DE1951222A1

DE1951222A1 - Fuellmaterial fuer chromatographische Saeulen

Info

Publication number: DE1951222A1
Application number: DE19691951222
Authority: DE
Inventors: Kirkland Joseph Jack
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1968-10-10
Filing date: 1969-10-10
Publication date: 1970-07-30
Also published as: SE360927B; GB1248105A; FR2020351A1; US3488922A; NL6914869A

Description

Füllmaterial für chromatographische Säulen

Die Erfindung bezieht sich die Chromatographie. Bei einem chromatographischen Verfahren ist es üblich, daß ein·Gemisch der Komponenten, die getrennt werden sollen, in einerTrägerflüssigkeit durch eine Chromatographie-Apparatur oder durch auftrennende Zonen hindurchgeht. Die trennende oder auflösende Zone enthält im allgemeinen ■ , ein . Material, das aktive chromatographische Sorptionswirkung besitzt.

Die im allgemeinen verwendeten chromatographischen Apparaturen sind Säulen. Diese sind offene Rohre, die mit einem gekörnten Material beschickt sind. Für analytische Arbeiten besitzen die Säulen im allgemeinen einen kleinen inneren Durchmesser im mm-Bereich. Für präparative Chromatographie haben sie einen größeren Durchmesser. Die üblicherweise verwendeten .Trägermaterialien sind Körner mit sorptiven Oberflächen oder mit Oberflächen, die mit einer sorptiven Substanz überzogen

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sind. Das Durchlaufen des zu trennenden Gemisches durch die Säule führt zu xitiederholten Wechselwirkungen, die von der chemischen Natur der verschiedenen Komponenten und der chromatographisch aktiven Ob erf lachen herrühien. Verschiedene Verbindungen besitzen aufgrund dieser wiederholten Wechselwirkungen verschiedene Retentions zeiten in der Säule. Der · ^ Auslauf aus der Säule geht im allgemeinen durch einen Detektor, ψ z.B. einen Ionisationsdetektor, um anzuzeigen, wann die aufgetrennten Komponenten aus der Säule austreten und eine Messung der Retentions zeiten und der Mengen der jeweiligen Komponenten zu erlauben.

Es ist lange bekannt, daß ideale chromatographysehe Trägermaterialien aus einer Vielzahl von einzelnen Teilchen von vollständig regelmäßiger Form,günstigerweise von sphärischer Form, bestehen sollten, deren Oberflächen eine größe Anzahl von oberflächlichen flachen Poren und keine tiefen Poren besitzen sollen. Um zu erreichen, daß verschiedene Säulen reproduzierbare chromatographische Resultate ergeben, sollten ψ die Körner regelmäßig und ihre Oberflächencharakteristika leicht kontrollierbar und reproduzierbar sein. Das war in der Praxis sehr schwer zu realisieren. :

In der britischen Patentschrift Ur. 1 016 635 wird ein ■ . chromatographisches Trägermaterial beschrieben, das dadurch hergestellt worden ist, daß ein feinverteilter feuerfester. Feststoff auf einen undurchlässigen Kern aufgetragen worden ist. Diese Beschichtung wird dadurch erreicht, daß das Beschichtungsmaterial in einer geeigneten Flüssigkeit als Aufschlämmung dispergiert wird. Die Kerne werden dann mit • der Aufschlämmung überzogen, herausgenommen und getrocknet, um

die Flüssigkeit zu entfernen. Es entstellt ein ziemlich lose festgehaltener mechanischer Überzug von uneinheitlich desorientierten Teilchen. Diese überzogenen Kerne können als chromatographische Trägermaterialien verwendet werden, obwohl sie verschiedene Nachteile besitzen. Die Überzüge werden durch Abschlagen und Abblättern leicht entfernt.. Solche Variablen wie die Dicke und die Einheitlichkeit des Überzugs können nicht kontrolliert werden, da aufgrund der Oberflächenspannung die Beschichtung an den Berührungspunkten zwischen den einzelnen Kernen dicker ist als an den übrigen Stellen. Es wäre wünschenswert, das Beschichtungsmaterial irreversibel an die Kerne zu binden und es wäre ideal, wenn diese Bindung so erreicht werden könnte, da3 der Überzug einheitlich von vorhersagbarer Dicke und von vorherbestimmbarer Porosität wäre.

