DE19681363C2

DE19681363C2 - Carbazinfarbstoffe und Derivate für pH-Wertmessungen

Info

Publication number: DE19681363C2
Application number: DE19681363T
Authority: DE
Inventors: Roger E Smith
Original assignee: Utah Medical Products Inc
Current assignee: Utah Medical Products Inc
Priority date: 1995-04-27
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2016-04-27
Also published as: DE19681363T1; CA2219117A1; WO1996034284A1; AU5575796A; US5567624A; GB9722470D0; GB2314626B; GB2314626A; AU697978B2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mittel zum Anzeigen des pH-Werts einer Lösung, das einen fluoreszierenden Carbazinfarbstoff umfaßt, der kovalent an einen festen Träger gebunden ist. Sie betrifft auch ein faseroptisches System, das eine Sonde, die ein solches Mittel enthält, eine an die Sonde gekoppelte optische Faser und ein damit verbundenes Fluorometer umfaßt. Ferner betrifft sie ein Verfahren zum Anzeigen des pH-Werts einer Lösung, bei dem das Mittel in die Lösung gegeben wird, das Mittel mit Licht einer ausgewählten Wellenlänge in Kontakt gebracht wird, um den Carbazinfarbstoff zur Fluoreszenz anzuregen, die Intensität der Fluoreszenz bei zwei verschiedenen Wellenlängen gemessen wird, das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten bei den zwei gewählten Wellenlängen berechnet wird und das Verhältnis mit einer vorgegebenen Beziehung für solche Verhältnisse mit dem pH-Wert korreliert wird.

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft Carbazinfarbstoffe und Derivate derselben zum Zweck der pH-Wertmessung. In besondere betrifft die Erfindung Carbazinfarbstoffe, Mittel bzw. Zusammensetzungen, die an feste Träger gebundene Carbazinfarbstoffe enthalten, und Ver fahren zur Verwendung dieser Carbazinfarbstoffe und Mittel und Indikatoren zum Messen des pH-Werts.

Die Wasserstoffionenkonzentration oder der pH-Wert ist ein extrem wichtiger Parameter in biologischen und vielen chemi schen Systemen. Viele chemische und biologische Reaktionen er fordern eine genaue Regelung des pH-Werts, damit Reaktionen richtig ablaufen. Beispielsweise findet ein komplexes natürli ches Verfahren zur Regelung des pH-Werts in menschlichem Blut statt, das normalerweise einen pH-Wert von etwa 7,4 hat. Ver änderungen von selbst einigen Zehnteln einer pH-Werteinheit können ernste Krankheitszustände oder den Tod verursachen. Die Kohlendioxidkonzentration des Bluts beeinflußt den pH-Wert aufgrund der Eigenschaft von CO₂, mit Wasser unter Bildung von Kohlensäure zu kombinieren, erheblich. Hämoglobin spielt bei der Regulierung des pH-Werts von Blut eine kritische Rolle, indem es Kohlendioxid von den Kapillaren zu den Lungen trans portiert, und auch dadurch, daß es mit Plasmaproteinen als Puffer wirk. Die Lungen entfernen normalerweise Kohlendioxid aus dem Blut so rasch, wie es gebildet wird, und tragen so zum Aufrechterhalten eines konstanten pH-Werts bei. Die Nieren ha ben auch eine Hauptrolle bei der Regulierung der Was serstoffionenkonzentration der intracellulären und extracellu lären Flüssigkeiten durch Sekretion von sauren oder basischen Bestandteilen, wenn diese vom Normwert abweichen, und stellen das Gleichgewicht wieder her.

Obwohl eine Vielfalt von Techniken entwickelt worden ist, um den pH-Wert zu messen, basieren diese allgemein auf entwe der elektrochemischen oder optischen Prinzipien. Ein Standard- Labormeßgerät für den pH-Wert umfaßt beispielsweise eine Stan dardelektrode mit bekanntem Potential, eine spezielle Glas elektrode, die das Potential in Abhängigkeit von der Konzen tration der Wasserstoffionen in der Lösung ändert, in die sie eintaucht, und ein Potentiometer, welches das Potential zwi schen den beiden Elektroden mißt. Die Potentiometerablesung wird automatisch elektronisch in eine direkte Ablesung des pH- Werts der untersuchten Lösung umgewandelt. Indikatoren sind auf der anderen Seite Farbstoffe, die die optischen Eigen schaften, wie Extinktion (Absorbtion) oder Fluoreszenz, mit Veränderungen des pH-Werts ändern. Die größte Empfindlichkeit von Indikatoren auf kleine Änderungen des pH-Werts liegt vor, wenn die Gleichgewichtskonstante zwischen den sauren und basi schen Formen des Indikators, d. h. der pK_a-Wert, nahe dem pH- Wert des gemessenen Mediums liegt.

Als breite Verallgemeinerung werden optische Messungen des pH-Werts als den elektrochemischen Techniken unterlegen ange sehen, hauptsächlich weil von der Wasserstoffionenkonzentrati on verschiedene Faktoren wie Temperatur, Ionenstärke und Pro teinkonzentration die Farbstoffe beeinflussen und pH-Wert messungen stören. Dennoch haben optische Techniken erhebliche Vorteile, wenn Kosten und Größe eine Rolle spielen. Unter den optischen Techniken sind auf Fluoreszenz basierende Verfahren aufgrund des wohlbekannten Empfindlichkeitsvorteils der Mes sung von emittiertem gegenüber absorbiertem Licht empfindli cher als solche, die auf Extinktion basieren. Unglücklicher weise ist die Fluoreszenzemission aus typischen Farbstoffen wesentlich empfindlicher gegenüber Störfaktoren als die Ex tinktion. Messungen von pH-abhängiger Emissionsintensität in einzelnen Zellen oder auf faseroptischen Medien mit einer ein zigen Anregungswellenlänge leidet an Falschergebnissen, die mit der Farbstoffkonzentration, Photobleichung des Farbstoffs und Zellendicke oder Weglänge zusammenhängen.

Eine Lösung des Problems der Farbstoffkonzentration be steht in der Bestimmung des Verhältnisses der Fluoreszenzmenge bei einer festen Wellenlänge mit Anregung bei einer pH-emp findlichen Wellenlänge zu der Fluoreszenzmenge bei der glei chen Wellenlänge mit Anregung bei einer relativ pH-unemp findlichen Wellenlänge. Dieses Verfahren wird üblicherweise verwendet, um den pH-Wert im Inneren von Zellen mit Fluores zeinderivaten zu schätzen, z. B. Paradiso et al., 325 Nature 477 (1987), und ist praktisch für Suspensionen von Zellen und in homogenen Flüssigkeiten in einem Forschungsfluorometer oder Mikroskop. Es ist jedoch üblicherweise unpraktisch, zwei un terschiedliche Wellenlängen von Licht mit bekannter Intensität zum Anregen von Fluoreszenz in Fließsystemen einschließlich Fließcytometern oder faseroptischen Systemen zum kontinuierli chen Aufzeichnen des pH-Werts von strömenden Flüssigkeiten wie Blut zu erzeugen. Die US-A-4 945 171 beschreibt Xanthenfarb stoffe mit einem kondensierten (c)-Benzoring, die die Vorteile zeigen, daß sie zwei Emissionsmaxima bei Anregung bei nur ei ner Wellenlänge mit Selektivität bei der unabhängigen Anregung von Säure- und Baseform und Messung von deren Emission bei entweder einer einzigen oder zwei Wellenlängen und Messung von charakteristischen pH-abhängigen Absorptions- oder Fluores zenzanregungsspektren messen können. Verglichen mit den Carba zinfarbstoffen der vorliegenden Erfindung zeigen diese Xan thinfarbstoffe eine geringere Fluoreszenz, geringere Stabili tät, höhere Temperaturempfindlichkeit und geringere Stokes- Verschiebungen und sie sind schwierig auf einem festen Träger zu immobilisieren.

R. Hill et al., The Phenol Dyestuff of Liebermann as an Acridan Derivate, J. Chem. Soc. (C) 2462 (1970), beschreiben ein Acridanderivat, 7-Hydroxyspiro[acridin-9,1'-cyclohexa- 2',5'-dien]-2[9H],4'-dion, das als Oxidations-Reduktions-Indi kator verwendet worden ist. Diese Verbindung und verwandte Acridanderivate, 4',7-Dihydroxyspiro[acridin-9,1'-cyclohexan]- 2(9H)-on, 7-Hydroxy-2',3',5',6'-tetramethylspiro[acridin-9,1'- cyclohexa-2',5'-dien]-2(9H),4'-dion, 9,9-Diphenyl-7-hydroxy acridin-2(9H)-on und 9,9-Dimethyl-7-hydroxyacridin-2(9H)-an ergeben blaue Lösungen in Schwefelsäure, die bei Verdünnung rot werden, wobei diese Farbe auf die Protonierung der freien Base zurückzuführen ist. Die neutralen Formen der Verbindungen sind in den meisten Lösungsmitteln gelb. Ein Verfahren zum Synthetisieren dieser Verbindungen ist auch offenbart.

Aus der US-A-5,308,581 ist ein Indikator zur Verwendung in einer Lumineszenz-optischen Konfiguration zur kontinuierlichen und reversiblen Messung des pH-Wertes einer Probe innerhalb eines relevanten Meßbereichs bekannt, wobei die Probe minde stens in indirektem Takt mit der Indikatorsubstanz steht, die als Base B^* bereitgestellt wird und eine Lumineszenz-Zerfalls zeit tauabhängig von dem pH-Wert der Probe hat, Beispiele für Indikatoren sind beispielsweise Acridin und Salycilaldehyd, 3- Indolylessigsäure, Acrydon und Naphtol.

Aus der US-A-4,139,342 wird ein Verfahren zum Dozieren von La serfarbstoffen in Plastik beschrieben, wobei dieses Verfahren die Kontrolle des Dotierungsprofils zur Erzielung von Profilen erlaubt, die nicht gleichmäßig sind und zur wirksamen Lasermo duskontrolle notwendig sind, das farbstoffimprägnierte Kunst stofflasermedium ist in der Lage, bei Frequenzen über 0,65 µm zu lasern und umfaßt ein festest Harz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polymethylmethacrylat, Polystyrol, Epoxy- und Polyesterpolymeren, die mit einem Farbstoff ausgewählt aus Carbopyronin- und Carbazinfarbstoff dotiert sind.

Aus der US-A-3,781,711 ist die Verwendung von versteiften Di- und Triphenylmethanfarbstoffen sowie der Azaderivate derselben als Lasermedien in Flüssigfarbstofflasern bekannt. Es sind darin Lasermedien beschrieben, die bestimmte dieser Farbstoffe enthalten und dahingehend als vorteilhaft befunden wurden, daß sie in der roten und nahen Infrarotregion des elektromagneti schen Spektrums lasern.

In Anbetracht des Vorhergehenden wird erkannt, daß pH- empfindliche Farbstoffe und Verfahren ihrer Verwendung zur Be stimmung des pH-Werts mit verminderter Empfindlichkeit gegen über potentiell störenden Faktoren und wesentlich verbesserter pH-Wert-Meßleistung in biologischen Systemen, von denen die meisten im Bereich von 5 bis 9 arbeiten, eine wesentliche Ver besserung des Stands der Technik darstellen würden.

Aufgaben und Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pH-emp findliche Fluoreszenzfarbstoffe und Verfahren zu ihrer Verwen dung zur Bestimmung des pH-Werts zu liefern.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Fluoreszenz farbstoffe und ein Verfahren zur optischen Messung des pH- Werts zu schaffen, daß die störenden Effekte der Temperatur, Ionenstärke und Anwesenheit anderer Moleküle wie Proteine we sentlich verringert.

