Zellen, umfassend:
Furthermore, the invention also relates to a reagent kit for the immuncyto-chemical detection of rarely occurring cells, comprising:

  • (a) mindestens einen zellassoziierten Nachweisantikörper,(a) at least one cell-associated detection antibody,
  • (b) mindestens eine Markierungsgruppe,(b) at least one marker group,
  • (c) gegebenenfalls ein Detergens, welches eine transiente Permeabilisie­ rung von Zellmembranen bewirkt, und(c) optionally a detergent which has a transient permeabilization causes cell membranes, and
  • (d) ein Mittel zur Fixierung von Zellen auf einer Festphase.(d) an agent for fixing cells on a solid phase.

Außerdem kann der erfindungsgemäße Reagenzienkit noch weitere Komponenten wie Pufferlösungen, Färbelösungen und eine Festphase wie etwa Objektträger enthalten. Der oder die zellassoziierten Nachweisanti­ körper liegen vorzugsweise als direktes Konjugat mit einer Markierungs­ gruppe vor.In addition, the reagent kit according to the invention can still be further Components such as buffer solutions, staining solutions and a solid phase such as about slides included. The cell-associated detection or the anti bodies preferably lie as a direct conjugate with a label group in front.

Schließlich betrifft die Erfindung auch die Verwendung von Saponinen als Detergenzien in einem immuncytochemischen Verfahren zur transienten Permeabilisierung von Zellen, insbesondere zur Permeabilisierung von suspendierten Zellen.Finally, the invention also relates to the use of saponins as Detergents in an immunocytochemical procedure for transient Permeabilization of cells, in particular for the permeabilization of suspended cells.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zum Nachweis von epithelialen Zellen in Präparationen mononuklearer Zellen oder in Zell­ suspensionen aus anderen nichtepithelialen Geweben (z. B. Lymphknoten). Im Vergleich zu der aus dem Stand der Technik bekannten APAAP-Färbung, bei der zum Teil nur schwach und ungleichmäßig angefärbte Zellen erhalten werden (siehe auch Abb. 1a), wird durch das erfindungsgemäße Verfahren ein wesentlich besseres Ergebnis erhalten (vgl. Abb. 1b). Diese intensive und gleichmäßige Färbung der Zellen wird sogar bei Nachweis von Zellen erreicht, bei denen die Expression von Cytokeratinen, die von dem in den Beispielen verwendeten Nachweisantikörper erkannt werden, relativ schwach ist. Außerdem ist aus den Abb. 1a und 1b ersichtlich, daß bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Morphologie der Tumorzellen besser erhalten bleibt.The method according to the invention is particularly suitable for the detection of epithelial cells in preparations of mononuclear cells or in cell suspensions from other non-epithelial tissues (e.g. lymph nodes). In comparison to the APAAP staining known from the prior art, in which cells are only stained weakly and unevenly in part (see also Fig. 1a), the method according to the invention gives a significantly better result (see Fig. 1b ). This intensive and uniform staining of the cells is achieved even when cells are detected in which the expression of cytokeratins, which are recognized by the detection antibody used in the examples, is relatively weak. It can also be seen from FIGS. 1a and 1b that the morphology of the tumor cells is better preserved when the method according to the invention is used.

Beim Nachweis von seltenen Zellen, z. B. von Tumorzellen verschiedenen Gewebeursprungs und aus verschiedenen Patienten, die hinsichtlich der Expression der nachzuweisenden Antigene, z. B. von Cytokeratinen, sehr heterogen sind, kommen die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders zum Tragen, da auch Zellen mit einer schwachen Antigen­ expression, die mit der herkömmlichen Technik nur schlecht oder gar nicht detektierbar sind, durch das erfindungsgemäße Verfahren gut erkannt werden können.When detecting rare cells, e.g. B. different from tumor cells Tissue origin and from different patients regarding the Expression of the antigens to be detected, e.g. B. of cytokeratins, very are heterogeneous, the advantages of the method according to the invention especially useful because it also contains cells with a weak antigen expression that with the conventional technology only poorly or not at all are detectable, easily recognized by the method according to the invention can be.

Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgenden Abbildungen und Beispiele erläutert. Es zeigen:The invention is further illustrated by the following figures and Examples explained. Show it:

Abb. 1a den immuncytochemischen Nachweis von A-431 Tumorzellen nach der APAAP-Methode (40fache Vergrößerung) und Fig. 1a the immunocytochemical detection of A-431 tumor cells by the APAAP method (40x magnification) and

Abb. 1b den immuncytochemischen Nachweis von A-431 Tumorzellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (40fache Vergrößerung). Fig. 1b the immunocytochemical detection of A-431 tumor cells by the method according to the invention (40 times magnification).

BeispieleExamples 1. Immuncytochemischer Nachweis von Tumorzellen mit der APAAP-Methode1. Immunocytochemical detection of tumor cells with the APAAP method

Periphere mononukleare Blutzellen (PBMNC) werden mit Zellen der epithelialen Tumorzellinie A-431 (Giard et al., J. Natl. Cancer Inst. 51 (1973), 1417-1423) in einem Verhältnis von 10 : 1 versetzt und auf eine Gesamtkonzentration von 1 × 106 Zellen/ml PBS eingestellt.Peripheral mononuclear blood cells (PBMNC) are mixed with cells of the epithelial tumor cell line A-431 (Giard et al., J. Natl. Cancer Inst. 51 (1973), 1417-1423) in a ratio of 10: 1 and to a total concentration of 1 × 10 6 cells / ml PBS adjusted.

Alle Arbeitsschritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt.All work steps are carried out at room temperature.

Die Zentrifugation der Zellen auf handelsübliche Glas-Objektträger erfolgt mit der Hettich Cytozentrifuge Universal 30 F. Dazu werden 500 µl der Zellsuspension (5 × 105 Zellen, entspricht 2000 Zellen/mm2 Reaktionsfeld) pro Cytokammer (Fassungsvermögen 8 ml) eingefüllt und mit 120 g 3 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand vorsichtig mit einer Pipette abgenommen und die Cytospins werden für 1 bis 24 Stunden luftgetrocknet. Anschließend können sie sofort gefärbt oder bei -20°C bis zu 6 Monate aufbewahrt werden. Der immuncytochemische Nachweis erfolgt mit dem murinen monoklonalen Antikörper A45-B/B3 (Kasper et al., supra), der gegen ein in allen bisher untersuchten Epithelien exprimiertes Cytokeratin-Epitop gerichtet ist.The cells are centrifuged on commercially available glass slides using the Hettich Universal 30 F cytocentrifuge. 500 μl of the cell suspension (5 × 10 5 cells, corresponds to 2000 cells / mm 2 reaction field) per cytic chamber (capacity 8 ml) are filled in and 120 g centrifuged for 3 minutes. After centrifugation, the supernatant is carefully removed with a pipette and the cytospins are air dried for 1 to 24 hours. They can then be dyed immediately or stored at -20 ° C for up to 6 months. The immunocytochemical detection is carried out with the murine monoclonal antibody A45-B / B3 (Kasper et al., Supra), which is directed against a cytokeratin epitope expressed in all the epithelia examined to date.

Um ein Austrocknen der Objektträger zu vermeiden, werden die Inkubations­ schritte in einer Inkubationskammer für Objektträger (Luft mit Wasserdampf gesättigt) durchgeführt. Die verwendeten Antikörper werden mit AB-Serum (Biotest, 1 : 10 verdünnt mit PBS) verdünnt.To prevent the slides from drying out, the incubations steps in an incubation chamber for slides (air with water vapor saturated). The antibodies used are with AB serum (Biotest, 1:10 diluted with PBS) diluted.

