DE19643921A1 - Integriertes Nukleinsäureanalysesystem für eine Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation-Laufzeit-Massenspektroskopie - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Probenvorbereitung für die Massenspektroskopie. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein miniaturisiertes inte­ griertes Handhabungsgerät für Nukleinsäureproben, die direkt mit einer MALDI-TOF-Ionisationsoberfläche (MALDI-TOF = Ma­ trix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation-Laufzeit) schnittstellenmäßig verbunden sind. Das hierin offenbarte integrierte System findet Verwendung bei der Verstärkung und Analyse von DNS-Proben für eine genetische Diagnose und bei anderen klinischen oder forensischen Zwecken.

Die Verwendung der DNS-Analyse bei der Diagnose und der Handhabung von menschlichen Krankheiten erhält weit verbrei­ tete Aufmerksamkeit in Gebieten, wie z. B. der Infektions­ krankheitendiagnose, der DNS-Typisierung und -Transplanta­ tion, der Diagnose und Handhabung von Krebs und bei der Dia­ gnose und Reihenuntersuchung von genetischen Krankheiten. Siehe beispielsweise in K.J. Skogerboe, "Molecular Biology Techniques", Anal. Chem. 67, 449R-454R (1995).

Die Fähigkeit, genetisch normale oder abweichende Gensequen­ zen in klinischen Proben zu erfassen, erfordert im allgemei­ nen die Verwendung einer enzymatischen Oligonukleotid-Ver­ stärkungstechnik (z. B. der Polymerase-Kettenreaktion (PCR; PCR Polymerase Chain Reaction)), um erfaßbare Pegel von ausgewählten Regionen einer DNS zur Analyse zu erzeugen. Ei­ ne Sequenzanalyse erfordert zusätzliche enzymatische oder chemische Verarbeitungsschritte.

Die genetische Analyse einer menschlichen Krankheit betrifft eine groß angelegte Erfassung und Reihenuntersuchung von klinischen DNS-Proben. Gegenwärtige Verfahren zur DNS-Analy­ se verwenden herkömmliche thermische PCR-Durchlaufgeräte und mehrere Geräte zum Vorbereiten, zum Trennen und zum Erfassen der DNS. Die Probenvorbereitung wird mit herkömmlichen Pro­ benhandhabungsgeräten (Teströhren, Pipetteneinrichtungen, Mikrozentrifugen, Konzentriereinrichtungen, Filtergeräten) ausgeführt, wobei dieselbe viele manuelle Handhabungsschrit­ te und Übertragungen umfaßt. Solche Prozeduren sind labor­ intensiv, zeitaufwendig, teuer und anfällig für eine Proben­ verschmutzung und einen Probenverlust.

Die groß angelegte Erfassung und Reihenuntersuchung von kli­ nischen DNS-Proben erfordert automatisierbare, schnelle und kosteneffektive Techniken zur Probenverarbeitung und zur Messung. Diese Techniken müssen empfindlich, genau und re­ produzierbar sein.

Die Laufzeit-Massenspektrometrie (TOF-MS; TOF-MS = Time-Of- Flight Mass Spectrometry) ist eine solche Technik, die po­ tentiell in der Lage ist, für eine DNS-basierte klinische Reihenuntersuchung verwendet zu werden. Die TOF-MS ist die effizienteste Massenanalysetechnik bezüglich der Erfassungs­ empfindlichkeit, wobei dieselbe ohne weiteres eine gute Mas­ senanalyse mit einer guten Massengenauigkeit liefert (R.J. Cotter, Anal. Chem. 64 (21), 1027 (1992)). Dieselbe ist eine der wenigen Analysetechniken, die eine hohe Empfindlichkeit, eine hohe Selektivität und Spezifizität mit einer Analysege­ schwindigkeit kombiniert. Die TOF-MS kann beispielsweise ein vollständiges Massenspektrum im Mikrosekundenbereich auf­ zeichnen.

Die Technik der Matrix-unterstützten Laser-Desorption/Ioni­ sation (MALDI; MALDI = Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization) (M. Karas und F. Hillenkamp, Anal. Chem. 60, 2299 (1988)) erweiterte den analytischen Bereich der Massen­ spektrometrie auf Oligonukleotide und Nukleinsäuren. Siehe allgemein in P. Limbach u. a., "Characterization of oligo­ nucleotides and nucleic acids by mass spectrometry", In Current Opinion in Biotechnoiogy, 6, 96-102 (1995). Die Verwendung der MALDI-TOF-MS, um Produkte einer Restriktions­ enzymdigestion mit einer Länge von 9 bis 622 bp zu erfassen, mit einer Meßgenauigkeit von +/- 2 bp für Fragmente kleiner als 622 wurde berichtet (Y-H. Liu u. a., Rapid Commun. Mass Spec. 9, 735-743 (1995)). Die PCR-DNS-Fragmente von 86 bis 426 bp werden routinemäßig schneller als mit der Gelelektro­ phorese erfaßt (Y.-H. Liu u. a., ibid). Ein 40-Basen-Oligonu­ kleotid kann mit einer Ein-Basen-Auflösung erfaßt werden (T.A. Shaler u. a., Rapid Commun. Mass Spec. 9, 942-947 (1995)). Diese Berichte dokumentieren den schnellen Fort­ schritt, der in der Massenspektrometrie für die DNS-Erfas­ sung und -Sequenzierung durchgeführt wird, und die Anwendung derselben für die klinische Genetik.

Die Probenhandhabung ist sehr wichtig für die erfolgreiche Anwendung der MALDI-TOF-MS auf die klinische Genetik. Die Probenvorbereitung für die Massenspektroskopie kann die Kon­ zentration eines Analyts und/oder Reinigungsschritte erfor­ dern, um Verschmutzungsstoffe zu entfernen, die andernfalls die Genauigkeit der Massenbestimmung und die Ionenerträge für größere Oligonukleotide stören könnten. Die Reinigung kann entweder auf der Sonde (on-probe) oder außerhalb der Messung (off-line) durchgeführt werden. Für eine Reinigung auf der Sonde wird das Analyt in eine Sondenoberfläche ab­ sorbiert, die für eine nicht-selektive (Y-H. Liu u. a., Rapid Commun. Mass Spectro. 9, 735-743 (1995)) oder selektive Absorption (z. B. eine Affinitätserfassungsoberfläche, siehe W.T. Hutchens, PCT-Anmeldung WO 94/28418) modifiziert ist. Eine geeignete modifizierte Sondenoberfläche kann ebenfalls für die Analytkonzentration verwendet werden. Für analyti­ sche Probleme, die mehrere biochemische Modifikationen eines Oligonukleotidanalyts vor der MS-Erfassung und Messung benö­ tigen (z. B. PCR-Verstärkung, Restriktionsenzymdigestionen, Sequenzierungsreaktionen), ist die Auf-Sonden-Verarbeitung potentiell in der Lage insoweit verwendet zu werden, daß nur ein kleiner Anteil des Matrix-eingebetteten Analyts tatsäch­ lich während der MALDI desorbiert wird. Diese Prozedur er­ höht jedoch die Wahrscheinlichkeit einer Verschmutzung oder eines Verlusts der Probe während des wiederholten Entnehmens und Wiedereinsetzens der Sonde in die Quelle des Massenspek­ trometers und während des Abwaschens der Matrix vor der bio­ chemischen Modifikation des Analyts. Die Reinigung und Kon­ zentration des Analyts außerhalb der Analyse ist weiter ver­ breitet, dieselbe benötigt jedoch mehrere manuelle Übertra­ gungen und Misch- und Konzentrationsschritte, welche ar­ beitsintensiv und zeitaufwendig sind und das Risiko des Pro­ benverlusts erhöhen.

Die Knappheit an effizienten Probenvorbereitungs- und Hand­ habungstechniken bleibt eine ernsthafte Begrenzung für die Routineverwendung der Massenspektroskopie für die Nuklein­ säureanalyse. Da Massenmessungen in einem Bruchteil der Zeit, die zur Probenvorbereitung und Handhabung benötigt wird, durchgeführt werden können, ist die Probenhandhabung der Geschwindigkeitsbegrenzungsschritt bei dem analytischen Prozeß. In jüngster Zeit wurden DNS-Probenvorbereitungstech­ nologien erfolgreich auf miniaturisierte Formate reduziert. Siehe beispielsweise in P. Wilding u. a., Clin. Chem. 40, 1815-1818 (1994) (PCR-Microchip); A.T. Woolley und R.A. Mathies, Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 11348-11352 (1994) (Kapillararray-Elektrophoresemikrochip); M. Eggers und D. Ehrlich, Hematol. Pathol. 9, 1-15 (1995) (mikrohergestell­ te Geräte für eine Gen-basierte Diagnostik). Auftretende Technologien zum Miniaturisieren von Detektorgeräten wurden ebenfalls berichtet (Cambridge Healthtech Institute Confe­ rence on Microfabrication Technology, 28.-29. September 1995, San Francisco, CA). Die Integration einer miniaturi­ sierten Probenhandhabungseinrichtung mit einem Probenüber­ reichungsgerät würde die Vorteile der erhöhten Analysege­ schwindigkeit, der verringerten Probengröße und des verrin­ gerten Reagenzverbrauchs, des verringerten Probenverlusts und der geringeren Verschmutzung und der erhöhten Erfas­ sungseffizienz- und -Genauigkeit bringen.