Es ist ebenfalls eine Aufgabe der Erfindung, Fluoreszenz farbstoffe und ein Verfahren zur optischen Messung des pH- Werts zu schaffen, das pH-Wertmessungen in biologischen Syste men im Bereich von pH 5 bis 9 wesentlich verbessert.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, Fluores zenzfarbstoffe und ein Verfahren zur optischen Messung des pH- Werts mit den Vorteilen von stärkerer Fluoreszenz, größerer Stabilität, geringerer Temperaturempfindlichkeit und größerer Stokes-Verschiebung als bisher bekannt zu liefern.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfingung, auf einem festen Träger immobilisierte Fluoreszenzfarbstoffe und ein Verfahren der optischen pH-Wertmessung mit diesen zu schaffen.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, einen faserop tischen pH-Sensor unter Verwendung von fluoreszierenden Carba zinfarbstoffen zu schaffen.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, fluores zierende Farbstoffe und ein Verfahren zur pH-Wertbestimmung zu schaffen, bei dem alle Anregungs- und Emissionswellenlängen im sichtbaren Bereich liegen, so daß preisgünstige faseroptische Materialien aus Kunststoff in einem faseroptischen pH-Sensor verwendet werden können.

Diese und andere Ziele werden erreicht, indem ein Mittel zum Anzeigen des pH-Werts einer Lösung geschaffen wird, in die das Mittel gegeben wird, das einen fluo reszierenden Carbazinfarbstoff umfaßt, der kovalent an einen festen Träger gebunden ist, wobei das Farbstoff-Träger-Mittel durch die Formel

D-B-M

wiedergegeben wird, in der M irgendein fester Träger ist, der eine funktionelle Gruppe enthält oder derivatisiert ist, um eine funktionelle Gruppe zu enthalten, die mit Hydrazin reak tiv ist, so daß die Umsetzung mit Hydrazin einen hydrazinderi vatisierten festen Träger bildet; D irgendein fluoreszierender Carbazinfarbstoff ist, der mit dem hydrazinderivatisierten fe sten Träger am 1-Kohlenstoffatom des Spirorings reaktiv ist, und B das Bindeglied ist, dessen kovalente Anbindung durch Reaktion zwischen dem hydrazinderivatisierten festen Träger und dem 1- Kohlenstoffatom des Carbazinfarbstoffs gebildet wird. Der Car bazinfarbstoff (D) der Zusammensetzung wird durch die Formel

wiedergegeben, in der R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils unabhängig aus gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H und Alkyl. Vor zugsweise ist der Carbazinfarbstoff ein Farbstoff mit einer einzigen Anregung und zweifacher Emission. Vorzugsweise ist H ein kovalent gebundenes Bindeglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -NHNH-, =N-NH- und =N-N=. Vorzugsweise ist M ein Mitglied aus gewählt aus der Gruppe bestehend aus gegenüber Oxidation mit Periodat empfindlichen Polymeren, mit Epoxid reaktiven Trä gern, anorganischen Trägern, Polyaldehyden und Poly(methyl ketonen). Bevorzugte gegenüber Oxidation mit Periodat empfind liche Polymere schließen Papier, Stärke, Cellulose, Amylose, Rayon, Cellophan und Mischungen derselben ein. Bevorzugte mit Epoxid reaktive Träger schließen Träger ein die eine oberflä chen-funktionelle Gruppe enthalten, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Amino, Carbonsäure und Anhy drid. Bevorzugte anorganische Träger schließen Glas, Glasfa sern, Sand, Siliciumdioxidgel, Aluminiumoxid, Titandioxid, Nickeloxid, Aluminiumoxid, Zirconiumdioxid und Mischungen der selben ein, wobei Glas, Glasfasern, Sand, Siliciumdioxidgel, Aluminiumoxid und Mischungen derselben besonders bevorzugt sind. Bevorzugte Polyaldehyde schließen Polyacrolein und poly merisiertes Glutaraldehyd ein.

Ein pH-Indikator umfaßt einen fluoreszierenden Carbazinfarbstoff, der kovalent an Hydrazin oder ein substituiertes Hydrazin gebunden ist, wo bei der Indikator ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

ist, wobei R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H und Alkyl und R- ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und Alkyl. Vorzugsweise ist der Carba zinfarbstoff ein Carbazinfarbstoff mit einer einzigen Anregung und zweifacher Emission.

Ein faseroptisches System zur Bestimmung des pH-Werts um faßt

a) eine Sonde zum Anzeigen des pH-Werts einer Lösung, in die die Sonde gegeben wird, die einen fluoreszierenden Carbazinfarbstoff umfaßt, der kovalent an einen festen Träger gebunden ist, wobei das Farbstoff-Träger-Mittel durch die Formel wiedergegeben wird, in der M irgendein fester Träger ist, der eine funktionelle Gruppe enthält oder derivatisiert ist, um eine funktionelle Gruppe zu enthalten, die mit Hydrazin reaktiv ist, so daß die Umsetzung mit Hydrazin einen hydrazinderivatisierten festen Träger bildet; D ir gendein fluoreszierender Carbazinfarbstoff ist, der mit dem hydrazinderivatisierten festen Träger am 1- Kohlenstoffatom des Spirorings reaktiv ist, und B ein Bindeglied ist, dessen kovalente Anbindung durch Umsetzung zwischen dem hydrazinderivatisierten festen Träger und dem 1- Kohlenstoffatom des Spirorings gebildet ist;
b) eine an diese Sonde gekoppelte optische Faser zum Emp fang von Anregungslicht aus einem Fluorometer und Leiten des Anregungslichts zu der Sonde und zum Empfang von emittiertem Licht aus der Sonde und Leiten des emittier ten Lichtes zu dem Fluorometer;
c) ein mit der optischer. Faser gekoppeltes Fluorometer zur Erzeugung von Anregungslicht mit einer gewählten Wellen länge und Abgabe des Anregungslichts an die Faser, zum Empfangen und Messen von Intensitäten des emittierten Lichtes bei einer ersten gewählter Wellenlänge und bei einer deutlich verschiedenen zweiten gewählten Wellen länge und zur Erzeugung eines elektronischen Signals, das Messungen der Intensitäten enthält; und
d) an das Fluorometer gekoppelte Einrichtungen zum Empfang des elektronischen Signals, zum Berechnen eines Verhält nisses der gemessenen Intensitäten, zum Korrelieren des Verhältnisses mit einer zuvor bestimmten Beziehung sol cher Verhältnisse zu dem pH-Wert und zum Anzeigen des pH-Werts umfaßt.

Die Faser umfaßt vorzugsweise eine Kunststoffaser und die Sonde liegt vorzugsweise in Form einer Perle vor. Die gewählte Wellenlänge des Anregungslichts liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 480 bis etwa 540 nm, wobei die erste gewählte Wellen länge des emittierten Lichts im Bereich von etwa 570 bis etwa 620 nm liegt und die zweite gewählte Wellenlänge des emittier ten Lichts im Bereich von etwa 650 bis etwa 720 nm liegt.

Ein Verfahren zur Bestimmung des pH-Werts einer Lösung um faßt die Stufen, in denen

a) eine Zusammensetzung bereitgestellt wird, die einen fluoreszierenden Carbazinfarbstoff umfaßt, der kovalent an einen festen Träger gebunden ist, wobei das Farb stoff-Träger-Mittel durch die Formel
D-B-M
wiedergegeben wird, in der M irgendein fester Träger ist, der eine funktionelle Gruppe enthält oder derivatisiert ist, um eine funktionelle Gruppe zu enthalten, die mit Hydrazin reaktiv ist, so daß die Umsetzung mit Hydrazin einen hydrazinderivatisierten festen Träger bildet; D ir gendein fluoreszierender Carbazinfarbstoff ist, der mit dem hydrazinderivatisierten festen Träger am 1- Kohlenstoffatom des Spirorings reaktiv ist, und B ein Bindeglied ist, dessen kovalente Anbindung durch Umsetzung zwischen dem hydrazinderivatisierten festen Träger und dem 1- Kohlenstoffatom des Spirorings gebildet ist;
b) das Mittel in die Lösung gegeben wird, deren pH-Wert bestimmt werden soll;
c) das Mittel in der Lösung mit Licht einer ge wählten Wellenlänge in Kontakt gebracht wird, um die Emission von Fluoreszenzlicht durch den Carbazinfarb stoff anzuregen;
d) die Intensitäten des Fluoreszenzlichts bei einer ersten gewählten Wellenlänge und einer deutlich verschiedenen zweiten gewählten Wellenlänge gemessen werden;
e) ein Verhältnis der gemessenen Intensität bei der ersten gewählten Wellenlänge und der zweiten gewählten Wellen länge berechnet wird; und
f) das Verhältnis mit einer vorbestimmten Beziehung dieser Verhältnisse mit dem pH-Wert korreliert wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung der Absorption eines beispielhaften Carbazinfarbstoffs bei Wellenlängen im Bereich von 400 bis 800 nm bei verschiedenen pH-Werten.

Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung der Fluoreszenz emission der Säure- und Baseformen eines beispielhaften Carba zinfarbstoffs bei Wellenlängen im Bereich von etwa 500 bis 800 nm.

Fig. 3 zeigt eine graphische Darstellung der Fluoreszenz emission der Säure- und Baseformen eines Carbazinazins bei Wellenlängen im Bereich von etwa 500 bis 800 nm.

Fig. 4 zeigt eine graphische Darstellung des Emissions verhältnisses (Emission bei 590 nm, geteilt durch Emission bei 680 nm) als Funktion des pH-Werts für Pufferproben, die mit einem erfindungsgemäßen faseroptischen pH-Wertmeßsystem analy siert wurden.

Fig. 5 zeigt eine graphische Darstellung des Emissions verhältnisses als Funktion des pH-Werts für proteinhaltige Pufferproben mit einem erfindungsgemäßen faseroptischen pH- Wertmeßsystem.

Fig. 6 zeigt ein schematisches Diagramm eines optischen Systems eines beispielhaften Fluorometers zur Verwendung zur erfindungsgemäßen pH-Wertbestimmung.

Fig. 7 zeigt ein Blockdiagramm eines elektronischen Sy stems eines beispielhaften Fluorometers zur Verwendung zur er findungsgemäßen pH-Wertbestimmung.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Bevor die vorliegenden Zusammensetzungen bzw. Mittel bzw. Indikatoren und Verfahren für pH-Wertmessungen auf Basis von Carbazinfarbstoff offenbart und beschrieben werden, sei darauf hingewiesen, daß diese Erfin dung nicht auf die hier offenbarten speziellen Verfahrens schritte und Materialien begrenzt ist, da solche Verfahrens schritte und Materialien etwas variieren können. Es ist auch so zu verstehen, daß die hier verwendete Terminologie und die hier verwendeten Bespiele nur zum Zweck der Beschreibung spe zieller Ausführungsformen dienen und nicht einschränkend sein sollen, da der Bereich der vorliegenden Erfindung nur durch die angefügten Patentansprüche und Äquivalente derselben be grenzt wird.

Es ist zu beachten, daß Verwendung in dieser Beschrei bung ung sen angefügten Patentansprüchen die Singularformen "ein", "eine" und "der", "die", "das" auch die Pluralformen einschließen, wenn der Kontext nicht eindeutig etwas anderes sagt. Somit schließt der Verweis auf eine Zusammensetzung bzw. Mittel, die bzw. das "einen Carbazinfarbstoff" enthält, den Verweis auf eine Mischung aus zwei oder mehr solchen Carbazinfarbstoffen ein, Verweise auf "einen festen Träger" schließen Verweis auf einen oder mehrere solcher festen Träger ein, und der Verweis auf "eine funktionelle Gruppe" schließt den Verweis auf eine Mi schung aus zwei oder mehr solchen funktionellen Gruppen ein.

Bei der Beschreibung und in den Patentansprüchen der vor liegenden Erfindung wird die folgende Terminologie gemäß den nachfolgend beschriebenen Definitionen verwendet.