Zur Absättigung unspezifischer Bindungen werden die Objektträger zunächst mit 10% AB-Serum/PBS 20 Minuten inkubiert. Überschüssiges Serum wird entfernt. Dabei ist darauf zu achten, daß die Objektträger nicht austrocknen. Es folgt die Inkubation mit dem Antikörper A45-B/B3 (2 µg/ml) für 45 Mi­ nuten. Danach werden die Objektträger in einer Inkubationsküvette für Objektträger 3 × 3 Minuten mit PBS gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Im nächsten Schritt erfolgt die Inkubation mit dem Brückenantikörper (1 µg/ml) für 30 Minuten. Dabei handelt es sich um einen Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörper (Dako). Nach erneutem Waschen (3 × 3 Mi­ nuten mit PBS) wird 30 Minuten mit einem Komplex aus alkalischer Phosphatase (AP) und einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen AP inkubiert (APAAP-Komplex, Dako, 1,6 µg/ml). Nach weiterem Waschen (3 × 3 Minuten mit PBS) wird die Färbung durchgeführt. Es wird eine Färbelösung verwendet, die Neufuchsin als Farbreagenz enthält.The slides are first used to saturate non-specific bindings incubated with 10% AB serum / PBS for 20 minutes. Excess serum will away. Make sure that the slides do not dry out. This is followed by incubation with the antibody A45-B / B3 (2 µg / ml) for 45 mi grooves. The slides are then placed in an incubation cell for Slides washed 3 × 3 minutes with PBS to free them Remove antibodies. The next step is to incubate with the Bridge antibody (1 µg / ml) for 30 minutes. It is a Rabbit anti-mouse IgG antibody (Dako). After washing again (3 × 3 Mi with PBS) is 30 minutes with a complex of alkaline  Phosphatase (AP) and a mouse monoclonal antibody against AP incubated (APAAP complex, Dako, 1.6 µg / ml). After further washing (3 × 3 minutes with PBS) the staining is carried out. It will be one Staining solution used that contains Neufuchsin as a color reagent.

Die Färbung der Objektträger wird in der Inkubationskammer durchgeführt. Pro Reaktionsfeld werden 300 µl der Färbelösung aufgetragen und es wird 10 Minuten inkubiert. Überschüssige Färbelösung wird entfernt. Die Objektträger werden in einer Küvette 3 Minuten mit PBS gewaschen. Dieser Schritt wird zweimal mit destilliertem Wasser anstelle von PBS wiederholt. Das restliche Wasser wird entfernt. Anschließend wird auf die Reaktions­ felder Eindeckmedium (Kaisers Glyzeringelatine, Merck) aufgetragen und die Auftragsflächen mit Deckgläsern abgedeckt.The slides are stained in the incubation chamber. 300 µl of the staining solution are applied per reaction field and it is Incubated for 10 minutes. Excess staining solution is removed. The Slides are washed in a cuvette with PBS for 3 minutes. This Step is repeated twice with distilled water instead of PBS. The remaining water is removed. Then the reaction fields mounting medium (Kaisers Glyzeringelatine, Merck) and the Application areas covered with cover glasses.

Die gefärbten Präparate werden mit einem Lichtmikroskop ausgewertet. Epitheliale Zellen werden durch die rote Färbung ihres Zytoplasmas erkannt (Abb. 1a).The colored preparations are evaluated with a light microscope. Epithelial cells are recognized by the red color of their cytoplasm ( Fig. 1a).

2. Immunzytochemischer Nachweis von Tumorzellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren2. Immunocytochemical detection of tumor cells after method according to the invention

Periphere mononukleare Blutzellen (PBMNC) werden mit Zellen der epithelialen Tumorzellinie A-431 in einem Verhältnis von 10 : 1 versetzt und auf eine Gesamtkonzentration von 2 × 106 Zellen/ml eingestellt.Peripheral mononuclear blood cells (PBMNC) are mixed with cells of the epithelial tumor cell line A-431 in a ratio of 10: 1 and adjusted to a total concentration of 2 × 10 6 cells / ml.

Alle Arbeitsschritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Als Nachweisantikörper wird der auch im Beispiel 1 verwendete Antikörper A45-B/B3 in Form eines Fab-Antikörperfragment-AP-Konjugats verwendet.All work steps are carried out at room temperature. As The antibody also used in Example 1 becomes a detection antibody A45-B / B3 used in the form of a Fab antibody fragment-AP conjugate.

