DE19521720B4

DE19521720B4 - Insulinanalogonformulierungen

Info

Publication number: DE19521720B4
Application number: DE19521720A
Authority: DE
Inventors: Diane Lee Indianapolis Bakaysa; David Nettleship Indianapolis Brems; Bruce Hill Indianapolis Frank; Henry Acken Indianapolis Havel; Allen Howard Indinapolis Pekar
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 2009-09-03
Anticipated expiration: 2015-06-15
Also published as: FI952931A0; ES2091727B1; NO952357D0; FR2721214B1; UA26874C2; CN1122248A; NO952357L; BR9502795A; KR960000924A; RU2152399C2; ITMI951278A1; CO4410203A1; HU227240B1; MY115631A; IE68853B1; PT101722B; GB2291427A; HUT73186A; PT101722A; SE9502167L

Abstract

Hexamerer Lys^B28Pro^B29-Humaninsulinkomplex, der enthält: sechs Moleküle des Lys^B28Pro^B29-Humaninsulins sowie zwei Zinkionen und sechs Moleküle, die ausgewählt sind aus m-Kresol, Phenol oder einem Gemisch aus m-Kresol und Phenol.

Description

Die Erfindung betrifft monomere Humaninsulinanaloga. Genauer gesagt betrifft die Erfindung einen Hexamerkomplex, der ein Insulinanalogon, Zink und Phenol und bzw. oder m-Kresol enthält.
Seit der Einführung von Insulin wurden laufend Fortschritte erzielt, um die Behandlung von Diabetes mellitus zu verbessern. Die hauptsächlichen Fortschritte wurden in der Insulinreinheit und Verfügbarkeit erzielt. Verschiedene Formulierungen mit unterschiedlichen Wirkzeiten wurden ebenfalls entwickelt. Trotz dieser Verbesserungen kann die subkutane Injektionstherapie dem Patienten immer noch keine bequeme Regulierung und normalisierte glykämische Kontrolle bieten. Häufige Abweichungen von den normalen glykämischen Spiegeln während des Lebens des Patienten führen zu Hyper- oder Hypoglykämie und Langzeitkomplikationen, die Retinopathie, Neuropathie, Nephropathie und Mikro- und Makroangiopathie beinhalten.
Um zur Vermeidung von extremen glykämischen Spiegeln beizutragen, praktizieren Diabetiker oft eine Mehrfachinjektionstherapie, wobei Insulin mit jeder Mahlzeit verabreicht wird. Jedoch wurde diese Therapie bis jetzt nicht optimiert. Das am schnellsten wirksame, im Handel erhältliche Insulin hat seine maximale Wirkung zu spät nach der Injektion und hält zu lange vor, um den Glukosespiegel optimal zu kontrollieren. Kürzlich wurde ein beträchtlicher Aufwand unternommen, um Insulinformulierungen und Insulinanalogonformulierungen zu entwickeln, die die Kinetik des subkutanen Absorptionsprozesses verändern.
Da alle im Handel erhältlichen pharmazeutischen Insulinformulierungen Insulin im selbstassoziierten Zustand und vorwiegend in der Zinkhexamerform enthalten, dürfte der geschwindigkeitsbeschränkende Schritt für die Absorption des Insulins aus dem subkutanen Injektionsdepot in den Blutstrom die Dissoziation des selbstaggregierten Insulinhexamers sein. Brange et al. in Diabetes Care 13: 923–954 (1990). Um diesen Absorptionsprozell zu beschleunigen, wurden monomere Insulinanaloga entwickelt. Diese monomeren Analoga besitzen ein schnelleres Einsetzen der Aktivität als Insulin, während sie die biologische Wirkung des nativen Humaninsulins behalten. Sie stellen eine schnelle Absorption bereit, um die Injektionszeit und die maximale Wirkung von Insulin näher zur postprandialen Glukoseabweichung zu bringen, die mit der Reaktion auf die Mahlzeit zusammenhängt. Die Herstellung von verschiedenen Monomeranaloga ist in Chance et al., EP-A 383 472 und Brange et al., EP-A 214 826 beschrieben.