Demgemäß besteht nach wie vor ein Bedarf nach einem inte­ grierten Nukleinsäureanalysesystem für die MALDI-TOF-MS, welches entworfen ist, um die inhärenten Nachteile herkömm­ licher Probenhandhabungstechniken zu vermeiden, während die Vorteile der Massenspektrometrieerfassung und -Messung bei­ behalten werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein integriertes Nukleinsäureanalysesystem für die MALDI-TOF- Massenspektroskopie zu schaffen, das ein miniaturisiertes Probenhandhabungsgerät umfaßt.

Diese Aufgabe wird durch ein integriertes Nukleinsäureana­ lysesystem für die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/ Ionisation-Laufzeit-Massenspektroskopie gemäß Anspruch 1, 11 oder 15 gelöst.

Um den oben beschriebenen Bedarf in der Technik zu bedienen, schafft die hierin offenbarte und beanspruchte Erfindung ein integriertes Nukleinsäureanalysesystem für die MALDI-TOF-MS auf einem Dünnfilmträger, wobei das System eine miniaturi­ sierte Probenhandhabungseinrichtung aufweist, die mit einer MALDI-Ionisationsoberfläche zum Erfassen und Messen von Oli­ gonukleotidanalyten in einem Laufzeit-Massenspektrometer in­ tegriert ist.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie ein automatisierbares Gerät für eine verbesserte Pro­ benhandhabung vor der massenspektrometrischen Analyse schafft. Ein miniaturisiertes System gemäß der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, eine komplexe Probenhandhabung, eine Trennung und Überreichung von Oligonukleotidanalyten für die Massenspektroskopie mit einer Geschwindigkeit und Genauigkeit durchzuführen, ohne daß eine wesentliche manu­ elle Manipulation und Interaktion notwendig ist.

Noch ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie kleine Mengen einer Probe mit einem minimalen Probenverlust handhaben kann. Ein miniaturisiertes Proben­ vorbereitungsfach mit einer automatisierbaren Einrichtung zum Trennen, zum biochemischen Manipulieren und zum Bewegen von Oligonukleotidanalyten von Punkt zu Punkt in dem Fach reduziert die Wahrscheinlichkeit eines Probenverlusts stark.

Ein verwandter Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie die Empfindlichkeit und Selektivität einer Analytmessung erhöht, indem Einfangregionen in dem Proben­ handhabungsfach zum Konzentrieren eines Oligonukleotids, welche in einer niedrigen Konzentration vorhanden sind, und zum Entfernen von potentiell störenden Molekülen und Ionen von dem Analyt vor der Massenspektrometrie geschaffen sind, wodurch das Signal verstärkt und das Rauschen in dem Massen­ spektrum erniedrigt wird.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht dar­ in, daß sie eine Selektivität und Sensitivität zur Analyt­ messung schafft, indem eine Einrichtung geschaffen wird, um eine DNS-Verstärkung in einem schnellen Durchlauf mit einer oligonukleotidprobe durchzuführen, wodurch ausgewählte DNS- Regionen auf für die Massenspektrometrie erfaßbare Pegel verstärkt werden.

Noch ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß dieselbe eine oder mehrere Oligonukleotid-Prozeß­ reaktionszonen mit immobilisierten Enzymen schafft. Die Ver­ wendung von immobilisierten Enzymen bei der vorliegenden Er­ findung ist darauf gerichtet, um eine erhöhte Enzymstabili­ tät mit einer verbesserten Reaktionskinetik, um einen nied­ rigeren Verlust eines Enzyms von einer nicht-spezifischen Adsorption an Oberflächen und um eine verringerte Verschmut­ zung von Reaktionszonen mit unerwünschten Enzymen zu schaf­ fen.

Noch ein weiterer verwandter Vorteil der vorliegenden Erfin­ dung besteht darin, die Durchführung vieler gleichzeitiger oder aufeinanderfolgender Analysen in dem gleichen Experi­ ment mit einer On-line-Überwachungsfähigkeit zu versehen. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird eine Mehrzahl von MALDI-Ionisationsoberflä­ chen innerhalb der Probenvorbereitung bereitgestellt, welche während der Massenspektrometrie reversibel abgedichtet wer­ den können. Ein alternatives bevorzugtes Ausführungsbeispiel betrifft die Plazierung der MALDI-Ionisationsoberflächen in einem drehbaren Kammgerät, welches zwischen der Funktion der Probensammlung und der Funktion der Probenüberreichung ab­ wechselt.

Noch ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Kosten des Analysierens von oligonukleotiden durch die Massenspektroskopie durch Aufbauen des Analysesy­ stems als eine einzige wegwerfbare Einheit zu reduzieren. Für die diagnostische Reihenuntersuchung von genetischen Proben wird das Einwegmerkmal die Kreuzverschmutzung von Proben beseitigen und falsche positive Ergebnisse reduzie­ ren.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend bezugnehmend auf die beiliegenden Zeich­ nungen detaillierter erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine Explosionsansicht eines Probenhandhabungssy­ stems, das mit einer MALDI-Ionisationsoberfläche integriert ist;

Fig. 2A eine Draufsicht der oberen Oberfläche des inte­ grierten Probenhandhabungssystems von Fig. 1;

Fig. 2B eine Draufsicht der äußeren unteren Oberfläche des integrierten Probenhandhabungssystems von Fig. 1;

Fig. 3 ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel des integrier­ ten Probenhandhabungssystems von Fig. 1, wobei Fig. 3A eine Draufsicht der oberen Oberfläche ist, die einzelne Merkmale des Probenvorbereitungsfachs zei­ gen, während Fig. 3B eine Draufsicht der oberen Oberfläche ist, die die Plazierung der Öffnungen zeigt; und

Fig. 4 ein Kammgerät, das eine Mehrzahl von MALDI-Ionisa­ tionsoberflächen in der Handhabungseinrichtung (Fig. 4A) enthält, und ein Kammgerät, das eine Mehrzahl von Zahndochten enthält, welche MALDI- Ionisationsoberflächen mit Einfangregionen auf­ weisen (Fig. 4B).

Vor der detaillierten Beschreibung der Erfindung sei ange­ merkt, daß diese Erfindung nicht auf die speziellen Kompo­ nententeile des beschriebenen Geräts oder auf die speziellen Prozeßschritte der beschriebenen Verfahren begrenzt ist, da solche Geräte und Verfahren variieren können. Es ist eben­ falls offensichtlich, daß die hierin verwendete Terminologie lediglich zur Beschreibung von speziellen Ausführungsbei­ spielen dient und nicht begrenzend ist. Bezüglich der Ver­ wendung in der Beschreibung und der beigefügten Ansprüche umfassen die Singularformen "ein" und "der/die/das" mehrere Bezüge, es sei denn, daß der Kontext deutlich etwas anderes aussagt. Somit umfaßt der Verweis auf "ein Analyt" Mischun­ gen von Analyten, der Verweis auf "eine MALDI-Ionisations­ oberfläche" zwei oder mehrere solcher Ionisationsoberflä­ chen, der Verweis auf "einen Mikrokanal" mehr als eine sol­ che Komponente, und dergleichen.

In dieser Beschreibung und in den folgenden Ansprüchen wird auf eine Anzahl von Ausdrücken Bezug genommen, welche im nachfolgenden definiert werden.

Der Ausdruck "Dünnfilmträger" wird hierin verwendet, um auf einen im wesentlichen planaren Verteiler zu verweisen, der aus einem nicht-leitenden Material besteht, und der einen Mikrokanal und weitere notwendige Komponenten eines miniatu­ risierten Probenvorbereitungsfachs, eine Schnittstelle zu nicht-wegwerfbaren Teilen und eine Ionisationsoberfläche für die MALDI-TOF-MS aufweist. Ein solches miniaturisiertes Ge­ rät kann aus einer Vielzahl von Materialien (z. B. Silizium, Glas, Niederpreispolymeren) durch Techniken gebildet werden, die in der Technik bekannt sind (z. B. Mikrobearbeitung, che­ misches Ätzen, Laserablation und dergleichen). Abschnitte des Geräts können aus zusammengesetzten Materialien herge­ stellt werden. Eine thermisch isolierte Reaktionszone kann beispielsweise aus verbundenen Schichten von Materialien mit unterschiedlichen thermischen Leitfähigkeiten gebildet sein. Es existieren bekannte Techniken zur Mikrobearbeitung plana­ rer Materialien, wie z. B. Silizium, wobei dieselben einen nützlichen und weit verbreitet angenommenen Lösungsansatz für die Miniaturisierung schaffen. Beispiele der Verwendung solcher Mikrobearbeitungstechniken, um miniaturisierte Trenngeräte auf Silizium- oder Borsilikatglas-Chips zu er­ zeugen, können in dem U.S. Patent Nr. 5,194,133 an Clark u. a., in dem U.S. Patent Nr. 5,132,012 an Miura u. a., in dem U.S. Patent Nr. 4,908,112 an Pace und in dem U.S. Patent Nr. 4,891,120 an Sethi u. a. gefunden werden.