Kirkland hat in "Gas Chromatography 1964", A. Goldup, Herausgeber, the Institute of Petroleum, London, ¥.1, Seiten 285-300, 1965» die Herstellung eines chromatographischen Trägermaterials durch aufeinanderfolgendes Auftragen von Schichten von Siliciumoxidmikroteilchen auf Glasperlen mit Hilfe von sehr dünnen faserigen Boehmit-Filmen beschrieben. Diese beschichteten Kerne können als chromatographische Adsorptions- oder Trägermaterialen verwendet werden. Sie haben jedoch den ernsten Nachteil, daß sie eine chemisch inhomogene Oberfläche besitzen. " Der geringe, aber bedeutende Anteil von oberflächlichem Aluminiumoxid, der in der porösen Schicht enthalten ist, ist für bestimmte Abtrennverfahren schädlich, wegen der Adsorption oder Reaktionseigenschaften des Aluminiumoxids.

Beschichtete Glasperlen, die aus einer einzelnen Schicht von

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feinverteilten Kieselgurteilchen, die mit faserigem Boehmit auf die Glasperlen gebunden sind, bestehen, wurden ebenfalls als chromatographisches Trägermaterial beschrieben /"KiuÖ-and a.a.O., KiAand, J. J. , Anal. Chem. 37* 1458-1461, (1965)_7-Der Nachteil dieses Materials als chromatographischer Träger liegt darin, daß die Oberfläche ebenfalls nicht chemisch homogen ist. Außerdem ist es nicht möglich, solche Strukturen mit einer einheitlichen Oberfläche und mit einer bestimmten vorherbestimmbaren Porosität herzustellen.

Ein Verfahren zur Abscheidung von kolloidalen Teilchen einer bestimmten Größe und Ionenladung aus wäßriger Dispersion auf die Oberfläche eines Festkörpers, xvObei'jeweils eine einzelne Teilchenschicht abgeschieden wird und dieses Verfahren wiederholt wird, um die Oberfläche mit Jeder beliebigen gewünschten Zahl von Monoschichten zu überziehen, · ist in der kanadischen Patentschrift Nr. 729 581 beschrieben worden. Es wird auch ein festes Substrat auf einer Oberfläche angegeben, auf die irreversibel ein Überzug aufgebracht wird, der aus verschiedenen Monoschichten von kolloidalen Teilchen besteht, wobei die Teilchen in jeder Monoschicht gleich und von den kolloidalen Teilchen in- der angrenzenden Monoschicht verschieden sind.

Die chromatographischen Trägermaterialien der vorliegenden Erfindung sind Makroteilchen mit oberflächlichen porösen Überzügen aus sorptivem Material, die nach dem Verfahren von Her aus undurchlässigen Kernen erzeugt worden sind. Die ^ Verwendung von Makropartikeln mit oberflächlichen porösen Überzügen, die nach dem Verfahren von Her hergestellt worden ,sind, ist in der französischen Patentschrift Nr. 1 570 beschrieben. Diese Anmeldung beschreibt nicht die Verwendung

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von Makropartikeln, die einzelne Schichten von sorptivem organischen Material innerhalb des Überzuges enthalten.