Wie hier verwendet bedeutet "gegenüber Oxidation mit Pe riodat empfindliches Polymer" ein Polymer, das an benachbarte Kohlenstoffatome gebundene -OH Gruppen enthält, so daß bei Oxidation mit Periodsäure die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung gespalten wird und diese -OH Gruppen zu Aldehydgruppen oxi diert werden. Bevorzugte gegenüber Oxidation mit Periodat emp findliche Polymere schließen Papier, Stärke, Cellulose, Amylo se, Rayon, Cellophan und dergleichen und Mischungen derselben ein.

Wie hier verwendet bedeutet ein "mit Epoxid reaktiver Trä ger" einen festen Träger, der eine funktionelle Gruppe ent hält, die mit einem Epoxid reaktiv ist, was zur Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem festen Träger und dem Epoxid führt. Solche funktionellen Gruppen, die mit einem Epoxid re aktiv sind, schließen Hydroxyl-, Amin-, Carbonsäure- und Anhy dridgruppen ein.

Wie hier verwendet bedeutet "anorganischer Träger" einen festen Träger, der aus einem anorganischen Material zusammen gesetzt ist. Bevorzugte anorganische Träger schließen Glas, Glasfasern, Sand, Siliciumdioxidgel, Aluminiumoxid, Titandi oxid, Nickeloxid, Aluminiumoxid, Zirconiumdioxid und Mischun gen derselben ein. Die besonders bevorzugten anorganischen Träger schließen Glas, Glasfasern, Sand, Siliciumdioxidgel, Aluminiumoxid und Mischungen derselben ein.

Wie hier verwendet bedeutet "Fluorometer" eine Vorrichtung zum Erzeugen von Licht mit einer gewählten Wellenlänge zur An regung der Fluoreszenz eines Carbazinfarbstoffs, zum Empfang und Messen der Intensitäten von Fluoreszenzlicht, das durch diesen Carbazinfarbstoff bei einer ersten gewählten Wellenlän ge und bei einer deutlich verschiedenen zweiten gewählten Wel lenlänge emittiert wird, und zum Erzeugen eines elektronischen Signals, das Messungen dieser Intensitäten enthält.

Carbazinfarbstoffe

Eine verallgemeinerte Struktur der erfindungsgemäßen Carb azinfarbstoffe ist in der folgenden Formel gezeigt:

in der R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H und Alkyl. Es wird kein Farbstoff gebildet, wenn R₂, R₃, R₅ oder R₆ ein Sauerstoffatom, wie ein Alkohol, Ether, Carbonyl, oder ein Halogenatom enthalten.

Diese Carbazinfarbstoffe werden durch eine Modifizierung der Methode von R. Hill et al. wie oben zitiert hergestellt, worauf hier Bezug genommen wird, die qualitativ in dem folgen den Reaktionsschema gezeigt ist.

Das Natriumsalz von Indophenol wird mit einem substituier ten Phenol umgesetzt, daß durch Umsetzung mit Natriumnitrit in Schwefelsäure modifiziert worden ist. Die modifizierte Phe nol/Indophenol-Reaktion wird in 90% Schwefelsäure durchge führt. Die Reaktionsmischung wird bei 40°C und unter leichtem Vakuum gehalten, um Stickoxide zu entfernen, wenn der Farb stoff synthetisiert wird. Die Schwefelsäurekonzentration ist für die Effizienz der Reaktion kritisch und muß für gute Aus beuten 90 ∀ 3% betragen. Aus Schwefelsäurekonzentrationen von weniger als 87% oder mehr als 93% resultieren sehr schlechte Ausbeuten. Farbstoffbildung, Fluoreszenz und Reaktivität mit einem festen Träger hängen von der Beschaffenheit der Substi tuenten an dem Phenolanteil ab.

Beispiel 1

Alle in diesem und den folgenden Beispielen verwendeten Reagentien wurden von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis consin, USA), Sigma Chemical Co. (5t. Louis, Missouri, USA) oder Spectrum Chemical Co. (Gardena, California, USA) gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet. 1 Gramm des Natriumsal zes von Indophenol wurde gründlich mit 1,5 g pulverisiertem Phenol gemischt. Diese Mischung wurde bei 40°C in einem 2000 ml Kolben mit Seitenarm, der etwa 100 ml Glaskugeln mit 1 cm Durchmesser enthielt, zu 10 ml 90,0% Schwefelsäure, die 600 mg gelöstes Natriumnitrit enthielten, gegeben. Der Kolben wur de dann oben mit einem Stopfen verschlossen, und es wurde ein leichtes Vakuum angelegt, um die Entfernung der sich sofort bildenden Stickoxide zu unterstützen. Der Kolben und der In halt wurden 15 Minuten bei 40°C mit zwischendurch erfolgendem Schütteln in den Brutschrank gegeben, und dann wurden zusätz liche 10 ml 90% Schwefelsäure, die 600 mg Natriumnitrit ent hielten, zugegeben und unter Schütteln gemischt. Es wurde wie derum oben verschlossen und Kolben und Inhalt kamen weitere 15 Minuten bei 40°C unter gelegentlichem Schütteln in den Brut schrank. Dann wurde 1 g pulverisiertes Phenol unter Schütteln zugegeben. Es wurde wieder oben verschlossen und die Reaktion wurde weitere 30 Minuten unter gelegentlichem Schütteln ablau fen gelassen.

Die Reaktionsmischung wurde dann unter Durchmischen in et wa 2 l Eiswasser gegossen. Die Mischung wurde dann erschöpfend mit kaltem Diethylether extrahiert. Der Etherextrakt wurde filtriert und dann mit kalter 3% Natriumcarbonatlösung extra hiert. Die resultierende hochfluoreszierende Carbonatlösung wurde filtriert, dann wurde ein leichter Luftstrom hindurchge leitet, um gelösten Ether zu entfernen. Dann wurden 3,5 g Ka liumferricyanid langsam zu dieser Lösung gegeben und 48 h bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Ferricyanidbehandlung zerstört Nebenprodukte der Reaktion. Diese Lösung, die fluoreszierenden Carbazinfarbstoff und Zersetzungsprodukte als Verunreinigungen enthielt, wurde filtriert und dann mit ausreichend Calcium chlorid behandelt, um das Carbonat auszufällen. Diese trübe gelbgrüne Lösung wurde erschöpfend mit Diethylether extra hiert. An dieser Stufe der Reinigung war der Etherextrakt stark orange fluoreszierend. Diese Etherlösung wurde dann fil triert und mit 3% Carbonatlösung extrahiert. Die resultieren de fluoreszierende blaue Carbonatlösung wurde durch Zugabe von Eisessig auf einen pH-Wert von 5 angesäuert. Nach Stehenlassen bei 5°C für mehrere Stunden schied sich der orangefarbene fe ste Carbazinfarbstoff als feines Pulver ab. Der feste Farb stoff wurde durch Filtration aufgefangen und im Vakuum ge trocknet. Der resultierende Carbazinfarbstoff war 7-Hydroxy spiro[acridin-9,1'-cyclohexa-2',5'-dien]-2(9H),4'-dion mit der Struktur der Formel 1, wobei R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils H waren.

Beispiel 2

Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Aus nahme, daß 3,5-Dimethylphenol (3,5-Xylenol) anstelle von Phe nol verwendet wurde. Der resultierende Carbazinfarbstoff hatte die Struktur der Formel 1, wobei R₂ und R₆ H waren und R₃ und R₅ Methyl waren.

Beispiel 3

Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Aus nahme, daß 2,3,5-Trimethylphenol (Isopseudocumenol) anstelle von Phenol verwendet wurde. Der resultierende Carbazinfarb stoff hatte die Struktur der Formel 1, wobei R₆ H war und R₂, R₃ und R₅ Methyl waren.

Beispiel 4

Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Aus nahme, daß Durenol (2,3,5,6-Tetramethylphenol) anstelle von Phenol verwendet wurde. Durenol wurde durch erschöpfende Me thylierung von 3,5-Dimethylphenol (3,5-Xylenol) nach der Me thode von Burawoy, J. Chem. Soc. 400 (1944) synthetisiert, auf das hier Bezug genommen wird. Der resultierende Carbazinfarb stoff hatte die Struktur der Formel 1, wobei R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils Methyl waren.

Beispiel 5

Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Aus nahme, daß 5,6,7,8-Tetrahydro-1-naphthol anstelle von Phenol verwendet wurde. Der resultierende Carbazinfarbstoff hatte die Struktur der Formel 1, wobei R₂ und R₃ Cyclohexyl waren und R₅ und R₆ jeweils H waren.

Beispiel 6

Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Aus nahme, daß 5-Isopropyl-3-methylphenol anstelle von Phenol ver wendet wurde. Der resultierende Carbazinfarbstoff hatte die Struktur der Formel 1, wobei R₂ und R₆ H waren, R₃ Isopropyl war und R₅ Methyl war.

Beispiel 7

Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Aus nahme, daß o-tert.-Butylphenol statt Phenol verwendet wurde.

Der resultierende Carbazinfarbstoff hatte die Struktur der Formel 1, wobei R₃, R₅ und R₆ jeweils H waren und R₂ t-Butyl war.

Beispiel 8

Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Aus nahme, daß m-tert.-Butylphenol statt Phenol verwendet wurde. Es wurde keine nachweisbare Menge an Carbazinfarbstoff synthe tisiert. Es wird angenommen, daß sterische Hinderung die Reak tion des substituierten Phenols mit Indophenol verhinderte.

Beispiel 9

Bestimmte Eigenschaften der Carbazinfarbstoffe der Bei spiele 1 bis 7 wurden bestimmt. Spektraldaten wurden entweder mit einem Diodenfeldspektrophotometer von Hewlett-Packard, Mo dell 8452A, oder einem Lumineszenzspektrometer von Perkin-El mer, Modell LS 508, erhalten. Alle Farbstoffe sind in ihren Extinktions- (Absorptions-) und Emissionsspektren ähnlich, wo bei es nur geringe Differenzen der Stellen der Peaks, Verhält nisse der Absorption der Säure zur Absorption der Base, und pK_a-Werte gibt. Eine typische Auftragung von Extinktion gegen pH-Wert ist in Fig. 1 gezeigt. Die nicht modifizierten Farb stoffe zeigen einen großen Abstand zwischen den Absorptionspe aks der Säure- und Baseform. Typischerweise hat die Säureform eine Peakabsorption bei etwa 480 nm und die Basenform eine Peak absorption bei etwa 660 nm. Eine typische Fluoreszenzemissi onskurve von sowohl Säure- als auch Basenform der Farbstoffe ist in Fig. 2 gezeigt. Die Fluoreszenzform der Baseform hat einen wohldefinierten Einzelpeak bei ungefähr 690 nm. Die Säu reform der Farbstoffe zeigt ein Emissionsspektrum ähnlich dem der Baseform, hat aber eine deutlich kürzerwellige Emissions komponente nahe 600 nm.

Die pK_a-Werte, d. h. die ungefähren pH-Werte einer wäßri gen Lösung des Farbstoffs, wobei die Säure- und Baseform des Farbstoffs in gleichen Konzentrationen vorhanden sind, wurden aus dem Absorptionsspektrum abgeleitet und sind in der folgen den Tabelle aufgeführt. Wie zuvor erwähnt sind Indikatorfarb stoffe im allgemeinen am empfindlichsten gegenüber pH-Wert änderungen nahe ihren pK_a-Werten.