Der Ausdruck "Probenvorbereitungsfach" wird hierin verwen­ det, um auf eine Region des Trägers zu verweisen, in der die Probenhandhabung ausgeführt wird. Die Probenhandhabung um­ faßt den gesamten Bereich von Operationen, die mit der Probe durchgeführt werden, und zwar von ihrer Einführung in das Fach bis zu ihrer Entfernung zur Analyse oder Verwendung. Solche Operationen können folgende Operationen aufweisen, sie sind jedoch nicht auf die genannten begrenzt: Konzen­ trieren eines Oligonukleotidanalyts aus einer schwachen Lö­ sung (z. B. durch selektive Absorption an eine chemisch-modi­ fizierte Oberfläche); Trennen eines Oligonukleotidanalyts von potentiell störenden Molekülen und Ionen (z. B. durch chromatographische und/oder elektrophoretische Verfahren); Durchführen eines Ionenaustausches oder Pufferaustausches mit einem Ionennukleotidanalyt-enthaltenden Fluid; chemi­ sches Manipulieren eines Oligonukleotidanalyts (z. B. durch Verstärkung, Nukleasedigestion, Hinzufügung oder Entfernung von Nukleotiden, kovalente Modifikationen von Nukleotiden, Oligonukleotidhybridisierung und -Denaturierung und derglei­ chen).

Das Probenvorbereitungsfach wird häufig eines oder mehrere Zugangstore zum Einführen von Materialien in dasselbe und zum Entfernen von Materialien von dem Fach aufweisen (z. B. zum Einführen von Proben und Reagenzien, zum Spülen des Fachs oder einer Region desselben mit Fluid von einem externen Behälter).

Das Probenvorbereitungsfach wird ferner eine oder mehrere "Reaktionszonen" zur chemischen Manipulation des Oligo­ nukleotidanalyts aufweisen, wie es oben beschrieben worden ist. Diese Reaktionszonen sind Regionen, in denen Reaktions­ partner und Katalysatoren eine ausreichende Zeit lang räum­ lich positioniert sind, um die beabsichtigte Reaktion auszu­ führen. Es ist nützlich und oft wesentlich, eine gleichmäßi­ ge und konstante Temperatur in einer Reaktionszone zu hal­ ten. Somit wird davon ausgegangen, daß das Probenvorberei­ tungsfach Temperatursteuerungsgeräte (z. B. Sensoren, Thermo­ elemente, Heizer und eine adäquate thermische Isolation, die die Reaktionszonen umgibt, um ein unbeabsichtigtes Querhei­ zen anderer Regionen des Faches zu verhindern) aufweisen wird. Wo es speziell erwünscht ist, eine PCR-(Polymerisa­ tions-Kettenreaktion-)vermittelte Verstärkung und keine isothermische Verstärkung durchzuführen, sind gleichmäßige Temperaturprofile, schnelle Temperaturdurchläufe und eine genaue Temperatursteuerung wesentlich. Ein Computer-gesteu­ erter Peltier-Heizer/Kühler ist für diesen Zweck nützlich. Siehe beispielsweise in P. Wilding, M.A. Shoffner und L.J. Kricka, "PCR in a Silicon Microstructure", Clin. Chem. 40 (9), 1815-1818 (1994). Unter Voraussetzung des gegenwär­ tigen Stands der Technik, der von M.A. Northrup, M.A. Burns u. a. (Cambridge Healthtech Institute Conference on Micro­ fabrication Technology, 28.-29. September 1995, San Fran­ cisco, CA) offenbart ist, kann ein außerordentlich schneller und genauer thermischer zyklischer Durchlauf erreicht werden (z. B. unter Verwendung eines Geräts mit 35 V und 0,5 Ampere ist es möglich, eine Rampenrate mit 30°C pro Sekunde zu er­ reichen). Eine ausreichende Isolation kann durch einen kor­ rekten Entwurf der Heizkammer und durch die Verwendung von geeigneten, in der Fachwelt bekannten Materialien erreicht werden (z. B. mehrschichtiges Silizium und Siliziumnitrid).

Der Ausdruck "Oligonukleotid" wird hierin verwendet, um auf natürlich auftretende oder synthetische Doppel- und Einzel­ strang-DNS-Moleküle und Doppel- und Einzelstrang-RNS-Mole­ küle zu verweisen.

Die Ausdrücke "Analyt", "Probenanalyt" und "Oligonukleotid- Analyt" werden in dieser Anmeldung austauschbar verwendet, um auf eine oder mehrere Oligonukleotid-Spezies zu verwei­ sen, deren Massen durch die Technik der MALDI-TOF-MS gemes­ sen werden sollen. Vor der Analyse kann das Analyt eine Ver­ stärkung, eine kovalente Modifikation, eine Konzentration oder eine Trennung von potentiell störenden Molekülen und Ionen in dem Probenvorbereitungsfach benötigen. Der Ausdruck "Analyse" wird hierin verwendet, um auf die Anwendung der MALDI-TOF-MS zur Erfassung und Strukturerklärung eines Oli­ gonukleotid-Analyts zu verweisen.

Ein Oligonukleotid-Analyt kann aus einer Vielzahl von natür­ lichen Quellen, wie z. B. biologischen Fluiden oder Gewebe­ extrakten, genetischer DNS oder RNS von Mikroorganismen, Vi­ ren, Rekombinantenzellen, Lebensmittelstoffen und Umwelt­ materialien, erhalten werden, oder dasselbe kann durch chemische Synthese (z. B. Sequenzen, die durch eine kombina­ torische Synthese hergestellt werden) erhalten und zur Ver­ wendung bei der vorliegenden Erfindung durch eine Vielzahl von Einrichtungen (z. B. Proteasedigestionen, chaotropische Salzextraktionen, organische Extraktionen und dergleichen) vorbereitet werden. Es wird davon ausgegangen, daß Einrich­ tungen zum Handhaben unprozessierter Proben von Fachleuten ohne eine übermäßige Experimentierung in die vorliegende Erfindung aufgenommen werden können.

Die Ausdrücke "Analyt-Bindepartner" und "Oligonukleotid-Bin­ departner" werden hierin verwendet, um auf Moleküle zu ver­ weisen, die allgemeine Strukturmerkmale (z. B. Einzel- oder Doppelstrang) des "Zielanalyts" (d. h. des Oligonukleotids, das an den Bindepartner gebunden werden soll) erkennen kön­ nen. Alternativ kann der Bindepartner spezifische Nukleotid­ sequenzen in dem Zielanalyt erkennen. Bindepartner können Oligonukleotid-Bindeproteine und Antikörper sowie Oligo­ nukleotid- oder Peptid-Nukleinsäuren aufweisen, die homologe Basispaarsequenzen für eine Wasserstoffbindung an das Ziel­ analyt aufweisen. Jeder der vorher erwähnten Typen von "Ana­ lyt-Bindepartnern" kann in der vorliegenden Erfindung ver­ wendet werden, wenn dieselben eine ausreichend hohe Binde­ affinität und Selektivität für das Zielanalyt aufweisen, um es zu ermöglichen, daß die Erfindung ausgeführt werden kann.

Der Ausdruck "MALDI" wird hierin verwendet, um auf die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation zu verwei­ sen, welche ein Verfahren ist, bei dem das Analyt in einer festen oder kristallinen "Matrix" von Licht-absorbierenden Molekülen (z. B. Nikotin-, Senf- oder 3-Hydroxypicolin-Säure) eingebettet wird, wonach dasselbe durch Laserstrahlung de­ sorbiert und von der festen Phase in die gasförmige oder Dampfphase ionisiert wird und als intakte Molekularionen zu einem Detektor hin beschleunigt wird. Die "Matrix" ist typi­ scherweise eine schwache organische Säure, die in Lösung mit dem Analyt in einem molaren Verhältnis von Matrix zu Analyt von 10.000:1 gemischt ist. Die Matrixlösung kann vor der Verwendung auf einen neutralen pH-Wert eingestellt werden.

Der Ausdruck "MALDI-TOF-MS" wird hierin verwendet, um auf die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation-Lauf­ zeit-Massenspektrometrie zu verweisen (MALDI-TOF-MS = Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight Mass Spectrometry).

Der Ausdruck "MALDI-Ionisationsoberfläche" wird hierin ver­ wendet, um auf eine Oberfläche zum Überbringen eines Ma­ trix-eingebetteten Analyts zu einem Massenspektrometer zur MALDI zu verweisen. Im allgemeinen werden die Ausdrücke "Sonde" oder "Sondenelement" austauschbar verwendet, um auf ein Gerät zum Überbringen des Analyts zu einem Massenspek­ trometer zur Strahlung und Desorption zu verweisen.