Unglücklicherweise führen diese Modifizierungen beim Insulin, die diese Analoga zu Monomeren werden lassen, ebenfalls zu einer hohen Polymerbildungsrate in parenteralen Formulierungen. Da der Abbau von Insulinpräparationen eintritt, wenn Mengen von 1% Polymer erhalten werden (U. S. Pharmacopeia, 1990), ist die Minimierung dieses Abbautyps sehr wichtig bei der Reduzierung von unerwünschten Nebenwirkungen. Daher war es wünschenswert, Monomeranaloga so zu formulieren, dass das Analogon unter Bildung einer stabilen Konformation sich selbst assoziiert und trotzdem seine schnelle Absorption beibehält.
Die Zugabe von bestimmten Metallionen, vor allem Zink, erhöht die chemische Stabilität, indem sie das Insulin zur Assoziation und Bildung von Hexameren, speziell der Zn(II)-T₆-Konformation, veranlasst.
Ferner wurde bei phenolischen Substanzen gezeigt, dass sie spezifisch an das Insulinhexamer binden und eine allosterische Konformationsänderung induzieren, wobei die acht N-terminalen Aminosäuren der B-Kette von der gestreckten Konformation in eine Alphahelix umgewandelt werden. Derewenda et al., Nature 338: 594–596 (1989). Dieser Phenol-bindende Konformationszustand ist als Zn(II)-R-Zustand bekannt.
Im starken Gegensatz zu diesen gut bekannten Beobachtungen, dass Insulin leicht in Gegenwart von Zink unter Bildung einer gut definierten, stabilen Zn-Hexamerstruktur aggregiert, zeigten frühe Untersuchungen mit monomeren Insulinanaloga, dass jede Aggregation zwischen Zink und dem Insulinanalogon sich von der unterscheidet, die mit Insulin beobachtet wird (B. H. Frank, Kopien des Texts und der Dias des bei der Insulinkonferenz ”Self-Association and Conformational Studies an Human Proinsulin and Insulin Analogs”, University of York (29. August – 1. September 1989) gehaltenen Vortrags). Ferner wird der hochstabile Zn-Hexamerkomplex, wie er mit Insulin beobachtet wird, nicht mit Monomeranaloga beobachtet. Id. Brems et al. Protein Engeneering, 5: 6 527–533 (1992), beschreiben, dass monomeres Lys^B28Pro^B29-hl weniger zu einer Dimerisierung und Selbstassoziation zu Formen mit höherem Molekulargewicht neigt als Humaninsulin. Brems et al., behaupten weiter, dass Asp^B28Pro^B29-hl, Ala^B28Pro^B29-hl und Lys^B28Pro^B29-hl eine geringe oder keine Zn-induzierte Assoziation zeigen und dass Pro^B29-Insulin, Lys^B28-Insulin, Asp^B28-Insulin und Ala^B28-Insulin eine Zn-induzierte Assoziation zeigen, aber eine geringere als Zn-Insulin. Daraufhin legen unveröffentlichte experimentelle Beobachtungen der vorliegenden Erfinder nahe, dass eine Assoziation mit Zink beobachtet wird, jedoch unterscheidet sich diese Assoziation zwischen dem Analogon und dem Zink von der bei Insulin. Die Assoziation, die mit diesen Analogs beobachtet wird, ist eine zu einer Unzahl an Formen mit höherem Molekulargewicht und unterscheidet sich von den überwiegenden, gut definierten Zn-Insulinhexameren. Daher ist es klar, dass monomere Insulinanaloga nicht die Zn(II)-T₆-Konformation auf analoge Weise zum Insulin bilden.