Die relativen Neigungen der Farbstoffe zu Immobilisierung auf einem festen Träger wurden aus der Intensität von kovalent an eine Dialysemembran aus regenerierter Cellulose gebundenem Farbstoff bestimmt. Die in der folgenden Tabelle zusammenge faßten Immobilisierungsdaten wurden aus Messungen in 2% Car bonatlösung entnommen, die auf einer willkürlichen Skala von 1 bis 10 normalisiert wurden, wobei 1 keine nennenswerte Menge an gebundenem Farbstoff und 10 die größte Menge an gebundenem Farbstoff wiedergab. Die Bedingungen der Kopplung der Farb stoffe an die regenerierte Cellulose waren gemäß dem nachfol gend beschriebenen Immobilisierungsverfahren 2. Unter diesen Bedingungen immobilisierte Carbazinfarbstoffe ergeben eine gleichförmig blau fluoreszierende Dialysemembran, was beim An säuern in orange Fluoreszenz überging. Als Bezugspunkt ergab der Carbazinfarbstoff aus Beispiel 3, immobilisiert auf einer "SPECTRAPOR 1" Membran (Molekulargewichtsabtrennungsbereich 6000 bis 8000) eine blaue Membran mit einer Absorption bei 660 nm von mehr als 1 bei einem pH-Wert < 9.

Die in der Tabelle gezeigten Fluoreszenzbewertungen basie ren auf der maximalen Fluoreszenz, die aus einer wäßrigen Car bazinfarbstofflösung mit Anregung bei der Wellenlänge der ma ximalen Absorption für den speziellen Farbstoff erreichbar ist, wobei jedoch Konzentrationen und pH-Wert bei allen Farb stoffen konstant waren. Die Fluoreszenzbewertung änderte sich nicht mit dem pH-Wert, d. h. die Farbstoffe, die in Base am stärksten fluoreszierten, fluoreszierten auch am stärksten in Säure. Quantenausbeuten der Säureformen der Farbstoffe schei nen so hoch wie die der Baseformen zu sein. Der Carbazinfarb stoff aus Beispiel 4. im Handel als "CARBAZINE 720" erhältlich (Exciton, Inc., Dayton, Ohio, USA) hatte eine Quantenausbeute von ungefähr 50% in wäßriger Lösung, die Base enthielt. Der Carbazinfarbstoff aus Beispiel 3 ist ebenso fluoreszierend, kann in höherer Ausbeute hergestellt werden und hat eine höhe re Immobilisierungseffizient als "CARBAZINE 720".

Die Eigenschaften der Carbazinfarbstoffe der Beispiele 1 bis 7 sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Tabelle

Diese Daten legen nahe, daß für hohe Fluoreszenzeffizienz eine gewisse Substitution in dem Spiroring erforderlich ist. Der Chromophoranteil des Farbstoffmoleküls kommt von dem In dophenolmolekül, das praktisch nicht fluoreszierend ist. Es ist vorgeschlagen worden, daß die Fluoreszenz von Carbazin farbstoffen von der tetraedrischen Kohlenstoffbrücke stammt, die dazu führt, daß der Indophenolchromophor starr ist. Da al le der in der Tabelle wiedergegebenen Farbstoffe die te traedrische Kohlenstoffbrücke enthalten, scheint die Substitu tion in dem Spiroring eine wichtige Rolle bei der Fluoreszenz zu spielen.

Die in der Tabelle wiedergegebenen Resultate zeigen auch einen Trend, der die Immobilisierungseffizienz mit sterischen Effekten nahe der 1-Position des Spirorings verknüpft. Der Farbstoff aus Beispiel 7, der eine tert.-Butylgruppe als R₂ enthält, reagiert nicht in irgendeinem nachweisbaren Ausmaß in einem der hier offenbarten Immobilisierungsschemata, wahr scheinlich aufgrund von sterischen Effekten nahe der Bindungs stelle an dem festen Träger. Der Farbstoff aus Beispiel 4 bindet sich außerdem nicht so effizient wie der Farbstoff aus Beispiel 3, wahrscheinlich aufgrund der Anwesenheit der Me thylgruppe als R₆. Schließlich ist der beste Farbstoff zum Bin den an einen festen Träger, ausgedrückt als Immobilisierungs effizienz, der unsubstituierte Farbstoff aus Beispiel 1.

Der optimale Carbazinfarbstoff für pH-Wertmessungsanwen dungen ist ein Kompromiß zwischen Ausbeute, Fluoreszenz und Immobilisierungseffizienz, wobei jedes von diesen durch die Substituenten am Spiroring beeinflußt wird. Der Farbstoff aus Beispiel 3 ist ein bevorzugter Carbazinfarbstoff für pH-Wert messungen, weil er einen effektiven Kompromiß der verschiede nen Faktoren darstellt, die die pH-Wertmessung beeinflussen, wenn er auf einer faseroptischen Sonde immobilisiert ist.

Modifikation der Carbazinfarbstoffe

Der Spiroring von einigen der hier beschriebenen Carbazin farbstoffen ist durch eine Nickel/Aluminium-Legierung in wäß rigem Natriumhydroxid zu den Verbindungen reduzierbar, die als Gattung durch die folgende Formel

gezeigt sind, wobei R₂, R₃, R₅ und R₆, unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H und Alkyl. Diese gesättigten Verbindungen zeigen ähnliche Absorptions- und Emissionsspek tren wie die entsprechenden ungesättigten Verbindungen, mit der Ausnahme der Absorptionsmaxima für die basischen Formen der Moleküle. Die basischen Formen der gesättigten Verbindungen zeigen alle eine Blauverschiebung von ungefähr 30 nm (von 660 nm zu 630 nm) für den Absorptionspeak.

Beispiel 10

Der Carbazinfarbstoff aus Beispiel 1 wurde gemäß dem fol genden Verfahren reduziert. Ungefähr 100 mg Farbstoff wurden in 20 ml 1 N NaOH in einem mit einem Vakuumanschluß ausgestat teten Becher aufgelöst. Es wurden ungefähr 500 mg 50% Nic kel/Aluminium-Legierung zugegeben, dann wurde der Becher ver schlossen und sofort Vakuum angelegt. Nach einigen Minuten wurde die blaue Farbstofflösung farblos, da sich die Leuko- Verbindung bildete. Nach einigen weiteren Minuten begannen sich Gasblasen zu bilden, da Wasserstoff durch Einwirkung der Base auf das Aluminium entwickelt wurde. Nach mehreren zusätz lichen Minuten wurde das Vakuum gebrochen und die Mischung wurde aus dem Becherglas in ungefähr 500 ml 0,1 N Natriumbi carbonat gespült. Diese Lösung wurde mehrfach filtriert, um Aluminiumhydroxid und die Reste der Legierung zu entfernen. Luft wurde langsam durch die filtrierte Lösung geblasen, wel che den gelösten Farbstoff enthielt, um die Leuko-Verbindung zu oxidieren. Als dies stattfand, kehrte die fluoreszierende Farbe zurück. Diese Lösung wurde dann mit Natriumphosphat be handelt, bis eine gelbgrüne Farbe erhalten wurde, und wurde dann mit kaltem Ether extrahiert. Der Etherextrakt wurde fil triert und dann mit kalter 3% Carbonatlösung extrahiert. Luft wurde dann durch die fluoreszierende blaue Carbonatlösung ge blasen, um den Ether zu entfernen, und wurde dann mit Eisessig auf einen pH-Wert von 5 angesäuert. Die angesäuerte Lösung wurde mehrere Stunden auf 5°C gekühlt und dann wurde der aus gefällte reduzierte Farbstoff durch Filtration aufgefangen und im Vakuum getrocknet. Der resultierende reduzierte Carbazin farbstoff hatte die Struktur gemäß Formel 2, wobei R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils H waren.

Immobilisierung von Carbazinfarbstoffen auf festen Trägern

Erfindungsgemäße Carbazinfarbstoffe binden sich an Hydra zindarivate unter Bildung der in den folgenden Formeln gezeig ten Verbindungen:

wobei R₂, R₃, R₅ und R₆ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H und Alkyl und R₇ ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H und Alkyl ist. Hydrazin und dessen Derivate reagieren gemäß dem folgenden Reaktionsschema in wasserfreien protischen oder aprotischen Lösungsmitteln oder in wäßriger Lösung unter Bildung von Carbaziniminen wie in Formel 3 gezeigt:

Diese Reaktionen finden am besten zwischen etwa pH 6,0 und 7,0 oder einfach in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert statt, bei dem der Carbazinfarbstoff eine grüne Farbe behält. Die Ba seform eines Carbazinfarbstoffs ist leuchtend blau, während die Säureform gelblich-orange ist. Am pK_a-Wert des Farbstoffs, etwa pH 6,5, liegen gleich viele Moleküle als ionisierte (basische Form, blau) und nicht ionisierte (Säureform, gelb) Farbstoffmoleküle vor, was so zu einer grünen bis blaugrünen Farbe führt. Substituierte Hydrazine sind reaktiver bei der Kupplung an Carbazinfarbstoff als freies Hydrazin.

Carbazinimine sind, obwohl sie nicht besonders stabil sind, mit Natriumcyanoborhydrid wie in dem folgenden Reakti onsschema gezeigt zu stabilen carbazinsubstituierten Hydrazi nen reduzierbar, wie in Formel 4 gezeigt

Diese Reaktion kann gleichzeitig mit der Iminbildungsreak tion als "Eintopfreaktion" durchgeführt werden. Carbazinfarb stoff, Hydrazin oder substituiertes Hydrazin und Natriumcyano borhydrid werden in Wasser mit einem pH-Wert von 6,2 aufgelöst oder suspendiert. Es ist bekannt, das Cyanoborhydrid unter diesen Bedingungen rasch und selektiv Imingruppen reduziert und in wäßrigen Lösungen mit einem pH-Wert über 6,0 relativ stabil ist.

Carbazinsubstituierte Hydrazine sind intensiv fluoreszie rende Verbindungen mit Spektren und pK_a-Werten ähnlich den freien Farbstoffen. Die zwischen dem Carbazinfarbstoff und dem substituierten Hydrazin gebildete kovalente Bindung ist che misch stabil, und das substituierte Hydrazin kann Teil eines unlöslichen Trägers sein. Somit können Carbazinfarbstoffe ko valent an hydrazinmodifizierte Träger gebunden werden.

Carbazinazine, gattungsgemäß in Formel 5 gezeigt, werden gemäß dem folgenden Reaktionsschema hergestellt:

Diese Verbindungen bilden sich leicht in wäßriger oder or ganischer Lösung mit einer umfassenden Breite der Reaktionsbe dingungen. Die beste Kupplung scheint jedoch in wäßriger Lö sung bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 6,5 zu erfolgen.

Carbazinazine zeigen verglichen mit anderen Carbazinderi vaten ein einzigartiges Fluoreszenzverhalten. Während die Ab sorptionsdaten im wesentlichen unverändert blieben, sind die Emissionsspektren wie in Fig. 3 gezeigt. Zudem ist der pK_a- Wert dieser Verbindungen etwa 1 pH-Einheit höher als der nicht modifizierte Farbstoff, d. h. etwa pH 7,5. Die Emission der Baseform bleibt unverändert, aber die Emission der Säureform ist ein gut aufgelöster Einzelpeak um einen Mittelwert von 590 nm. Carbazinazine sind somit Farbstoffe mit zweifacher Anre gung und zweifacher Emission mit Säureform-Anregung/Emission bei 480 nm/590 nm und Baseform-Anregung/Emission von 660 nm/690 nm. Die Säure/Base-Absorptionskurven kreuzen sich, wie in Fig. 1 gezeigt, bei ungefähr 520 nm. Eine Anregungswellen länge kann gewählt werden, um in geeigneter Weise sowohl die Säureform als auch die Baseform des Carbazinazins anzuregen, um einen pH-Indikator mit einer einzigen Anregung und zweifa cher Emission zu erzeugen. Wie bei den anderen Farbstoffformen ist das Carbazinazin intensiv fluoreszierend und chemisch sta bil.