Metalle, wie z. B. Gold, Kupfer und rostfreier Stahl, werden typischerweise verwendet, um MALDI-Ionisationsoberflächen zu bilden. Weitere kommerziell verfügbare inerte Materialien (z. B. Glas, Silika, Nylon und andere synthetische Polymere, Agarose und andere Kohlehydrat-Polymere und Kunststoffe) können verwendet werden, wenn es erwünscht ist, die Oberflä­ che zu verwenden, um aktiv ein Analyt einzufangen, oder als Reaktionszone für eine chemische Modifikation des Analyts. Eine allgemeine Beschreibung nützlicher Verfahren zum Modi­ fizieren von MALDI-Ionisationsoberflächen für eine spezifi­ sche oder nicht-spezifische Absorption von Biopolymeren exi­ stiert von W.T. Hutchens, "Affinity Mass Spectrometry, In: Methods in Enzymology, 1995 (B. Karger & W.S. Hancock, Hrsg.), wobei diese Schrift hierin durch Bezugnahme aufge­ nommen ist. Die Verwendung von Nafion und Nitrozellulose-be­ schichteten MALDI-Sonden für eine Auf-Sonden-Entfernung von Salzen von PCR-verstärkten Gensequenzen wird von Y-H. Liu u. a., Rapid Commun. Mass Spec. 9, 735-743 (1995), berich­ tet. Tang u. a. berichteten die MALDI-Analyse von kurzen DNS-Duplexsonden mit einem Strang, welcher auf einem festen Träger (Streptavidin-beschichtete Magnetperlen oder Glasper­ len mit gesteuerten Poren) immobilisiert sind.

Der Ausdruck "Einfangregion" wird hierin verwendet, um auf eine Region oder auf Regionen in dem Probenüberreichungsfach zu verweisen, in der Probenhandhabungsfunktionen, die eine Immobilisation des Analyts erfordern, durchgeführt werden können (z. B. eine Konzentration von Analyten aus einer schwachen Lösung, ein Entfernen von potentiell störenden Mo­ lekülen und Ionen, die zu Anfang in der Probe vorhanden sind oder während der Analythandhabung eingeführt werden, einen Pufferaustausch und dergleichen).

Einfangregionen können durch bekannte Verfahren zum Anhaften von biologischen Molekülen an festen Trägern gebildet wer­ den. Siehe beispielsweise allgemein in Affinity Techniques Enzyine Purification: Part B. Methods in Enzymology, Bd. 34, Hrsg. W.B. Jakoby, M. Wilchek, Acad. Press, NY (1974) und Immobilized Biochemicals and Affinity Chromatography, Advan­ ces in Experimental Medicine and Bilogy, Bd. 42, Hrsg. R. Dunlap, Plenum Press, NY (1974), wobei diese Schriften hier­ in durch Bezugnahme aufgenommen sind. Die Oberfläche einer Perle beispielsweise oder eines Partikels oder eines plana­ ren Trägers kann mit einem bifunktionalen Vernetzungsreagenz (d. h. einem Vernetzungsreagenz mit gleichen oder unter­ schiedlichen chemischen Reaktivitäten an jedem Ende eines molekularen Vernetzungsmittels) behandelt sein, um ein Ende des Reagenz an reaktive Gruppen auf der Oberfläche anhaften zu lassen, und das entgegengesetzte Ende an ein biologisches Molekül. Der Vernetzer weist vorzugsweise eine ausreichende Länge auf, um es zu erlauben, daß anhaftende biologische Moleküle frei mit Verbindungen in Lösung interagieren. Ver­ netzungsgruppen können an der Oberfläche durch Siloxanbin­ dungen unter Verwendung von Organosilanen, wie Z.B. 3-Gly­ cidoxypropyl-Trimethoxysilan ("GOPS"), 3-Aminopropyltri­ ethoxysilan (APS) und dergleichen angehaftet werden, welche in der Chemie bekannt sind. Zur Immobilisierung von Oligo­ nukleotid-Sonden an SiO₂-Oberflächen unter Verwendung von Epoxy-Silan- und Amin-modifizierten Oligonukleotid-Sonden wird auf Eggers u. a., Bio Techniques 17, 516-524 (1994) verwiesen. Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zum Immobili­ sieren von biologischen Molekülen an Oberflächen besteht darin, ein Avidin- oder Streptavidin-Protein an die Oberflä­ che anzuhaften und anschließend die Oberfläche mit einem Analytbindepartner reagieren zu lassen, der kovalent an Bio­ tin oder ein Biotinanalogon gebunden ist. Avidin und Strep­ tavidin binden Biotin nicht-kovalent, jedoch mit einer sehr hohen Affinität (das K_a beträgt etwa 10¹⁵M^-1). Siehe in Green, "Avidin" in Advances in Protein chemistry, Academic Press, Bd. 29, 105 (1975). Biotinilierte Oligonukleotide können vorbereitet werden, wie es in der Literatur beschrie­ ben ist. Siehe beispielsweise Bayer u. a., Methods of Bioche­ mical Analysis, Bd. 26 (D. Glick, Hrsg.), 1-45 (1980) und Current Protocols in Molecular Biology, Ergänzung 20 (John Wiley & Sons, Inc.), wobei diese Schriften hierin durch Be­ zugnahme aufgenommen sind.

Gemäß der Ausführung der vorliegenden Erfindung kann eine Einfangregion in irgendeiner Mikrostrukturoberfläche in dem Probenvorbereitungsfach durch Vernetzen eines Analytbin­ dungspartners direkt an der Oberfläche und auf MALDI-Ioni­ sationsoberflächen gebildet werden, die mit dem Probenfach integriert sind. Alternativ kann eine Einfangregion auf den Oberflächen von Perlen gebildet sein, welche chemisch an der Oberfläche des Trägers befestigt sein können, oder welche magnetisch unter Verwendung von magnetisch-ansprechenden Perlen magnetisch befestigt werden können, indem ein Magnet­ feld angelegt wird, um die Perlen an der gewünschten Region des Trägers festzumachen. Magnetisch ansprechende Perlen und Partikel sind in der Technik bekannt und beispielsweise von Dynal (Dynal ist ein eingetragenes Warenzeichen), Inc. (Lake Success, NY) und von Bangs Laboratories, Inc. (Carmel, IN), erhältlich.

Zusätzlich zu Affinitätseinfangverfahren, welche für die Ausführung der Erfindung bevorzugt werden, kann ein Analyt­ einfangen durch Wasserabweisungs- oder Ladungs-Interaktionen oder durch Chelatbildungsmechanismen bewirkt werden, wie es weiter oben gezeigt wurde.

Ein eingefangenes Oligonukleotid-Analyt kann durch verschie­ dene in der Technik bekannte Verfahren wieder in Lösung ent­ lassen werden, um Oligonukleotid-Doppel zu denaturieren, oder Oligonukleotid-Protein-Bindungskomplexe mit hoher Affi­ nität durch Aufbrechen von H-Bindungen und/oder durch Bewir­ ken von polaren oder nicht-polaren Interaktionen (z. B. Än­ dern der Temperatur, des pH, der Lösungspolarität, Verwenden von chaotropischen Salzen, lokalisiertes Erwärmen mit Laser­ strahlung und dergleichen) aufzubrechen. Veränderungen der elektrischen Feldstärke können verwendet werden, um elektro­ statisch-vermittelte Bindungsinteraktionen zwischen einge­ fangenen Oligonukleotiden und ihren Bindungspartner aufzu­ brechen. Ein auf einem magnetisch ansprechenden Partikel eingefangenes Analyt kann mobilisiert werden, indem die ma­ gnetische Feldstärke verändert wird. Beim Ausführen dieser Erfindung wird davon ausgegangen, daß die Erwärmung der MALDI-Oberfläche verwendet werden kann, um ein Lösen eines Oligonukleotids von einer Einfangregion, die in derselben positioniert ist, zu erleichtern.

Der Ausdruck "Reaktionszone" wird in dieser Anmeldung ver­ wendet, um auf eine Region in dem Probenvorbereitungsfach zu verweisen, die einen immobilisierten Katalysator (z. B. ein Enzym, einen katalytischen Antikörper, eine katalytische Oberfläche, die durch Molekularaufdrucken gebildet ist, ein Ribozym und dergleichen) enthält. Die Immobilisierung von Katalysatoren in einer Reaktionszone kann durch irgendein bekanntes Verfahren erreicht werden, das stabile Verbindun­ gen und eine ausreichende katalytische Aktivität schafft, um die vorliegende Erfindung auszuführen (oben unter "Erfas­ sungsregion" beschrieben).

Die Reaktionszone kann in einem Mikrokanal, einem Topf oder in einer anderen Mikrostruktur in dem Probenvorbereitungs­ fach oder auf einer MALDI-Ionisationsoberfläche gebildet werden. Eine Mehrzahl von Reaktionszonen kann in dem glei­ chen Probenvorbereitungsfach zum gleichzeitigen Ausführen einer einzelnen Reaktion unter verschiedenen Reaktionsbedin­ gungen (Z.B. zum Optimieren einer PCR-Reaktion) oder für aufeinanderfolgende chemische Manipulationen eines Oligo­ nukleotid-Analyts (z. B. Restriktionsenzymdigestionen, Se­ quenzierungsreaktionen) oder zum gleichzeitigen Ausführen von Reaktionen mit vielen Analyt-Spezies oder für eine Kombination der vorstehend genannten Verfahren versehen sein.