In Anbetracht der veröffentlichten Literatur ist es überraschend, dass die Erfindung ein monomeres Insulinanalogon in einem gut definierten, stabilen Zink-Phenol-Hexamerkomplex hervorbringt. Dieser Hexamerkomplex ist einzigartig unterschiedlich zu solchen Komplexen, die mit Insulin unter identischen Bedingungen erhalten werden. Insulinkomplexe mit Zink und Phenol liegen in einer Zn(II)-R₆-Konformation vor. Der Hexamerkomplex der Erfindung ist nicht mit dieser Konformation identisch. Ebenfalls ziemlich bemerkenswert ist, dass der Insulinanalogonhexamerkomplex eine viel größere Neigung zur Dissoziation aufweist als Insulin. Diese Neigung zur Dissoziation führt zur gewünschten Eigenschaft der schnellen Wirksamkeit. Brange et al. in Current Opinion in Structural Biology 1: 934–940 (1991) beschreiben verschiedene schnell wirkende stabile Insulinmonomere und behaupten, dass der offensichtliche Weg zur Entwicklung eines schnell-wirkenden Insulins der ist, eine Dimer- oder Hexamerbildung zu vermeiden. Ähnlich beschreiben Brange et al., in Diabetes Care 13: 923–954 (1990), das bei einer Verabreichung von Insulin als Hexamer das Hexamer zusätzlich zu dessen geringeren freien Diffusion wahrend des Diffusionstransports in die Subkutis und/oder während seines Durchtritts durch die Kapillarmembran sterisch behinderter sein muss als ein Monomer. Ferner dissoziiert die Zn(II)-R₆-Konformation bei einer subkutanen Injektion nicht direkt, sondern muss sich zur Zn(II)-T₆-Konformation umwandeln. Diese Konformationsänderungen und die Dissoziation hieraus verzögern das Einsetzen der Wirkung. Daher glaubte ein Fachmann zum Erfindungszeitpunkt, dass Bemühungen zur chemischen Stabilisierung des monomeren Insulinanalogons mit Zink unter Bildung eines gut definierten Hexamerkomplexes nicht erfolgreich sein würden, oder, falls sie erfolgreich wären, das schnelle Einsetzen der gewünschten Wirkung verhindern würden.
Die vorliegende Formulierung ist ein Zink-Phenol-induzierter Hexamerkomplex, der schnell absorbiert wird. Die Absorptionsgeschwindigkeit für den Hexamerkomplex ist mindestens zweimal so groß wie die, die mit insulin beobachtet wird. Dabei ist bei einer Formulierung des Hexamerkomplexes dieser genauso stabil gegen chemischen Abbau, wenn er mit insulin verglichen wird. Daher ist es überraschend, dass die Erfindung ein monomeres Insulinanalogon in einen gut definierten, stabilen Zink-Phenol-Hexamerkomplex umwandelt. Bemerkenswerterweise behält dieser Hexamerkomplex bei einer Formulierung die schnellwirkenden Eigenschaften, die mit dem monomeren Insulinanalogon zusammenhängen. Demnach liefert die Erfindung parenterale Formulierungen des Insulinanalogonhexamerkomplexes, der stabil ist und schnell wirkt.
Die Erfindung liefert einen Humaninsulinanalogonkomplex, der umfasst: Sechs Moleküle des Lys^B28Pro^B29-Humaninsulins, zwei Zinkionen und sechs Moleküle m-Kresol, Phenol oder eines Gemisches aus m-Kresol und Phenol, so dass der Analogonkomplex ein Hexamer ist. Die Erfindung liefert ferner parenterale Formulierungen, die den Hexamerkomplex enthalten.
Die 1 ist eine graphische Darstellung des Wirkprofils von Lys^B28Pro^B29-hl und Humaninsulin. Der Graph ist die mittlere Reaktionsrate auf die Glukoseinfusion. Die Figur zeigt die Vorteile der Erfindung.
Die 2 ist eine graphische Darstellung der Stabilität von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin. Der Graph zeigt die Stabilität durch Messung der Polymerbildung des Insulinanalogons in der Hexamerassoziation, verglichen mit monomerem Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin und Insulin. Die Figur zeigt die Vorteile der Erfindung.
Die 3 ist eine graphische Darstellung der Dissoziation von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin in einem Hexamerkomplex. Der Graph zeigt die in-vitro-Dissoziation von formuliertem Insulin (o), von Lys^B28Pro^B29-hl als Hexamerkomplex formuliert (Δ), von nichtformuliertem Insulin (o) und von monomerem Lys^B28Pro^B29-hl (*), die durch statische Lichtstreuung bei 488 nm in einem 90°-Winkel verfolgt wurde. Die formulierten Proben enthielten 0,5 mol Zn pro mol Protein, 1,25 mg/ml m-Kresol und 1,09 mg/ml Phenol, 7 mM Natriumphosphat und 16 mg/ml Glycerin. Die nicht-formulierten und monomeren Proben enthielten keine zusätzlichen Hilfsstoffe. Die Figur zeigt die Vorteile der Erfindung.