Zu 500 µl der Zellsuspension werden in einem 2 ml Reaktionsgefäß (Eppendorf) 5 µl Antikörperlösung (0,387 mg/ml Antikörper-Enzym- Konjugat) und 5 µl Saponinlösung (10 mg/ml Saponin (Sigma S-7900) in PBS) zugegeben.500 µl of the cell suspension are added to a 2 ml reaction vessel (Eppendorf) 5 µl antibody solution (0.387 mg / ml antibody-enzyme  Conjugate) and 5 µl saponin solution (10 mg / ml saponin (Sigma S-7900) in PBS) added.

Die anschließende Inkubation für 30 Minuten erfolgt unter schwacher Bewegung auf einem Taumler (Heidolph, Polymax 1040). Nach der Inkubation werden 1,5 ml NKH-Puffer (2 mM Hepes pH 7,4; 0,8% NaCl; 0,04% KCl) zugesetzt und die Zellsuspension 5 Minuten bei 250 g zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und das Zellpellet in 400 µl NKH-Puffer resuspendiert.The subsequent incubation for 30 minutes is carried out under weak Movement on a tumbler (Heidolph, Polymax 1040). After Incubate 1.5 ml of NKH buffer (2 mM Hepes pH 7.4; 0.8% NaCl; 0.04% KCl) and the cell suspension for 5 minutes at 250 g centrifuged. The supernatant is removed and the cell pellet in 400 µl NKH buffer resuspended.

Die Adhäsionsobjektträger (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG) werden entsprechend den Herstellerangaben vorbereitet und mit NKH-Puffer gespült. Jeweils 200 µl der Zellsuspension (5 × 105 Zellen) werden auf ein Reak­ tionsfeld (Durchmesser 18 mm) aufgetragen (2000 Zellen/mm2). Nach 20-minütiger Sedimentation und Adhäsion der Zellen wird der Puffer entfernt. Zur Fixierung der Zellen werden die Objektträger für 5 Minuten in einer Inkubationsküvette für Objektträger mit einer Glutardialdehyd enthaltenden Fixierungslösung inkubiert und anschließend in NKH-Puffer gewaschen. Die mit Zellen beschichteten Objektträger können nun gefärbt werden. Es wird die gleiche Färbelösung wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet.The adhesion slides (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG) are prepared according to the manufacturer's instructions and rinsed with NKH buffer. In each case 200 µl of the cell suspension (5 × 10 5 cells) are applied to a reaction field (diameter 18 mm) (2000 cells / mm 2 ). After 20 minutes of sedimentation and cell adhesion, the buffer is removed. To fix the cells, the slides are incubated for 5 minutes in an incubation cuvette for slides with a fixation solution containing glutardialdehyde and then washed in NKH buffer. The slides coated with cells can now be stained. The same coloring solution as described in Example 1 is used.

Um ein Austrocknen zu vermeiden, werden die Objektträger in eine Inkubationskammer für Objektträger (Luft mit Wasserdampf gesättigt) überführt. Pro Reaktionsfeld werden 300 µl der Färbelösung aufgetragen und 10 Minuten inkubiert. Überschüssige Färbelösung wird entfernt. Die Objektträger werden in einer Küvette 3 Minuten mit PBS inkubiert. Dieser Waschschritt wird zweimal mit destilliertem Wasser anstelle von PBS wiederholt. Das restliche Wasser wird entfernt. Anschließend wird auf die Reaktionsfelder Eindeckmedium (Kaisers Glyzeringelatine) aufgetragen und die Auftragsflächen mit Deckgläsern abgedeckt. To avoid drying out, the slides are placed in a Incubation chamber for slides (air saturated with water vapor) transferred. 300 µl of the staining solution are applied to each reaction field and incubated for 10 minutes. Excess staining solution is removed. The Slides are incubated in a cuvette with PBS for 3 minutes. This Wash step twice with distilled water instead of PBS repeated. The remaining water is removed. Then the Reaction fields mounting medium (Kaisers Glyzeringelatine) applied and the application areas covered with cover glasses.  

Die gefärbten Präparate werden mit einem Lichtmikroskop ausgewertet. Epitheliale Zellen werden durch die intensive rote Färbung ihres Cytoplas­ mas erkannt (Abb. 1b).The colored preparations are evaluated with a light microscope. Epithelial cells are recognized by the intense red color of their cytoplasm ( Fig. 1b).