In den folgenden Methoden wird "R" verwendet, um den fe sten Träger wiederzugeben, auf dem der Carbazinfarbstoff immo bilisiert werden soll. In einigen Fällen kann der feste Träger gemäß den folgenden Reaktionsschemata modifiziert, derivati siert oder funktionalisiert sein. Es sei darauf hingewiesen, daß es notwendigerweise eine funktionelle Gruppe oder funktio nelle Gruppen auf dem festen Träger geben muß, damit eine che mische Reaktion stattfindet. Diese Gruppen können in Form von -OH, =O, -NH₂, -MgX, -COOH, Ketonen und so weiter vorliegen, die dann weiter durch Oxidation zu Aldehyden oder Säuren umge setzt werden können, mit Glycidol, GOPS derivatisiert werden können oder direkt mit Hydrazin oder Hydrazinderivat gemäß den folgenden Reaktionsschemata umgesetzt werden können. Zum Zweck der Klarheit und Eindeutigkeit wird der feste Träger einfach als "R" bezeichnet. Es ist für Fachleute klar, was "R" gemäß dem verwendeten Reaktionsschema wiedergibt.

Polysaccharidträger - Verfahren 1

Gemäß einem ersten Verfahren werden die mit Farbstoff re aktiven Hydrazin/Hydrazon-Gruppen leicht auf die Oberfläche eines gegenüber Oxidation mit Periodat empfindlichen Polymer trägers wie Papier, Stärke, Cellulose, Amylose, Rayon, Cello phan und dergleichen und Mischungen derselben eingebracht. Bei Behandlung mit Periodsäure gehen Verbindungen, die an benach barte Kohlenstoffatomen gebundene -OH Gruppen enthalten, Oxi dation unter Spaltung der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen ein, R. Morrison & R. Boyd, Organic Chemistry, 523 bis 25 (4. Ausgabe, 1983). Die -OH Gruppen werden zu Aldehydgruppen oxi diert. Die Aldehydgruppen des oxidierten Polysaccharids werden dann in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid mit Hydrazin umge setzt, um ein immobilisiertes Hydrazin zu bilden. Dieser hy drazinmodifizierte Träger wird dann mit einem Carbazinfarb stoff wie oben beschrieben umgesetzt. Dieses Verfahren führt aufgrund des Bruchs der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen durch Periodatoxidation der Polymerkette zu einem gewissen Ab bau des Polymers. Dieses Reaktionsschema ist wie folgt illu striert:

wobei R ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Papier, Stärke, Cellulose, Amylose, Rayon, Cellophan und anderen Polymeren ist, die durch Periodat oxidiert werden kön nen, um eine Aldehydgruppe zu ergeben, und D ist ein Carbazin farbstoff gemäß Formel 1, wobei R₂, R₃, R₅ und R₆ unabhängig ausgewählt sind aus H und Alkyl. Die kovalenten Bindungen zwi schen dem Carbazinfarbstoff und dem substituierten Hydrazin werden gemäß den Formeln 3 und 4 gebildet.

Polysaccharidträger - Verfahren 2

Ein zweites Verfahren zum Immobilisieren von Carbazinfarb stoffen auf Polymerträgern erfordert nicht den Abbau des Poly mers, d. h. Brechen der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen des Polymers durch Periodatoxidation, und erzeugt wesentlich höhe re Ausbeuten an immobilisiertem Farbstoff als Verfahren 1. Dieses zweite Verfahren funktioniert mit jedem Trägermaterial, das eine mit Epoxid reaktive Gruppe enthält, wie eine Hy droxylgruppe, Amingruppe, Carbonsäuregruppe oder Anhydridgruppe. Reaktionen verschiedener mit Epoxid reaktiver Gruppen mit dem Epoxid, Glycidol, sind wie folgt illustriert.

wobei R den festen Träger ohne die mit Epoxid reaktive Gruppe wiedergibt.

Glycidol reagiert mit der mit Epoxid reaktiven Gruppe in dem festen Träger, üblicherweise in einer wäßrigen Lösung mit entweder Säure- oder Basenkatalyse unter Bildung eines poly substituierten Produkts. Die vicinalen Hydroxylgruppen, d. h. Hydroxylgruppen an benachbarten Kohlenstoffatomen des Glyci dolrestes werden selektiv durch Periodat zu der Polyglyoxal form (Polyaldehyd) oxidiert, die nachfolgend mit Hydrazin und einem Carbazinfarbstoff wie in dem oben beschriebenen ersten Verfahren umgesetzt wird. Diese Reaktionen sind in dem folgen den Reaktionsschema illustriert:

wobei R der feste Träger ist, der die mit Epoxid reaktive Gruppe enthält, und D ein Carbazinfarbstoff gemäß Formel 1 ist, wobei R₂, R₃, R₅ und R₆ unabhängig ausgewählt sind aus H und Alkyl. Die kovalenten Bindungen zwischen dem Carbazinfarb stoff und dem substituierten Hydrazin werden gemäß den Formeln 3 und 4 gebildet.

Anorganische Träger - Verfahren 3

Viele anorganische Träger werden durch Behandlung mit ei nem Silanisierungsmittel "silanisiert". Es wird allgemein an genommen, daß diese Reaktionen zu einem organischen Molekül führen, das kovalent an eine Silanolfunktionalität (Si-OH) an der Oberfläche gebunden ist. Diese Behandlung blockiert die Reaktivität der Silanolfunktionalität an der Oberfläche und verleiht der Oberfläche des anorganischen Trägers eine reakti ve Funktionalität, die dem organischen Anteil des silanisie rungsreagenzes entspricht.

Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOPS) reagiert mit anorga nischen Trägern wie Glas, Glasfasern, Sand, Siliciumdioxidgel, Aluminiumoxid, Titandioxid, Nickeloxid, Aluminiumoxid, Zirco niumdioxid und anderen hydrophilen anorganischen Trägern und Mischungen derselben unter Bildung einer organischen Epoxy funktionalität auf der anorganischen Oberfläche, wie durch das folgende Reaktionsschema mit Siliciumdioxidgel dargestellt ist:

Diese Epoxyfunktionalität kann durch Säure hydrolysiert werden, um eine Oberfläche zu ergeben, die vicinale Hydroxyl gruppen enthält. Diese vicinalen Hydroxylgruppen können weiter mit Periodat oxidiert werden, um eine Aldehydfunktionalität an der Oberfläche zu liefern. Diese Reaktionen werden wie folgt illustriert:

Die Oberflächenaldehydgruppe kann sequentiell mit Hydrazin und einem Carbazinfarbstoff wie oben beschrieben gekuppelt werden.

Anorganische Träger - Verfahren 4

Glycidol reagiert mit den in der Verbindung aus Verfahren 3 vorhandenen vicinalen Hydroxylgruppen, die aus der Umsetzung von Siliciumdioxidgel oder anderem geeigneten anorganischen Träger resultieren, um zu einer mit Periodat oxidierbaren Oberfläche mit größeren Hydrazinbindungskapazität zu führen, wie folgt:

Die vicinalen Hydroxylgruppen können dann mit Periodat oxidiert werden, um Aldehydgruppen zu ergeben, die dann se quentiell mit Hydrazin und einem Carbazinfarbstoff wie oben beschrieben gekuppelt werden können.

Polyaldehydträger - Verfahren 5

Polyaldehyde wie Polyacrolein und Polyglutaraldehyd rea gieren mit Hydrazin in Gegenwart von Cyanoborhydrid unter Bil dung von substituierten Polyhydrazinmaterialien. Carbazinfarb stoffe können dann nach der Vorgehensweise aus Verfahren 1 an die Polyhydrazinträger gebunden werden. Die Reaktion der Po lyaldehyde mit Hydrazin wird wie folgt illustriert:

Polymethylketonträger - Verfahren 6

Polymethylketone gehen bei erhöhten Temperaturen mit Hy drazinhydrat eine Substitutionsreaktion ein, um Polymethylhy drazon zu ergeben. Dieses Produkt reagiert direkt mit Carba zinfarbstoffen unter Bildung von intensiv fluoreszierenden Azinpolymeren mit einzigartigen optischen und chemischen Cha rakteristika für pH-Wertmessungen. Die Reaktionen von Polyme thylketonen mit Hydrazin und von Polymethylhydrazon mit Carba zinfarbstoff sind wie folgt illustriert:

Beispiel 17

Ungefähr 1 g mikrokristalline Cellulose wurden in 50 ml 1 N NaIO₄-Lösung suspendiert und 1 h bei Raumtemperatur umge setzt. Die Cellulose wurde durch Filtration entfernt, ausgie big mit Wasser gewaschen und dann mit wasserfreiem Alkohol ge waschen und dann im Vakuum getrocknet. Die Cellulose wurde dann in 10% (Vol./Vol.) wäßriger Lösung von Hydrazinhydro chlorid, pH 6,2, 5 h bei Raumtemperatur suspendiert. Die Cellulose wurde dann wieder durch Filtration entfernt, ausgiebig mit Wasser gewaschen und dann in einer Lösung von etwa 1 mg/ml Natriumcyanoborhydrid in Wasser, pH 6,2, suspendiert und 5 h bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Cellulose wurde dann wieder durch Filtration entfernt, ausgiebig mit Wasser gewaschen und dann mit wasserfreiem Alkohol gewaschen und dann im Vakuum ge trocknet. Die resultierende Verbindung war ein hydrazinmodifi zierter Celluloseträger, der gemäß Verfahren 1 hergestellt war.

Beispiel 18

Etwa 1 g mikrokristaline Cellulose wurde in etwa 20 ml ei ner 10% (Gew. /Vol.) Lösung von Glycidol in 1 N Natriumhydro xid suspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Das feste Material wurde durch Filtration abge trennt, ausgiebig mit Wasser und Ethanol gewaschen und dann sequentiell mit Periodat, Hydrazin und Natriumcyanoborhydrid gemäß dem Verfahren aus Beispiel 17 umgesetzt.

Beispiel 19

Etwa 1 g Siliciumdioxidgel wurde in 50 ml 10% (Gew./Vol.) GOPS auf 90°C erwärmt und 1 h gehalten, während der pH-Wert durch Zugabe von HCl auf zwischen 1 und 2 gehalten wurde. Das modifizierte Siliciumdioxidgel wurde dann durch Filtration aufgefangen, ausgiebig mit Wasser gewaschen und dann sequenti ell mit Periodat, Hydrazin und Natriumcyanoborhydrid gemäß dem Verfahren aus Beispiel 17 umgesetzt.

Beispiel 20

Etwa 1 g Glasfasern wurden gemäß dem Verfahren aus Bei spiel 19 mit GOPS umgesetzt und dann ausgiebig gespült. Die modifizierten Glasfasern wurden dann sequentiell mit Glycidol, Periodat, Hydrazin und Natriumcyanoborhydrid gemäß dem Verfah ren aus Beispiel 18 umgesetzt.

Beispiel 21

Etwa 1 g Polyacrolein wurde mit Hydrazin und Cyanoborhy drid nach dem Verfahren aus Beispiel 17 umgesetzt.

Beispiel 22

In diesem Beispiel wurden 5,0 g Poly (methylvinylketon) in etwa 50 ml Hydrazinhydrat suspendiert und in einem Wasser dampfbad 48 h erwärmt. Das aufgequollene vernetzte Gel wurde dann durch Filtration entfernt und ausgiebig mit Wasser gewa schen. Das resultierende Gel war ein hydrazonhaltiger Träger.

Beispiel 23 Kupplung von Carbazonfarbstoff an hydrazinmodifizierten Träger

Etwa 1 g nach dem Verfahren aus Beispiel 17 hergestellter hydrazinmodifizierter Träger wurde in 1 ml 0,1 N [N-(2-Acet amido)-2-aminoethansulfonsäure] (ACES) als Puffer, pH 6,2, suspendiert. Eine Lösung von 5 mg Carbazinfarbstoff, herge stellt gemäß dem Verfahren aus Beispiel 3, aufgelöst in 200 µl Dimethylformamid, wurde zu der trägerhaltigen Lösung gegeben, gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Der Träger wurde dann durch Filtration abgetrennt, ausgiebig mit Wasser gewaschen und in 5 ml ACES-Puffer, pH 6,2, suspen diert, der ungefähr 10 mg Natriumcyanoborhydrid enthielt. Die Reaktion wurde 5 h ablaufen gelassen. Da diese Reaktion Was serstoffionen verbraucht, wurde gelegentlich Essigsäure zuge geben, um den pH-Wert aufrechtzuerhalten. Nach Beendigung der Reaktion wurden einige Tropfen wäßriges Formaldehyd zugegeben, um jegliche nicht umgesetzten Hydrazingruppen zu blockieren, gefolgt von der Zugabe von etwa 5 mg weiterem Cyanoborhydrid, um die Formaldehydreaktion zu bewirken. Diese Blockierungsre aktion wurde 1 h bei Raumtemperatur ablaufen gelassen.