Wie oben erwähnt, liefert die Erfindung einen Hexamerkomplex eines monomeren Lys^B28Pro^B29-Humaninsulins. Der Ausdruck monomeres Insulinanalogon oder Humaninsulinanalogon, wie er hierin verwendet wird, betrifft Humaninsulin, worin:
Pro an der Position B28 durch Lys und Lys an der Position B29 durch Prolin ersetzt wurde.
Monomere Insulinanaloga sind in Chance et al., EP-A 383 472 und Brange et al., EP-A 214 826 beschrieben. Monomere Insulinanaloga neigen weniger zur Dimerisierung oder Selbstassoziation als Insulin.
Alle Aminosäureabkürzungen, die in der Beschreibung verwendet werden, sind die, die vom United States Patent & Trademark Office akzeptiert werden, wie dies in 37 C. F. R § 1.822(b) (2) beschrieben ist.
Der Ausdruck behandeln beschreibt, wie er hierin verwendet wird, die Handhabung und die Pflege eines Patienten zur Bekämpfung der Krankheit, des Zustands oder der Störung und beinhaltet die Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung, um das Einsetzen der Symptome oder Komplikationen zu verhindern, die Symptome oder Komplikationen zu lindern oder die Krankheit, den Zustand oder die Störung zu beheben.
Der Ausdruck isotonisches Mittel betrifft ein Agens, das physiologisch toleriert wird und der Formulierung eine geeignete Tonizität verleiht, um den Nettofluss des Wassers durch die Zellmembran zu verhindern. Verbindungen, wie Glycerin, werden gewöhnlich für solche Zwecke in bekannten Konzentrationen verwendet.
Von der Gruppe m-Kresol, Phenol oder einem Gemisch aus m-Kresol und Phenol wird vorzugsweise m-Kresol eingesetzt.
Der später verwendete Ausdruck physiologisch tolerierter Puffer ist in der Technik bekannt. Ein physiologisch tolerierter Puffer ist vorzugsweise ein Phosphatpuffer, wie Natriumphosphat. Andere physiologisch tolerierte Puffer sind unter anderem TRIS, Natriumacetat oder Natriumcitrat. Die Auswahl und die Konzentration des Puffers sind in der Technik bekannt.
Das erfindungsgemäße Insulinanalogon komplexiert mit Zinkionen und Phenol und bzw. oder m-Kresol unter Bildung einer stabilen Hexamerkonformation. Sowohl das Zink wie auch das Phenol und bzw. oder m-Kresol sind entscheidend bei der Erlangung eines Komplexes, der stabil ist und zur schnellen Dissoziation und zum schnellen Einsetzen der Wirkung fähig ist. Der Hexamerkomplex besteht aus zwei Zinkionen pro Hexamer Humaninsulinanalogon und sechs Molekülen Phenol und bzw. oder m-Kresol.
Das lösliche Monomeranalogon wird in den Hexamerkomplex durch Lösen des Monomeranalogons in einem Verdünnungsmittel, das das Phenol und bzw. oder m-Kresol enthält, bei einem pH-Wert von 7,5 und durch Zinkzugabe umgewandelt. Zink wird vorzugsweise als Salz zugegeben. Repräsentative Beispiele von Zinksalzen beinhalten Zinkacetat, Zinkbromid, Zinkchlorid, Zinkfluorid, Zinkiodid und Zinksulfat. Der Fachmann erkennt, dass viele andere Zinksalze existieren, die ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden könnten. Vorzugsweise werden Zinkacetat oder Zinkchlorid verwendet, da diese Salze keine neuen chemischen Ionen in kommerziell annehmbare Prozesse zugeben.
Das Lösen des Analogons kann mit einer Maßnahme erleichtert werden, die gewöhnlich als Säurelösung bekannt ist, das heißt der pH-Wert wird auf 3,0 bis 3,5 mit einer physiologisch tolerierten Säure erniedrigt, vorzugsweise HCl, um das Lösen des Monomeranalogons zu erleichtern. Andere physiologisch tolerierte Säuren sind unter anderem Essigsäure, Citronensäure und Phosphorsäure. Der pH-Wert wird dann mit einer physiologisch tolerierten Base, vorzugsweise Natriumhydroxid, auf 7,4 bis 7,5 eingestellt. Andere physiologisch tolerierte Basen sind Kaliumhydroxid und Ammoniumhydroxid.