Typischerweise werden die Reaktionszonen dieser Erfindung individuell Temperatur-gesteuert sein und an Mikrokanäle angrenzen. Es wird davon ausgegangen, daß Mikroventile und/ oder ventillose Pumpen in dem Probenvorbereitungsfach ge­ eignet positioniert sein werden, um den Analytfluß zu ge­ eigneten Reaktionszonen zu lenken. Eine Einrichtung zum Be­ wegen des Analyts von einem Punkt zu einem anderen in dem Probenvorbereitungsfach kann verwendet werden, um lösliche Reaktionspartner vor oder nach dem Eintritt in eine Reak­ tionszone zu mischen (z. B. Elektroosmose, Elektrokinese, hydrodynamischer Fluß oder irgendeine andere Technik, die dafür bekannt ist, daß sie zur Verwendung bei miniaturi­ sierten Probenhandhabungsgeräten geeignet ist).

Der Ausdruck "Oberflächenbehandlung" wird in dieser Anmel­ dung verwendet, um auf die Vorbereitung oder Modifikation der Mikrostrukturoberflächen der Probenvorbereitungskammer zur Biokompatibilität und zur Verhinderung einer nicht-spe­ zifischen Adsorption von Biomolekülen zu verweisen. Solche Behandlungen umfassen das Beschichten von Oberflächen mit Proteinen, mit nicht-reaktiven Silanen, mit Teflonstoffen und mit anderen Polymeren, die in der Technik bekannt sind, um eine nicht-spezifische Adsorption von Biomolekülen an der Oberfläche während der Probenhandhabung zu reduzieren oder zu beseitigen (siehe beispielsweise in C. Schöneich u. a., Anal. Chem. 65, 67R-84R (1993) bezüglich einer detaillier­ ten Beschreibung von Verfahren, die in der Technik verwendet werden).

Der Ausdruck "Verstärkung" wird in dieser Anmeldung verwen­ det, um auf irgendein In-Vitro-Verfahren zum Erhöhen der Kopieanzahl einer Zielnukleinsäuresequenz zu verweisen. Ver­ stärkungstechniken umfassen solche Techniken, die einen zyklischen Temperaturdurchlauf benötigen (z. B. die Polyme­ rase-Kettenreaktion (PCR), die Ligase-Kettenreaktion (LCR) und die Polymerase/Ligase-Kettenreaktion (PLCR)) und solche Techniken, welche unter isothermischen Bedingungen durchge­ führt werden können (z. B. eine Strangverschiebungsverstär­ kung (SDA; SDA = Strand Displacement Amplification), eine Nukleinsäuresequenz-basierte Verstärkung (NASBA; NASBA = Nucleic Acid Sequence Based Amplification), und eine sich selbst unterhaltende oder kritische Sequenzwiederholung (3SR; 3SR = Self-Sustained Sequence Replication)).

Die Polymerase-Kettenreaktions-(PCR-)Technik, welche die erste Verstärkungstechnik war, die entwickelt worden ist, und welche die Technik mit den breitesten Anwendungen zur Verwendung der vorliegenden Erfindung für eine genetische Diagnose in einem klinischen Laborumfeld ist, betrifft die Denaturierung eines DNS-DNS-Doppel, das die Zieloligonukleo­ tid-Sequenz zur Verstärkung enthält, und zwar bei einer Tem­ peratur von etwa 94°C, das Ausheilen von Vorbereitungsstof­ fen an jeden der Modellstränge bei Positionen, die die Ziel­ oligonukleotid-Sequenz flankieren, bei etwa 55°C oder 60°C, und die Vorbereitungsstofferweiterung mit einer thermophilen DNS-Polymerase bei etwa 72°C. Diese Reaktionssequenz wird ungefähr 30 Zyklen wiederholt, wobei Erweiterungsprodukte von jedem Zyklus als Ziel in dem nächsten Zyklus dienen, wo­ durch eine exponentielle Verstärkung erzeugt wird.

Der Ausdruck "transparent", wie er in dieser Anmeldung ver­ wendet wird, verweist auf die Fähigkeit eines Materials Licht verschiedener Wellenlängen durchzulassen, was als der Strahlungsprozentsatz gemessen werden kann, der eine Strecke von einem Meter durchdringt. Bei der Ausführung der vorlie­ genden Erfindung ist beispielsweise die obere Oberfläche des Probenvorbereitungsfachs vorzugsweise transparent, um es zu erlauben, daß die Probenhandhabung mikroskopisch überwacht werden kann, falls es erwünscht ist, und um eine Laserbe­ strahlung des Probenvorbereitungsfachs zu ermöglichen, falls es notwendig ist.

"Optional" oder "auf optionale Weise" bedeutet, daß das da­ rauffolgend beschriebene Merkmal oder die darauffolgend be­ schriebene Struktur in dem Analysesystem vorhanden sein kann oder nicht, oder daß das darauffolgend beschriebene Ereignis oder der darauffolgend beschriebene Umstand auftreten kann oder nicht, und daß die Beschreibung Fälle umfaßt, bei denen das Merkmal oder die Struktur vorhanden ist, und Fälle, bei denen das Merkmal oder die Struktur abwesend ist, oder Fäl­ le, bei denen das Ereignis oder der Umstand auftritt, und Fälle, bei denen dies nicht so ist. Der Satz "die Einfang­ region ist optional mit Zugangstoren versehen" bedeutet bei­ spielsweise, daß die Einfangregion mit Zugangstoren versehen sein kann oder nicht, und daß die Beschreibung beide Umstän­ de, und zwar ob Zugangstore vorhanden sind oder nicht, um­ faßt.

Der Ausdruck "Vakuumtor", wie er in dieser Anmeldung verwen­ det wird, verweist auf eine Öffnung in der Vakuumkammer ei­ nes Massenspektrometers zum Einfügen der MALDI-Ionisations­ oberfläche in denselben.

Falls nichts anderes gesagt ist, wird die Ausführung der vorliegenden Erfindung herkömmliche Techniken der Molekular­ biologie und der Rekombinanten-DNS-Technologie verwenden, welche in der Technik bekannt sind. Diese Techniken sind in der Literatur vollständig erklärt. Siehe beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.) und G.H. Keller und M.M. Manak, DNA Probes, zweite Ausgabe (Stockton Press, 1993), wobei diese Schriften hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind.

Gemäß der Erfindung kann ein integriertes Nukleinsäureanaly­ sesystem für die MALDI-TOF-MS in einer einzelnen preisgün­ stigen Einwegeinheit aufgebaut sein, welche hauptsächlich aus einem nicht-leitenden Material, wie z. B. aus Glas, Sili­ zium oder einem preisgünstigen Kunststoffpolymer, gebildet ist. Die Einheit kann Mikrokanäle, Reaktionszonen zum Aus­ führen von chemischen und enzymischen Reaktionen, Schnitt­ stellen zu Nicht-Einwegteilen und eine Ionisationsoberfläche für die MALDI-TOF-MS umfassen. Durch Verwenden sich ent­ wickelnder Technologien, die in der Mikrobearbeitung und Nanotechnologie gefunden werden können, können preisgünstige Dünnfilmträger mit Mikrokanälen, Mischkammern, Töpfen und Ventilen geätzt werden, um es zu ermöglichen, daß ein Oli­ gonukleotid-Analyt eingeführt wird, durch eine Serie von chemischen Manipulationen, welche räumlich und daher zeit­ lich getrennt sind, bewegt wird, und auf einer MALDI-Ioni­ sationsoberfläche abgelegt wird, die schnittstellenmäßig mit einem Massenspektrometer verbunden ist. Die gesamte Sequenz von Schritten von der Probeneinführung zur Probenerfassung kann automatisiert werden.