Die beiden Stufen von (a) Bindung des Carbazinfarbstoffs an das Hydrazin unter Bildung eines Hydrazons und (b) Redukti on des Hydrazons mit Cyanoborhydrid unter Bildung des farb stoffsubstituierten Hydrazins können auch in effektiver Weise gleichzeitig in einer Einstufenreaktion durchgeführt werden. Da der Farbstoff das wertvollste Reagenz in dieser Synthese ist, ist es jedoch vorteilhaft, wenn der nicht umgesetzte Farbstoff zur Zurückführung zurückgewonnen werden kann. Das zweistufige Verfahren gestattet die Rückgewinnung des Farb stoffs ohne Verunreinigung mit Cyanoborhydrid.

Beispiel 24

Etwa 1 g des feuchten hydrazonhaltigen Trägers, herge stellt nach dem Verfahren aus Beispiel 22, wurde in 1 ml ACES- Puffer, pH 6,2, suspendiert. Eine Lösung von 5 mg Carbazin farbstoff, hergestellt nach dem Verfahren aus Beispiel 3, der in 200 µl Dimethylformamid aufgelöst war, wurde zu der träger haltigen Lösung gegeben, gemischt und in einem Wasserdampfbad 1 h erwärmt. Der Träger wurde durch Filtration aufgefangen, sequentiell mit Wasser, Aceton, verdünnter Essigsäure und wäß rigem Carbonat gewaschen und dann in Wasser aufbewahrt. Farb stoffsubstituierte Azine sind chemisch stabil und erfordern keine Reduktion mit Natriumcyanoborhydrid.

Faseroptischer pH-Sensor

Faseroptische pH-Sensoren, die die hier beschriebenen Ma terialien und Verfahren verwenden, arbeiten als Sensoren mit einer einzigen Anregung und zweifacher Emission mit einer An regung zwischen etwa 480 und 540 nm, Säureform-Emission bei etwa 590 nm und Baseform-Emission bei etwa 690 nm. Eine Tech nik zum Messen eines Verhältnisses (ratiometrische Technik) zur Bestimmung des pH-Werts mit diesen faseroptischen pH-Sen soren umfaßt das Anregen des fluoreszierenden Farbstoffs mit einer einzigen Wellenlänge des Lichtes und gleichzeitiger Auf zeichnung der Fluoreszenz aus der Säureform und der Baseform des Farbstoffs. Das Verhältnis der Emission der Säureform zu Emission der Baseform korreliert günstig mit dem pH-Wert. Die hier beschriebenen Carbazinfarbstoffe zeigen eine geringere Empfindlichkeit gegenüber Temperatur- und Lösungsmittelveränderungen als derzeit verwendete fluoreszierende pH- Indikatoren. Diese faseroptischen Sensoren und das Verfahren zu ihrer Verwendung beseitigen die meisten der Probleme, die bisher in pH-Meßsystemen auf Faseroptikbasis auftraten. Die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren gestatten auch die Verwendung preiswerter faseroptischer Materialien aus Kunststoff, da alle Wellenlängen des Lichts, sowohl Anregung als auch Emission, im sichtbaren Bereich des Spektrums liegen. Die meisten derzeit verwendeten Farbstoffe für faseroptische pH-Wertmessungen erfordern die Anregung mit ultraviolettem Licht, wodurch der Einsatz von optischen Fasern aus Quarz er forderlich wird.

Zur Demonstration der Nützlichkeit dieser Materialien als ph-Indikatoren wurde eine pH-Sonde auf Faseroptikbasis aufge baut aus einem fluoreszierenden Farbstoff, hergestellt gemäß Beispiel 3, gemäß dem Verfahren aus Beispiel 24 an eine keton haltige Polyacrylatperle (XAD-7, Rohm & Haas) mit 0,012 Zoll Durchmesser gebunden und mit einer 0,010 Zoll optischen Fasern aus Kunststoff (Polyoptical 1610 Faser) verbunden. Die Perle wurde ohne irgendwelche Poliervorgänge des Endes oder andere Vorbereitungsstufen mit Norland Optical Adhesive Nr. 68 an das Ende der Faser geklebt. Diese Sonde wurde optisch an ein Puls faserfluorometer gekoppelt, wobei die Anregung um einen Mit telwert von etwa 520 nm lag, die Säureemission um einen Mit telwert von etwa 600 nm lag und die Baseemission um einen Mit telwert von etwa 680 nm lag. Es wurden Interferenzfilter mit Bandbreiten von etwa 40 nm verwendet, um den großen spektralen Abstand (große spektrale Trennung) des Farbstoffs vorteilhaft auszunutzen. Das Fluorometer wurde mit einem Computerdatener fassungssystem für elektronische Datengewinnung gekoppelt.

Ein beispielhaftes Pulsfaserfluorometer, das zusammen mit den erfindungsgemäßen Carbazinfarbstoffen verwendet werden kann, um den fötalen pH-Wert zu messen, ist in den Fig. 6 und 7 offenbart. In Fig. 6 ist ein optisches System 4 zur Herstellung einer Anregungswellenlänge mit einem Mittelwert von 520 nm und zum Nachweis von Emissionswellenlängen mit Mit telwerten von 600 nm und 680 nm dargestellt. Das optische Sy stem umfaßt eine Stroboskoplampe 8 zur Erzeugung eines Licht strahls mit hoher Intensität 12 aus weißem Licht. Die Lampe 8 wird hinsichtlich einer langen Gebrauchszeit ausgewählt, z. B. 10 Millionen Blitze. Jeder Blitz dauert etwa 100 Mikrosekun den. Der elektrische Antrieb für die Lampe 8 ist so konstru iert, daß elektrische Interferenz mit den anderen elektroni schen Vorrichtungen minimiert ist.

Der Strahl 12 des weißen Lichtes von jedem Blitz wird durch Linsen 20 und 24 gesammelt und auf einen Brennpunkt 16 fokussiert. Diese Linsen sind asphärisch, um effizient so viel Licht wie möglich zu sammeln. Das so gebildete fokussierte Licht wird verwendet, um ein Loch 28 in einer Platte 32 zu be leuchten. Das Loch 28 hat einen ungefähren Durchmesser von 0,060 Zoll. Das fokussierte Licht kann einen wesentlich größe ren Bereich als die Größe des Lochs 28 beleuchten, wodurch ei ne gewisse Ungenauigkeit der Ausrichtung der Stroboskoplampe 8, der Linsen 20 und 24 und des Lochs 28 zulässig ist.

Der durch das Loch 28 hindurchgehende Lichtstrahl 12 wird durch eine Linse 36 kollimatiert. Das kollimatierte Licht wird dann durch einen Filter 40 geleitet. Es ist wichtig, eine gute Kollimation zu erreichen, damit der Filter 40 richtig arbei tet, wie nun erklärt wird. Der Filter 40 ist ein hochselekti ver Interferenzfilter, der Licht von 520 ∀ 20 nm überträgt. Alles Licht, das in Wellenlängen, bei denen die Fluoreszenz gemessen wird, 600 nm und 680 nm, durch den Filter 40 hin durchgeht, ist falsche Fluoreszenz. Die hohe Selektivität, die erforderlich ist, um falsche Fluoreszenz im wesentlichen zu beseitigen, kann nur mit gut kollimatiertem Licht aus der Lin se 36 erhalten werden.

Das durch den Filter 40 durchgelassene Licht, z. B. Licht mit 520 nm, gelangt dann zu einer Linse 44, die dieses Licht auf die optische Faser 48 fokussiert. Die optische Faser 48 leitet das 520 nm Licht zu einer pH-Indikatorsonde, die den an einen festen Träger kovalent gebundenen fluoreszierenden Car bazinfarbstoff umfaßt, wie oben erklärt. Nach Beleuchtung durch das 520 nm Licht fluoresziert die Sonde mit Fluoreszenz mit zweifacher Emission mit Wellenlängen um einen Mittelwert von etwa 600 nm und 680 nm. Ein Teil dieses emittierten Lich tes wird durch die optische Faser 48 aufgefangen, die dieses emittierte Licht zurück zu dem optischen System 4 des Fluoro meters leitet.

Das fluoreszierende emittierte Licht aus der optischen Fa ser 48 gelangt durch die Linse 44 und von dort aus zu dem Fil ter 40. Der Filter 40 reflektiert dieses emittierte Fluoris zenzlicht zu einem Spiegel 52. Licht, das den Spiegel 52 kon taktiert, wird dann zu einem Filter 56 reflektiert. Filter 56 ist ein weiterer Hochleistungsinterferenzfilter, der Licht mit 680 nm durchläßt und Licht mit 600 nm Wellenlänge reflektiert. Dieses durchgelassene Licht kontaktiert eine Linse 60, die das 680 nm Licht auf ein Loch 64 in einer Platte 68 fokussiert. Dieses Loch 64 entfernt auf räumliche Weise Streulicht und Störlicht, da nur aus der optischen Faser 48 emittiertes Licht auf dieses fokussiert wird. Das fokussierte Licht mit 680 nm Wellenlänge, das durch das Loch 64 gelangt, kontaktiert eine Photodiode 72.

Durch den Filter 56 reflektiertes Licht kontaktiert einen Filter 76, der ein weiterer Hochleistungsinterferenzfilter ist, der nur Licht mit etwa 600 nm durchläßt. Dieses von dem Filter 76 durchgelassene Licht mit 600 nm kontaktiert eine Linse 80, die das 600 nm Licht auf ein Loch 84 in Platte einer 88 fokussiert. Wie bei dem Loch 64 entfernt das Loch 84 auf räumliche Weise Streulicht und Störlicht. Das das Loch 84 pas sierende 600 nm Licht kontaktiert dann eine Photodiode 92, die dieses 600 nm Licht wahrnimmt.

Die Winkel von Filter 40 und Filter 56 werden auf 15° von normalem Einfallswinkel gehalten. Dieser Winkel muß für die Filter 40 und Filter 56 klein gehalten werden, damit sie rich tig arbeiten, um die gewählten Wellenlängen des Lichts hindurchzulassen und andere Wellenlängen des Lichtes reflektie ren. Der Filter 76 muß kein Licht zu weiteren optischen Kompo nenten des Systems reflektieren und wird daher auf einen Ein fallswinkel von 90° eingestellt. Diese Einstellung ermöglicht steilere Kanten zu dem Übertragungsband des Filters 76, was für den optischen Kanal mit dem geringsten Wellenlängenabstand von der Beleuchungsquelle wichtig ist.

Dieses optische System 4, das gut konstruierte Filter ein setzt, ermöglicht es den Photodioden 72 und 92, Fluoreszenzsi gnale zu erkennen, die viele Größenordnungen niedriger in der Intensität sind als die der Beleuchtungsquelle (Stroboskoplam pe 8). Während es arbeitet, nehmen die Fluoreszenzkanäle im wesentlichen kein Licht in Abwesenheit einer optischen Faser 48 wahr. Selbst das Aufstellen eines Reflektors an der Stelle der optischen Faser 48 führt zu im wesentlichen keiner Wahr nehmung von falscher Fluoreszenz.