Der Hexamerkomplex kann zu stabilen, schnell wirkenden parenteralen Formulierungen formuliert werden. Die Konzentration des Insulinanalogons beträgt in der Formulierung 0,5 mg/ml bis 20 mg/ml, vorzugsweise 1,2 mg/ml bis 17,5 mg/ml, vor allem etwa 3,5 mg/ml. Im allgemeinen beträgt die Zinkkonzentration 10 μg/ml bis 50 μg/ml. Die optimale Zinkkonzentration beträgt in der Formulierung 14 μg/ml bis 35 μg/ml, wobei zwei Zinkionen an jedes Hexamer gebunden sind. In einer Formulierung sind sechs Moleküle Phenol und bzw. oder m-Kresol an das Hexamer gebunden. Das Phenol und bzw. oder m-Kresol wird vorzugsweise im Überschuss zur Formulierung gegeben. Das Phenol und bzw. oder m-Kresol wirkt auch als Konservierungsstoff. Daher beträgt die bevorzugte Konzentration 23 mM bis 35 mM, vor allem 29 mM. Vorzugsweise wird m-Kresol verwendet.
Es kann ein isotonisches Mittel, vorzugsweise Glycerin, zur Formulierung gegeben werden. Die Konzentration des isotonischen Mittels liegt im Bereich, der in der Technik für Insulinformulierungen bekannt ist, vorzugsweise 16 mg/ml. Der pH-Wert der Formulierung kann mit einem physiologisch tolerierten Puffer, vorzugsweise einem Phosphatpuffer, wie Natriumphosphat, gepuffert werden.
Zur Zeit der Erfindung legte die veröffentlichte Literatur nahe, dass der Fachmann die Aggregation vermeiden muss, um eine schnelle Absorption zu erzielen. Daher ist es ziemlich überraschend, dass das formulierte Hexameranalogon ein schnelles Einsetzen der Wirkung bringt. Im Gegensatz zu Insulin beeinflusst die Bindung des Insulinanalogonhexamerkomplexes die Zeit nicht nachteilig, die zum Erreichen der maximalen Serumkonzentration des Insulinanalogons erforderlich ist. Die 1 zeigt die mittlere Reaktionsgeschwindigkeit auf die Glucoseinfusion bei Patienten mit einer Formulierung, die monomeres Lys^B28Pro^B29-hl enthält (ohne Zink formuliert), mit einem formulierten Lys^B28Pro^B29-hl Hexamer und mit normalem Humaninsulin. Der formulierte Hexamerkomplex behält die schnelle Wirkung von monomerem Lys^B28Pro^B29-hl. Die Absorptionsrate ist signifikant schneller als bei normalem Humaninsulin. Daher zeigen die Ergebnisse in 1: Erstens haben hexameres Lys^B28Pro^B29-hl und monomeres Lys^B28Pro^B29-hl ähnliche Absorptionsraten, zweitens haben sowohl hexameres als auch monomeres Lys^B28Pro^B29-hl schnellere Absorptionsraten als Insulin.
Die den Insulinanalogonkomplex als Hexamer enthaltende Formulierung ist stabil. In vergleichenden Untersuchungen zeigt das monomere Lys^B28Pro^B29-hl die schnellste Abbaurate mit einer 1,63%igen Zunahme der Polymerbildung wahrend der sechswöchigen Untersuchung. Nicht-formuliertes Humaninsulin weist eine langsamere Polymerbildungsrate von 0,61% pro Woche auf. Bei einer Formulierung wird jedoch die Bildungsrate von Polymeren mit hohem Molekulargewicht auf 0,095% pro Woche für Insulin reduziert. Formuliertes Lys^B28Pro^B29-hl zeigt als Hexamerkomplex eine verringerte Bildungsrate der Polymere mit höherem Molekulargewicht von 0,11% pro Woche, was mit der Rate vergleichbar ist, die bei formuliertem Insulin beobachtet wird. Diese Untersuchungen sind in Beispiel 1 beispielhaft dargestellt und in 2 gezeigt.