Chromatographische !rager mit εorptiven Oberflächen sind in der Literatur beschrieben worden. Die Verwendung von oberflächenmodifiziertem Polystyrol zur Ionenaustauschchromatographie wurde zuerst von Pepper in Chemistry Research, 1952, Her Majesty's Stationary Office, London, England, gezeigt. Diese Lösung wurde kürzlich von Horvath et al. (C.G. Horvath, B.A. Preiss und S.E. Lipsky, Anal. Chem., 39, 14-22, 196?) als "oberflächliche Ionenaustausehchromatographie" diskutiert und umfaßt dünne Schalen von Ionenaustauschern, die durch Polymerisation organischer Polymere auf die Oberfläche von Glasperlen und chemische Modifizierung der organischen Schalen zur Herstellung' der erwünschten ' Sorptionsmittel erhalten wurden. Perlen von vernetztem Polystyrol, die Ionenaustauschergruppen nur in einer dünnen Oberflächenschicht enthalten, wurden ebenfalls für oberflächliche Ionenaustauscherchromatographie verwendet (J.R. Parrish, Nature, 207, 402, 1965).

Keine der oben angegebenen Literaturstellen erwähnt Makroteilchen, die oberflächliche poröse überzüge aus einzelnen Schichten von nacheinander adsorbierten sorptiven organischen Mikropartikeln enthalten.

Bei der'Verwendung von chromatographysehen !Trägern, die aus solchen Kakroteilchen bosüehen, wurden unerxvartet wirkungsvolle Trennungen erhalten. Darüber hinaus sind die Makrotoilchen, die durch die hier beschriebene'Anwendung des Iler'-sehen Verfahrens erhalten werden, direkt als chromatocraphicclie ϊί-Μ&'ΘΓ geeignet, da. dar; korptivo I-laturial in den Überzügen di~

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BAD ORIGiNAL

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rekt enthalten ist. Die Makroteilchen dieser Erfindung verbessern auch die Wirksamkeit einer Säule und die Geschwindigkeit, mit der die 'chromatographischen Trennungen durchgeführt werden können.

Pig. 1 zeigt in Diagrammform einen Querschnitt durch ein Makro teilchen des chromatographischen Trägers dieser Erfindung.

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Iquivalenthöhe eines theoretischen Bodens gegen die lineare Geschwindigkeit des Trägers für drei chromatographische Säulen. Kurve A ist die Kurve, die mit einer Säule erhalten wurde, die das beste bisher bekannte Material für die vorliegenden Verbindungen enthielt. Kurve B und G wurden mit Säulen erhalten, deren Packung aus den Makroteilchen dieser Erfindung bestand,

J¹Ig, 3 stellt ein Ghromatogramm einer Lösung von Eibonucleosid-^'-monophosphorsäurendar, die aus Gytidin-5'-phosphat (5'GMP), Uridin-5'-phosphat (5¹ UMP)₁ Adenosin-5' -phosphat (5' AMP) und Guanosin-5^l-phos». phat (5' GMP) besteht, das mit einer Säule erhalten wurde, die mit den flakropartikeln dieser Erfindung wie in Beispiel 1 beschrieben, beschickt war«

Es hat sich gezeigt, daß Makroteilchen mit undurchlässigen Kernen und adsorbierten Monoschichten von .sorptiven kolloidalen organischen Mikroteilcliea ausgeseichnete chromategraphische Füllmaterialien darstellen^ Die bisher üblichen Schwierigkeiten der Uneiiih;3itlielik©i'ö_} der lielrfevorh«rbestisiia-

..:._:...--. ^BAi? ORIGINAL

barkeit der Dicke und Porengröße und der schlechten Haftung des Überzugs auf dem Kern, sind reduziert oder im wesentlichen ausgeschaltet worden durch die Verwendung von Makroteilchen mit undurchlässigen Kernen, auf die Mikroteilchen einheitlich und irreversibel gebunden sind und zwar in der Form, daß jeweils eine Monoschicht in einem Arbeitsgang auf den Kern des Makroteilchens gebunden worden ist, wodurch ein oberflächlicher poröser Überzug entsteht. Das Einarbeiten von Monoschichten aus sorpti-^en kolloidalen organischen Mikroteilchen in den porösen Überzug führt zu Makro teilchen, die direkt ohne weitere Behandlung mit soj-ptivem Material als chromatographische Träger verwendet werden können. Sie ■ verlieren ihre Einheitlichkeit dadurch nicht, was bei der mechanischen Beschichtung mit sorptivem Material oft geschieht. . . .