Ein Schemadiagramm des elektronischen Systems 100, das das optische System 4 (Fig. 6) des Fluorometers begleitet, ist in Fig. 7 gezeigt. Alle Funktionen des Fluorometers sind mikro prozessorgesteuert. Es gibt zwei Detektorkanäle, einen für 600 nm- und einen weiteren für 680 nm-Licht. Jeder Detektor ist aus einer Photodiode mit hoher Empfindlichkeit und niedrigem Rauschen zusammengesetzt, die mit geeigneten Verstärkern, Ana log/Digital-Wandlern (A/D-Wandlern), und dann mit dem Mikro prozessor verbunden ist. Alle Kanäle sind identisch. Es folgt eine Beschreibung eines solchen Kanals.

Licht, das die 600 nm Photodiode 92 kontaktiert, wird in einen schwachen elektrischen Strom umgewandelt, wobei der Strom proportional zu der Intensität des Lichts ist. Dieser Strom wird über zwei getrennte Transimpedanzverstärker 104 und 108 zu einer positiven und einer negativen Spannung verstärkt. Diese Spannungen werden zu einem Echtdifferentialverstärker 112 geleitet, in dem die Spannungssignale zu einem Signal mit höherer Spannung kombiniert werden, wobei die Spannungsausgabe proportional zu der Beleuchtungsintensität der Photodiode 92 ist. Dieses Schema der Differentialverstärkung wird verwendet, um Gleichtaktrauschen zu verringern, das aufgrund der von der Photodiode 92 erzeugten schwachen Signale vorhanden sein kann, verglichen mit elektrischen Rauschen, das von der Hochsstrom stroboskoplampe 8 erzeugt werden kann (Fig. 6).

Die Spannung aus dem Verstärker 112 wird in einen Verstär ker 116 eingespeist, in dem eine zusätzliche Spannungsverstär kung stattfindet. Zusätzlich speist der automatische Null schaltkreis 120 ein Signal in den Verstärker 116 ein, das pro portional zu dem Signal ist, welches von dem Verstärker 112 vorhanden ist, wenn die Stroboskoplampe 8 nicht feuert. Dieses automatische Nullsignal wird von dem des Verstärkers 112 sub trahiert, um so im wesentlichen keine Ausgabe von Verstärker 116 zu erhalten, außer wenn tatsächlich Licht auf die Photo diode 92 fällt. Dieses automatische Nullabgleichmerkmal korri giert automatisch eine Verstärkerdrift und dergleichen und stellt sicher, daß die Ausgabe von Verstärker 116 proportional zu der Lichtintensität während des Blitzes ist. Sorgfältige Konstruktion des automatischen Nullabgleichschaltkreises 120 trägt auch dazu bei, Lichtsignale aus Umgebungslicht zu elimi nieren, die vorhanden sein können, wenn die Faser 48 (Fig. 6) von einer äußeren Weißlichtquelle wie Raumbeleuchtung oder Un tersuchungslicht beleuchtet wird. Schließlich wandelt ein wei terer Teil von Verstärker 116 die Spannungsausgabe in eine echte Stromquelle zum Einspeisen in den A/D-Wandler 124 um.

Der A/D-Wandler 124 ist eine 20 bit-Ladungsintegrations vorrichtung. Während des Betriebs ist die Integrationsperiode 300 Mikrosekunden. Das heißt, daß der A/D-Wandler 124 die ge samte Ladung von Verstärker 116 über einen Zeitraum von 300 Mikrosekunden mißt. Der Arbeitsvorgang beginnt damit, daß der A/D-Wandler 124 eine Hintergrundperiode ohne Licht aus der Stroboskoplampe 8 (Fig. 6) mißt. Nachfolgend wird die Stro boskoplampe (von dem Mikroprozessor 128) getriggert und das Gesamtsignal von den Photodioden 92 und 72 gemessen. Da der Blitz 100 Mikrosekunden lang ist, ist der Zeitgeber des A/D- Wandlers 124 so eingestellt, daß er das gesamte Signal in die ser Integrationsperiode aufnimmt. Der A/D-Wandler 124 mißt dann einen weiteren Zeitraum ohne die Stroboskoplampe 8 (Fig. 6). Die erste und dritte Periode werden gemittelt und von dem Signal während der zweiten Periode abgezogen, um zusätzliches Hintergrundrauschen zu entfernen. Auf diese Weise werden zu sätzliches Rauschen und Umgebungslichteffekte entfernt. Der A/D-Wandler 124 ist mit einer 20 bit Auflösung gewählt, um große Veränderungen des wahrgenommenen Lichts aus unterschied lichen Sonden, Alterungseffekte der optischen Geräte und so weiter ohne Notwendigkeit eines automatischen Verstärkungs schaltkreises akkurat zu behandeln. Es muß daran gedacht wer den, daß in diesem System der pH-Wert durch das Verhältnis zwischen Fluoreszenz bei 600 nm und bei 680 nm bestimmt wird, nicht durch ihre absoluten Größen. Das so offenbarte Fluorome ter mißt dieses Verhältnis genau und automatisch unabhängig von dem Gerät, der Sonde oder Veränderungen der Umgebung.

Der Mikroprozessor 128 mißt die Signale von beiden A/D- Wandlern 124 und 132 gleichzeitig und erzeugt ein Pulsverhält nis der Fluoreszenz für jeden Stroboskoplampenpuls. Zudem kann es außerdem das Signal mitteln oder verarbeiten, falls erfor derlich. Wie zuvor erwähnt steuert er auch die A/D-Wandler 124 und 132, den Stroboskoplampentrigger 136 und die automatischen Nullwertfunktionen des Zeitgebers 140. Das von Mikroprozessor 128 berechnete Fluoreszenzverhältnis wird in pH-Daten umgewan delt, die der pH-Wertausgabevorrichtung 144 übergeben werden.

Beispiel 25

Pufferlösungen (1% ACES, 1% NaCl) wurden hergestellt und auf pH-Werte zwischen ungefähr 5 und 9 eingestellt, und bei Raumtemperatur wurden mit einem frisch geeichten Orion Modell 720 pH-Wertmeßgerät die Werte abgelesen. Optische pH-Wertdaten wurden aus jeder Pufferprobe elektronisch mit dem Computerda tenerfassungssystem aufgenommen. Nach Einstellung des Gleich gewichts wurden 100 Ablesungen von jeder Probe genommen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 4 gezeigt, bei der das Emissionsverhältnis (Emission bei 590 nm, geteilt durch Emission bei 680 nm) als Funktion des pH-Werts wiedergegeben ist. Die Genauigkeit jedes Verhältnisdatenpunkts war typi scherweise besser als 0,5%, was eine Unsicherheit des pH- Werts von ungefähr 0,02 pH-Einheiten bei einer Standardabwei chung von ∀ 1 ergibt.

Beispiel 26

Proteinhaltige Pufferproben (1% BSA, 1% ACES, 1% NaCl) wurden mit einem pH-Wert im Bereich von 6,9 bis 7,6 herge stellt. Diese Proben wurden gemäß dem Verfahren aus Beispiel 25 einer pH-Wertbestimmung unterworfen. Die resultierenden Da ten sind in Fig. 5 zusammengefaßt. Wie in Beispiel 25 ergab die Genauigkeit jedes Datenpunkts und die Neigung der Emissi onsverhältnis/pH-Wert-Kurve eine Unsicherheit des pH-Werts von etwa 0,02 pH-Werteinheiten.

Aus dem vorhergehenden wird erkannt, daß die erfindungsge mäßen Zusammensetzungen Mittel zur pH-Wertbestimmung unter Verwendung eines weiten Bereichs von festen Trägermaterialien liefern. Es ist somit möglich, einen speziellen Carbazinfarb stoff, festen Träger und kovalente Verbindungsmittel zu ver wenden, um eine optimale pH-Wertmessung zu ergeben.

Die vorliegende Erfindung kann in anderen speziellen For men ausgeführt werden, ohne von ihrer Idee oder wesentlichen Charakteristika abzuweichen. Die beschriebenen Ausführungsfor men werden in jederlei Hinsicht nur als illustrierend und nicht als einschränkend angesehen. Der Bereich der Erfindung ist somit nur durch die angefügten Patentansprüche begrenzt und nicht durch die vorangehende Beschreibung. Alle Verände rungen, die mit Bedeutung und Bereich von funktioneller Gleichwertigkeit der Patentansprüche einhergehen, sollen in nerhalb ihrer Bereiche liegen.

Claims

1. Mittel zum Anzeigen des pH-Werts einer Lösung, in die das Mittel gegeben wird, das einen fluoreszie renden Carbazinfarbstoff umfaßt, der kovalent an einen fe sten Träger gebunden ist, wobei das Farbstoff-Träger-Mittel durch die Formel
D-3-M
wiedergegeben wird, in der M irgendein fester Träger ist, der eine funktionelle Gruppe enthält oder derivatisiert ist, um eine funktionelle Gruppe zu enthalten, die mit Hydrazin reaktiv ist, so daß die Umsetzung mit Hydrazin einen hydra zinderivatisierten festen Träger bildet; D irgendein fluo reszierender Carbazinfarbstoff mit der Formel
ist, in der R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H und Alkyl, und wobei der fluores zierende Carbazinfarbstoff mit dem hydrazinderivatisierten festen Träger am 1-Kohlenstoffatom des Spirorings reaktiv ist, und B ein Bindeglied ist, dessen kovalente Anbindung durch Umsetzung zwischen dem hydrazinderivatisierten festen Träger und dem 1-Kohlenstoffatom des Spirorings gebildet ist und das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -NHNH-, =N-NH- und =N-N=.

2. Mittel nach Anspruch 1, bei dem M ein Mitglied aus gewählt aus der Gruppe bestehend aus einem gegenüber Oxida tion mit Periodat empfindlichen Polymer, mit Epoxid reak tivem Träger, anorganischem Träger, Polyaldehydpolymer und Poly(methylketon)polymer ist.

3. Mittel nach Anspruch 2, bei dem M ein gegenüber Oxidation mit Periodat empfindliches Polymer ist.

4. Mittel nach Anspruch 3, bei dem M ein Mitglied aus gewählt aus der Gruppe bestehend aus Papier, Stärke, Cellu lose, Amylose, Rayon, Cellophan und Mischungen derselben ist.

5. Mittel nach Anspruch 4, bei dem B -NHNH- ist.

6. Mittel nach Anspruch 2, bei dem M ein mit Epoxid reaktiver Träger ist.

7. Mittel nach Anspruch 6, bei dem das mit Epoxid re aktive Polymer eine oberflächen-funktionelle Gruppe enthält, die aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Amino, Carbonsäu re und Anhydrid ausgewählt ist.

8. Mittel nach Anspruch 2, bei dem M ein anorganischer Träger ist.

9. Mittel nach Anspruch 8, bei dem der anorganische Träger ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glas, Glasfasern, Sand, Siliciumdioxidgel, Alumoniumoxid, Titandioxid, Nickeloxid, Aluminiumoxid, Zirconiumdioxid und Mischungen derselben ist.

10. Mittel nach Anspruch 9, bei dem der anorganische Träger ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glas, Glasfasern, Sand, Siliciumdioxidgel, Aluminiumoxid und Mischungen derselben ist.

11. Mittel nach Anspruch 10, bei dem B -NHNH- ist.

12. Mittel nach Anspruch 2, bei dem M ein Polyaldehyd polymer ist.

13. Mittel nach Anspruch 12, bei dem das Polyaldehyd polymer ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyacrolein und polymerisiertem Glutaraldehyd ist.