Ein spezielles Ausführungsbeispiel der Erfindung in ihrer einfachsten Form ist in den Fig. 1 und 2 gezeigt. Fig. 1 ist eine Explosionsansicht eines integrierten Analysesystems, das den Dünnfilmträger, der allgemein mit 10 bezeichnet ist, mit Komponenten des Probenvorbereitungsfachs zeigt, das in der oberen Oberfläche (12) des Trägers definiert ist. Die obere Oberfläche ist optional von einer Abdeckung (14) umge­ ben, die befestigbar über der Trägeroberfläche ausgerichtet ist, um ein Flüssigkeits-dichtes Probenvorbereitungsfach un­ ter Verwendung von Druckabdichtungstechniken durch Verwenden einer externen Einrichtung, um die Stücke zusammenzudrücken (z. B. Halter oder Spannungsfedern), oder durch Verwenden von in der Technik des Polymerverbindens bekannten Klebstoffen zu bilden. Die Abdeckung ist vorzugsweise aus einem transpa­ renten Material gebildet, um eine mikroskopische Beobachtung der Probeneinführung und der Handhabungsschritte und zur Laserbestrahlung zu erlauben. Die Abdeckung umfaßt Öffnungen (16, 18, 20), die räumlich mit Töpfen (24, 26 und 28 in Fig. 2A) ausgerichtet sind, und eine Öffnung (22), die mit einer MALDI-Ionisationsoberfläche (30) in dem Probenvorbereitungs­ fach ausgerichtet ist, um Zugangstore zu bilden, wenn die Abdeckung auf dem Träger befestigt ist. Die MALDI-Ionisa­ tionsoberfläche (30) besteht vorzugsweise aus einem typi­ schen MALDI-Oberflächenmaterial, wie z. B. Gold, dieselbe kann jedoch auch aus anderen bekannten Materialien herge­ stellt werden, falls es notwendig ist, wie es oben detail­ liert beschrieben worden ist. Eine Reaktionszone (32) ist zwischen der MALDI-Ionisationsoberfläche und den Probentöp­ fen positioniert. Die Reaktionszone ist mit einer Einrich­ tung zum Immobilisieren von Enzymen versehen, um die Synthe­ se, Digestion, Fragmentierung, kovalente Modifikation, die umgekehrte Transkription und weitere Reaktionen von Nuklein­ säure- und Oligonukleotid-Substraten zu katalysieren, wobei die Reaktionszone ferner mit einer Einrichtung zum Ausführen dieser Reaktionen in einer Temperatur-gesteuerten Umgebung (34) versehen ist. Es wird davon ausgegangen, daß katalyti­ sche Antikörper, Ribozyme und weitere Biokatalysatoren bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Die Ver­ bindungen zwischen den Töpfen, der Reaktionszone und der MALDI-Ionisationsoberfläche ist durch Mikrokanäle implemen­ tiert. Ein solcher Mikrokanal ist bei 36 gezeigt. Es ist ohne weiteres offensichtlich, daß die Darstellung des Mikro­ kanals (36) in einer im allgemeinen ausgedehnten Form lediglich aus Darstellungsgründen gegeben ist, wobei diese Darstellung die Gestalt und Geometrie von Mikrokanälen dieser Erfindung nicht begrenzen soll. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Probenvorbereitungsfach mit einer Mehrzahl von Mikrokanälen. Ferner ist die räumliche Anordnung von Töpfen, Reaktionszonen und Ionisationsober­ flächen auf dem Träger teilweise durch die analytischen Prozeduren und ihre Anforderungen bestimmt, wobei diese nicht durch irgendeine spezielle in den Figuren gezeigte Anordnung begrenzt sein soll.

Fig. 2B ist eine Draufsicht der äußeren unteren Oberfläche (8) des Dünnfilmträgers, welche elektrische Verbindungen (42, 44, 46, 48) und eine Peltier-Oberfläche (50) zeigt, die positioniert ist, um eine Temperatursteuerung für die Reak­ tionszone zu schaffen. Bei diesem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist es beabsichtigt, daß der Dünnfilmträger auf einer Vorbereitungsstation plaziert wird, welche elektrische Verbindungen für jeden der Töpfe schaffen wird, und welche eine Temperatursteuerung über die Peltieroberfläche (50) be­ reitstellen wird.

Wie es ferner detaillierter oben beschrieben worden ist, ist es beabsichtigt, lokale magnetische Felder an ausgewählte Regionen des Dünnfilmträgers anzulegen, welche magnetisch ansprechende Partikel als Einrichtung zum Bewegen der Parti­ kel von einer Region des Probenvorbereitungsfachs zu einem anderen anzulegen.

Demgemäß wird beim Ausführen der Erfindung ein kleines Volu­ men eines Oligonukleotid-Analyts (z. B. 1 µg oder weniger) in einen Probentopf injiziert und automatisch von dem Topf zu dem Mikrokanal bewegt. Zwecks dieser Diskussion wird ange­ nommen, daß Analyte und Reagenzien in Töpfe injiziert werden und durch elektromotorische Kräfte, die auf geladene Molekü­ le elektrophoretisch wirken, und auf ungeladene Moleküle elektroosmotisch wirken, von Punkt zu Punkt bewegt werden. Gleichzeitig werden Reagenzien in einen zweiten Topf inji­ ziert und von dem Topf zu dem Mikrokanal bewegt, indem sie sich mit dem Analyt mischen. Die Reaktionsmischung wird in die Reaktionszone bewegt und in Kontakt mit einem in dersel­ ben enthaltenen immobilisierten Enzym gebracht. Die Reak­ tionszonentemperatur wird automatisch gemessen und auf eine gewünschte Reaktionstemperatur eingestellt, auf der dieselbe für eine feste Zeit (unter der Annahme von isothermischen Reaktionsbedingungen) konstant gehalten wird. Das Oligo­ nukleotid-Analyt kann unter statischen Bedingungen reagie­ ren, indem der Fluß ausgeschaltet wird, oder dasselbe kann dynamisch in der Reaktionsregion gemischt werden, indem das elektrische Potential oder das magnetische Feld oder eine Druckdifferenz an der Reaktionszone oszillieren, um zu be­ wirken, daß der Fluß hin und her geht. Das reagierte Oligo­ nukleotid-Analyt wird auf die MALDI-Ionisationsoberfläche bewegt, mit der Matrix gemischt und getrocknet, wonach der Träger in das MALDI-TOF-MS-Vakuumsystem übertragen wird, um das MALDI-Experiment zu beginnen. Nach der Messung wird der Träger entfernt und weggeworfen.

Die Immobilisierung von Enzymen in einer Reaktionszone bie­ tet mehrere wichtige Vorteile gegenüber der Verwendung von Enzymen in Lösung an, von denen im nachfolgenden einige ge­ nannt sind: eine erhöhte Enzymstabilität; ein geringerer Verlust eines Enzyms durch nicht-spezifische Adsorption an Oberflächen; einen verringerten oder vernachlässigbaren Übertrag eines Enzyms zu anderen Reaktionszonen; und die Fähigkeit, eine hohe Enzymkonzentration für eine katalyti­ sche Reaktion mit einer sehr kleinen Konzentration eines Substrats zu erreichen, um kinetische Raten von schwachen Probenlösungen zu verbessern, ohne die molare Konzentration des Enzyms in Lösung zu erhöhen, wodurch die Verschmutzung des Analyts mit Enzymunreinheiten minimiert wird.

Der Vorteil des Integrierens des Probenvorbereitungsfaches mit der MALDI-Ionisationsoberfläche besteht darin, eine automatisierte chemische Manipulation von analytischen Pro­ ben vor der Analyse durch die MALDI-TOF-MS ohne irgendeine manuelle Probenhandhabung zu ermöglichen, wodurch eine Ver­ schmutzung und ein Probenverlust reduziert werden, während eine spezifische chemische Vorbehandlung vor der MALDI-Ana­ lyse erlaubt wird, um die Selektivität, die Empfindlichkeit und/oder die Reproduzierbarkeit der Messungen zu steigern. Dieses Merkmal wird von besonderer Wichtigkeit sein, wenn die volle Empfindlichkeit der MALDI-TOF erreicht werden soll. Mit besonderer Bezugnahme auf die vorliegende Erfin­ dung schafft die Integration eines miniaturisierten Nuklein­ säureanalysesystems mit der Fähigkeit des Verstärkens von kleinen Mengen von Oligonukleotid-Analyten mit der MALDI- TOF-MS eine sehr empfindliche, genaue, schnelle und repro­ duzierbare Technik zu Erfassen und Erklären der Struktur von Oligonukleotiden, die in relativ kleinen Mengen in klini­ schen und forensischen Proben vorhanden sind. Die Empfind­ lichkeit der Erfassung (zwischen 10^-12 bis 10^-15 Mol eines Oligonukleotids, das auf einer MALDI-Ionisationsoberfläche abgelegt ist) bedeutet, daß ein Oligonukleotid-Analyt nicht bis zu dem Grad verstärkt werden muß, der für andere analy­ tische Techniken notwendig ist, wohingegen die Meßgeschwin­ digkeit (in der Größenordnung von ein paar Minuten) das Durchführen von mehreren Massenbestimmungen in einem einzi­ gen Experiment erlauben sollte. Die Verwendung von wegwerf­ baren Sonden soll die Probenverschmutzung minimieren.

Bezugnehmend nun auf Fig. 3A sind bei einem bevorzugten Aus­ führungsbeispiel der Erfindung mehrere Reaktionszonen (60) räumlich auf der Trägeroberfläche angeordnet. Jede Zone kann das gleiche oder auch ein verschiedenes immobilisiertes En­ zym enthalten. Eine Mehrzahl von MALDI-Ionisationsoberflä­ chen (allgemein bei 62 gezeigt) ist in dem Probenvorberei­ tungsfach distal zu den Reaktionszonen positioniert enthal­ ten. Die verbindenden Fluid-gefüllten Mikrokanäle (64) sind optional mit umkehrbaren Abdichtungseinrichtungen (66) (z. B. einem thermisch ausdehnbaren Metall mit einer lokalen Heiz­ einrichtung) zum Abdichten der Kanäle verbunden, wenn die MALDI-Oberflächen schnittstellenmäßig mit dem Vakuumtor des Massenspektrometers verbunden sind. Einfangregionen (68) sind zwischen aufeinanderfolgenden Reaktionszonen angeord­ net. Wie es oben detailliert beschrieben worden ist, sind diese Regionen chemisch oder magnetisch angepaßt, um nach der Verarbeitung ein Oligonukleotid-Analyt selektiv zu hal­ ten. Dieses Merkmal ermöglicht es, daß Verschmutzungsstoffe, die während einer chemischen Reaktion eingeführt worden sind, durch Waschen des Analyts vor der Messung in dem Mas­ senspektrometer entfernt werden können, oder bevor zusätzli­ che Reaktionen mit dem Analyt durchgeführt werden, oder be­ vor das Analyt für andere Zwecke gesammelt wird. Somit ist jede Einfangregion optional mit Töpfen (70) und Zugangstoren (72, Fig. 3B) in der Dünnfilmträgerabdeckung (74, Fig. 3B) versehen. Die Richtungsbewegung eines Analyts von einer Reaktionszone zu einer Einfangregion und von einer Einfang­ region zu einer MALDI-Ionisationsoberfläche oder alternativ von einer Einfangregion zu der nächsten Reaktionszone in der Serie wird durch Mikroventile (nicht gezeigt) gesteuert. Be­ zugnehmend auf Fig. 3A speist eine Mehrzahl von Töpfen (76), die durch Mikrokanäle miteinander verbunden sind, jeweilige Reaktionszonen.