Die ■ chromatographischen Träger, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können entsprechend dem in der kanadischen Patentschrift ITr. 729 581 beschriebenen Verfahren hergestellt werden, das darin besteht_r daß die undurchlässigen Kerne der Makroteilchen mit einer Reihe von ungleichen, gegensätzlich geladenen, nacheinander adsorbierten Monoschichten von gleichen kolloidalen Mikroteilchen überzogen werden. Mit "gleichen Teilchen" ist gemeint, daß die Teilchen einer bestimmten Monoschicht die gleiche Ladung und günstigerweise, aber nicht notwendig, die gleiche chemische Zusammensetzung besitzen. Das Beschichtungsverfahren führt zu irreversibel an die Makroteilchen gebundenen Überzügen aufgrund der elektrostatischen Kräfte//Die Beschichtung wird dadurch erreicht, daß die Makroteilchen, die eine Ober- ' flächenladung besitzen, mit einer kolloidalen Dispersion eines Stoffes, der eine entgegengesetzte Ladung besitzt, zusammengebracht werden. Diese kolloidalen Teilchen werden von den entgegengesetzt geladenen Makroteilchen angezogen*

/in der Art einer chemischen oder Teilvalenz-Bindung.

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und an diese elektrostatisch, gebunden. Die Oberfläche der Makroteilchen erhält nun eine elektrische Ladung, die der ursprünglich auf der Oberfläche vorhandenen entgegengesetzt ist. Der Grund hierfür besteht darin, daß in dem Moment, wo die kolloidalen Teilchen an das Makroteilchen gebunden werden, die Oberflächenladungen neutralisiert werden, so daß die überzogene Stelle der Oberfläche gegenüber den in der Dispersion bleibenden kolloidalen Teilchen nicht mehr entgegengesetzt geladen erscheint. Daher werden keine weiteren kolloidalen Teilchen mehr angezogen und an dieser Stelle werden keine weiteren Teilchen mehr angelagert. Der Überschuß der Kolloidlösung wird abgespült und die überzogenen Makroteilchen werden dann in eine zweite kolloidale Dispersion von Mikroteilchen getaucht, deren Ladung der der zuerst verwendeten Teilchen entgegengesetzt ist. Eine Wiederholung des Prozesses durch abwechselndes Eintauchen in positiv und negativ geladene Mikroteilchendispersionen, führt zu aufeinanderfolgender Adsorption von weiteren Monoschichten. Jede Monoschicht ist aus anderem Material als die angrenzende. Nachdem die gewünschte Zahl von Monoschicht en von Mikroteilchen aufgebaut ist, werden die Perlen gewaschen, gespült und im Vakuum getrocknet.

Bevorzugte Materialien für die undurchlässigen Kerne sind Glasperlen und als sorptive Materialien handelsübliche Ionenaustauscherharze, wie "Amberlite" (Rohm & Haas Co.). Wenn Monoschichten aus anorganischem Material in den porösen überzug eingebaut werden sollen, ist ein Siliciumoxidgel, das geeignetste Material.

Die Makroteilchen dieser Erfindung können in verschiedenen

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Apparaturen und Verfahren zur Ionenaustauschchromatographie verwendet werden. Die üblichste Verwendung ist die als · Packmaterial für chromatographische Säulen.

Die JTig. Λ zeigt die Struktur eines Makropartikels eines chromatographischen Trägers der beanspruchten Art. Der undurchlässige Kern 11 ist günstigerweise Glas oder ein anderes keramisches Material und besitzt einen porösen Überzug 15 aus nacheinander adsorbierten Monoschichten 13 von Mikroteilchen. Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden abwechselnd Monoschichten von sorptiven kolloidalen organischen Mikroteilchea 18 durch Monoschichten von Mikroteilchen mit entgegengesetzter Ladung getrennt. Es ist nicht notwendig, daß die Mikroteilchen sphärisch sind, wie in der Zeichnung. Sie können auch faserig oder von anderer Form sein. .