14. Mittel nach Anspruch 13, bei dem B -NHNH- ist.

15. Mittel nach Anspruch 2, bei dem ein Poly(methyl keton)polymer ist.

16. Mittel nach Anspruch 15, bei dem B =N-N= ist.

17. Mittel nach Anspruch 2, bei dem R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils H sind.

18. Mittel nach Anspruch 2, bei dem R₂ und R₆ jeweils H sind und R₃ und R₅ jeweils Methyl sind.

19. Mittel nach Anspruch 2, bei dem R₂, R₃ und R₅ je weils Methyl sind und R₆ H ist.

20. Mittel nach Anspruch 2, bei dem R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils Methyl sind.

21. Mittel nach Anspruch 2, bei dem R₂ und R₃ Cyclo hexyl sind und R₅ und R₆ jeweils H sind.

22. Mittel nach Anspruch 2, bei dem R₂ und R₆ jeweils sind, R₃ Isopropyl ist und R₅ Methyl ist.

23. pH-Indikator, der einen fluoreszierenden Carbazinfarbstoff umfaßt, der kova lent an Hydrazin oder ein substituiertes Hydrazin gebunden ist, wobei der Indikator ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
ist, wobei R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H und Alkyl und R₇ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und Alkyl.

24. pH-Indikator nach Anspruch 23, bei dem R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils H sind.

25. pH-Indikator nach Anspruch 23, bei dem R₂ und R₆ jeweils H sind und R₃ und R₅ jeweils Methyl sind.

26. pH-Indikator nach Anspruch 23, bei dem R₂, R₃ und R₅ je weils Methyl sind und R₆ H ist.

27. pH-Indikator nach Anspruch 23, bei dem R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils Methyl sind.

28. pH-Indikator nach Anspruch 23, bei dem R₂ und R₃ Cyclo hexyl sind und R₅ und R₆ jeweils H sind.

29. pH-Indikator nach Anspruch 23, bei dem R₂ und R₆ jeweils H sind, R₃ Isopropyl ist und R₅ Methyl ist.

30. Faseroptisches System zur Bestimmung des pH-Werts, das

a) eine Sonde zum Anzeigen des pH-Werts einer Lösung, in die die Sonde gegeben wird, die einen fluoreszierenden Carbazinfarbstoff umfaßt, der kovalent an einen festen Träger gebunden ist, wobei das Farbstoff-Träger-Mittel durch die Formel
D-B-M
wiedergegeben wird, in der M irgendein fester Träger ist, der eine funktionelle Gruppe enthält oder derivatisiert ist, um eine funktionelle Gruppe zu enthalten, die mit Hy drazin reaktiv ist, so daß die Umsetzung mit Hydrazin ei nen hydrazinderivatisierten festen Träger bildet; D ir gendein fluoreszierender Carbazinfarbstoff mit der Formel
ist, in der R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H und Alkyl, und wobei der fluo reszierende Carbazinfarbstoff mit dem hydrazinderivatisierten festen Träger am 1-Kohlenstoffatom des Spiro rings reaktiv ist, und B das Bindeglied ist, dessen kovalente Anbindung durch Umsetzung zwischen dem hydrazinderivatisierten fe sten Träger und dem 1-Kohlenstoffatom des Spirorings ge bildet ist und das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -NHNH-, =N-NH- und =N-N=;
b) eine an diese Sonde gekoppelte optische Faser zum Emp fangen von Anregungslicht aus einem Fluorometer und Lei ten des Anregungslichts zu der Sonde und zum Empfang von emittiertem Licht aus der Sonde und Leiten des emittier ten Lichtes zu dem Fluorometer;
c) ein an die optischen Faser gekoppeltes Fluorometer zur Erzeugung von Anregungslicht mit einer gewählten Wellen länge und Abgabe des Anregungslichts an die Faser, zum Empfang und Messen von Intensitäten des emittierten Lichtes bei einer ersten gewählten Wellenlänge und bei einer deutlich verschiedenen zweiten gewählten Wel lenlänge und zur Erzeugung eines elektronischen Signals, das Messungen der Intensitäten enthält; und
d) an das Fluorometer gekoppelte Einrichtungen zum Empfang des elektronischen Signals, Berechnen eines Verhältnis ses der Messungen der Intensitäten, Korrelieren des Ver hältnisses mit einer zuvor bestimmten Beziehung zu dem pH-Wert und Anzeigen des pH-Werts umfaßt.

31. System nach Anspruch 30, bei dem M ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem gegenüber Oxidation mit Periodat empfindlichen Polymer, mit Epoxid reaktivem Träger, anorganischem Träger, Polyaldehydpolymer und Poly(methyl keton)polymer ist.

32. System nach Anspruch 31, bei dem M ein gegenüber Oxidation mit Periodat empfindliches Polymer ist.

33. System nach Anspruch 32, bei dem M ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Papier, Stärke, Cellulose, Amy lose, Rayon, Cellophan und Mischungen derselben ist.

34. System nach Anspruch 33, bei dem B -NHNH- ist.

35. System nach Anspruch 31, bei dem M ein mit Epoxid reaktiver Träger ist.

36. System nach Anspruch 35, bei dem der mit Epoxid reaktive Träger eine oberflächen-funktionelle Gruppe enthält, die aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Amino, Carbonsäure und Anhydrid ausgewählt ist.

37. System nach Anspruch 31, bei dem M ein anorganischer Träger ist.

38. System nach Anspruch 37, bei dem der anorganische Träger ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glas, Glasfasern, Sand, Siliciumdioxidgel, Aluminiumoxid, Titandi oxid, Nickeloxid, Aluminiumoxid, Zirconiumdioxid und Mi schungen derselben ist.

39. System nach Anspruch 38, bei dem der anorganische Träger ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glas, Glasfasern, Sand, Siliciumdioxidgel, Aluminiumoxid und Mi schungen derselben ist.

40. System nach Anspruch 39, bei dem B -NHNH- ist.

41. System nach Anspruch 31, bei dem M ein Polyaldehydpolymer ist.

42. System nach Anspruch 41, bei dem das Polyaldehydpolymer ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly acrolein und polymerisiertem Glutaraldehyd ist.

43. System nach Anspruch 42, bei dem B -NHNH- ist.

44. System nach Anspruch 31, bei dem M ein Poly(methylketon) po lymer ist.

45. System nach Anspruch 44, bei dem B =N-N= ist.

46. System nach Anspruch 31, bei dem R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils H sind.

47. System nach Anspruch 31, bei dem R₂ und R₆ jeweils H sind und R₃ und R₅ jeweils Methyl sind.

48. System nach Anspruch 31, bei dem R₂, R₃, und R₅ jeweils Me thyl sind und R₆ H ist.

49. System nach Anspruch 31, bei dem R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils Methyl sind.

50. System nach Anspruch 31, bei dem R₂ und R₃ Cyclohexyl sind und R₅ und R₆ jeweils H sind.

51. System nach Anspruch 31, bei dem R₂ und R₆ jeweils H sind, R₃ Isopropyl ist und R₅ Methyl ist.

52. System nach Anspruch 30, bei dem die Faser eine Kunststoff faser umfaßt.

53. System nach Anspruch 30, bei dem die gewählte Wellenlänge des Anregungslichts im Bereich von etwa 480 bis etwa 540 nm liegt.

54. System nach Anspruch 53, bei dem die erste gewählte Wel lenlänge des emittierten Lichtes im Bereich von etwa 570 bis etwa 620 nm liegt und die zweite gewählte Wellenlänge des emittierten Lichtes im Bereich von etwa 650 bis etwa 720 nm liegt.

55. Verfahren zur Bestimmung des pH-Werts einer Lösung, bei dem in Stufen

a) ein Mittel bereitgestellt wird, das einen fluoreszierenden Carbazinfarbstoff umfaßt, der kovalent an einen festen Träger gebunden ist, wobei Farb stoff-Träger-Mittel durch die Formel
D-B-M wiedergegeben wird, in der M irgendein fester Träger ist, der eine funktionelle Gruppe enthält oder derivatisiert ist, um eine funktionelle Gruppe zu enthalten, die mit Hy drazin reaktiv ist, so daß die Umsetzung mit Hydrazin ei nen hydrazinderivatisierten festen Träger bildet; D ir gendein fluoreszierender Carbazinfarbstoff mit der Formel
ist, in der R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H und Alkyl, und wobei der fluo reszierende Carbazinfarbstoff mit dem hydrazinderivati sierten festen Träger am 1-Kohlenstoffatom des Spirorings reaktiv ist, und B das Bindeglied ist, dessen kovalente Anbindung durch Umsetzung zwischen dem hydrazinderivatisierten festen Trä ger und dem 1-Kohlenstoffatom des Spirorings gebildet ist und das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -NHNH-, =N-NH- und =N-N=;
b) das Mittel in die Lösung gegeben wird, deren pH-Wert bestimmt werden soll;
c) das Mittel in der Lösung mit Licht einer ge wählten Wellenlänge in Kontakt gebracht wird, um die Emission von Fluoreszenzlicht durch den Carbazinfarb stoff anzuregen;
d) die Intensitäten des Fluoreszenzlicht bei einer ersten gewählten Wellenlänge und einer deutlich verschiedenen zweiten gewälten Wellenlänge gemessen werden;
e) ein Verhältnis der gemessenen Intensität bei der ersten gewählten Wellenlänge und der zweiten gewählten Wellen länge berechnet wird; und
f) das Verhältnis mit einer vorbestimmten Beziehung der Verhältnisse mit dem pH-Wert korreliert wird.

56. Verfahren nach Anspruch 55, bei dem M ein Mitglied ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus einem gegenüber Oxidation mit Periodat empfindlichen Polymer, mit Epoxid reaktivem Träger, anorganischem Träger, Polyaldehydpolymer und Poly (methylketon)polymer ist.

57. Verfahren nach Anspruch 56, bei dem M ein gegenüber Oxida tion mit Periodat empfindliches Polymer ist.

58. Verfahren nach Anspruch 57, bei dem M ein Mitglied aus gewählt aus der Gruppe bestehend aus Papier, Stärke, Cellu lose, Amylose, Rayon, Cellophan und Mischungen derselben ist.

59. Verfahren nach Anspruch 58, bei dem B -NHNH- ist.

60. Verfahren nach Anspruch 56, bei dem M ein mit Epoxid reak tiver Träger ist.

61. Verfahren nach Anspruch 60, bei dem das mit Epoxid reaktive Polymer eine oberflächen-funktionelle Gruppe enthält, die aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Amino, Carbonsäure und Anhydrid ausgewählt ist.

62. Verfahren nach Anspruch 56, bei dem M ein anorganischer Träger ist.

63. Verfahren nach Anspruch 62, bei dem der anorganische Träger ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glas, Glasfasern, Sand, Siliciumdioxidgel, Aluminiumoxid, Titandi oxid, Nickeloxid, Aluminiumoxid, Zirconiumdioxid und Mi schungen derselben ist.

64. Verfahren nach Anspruch 63, bei dem der anorganische Träger ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glas, Glasfasern, Sand, Siliciumdioxidgel, Aluminiumoxid und Mi schungen derselben ist.

65. Verfahren nach Anspruch 64, bei dem B -NHNH- ist.

66. Verfahren nach Anspruch 56, bei dem M ein Polyaldehydpo lymer ist.

67. Verfahren nach Anspruch 66, bei dem das Polyaldehydpolymer ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly acrolein und polymerisiertem Glutaraldehyd ist.

68. Verfahren nach Anspruch 67, bei dem B -NHNH- ist.

69. Zerfahren nach Anspruch 56, bei dem M ein Poly(methylke ton) polymer ist.

70. Verfahren nach Anspruch 69, bei dem B =N-N= ist.

71. Verfahren nach Anspruch 56, bei dem R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils H sind.

72. Verfahren nach Anspruch 56, bei dem R₂ und R₆ jeweils H sind und R₃ und R₅ jeweils Methyl sind.

73. Verfahren nach Anspruch 56, bei dem R₂, R₃ und R₅ jeweils Methyl sind und R₆ H ist.

74. Verfahren nach Anspruch 56, bei dem R₂, R₃, R₅ und R₆ jeweils Methyl sind.

75. Verfahren nach Anspruch 56, bei dem R₂ und R₆ Cyclohexyl sind und R₅ und R₆ jeweils H sind.

76. Verfahren nach Anspruch 56, bei dem R₂ und R₆ jeweils H sind, R₃ Isopropyl ist und R₅ Methyl ist.