Als Beispiel einer aufeinanderfolgenden Verarbeitung eines Analyts wird ein Analyt zuerst in der Zone 60 reagiert, dann in seine entsprechende Einfangregion zum Waschen bewegt, wonach es losgelassen wird und in die Zone 78 bewegt wird.

Nach der Reaktion in der Zone 78 wird das Analyt zu der nächsten Einfangregion usw. bewegt, bis die gewünschte Reak­ tionssequenz vollendet worden ist. Nach einem abschließenden Einfangschritt und Waschschritt wird das Analyt zur Bewegung zu seiner entsprechenden MALDI-Ionisationsoberfläche (62) oder zu einem Sammlungstopf (allgemein bei 70 gezeigt) los­ gelassen.

Als Beispiel einer gleichzeitigen Verarbeitung von einem oder mehreren Analyten durch einen einzigen Reaktionsschritt können die einzelnen Reaktionszonen voneinander getrennt werden, indem der Verbindungsmikrokanal verschlossen wird, wie es gezeigt ist. Das Probenanalyt und die Reagenzien kön­ nen in den Mikrokanal für jede gegebene Zone injiziert wer­ den, wie es vorher für das in den Fig. 1 und 2 gezeigte Aus­ führungsbeispiel beschrieben worden ist.

Ein alternatives bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfin­ dung ist in den Fig. 4A und 4B gezeigt. Hier ist die MALDI- Ionisationsoberfläche in einem drehbaren Kammgerät (allge­ mein bei 90 gezeigt) mit einer Handhabungseinrichtung (92) und Zähnen gezeigt. Die Zähne können hohle, rohrartige Strukturen (94) sein, die sich nach oben erstrecken, um MALDI-Ionisationsoberflächen (96) in der Handhabungseinrich­ tung zu bilden, oder die Zähne können feste Zahndochte mit Analyteinfangregionen (Fig. 4B; (98)) sein. Wenn der Kamm zu einer ersten Position gedreht wird, werden die Spitzen der Zähne in Kontakt mit Fluidanalyt-enthaltenden Töpfen in dem Probenvorbereitungsfach gebracht, was dazu dient, daß die­ selben dadurch das Fluidanalyt durch Kapillarwirkung in die röhrenartigen Zähne ziehen. Das Analyt wird mit der Matrix in dem Handhabungsabschnitt der Röhre gemischt und an­ schließend auf der Ionisationsoberfläche (96) getrocknet. Alternativ wird das Analyt aktiv auf Zahndochteinfangregio­ nen (98) eingefangen. Beim Drehen des Kamms in eine zweite Position wird die MALDI-Ionisationsoberfläche, die entweder in der Kammhandhabungseinrichtung (Fig. 4A; 96) positioniert ist, oder die die Zahndochteinfangregion (Fig. 4B; 98) auf­ weist, mit dem Vakuumtor eines Massenspektrometers zum Ein­ führen in dasselbe ausgerichtet. Die Matrix wird auf der Einfangoberfläche der Zahndochte aufgebracht und kann vor dem Einführen der Zahndochte in das Massenspektrometervaku­ umtor trocknen.

Das folgende Beispiel wird gebracht, um Fachleute mit einer vollständigen Offenbarung und Beschreibung zu versehen, wie das Verfahren der Erfindung verwendet werden soll, wobei dieses Beispiel jedoch nicht den Bereich der Erfindung be­ grenzen soll. Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Genauigkeit bezüglich von Zahlen (z. B. Mengen, Temperatur, usw.) sicherzustellen, wobei jedoch bestimmte Fehler und Abweichungen möglich sein können. Es sei denn, daß etwas anderes gesagt ist, sind Teile Gewichtsteile, während die Temperatur in °C angegeben ist, und der Druck atmosphärisch oder nahezu atmosphärisch ist.

Beispiel PCR-verstärkung von HLA-DQ_α-Stoffen

Die folgenden flankierenden Oligonukleotid-Vorbereitungs­ stoffe sind zur Verwendung beim Verstärken jedes der ent­ sprechenden DQ_α-Untertypen, welche nachfolgend aufgelistet sind, entworfen:

Eine menschliche DNS wird aus 10 bis 50 µl Vollblut durch Lyse in 50 mM Tris-OH (pH 8,0), 50 mM EDTA, 1% SDS, 100 mM NaCl, 1% 2-Mercaptoethanol und Digestion mit Proteinase K (200 µg/ml Endkonzentration) und Ribonuklease A (100 µg/ml Endkonzentration) bereitet. Die DNS, die in dem Lysat enthalten ist, wird durch Phenolextraktion deproteinisiert, ausgefällt und in einem 100-µl-1×-TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) wieder in Suspension gebracht.

Um die extrahierte DNS zu verstärken, wird ein Stoff in einer Menge von 2-3 µg der Verstärkungsreaktionsmischung hinzugefügt, wobei der Stoff einen Reaktionspuffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-OH, pH 8,4 bei 22°C, 2,5 mM MgCl₂ und 0,01% Gelatin), Vorbereitungsstoffe oder "Primer" (20 pmol) und Deoxynukleotid-Triphosphate (dNTPs) (20 nmol) enthält. Die Reaktionsmischung wird in die Probenvorbereitungsregion ein­ geführt und zu einer Reaktionszone bewegt, die eine immobi­ lisierte Taq-Polymerase (2,5 Einheiten) enthält. Das Endvo­ lumen der Verstärkungsreaktion beträgt 10 µl bis 20 µl. Die Temperatur der Reaktionszone wird auf 95°C erhöht, um die Ziel-DNS zu denaturieren, und anschließend bis zu einer Ge­ samtzahl von 25 bis 40 Zyklen zyklisch verändert, um die DNS zu verstärken. Typischerweise wird das Temperaturzykluspro­ fil eine Denaturierung bei 95°C für eine Minute, das Aushei­ len bei 55 bis 60°C für 30 Sekunden und eine Erweiterung bei 72°C für eine Minute umfassen.

Nach der Vollendung der Verstärkung wird die verstärkte DNS von der Reaktionszone in den Mikrokanal bewegt, der zu der MALDI-Ionisationsoberfläche führt. Ein Anteil der DNS wird in die erste Einfangregion umgeleitet. Der Rest wird zu der MALDI-Ionisationsoberfläche bewegt. Der Mikrokanal, der die MALDI-Oberfläche mit der ersten Reaktionszone verbindet, wird abgedichtet, wonach die MALDI-Matrix hinzugefügt und getrocknet wird, wonach der Träger dann in das Vakuumtor des Massenspektrometers zur Erfassung gebracht wird.

Nachdem Massenmessungen durchgeführt worden sind, wird der Träger von dem Massenspektrometer entfernt, wonach die ein­ gefangene DNS für eine weitere Analyse und Charakterisierung bereit ist.

Claims (17)

1. Integriertes Nukleinsäureanalysesystem für eine Ma­ trix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation-Lauf­ zeit-Massenspektroskopie (MALDI-TOF-MS), mit folgenden Merkmalen:
einem Dünnfilmträger (10) mit einer oberen Oberfläche (12) und einer unteren Oberfläche (8), wobei die obere Oberfläche (12) ein Probenvorbereitungsfach aufweist, und wobei die untere Oberfläche eine Einrichtung zum Bewegen eines Analyts und von Fluiden in dem Fach und eine Einrichtung (50) zum Steuern der Temperatur des Fachs aufweist, wobei das Probenvorbereitungsfach fol­ gende Merkmale aufweist:
einen Topf (24, 26, 28; 70, 76) zum Aufnehmen von flüssigen Substanzen zur Probenvorbereitung;
eine Reaktionszone (32; 60), die eine Einrichtung zum Immobilisieren eines Katalysators an dieselbe aufweist, zum chemischen Manipulieren eines Oligo­ nukleotid-Analyts in derselben, wobei die Zone (32; 60) für eine Temperatursteuerung in einem Be­ reich von etwa 10°C bis etwa 100°C angepaßt ist; und
einen Mikrokanal (36; 64), der den Topf (24, 26, 28; 70, 76) und die Reaktionszonen (32; 60) ver­ bindet;
einer MALDI-Ionisationsoberfläche (30; 96), die mit dem Probenvorbereitungsfach kommuniziert;
einer Einrichtung zum schnittstellenmäßigen Verbinden des Dünnfilmträgers (10) mit einem Massenspektrometer; und
einer Einrichtung zur automatischen Probenvorbereitung.