Das erfindungsgemäße Insulinanalogon kann durch jede einer Vielzahl an bekannten Peptidsynthesetechniken hergestellt werden, einschließlich klassischer Verfahren (Verfahren in Lösung), Festphasenverfahren, halbsynthetischer Verfahren und neuerdings auch rekombinanter DNA Verfahren. Beispielsweise beschreiben Chance et al., EP-A 383 472 und Brange et al., EP-A 214 826 die Herstellung von verschiedenen Monomeranaloga.
Die folgenden Beispiele und Präparationen werden lediglich zur weiteren Erläuterung der Herstellung des erfindungsgemäßen Insulinanalogons bereitgestellt. Der Schutzumfang der Erfindung besteht nicht nur aus den folgenden Beispielen.
Präparation 1
Proteinstammlösungspräparation
Nicht-formulierte Proben von Insulin und Lys^B28Pro^B29-hl werden mit 3,5 mg/ml in 7 mM Natriumphosphat und mit oder ohne 1,25 mg/ml m-Kresol, 1,09 mg/ml Phenol und 16 mg/ml Glycerin in Abhängigkeit vom durchgeführten Experiment präpariert. Proben von Lys^B28Pro^B29-hl als Hexamerkomplex werden auf identische Weise hergestellt, außer dass 19,7 μg/ml Zink zugegeben werden. Alle Proben werden durch einen Säureschritt auf pH 3,0 entnommen, wobei Zink zu den Formulierungschargen gegeben wird. Der pH wird dann auf 7,4 eingestellt. Die Proteinkonzentrationen werden vor der Zugabe der phenolischen Substanzen durch UV Absorptionsspektroskopie mit einem AVIV Modell 14 DS Zweistrahlspektrophotometer bestimmt. Die Proteinkonzentrationen werden berechnet, wie es in B. H. Frank, A. H. Pekar und A. J. Veros (1972) Diabetes, 21 (Suppl. 2), 486–491 beschrieben wurde.
Beispiel 1
Chemische Stabilität
Der Abbau wird durch die Inkubation der formulierten und nicht-formulierten Präparationen des Insulins und des monomeren und hexameren Lys^B28Pro^B29-hl bei 30°C initiiert. Das formulierte Insulin und das Hexamer Lys^B28Pro^B29-hl enthalten: 3,5 mg/ml Protein, 16 mg/ml Glycerin, 7 mM dibasisches Natriumphosphatheptahydrat, 1,25 mg/ml m-Kresol, 1,09 mg/ml Phenol und 0,0245 mg/ml Zinkoxid bei einem pH-Wert von 7,3 bis 7,4. Das nicht-formulierte Insulin und das monomere Lys^B28Pro^B29-hl enthalten: 3,5 mg/ml Protein, 16 mg/ml Glycerin, 7 mM dibasisches Natriumphosphatheptahydrat, 1,25 mg/ml m-Kresol und 1,09 mg/ml Phenol bei einem pH von 7,3 bis 7,4. In Intervallen von sieben Tagen werden Proben aus der 30°C Inkubation entnommen und auf die Bildung von Spezies mit hohem Molekulargewicht mittels Größenausschluss-HPLC untersucht. Die Analyse wird durch eine Injektion von 20 μl Proben in eine Dupont Zorbax GF-250 Special (9,4 × 250 mm) Säule mittels eines Gemisches aus 0,4 M Ammoniumbicarbonat und Acetonitril als Elutionslösung durchgeführt (Flussrate 0,5 ml/min bei Raumtemperatur und Detektion bei 214 nm). Die Polymerbildung in Prozent wird aus dem Verhältnis der hochmolekularen Peaks zur Gesamtfläche der Monomerpeaks und hochmolekularen Peaks bestimmt. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
Beispiel 2
Statische Lichtstreuung
Die in vitro Dissoziationseigenschaften von monomerem Lys^B28Pro^B29-hl, Lys^B28Pro^B29-hl als Hexamerkomplex und Insulin wurden mittels statischer Lichtstreuung untersucht.