Claims (18)

1. Verfahren zum immuncytochemischen Nachweis von selten vorkom­ menden Zellen, umfassend
  • (a) Bereitstellen einer zu testenden Probe in Form einer Zell­ suspension,
  • (b) Inkubieren der Zellsuspension mit mindestens einem, mit den nachzuweisenden Zellen assoziierten Nachweisantikörper und einer Markierungsgruppe gegebenenfalls in Gegenwart eines Detergens, welches eine transiente Permeabilisierung von Zellmembranen bewirkt,
  • (c) Fixieren der Zellen auf eine Festphase und
  • (d) Analysieren der Zellen durch Nachweis der Markierungsgruppe.
1. A method for immunocytochemical detection of rare cells, comprising
  • (a) providing a sample to be tested in the form of a cell suspension,
  • (b) incubating the cell suspension with at least one detection antibody associated with the cells to be detected and a labeling group, optionally in the presence of a detergent which brings about a transient permeabilization of cell membranes,
  • (c) fixing the cells to a solid phase and
  • (d) Analyze the cells by detecting the labeling group.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierungsgruppe ein Enzym verwendet.2. The method according to claim 1, characterized, that an enzyme is used as the labeling group. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markierungsgruppe die alkalische Phosphatase (AP) verwendet.3. The method according to claim 2, characterized, that the labeling group is alkaline phosphatase (AP) used. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Tumorzellen nachweist.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized, that one detects tumor cells. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Nachweisantikörper verwendet, der gegen Cytokera­ tine gerichtet ist. 5. The method according to claim 4, characterized, that one uses a detection antibody against Cytokera tine is directed.   6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweisantikörper gegen das vom Antikörper A45-B/B3 erkannte Epitop gerichtet ist.6. The method according to claim 5, characterized, that the detection antibody against the antibody A45-B / B3 recognized epitope is directed. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man fetale Erythroblasten nachweist.7. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized, that fetal erythroblasts are detected. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Cytomegalovirus-infizierte periphere Blutzellen nachweist.8. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized, that one detects peripheral blood cells infected with cytomegalovirus. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Konjugat von Nachweisantikörper und Markierungs­ gruppe verwendet.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized, that a conjugate of detection antibody and label group used. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Detergens aus der Klasse der Saponine verwendet.10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized, that one uses a detergent from the class of saponins. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Fixieren der Zellen durch Glutardialdehyd erfolgt.11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized, that the cells are fixed by glutardialdehyde. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Fixieren der Zellen auf Objektträgern erfolgt. 12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized, that the cells are fixed on slides.   13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man Adhäsionsobjektträger verwendet.13. The method according to claim 12, characterized, that one uses adhesion slides. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Analysieren der Zellen durch mikroskopische Auswertung erfolgt.14. The method according to any one of claims 1 to 13, characterized, that analyzing the cells by microscopic evaluation he follows. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Analysieren eine Isolierung der Zellen oder/und darin enthaltener Nukleinsäuren umfaßt.15. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized, that analyzing an isolation of the cells or / and therein contained nucleic acids. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Amplifikation von in den Zellen enthaltenen Nu­ kleinsäuren durchführt.16. The method according to claim 15, characterized, that an amplification of Nu contained in the cells performs small acids. 17. Reagenzienkit zum immuncytochemischen Nachweis von selten vorkommenden Zellen, umfassend:
  • (a) mindestens einen zellassoziierten Nachweisantikörper,
  • (b) mindestens eine Markierungsgruppe,
  • (c) gegebenenfalls ein Detergens, welches eine transiente Permeabilisierung von Zellmembranen bewirkt, und
  • (d) ein Mittel zur Fixierung von Zellen auf einer Festphase.
17. A reagent kit for immunocytochemical detection of rare cells, comprising:
  • (a) at least one cell-associated detection antibody,
  • (b) at least one marker group,
  • (c) optionally a detergent which transiently permeabilizes cell membranes, and
  • (d) an agent for fixing cells on a solid phase.
18. Kit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der zellassoziierte Nachweisantikörper als Konjugat mit der Markierungsgruppe vorliegt.18. Kit according to claim 17, characterized, that the cell-associated detection antibody as a conjugate with the Marker group is present.
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