2. Analysesystem gemäß Anspruch 1, welches ferner folgende Merkmale aufweist:
eine Vorbereitungsstation zum steuerbaren Eingeben von Elektrizität, Wärme, Druck und Magnetisierung in das Probenvorbereitungsfach als Reaktion auf augenblickli­ che Probenhandhabungsanforderungen; und
eine Einrichtung (42, 44, 46, 48) zum schnittstellen­ mäßigen Verbinden des Probenvorbereitungsfachs mit der Vorbereitungsstation.

3. Analysesystem gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem das Probenvorbereitungsfach ferner ein Zugangs­ tor (72) und mindestens eine Analyterfassungsregion (68) aufweist, die mit einem Mikrokanal (64) kommuni­ ziert, wobei die Erfassungsregion angepaßt ist, um ein interessierendes Analyt von einer mit derselben in Kon­ takt stehenden Fluidmischung reversibel zurückzuhalten, wobei die Erfassungsregion (68) optional für eine Wär­ me-, für eine Magnetisierungs- und für eine elektrische Eingabe angepaßt und optional mit dem Zugangstor (72) ausgerichtet ist.

4. Analysesystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Reaktionszone (32; 60) ein immobilisiertes Enzym aufweist.

5. Analysesystem gemäß Anspruch 4,
das für eine isothermische Oligonukleotid-Verstärkung angepaßt ist.

6. Analysesystem gemäß Anspruch 4, das für eine PCR-Ver­ stärkung angepaßt ist,
wobei das immobilisierte Enzym eine thermophile Desoxy­ ribonukleinsäure- (DNS-) Polymerase mit einer ausrei­ chenden Aktivität ist, um ein DNS-Analyt zu einem für die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation- Laufzeit-Massenspektroskopie erfaßbaren Pegel zu ver­ stärken,
wobei das Analysesystem ferner eine Einrichtung zum schnellen zyklischen Durchlaufen der Temperatur der Reaktionszone aufweist, wie es für eine PCR-Verstärkung erforderlich ist, und
wobei der Dünnfilmträger (10) ferner eine Abdeckung (14; 72) mit einem Zugangstor (16, 18, 20, 22; 74) auf­ weist.

7. Analysesystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die MALDI-Ionisationsoberfläche (30; 96) in dem Probenvorbereitungsfach enthalten und mit einem Mikro­ kanal (36; 64) verbunden ist.

8. Analysesystem gemäß Anspruch 7, bei dem die MALDI-Ionisationsoberfläche eine Reaktions­ zone aufweist.

9. Analysesystem gemäß Anspruch 7, bei dem die MALDI-Ionisationsoberfläche (96) eine Er­ fassungsregion (98) aufweist.

10. Analysesystem gemäß Anspruch 8 oder 9, bei dem der Verbindungsmikrokanal (64) eine reversible Abdichtungseinrichtung (66) aufweist.

11. Integriertes Nukleinsäureanalysesystem für eine Ma­ trix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation-Lauf­ zeit-Massenspektroskopie (MALDI-TOF-MS) mit folgenden Merkmalen:
einem Dünnfilmträger (10) mit einem Probenvorberei­ tungsfach, wobei das Fach eine Mehrzahl von Reaktions­ zonen (60, 78), die durch Mikrokanäle (64) mit Töpfen (70, 76) verbunden sind, eine Erfassungsregion (68) und eine oder mehrere MALDI-Ionisationsoberflächen (62) in dem Fach aufweist, und mit einem Zugangstor (72), das mit mindestens einem Mikrokanal (64) kommuniziert, wobei die Mikrokanäle (64) mit einer Einrichtung zum Richten des Flusses von Reagenzien und Analyten in dem Probenvorbereitungsfach und mit einer Abdichtungsein­ richtung (66) versehen sind, und wobei die Töpfe (70, 76) und die Erfassungsregionen (68) optional mit Zu­ gangstoren (72) versehen sind;
einer Einrichtung zum Bewegen des Oligonukleotid-Ana­ lyts in dem Fach;
einer Einrichtung zum Automatisieren einer Probenvorbe­ reitung; und
einer Einrichtung zum schnittstellenmäßigen Verbinden des Dünnfilmträgers mit einem Massenspektrometer.

12. Analysesystem gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche,
bei dem die MALDI-Ionisationsoberfläche (62) in einem drehbaren Kammgerät (90) vorgesehen ist, wobei das Ge­ rät (90) eine obere Handhabungseinrichtung (92) mit sich nach unten erstreckenden Zähnen aufweist, und wo­ bei das Gerät (90) zu einer ersten und einer zweiten Position drehbar ist,
wobei aufgrund einer Drehung des Geräts (90) in eine erste Position die Spitzen der Zähne in Kontakt mit Analyt-enthaltenden Töpfen in dem Probenvorbereitungs­ fach gebracht werden, wodurch es bewirkt wird, daß das lösliche Analyt, das in demselben enthalten ist, zum Mischen mit einer Matrix und zum Ablegen auf der Ioni­ sationsoberfläche (96) nach oben gezogen wird, und
wobei eine Drehung des Geräts (90) in eine zweite Posi­ tion die Ionisationsoberfläche (96) mit dem Vakuumtor eines Massenspektrometers zum Einführen in dasselbe ausrichtet.

13. Analysesystem gemäß Anspruch 12, bei dem die Kammzähne hohle Röhren mit einem offenem Ende aufweisen, die sich zusammen mit der Kammhandha­ bungseinrichtung (92) erstrecken, wobei die Kammhandha­ bungseinrichtung (92) eine MALDI-Ionisationsoberfläche (96) aufweist.

14. Analysesystem gemäß Anspruch 12, bei dem die Kammzähne feste Dochte aufweisen, von denen jeder eine Analyteinfangregion (98) aufweist, wobei die Einfangregion (98) sich zusammen mit der MALDI-Ionisa­ tionsoberfläche (96) erstreckt.

15. Integriertes Nukleinsäureanalysesystem für eine Ma­ trix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation-Lauf­ zeit-Massenspektroskopie (MALDI-TOF-MS) mit folgenden Merkmalen:
einem Dünnfilmträger (10) mit einem Probenvorberei­ tungsfach, wobei das Fach eine Mehrzahl von Reaktions­ zonen (60, 78), die durch Mikrokanäle (64) mit Töpfen (70, 76) und Einfangregionen (68) in dem Fach verbunden sind, und ein Zugangstor (72) aufweist, das mit minde­ stens einem Mikrokanal (64) kommuniziert, wobei die Mi­ krokanäle (64) mit einer Einrichtung zum Richten des Flusses von Reagenzien und Analyten in dem Probenvorbe­ reitungsfach versehen sind, und wobei die Töpfe (70, 76) und Einfangregionen optional mit Zugangstoren (72) versehen sind;
einer Matrix-unterstützte-Laser-Desorption/Ionisation- (MALDI-) Ionisationsoberfläche (96), die in einem dreh­ baren Kammgerät (90) enthalten ist, wobei das Gerät (90) eine obere Handhabungseinrichtung (92) mit sich nach unten erstreckenden Zähnen aufweist, wobei das Ge­ rät (90) zu einer ersten und einer zweiten Position drehbar ist, wobei eine Drehung des Geräts (90) in eine erste Position die Spitzen der Zähne in Kontakt mit Analyt-enthaltenden Töpfen in dem Probenvorbereitungs­ fach bringt und bewirkt, daß das lösliche Analyt, das in demselben enthalten ist, zum Mischen mit einer Ma­ trix und zum Ablegen auf die Ionisationsoberfläche (96) nach oben gezogen wird, und wobei eine Drehung des Ge­ räts (90) in eine zweite Position die Ionisationsober­ fläche mit dem Vakuumtor eines Massenspektrometers zum Einfügen in dasselbe ausrichtet;
einer Einrichtung zum Bewegen des Oligonukleotid-Ana­ lyts in dem Probenvorbereitungsfach;
einer Einrichtung zum Automatisieren einer Probenvorbe­ reitung; und
einer Einrichtung zum schnittstellenmäßigen Verbinden des Dünnfilmträgers (10) mit einem Massenspektrometer.

16. Analysesystem gemäß Anspruch 15, bei dem die Kammzähne hohle Röhren mit offenem Ende aufweisen, die sich zusammen mit der Kammhandhabungs­ einrichtung (92) erstrecken, wobei die Kammhandhabungs­ einrichtung (92) eine MALDI-Ionisationsoberfläche (96) aufweist.

17. Analysesystem gemäß Anspruch 15, bei dem die Kammzähne feste Dochte aufweisen, wobei je­ der der Dochte eine MALDI-Ionisationsoberfläche (96) aufweist, und wobei die Ionisationsoberfläche (96) fer­ ner eine Einfangregion (98) aufweist.