Drei formulierte und nicht-formulierte Proteinstammlösungen werden wie beschrieben hergestellt, außer dass die nicht-formulierten Proteinstammlösungen kein Zink, Glycerin oder Konservierungsstoffe enthalten. Unter Verwendung dieser 3,5 mg/ml-Stammlösungen wird eine Verdünnungsreihe sowohl für Insulin als auch für Lys^B28Pro^B29-hl hergestellt, die den Proteinkonzentrationsbereich von 3,5 mg/ml bis 0,2 mg/ml abdeckt. Alle Verdünnungen werden auf ein Endvolumen von 10 ml mit 7 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 hergestellt, um die subkutane Stelle nach der Injektion zu imitieren. Alle Lösungen werden durch 0,2 μm Gelman Filter mit niedriger Proteinbindung filtriert, bevor man die SLS Messungen durchführt. Die Proteinkonzentration wird für diese Proben mittels Umkehrphasen-HPLC bestimmt.
Zur Analyse der formulierten Proben werden proteinfreie Lösemittelnullwerte für jeden Satz an Proteinproben hergestellt. Die Nullwerte enthalten die Hilfsstoffe in der selben Konzentration, wie die entsprechenden Proteinprobensätze. Zur Analyse der nicht-formulierten Proben wird ein einzelner Nullwert mit 7 mM Natriumphosphat verwendet. Die Verwendung dieser geeigneten Lösemittelnullwerte stellt sicher, dass die Daten nur die Streuung des gelösten Stoffs widerspiegeln und nicht einen zusätzliche Beitrag aufgrund von Lösemittelveränderungen.
Die statischen Lichtstreuungsexperimente (SLS) werden mittels eines Brookhaven Instruments 2030AT Autokorrelators und Goniometers durchgeführt. Alle Messungen werden mit einem 1 mm Loch bei 90° Streuungswinkel mittels eines Lexel Model 3500 Argonionenlasers durchgeführt, der auf 488 nm eingestellt ist. Die Temperatur wird durch ein Neslab RTE-110 Temperaturbad auf 25°C gehalten. Das Signal an der Photomultiplierröhre wird mittels 0,1 μM gefiltertem Toluol kalibriert.
Mittlere Molekulargewichte werden unter Verwendung der in C. R. Cantor und P. R. Schimmel, Biophysical Chemistry, W. H. Freeman and Company, New York, Seiten 838–843 (1982) berechnet. Die 3 zeigt die Ergebnisse der Lichtstreuungsuntersuchung. Im in vitro Dissoziationsprofil ist Lys^B28Pro^B29-hl als Hexamerkomplex und Insulin ziemlich unterschiedlich. Die Insulinanalogonergebnisse zeigen eine schnelle Dissoziation, die eine schnellere Absorption erlaubt, als Humaninsulin. Obwohl beide Präparationen hexamere Assoziierungszustände enthalten und die Formulierungen gleichermaßen gegen chemischen Abbau stabil sind, zeigt das hexamere Lys^B28Pro^B29-hl eine größere Neigung zur Dissoziation als Insulin.

Claims

Hexamerer Lys^B28Pro^B29-Humaninsulinkomplex, der enthält: sechs Moleküle des Lys^B28Pro^B29-Humaninsulins sowie zwei Zinkionen und sechs Moleküle, die ausgewählt sind aus m-Kresol, Phenol oder einem Gemisch aus m-Kresol und Phenol.
Schnell wirkende chemisch stabile parenterale pharmazeutische Formulierung, enthaltend einen hexameren Lys^B28Pro^B29-Humaninsulinanalogonkomplex, der enthält: sechs Moleküle des Lys^B28Pro^B29-Humaninsulinanalogons sowie zwei Zinkionen und sechs Moleküle, die ausgewählt sind aus m-Kresol, Phenol oder einem Gemisch aus m-Kresol und Phenol, wobei die Konzentration des Humaninsulinanalogons in der Formulierung 0,5 mg/ml bis 20 mg/ml beträgt, die Konzentration an Zink in der Formulierung 14 μg/ml bis 35 μg/ml beträgt und die Konzentration der phenolischen Verbindung in der Formulierung 23 mmol/l bis 35 mmol/l beträgt.
Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 2, wobei die Formulierung ferner ein isotonisches Mittel und einen physiologisch tolerierten Puffer enthält.
Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 2, die etwa 3,5 mg/ml Humaninsulinanalogon enthält.
Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 2, die enthält: etwa 3,5 mg/ml Humaninsulinanalogon, etwa 19,7 μg/ml Zink, etwa 7 mmol/l Natriumphosphat, etwa 16 mg/ml Glycerin und etwa 29 mmol/l m-Kresol.