Solche Makroteilchen werden nach der von Her in der kanadischen. Patentschrift Nr. 729 581 beschriebenen Methode durch Teilchenabscheidung hergestellt. Anwendungen dieser Methode zur Herstellung von chromatographischen Trägern sind in der oben erwähnten französischen Patentschrift Hr. 1 5?0 94-0 offenbart. Makropartikel der vorliegenden Erfindung können dadurch hergestellt 'werden, -daß maix.clas Material\ das aur Bildung der organischen "Zwischenschichten" der französischen Patentschrift 1 570 94-0 verwendet wird, durch sorptives organisches Material ersetzt,« JSs ist jecloeii für- die vorliegende Erfindung nicht notwendig, swi^oh&n organischen und anorganischen Tlonos-ehiciiten abatisch;ie3.xu Ber Überzug 'tami außßchlieiii.ich r;U£, c^aniec-hc-Tn. Ke.uerial hu^ge^uellt- werden, volmvgo 3<'£<j- Mo.!>'ⁱ:.-?>ciiic"ixiT öntgccfjivri'jfc-^tst "θΐΒβ^η irt wie

■Me v^riiei¹ abgeF^.uied&oft Iioaosuhi^^iit., n-> J er Hern Ue Liui^r si or i^^ropar-tlkel ö:;.?---■ ftf

BAD ORlGiNAL

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dampfen der Zwischenschichten auf und Keines der Materialien muß daher feuerfest sein. .

Glasperlen besitzen eine negative Oberflächenladung, so daß, wenn sie als undurchlässige Kerne verwendet werden, zuerst eine Schicht von Teilchen mit positiver Ladung abgeschieden. Der Überzug wird aufgebaut, in^dem positiv und negativ geladene Teilchen abwechselnd abgeschieden werden. Als sorptives organisches Material können entweder Kationenaustauscherharze, wie sulf onierte Polystyrole oder Polyacrylsäure^ oder Anionenaustauseherharze, wie Polymere mit quaternären Ammonium- oder Pyri&iniumgruppen, verwendet werden.

Wenn die negativ geladenen Teilchen kollodiales Siliciumoxid sein sollen, kann ein Sol auf die folgende Weise, hergestellt werden« . . '

Siliciummetall wird zu kleinen {Teilchen verrieben, und mit !fluorwasserstoff behandelt, um das Metall zu aktivieren. : Ein Ans at s sines Siliciumgels von 100 m/a großen 'T e lichen _s der AmoaiiaBiijdro2d.d enthält-, wird in kleinen Anteilen zugegeben= Each der Zugabe des gesamten Metalls wird das Ge misch 50 min gerührtο -Bas Eeaktionsgemiscii wird dann filtrierte Durch langsames Erhitzen zur {Entfernung von überschüssigem Ammoniak xcLrd- das Gemiseli -'äageengt» Es wird dann gekocht ₉ um den Wassergehalt Jaerafesiisetsen und hierbei das SiSciumoxicisol _s das eine mittler© Seilchengröße von ungefähr 200 m/x enthält, su lconzentrier-erie

Sin Sol mit einer geringeren Teilchengröße Isaim im wesentlichen, auf die gleich© Waise hergestellt v-T3:cd.erio

Haoli der Herstellung des SiliciumossidsoZn ^i-rd@ii die v.'-j.asperlen mit einem alkalischen Labörglasroiiii^er goreir."! je» Eeiniger wird i.cim du^oii kontismlsrl^öii'js yaseläCCi mi % " ■ sj? entfe^Bt nn& &i,G "^orlea ws2»den g«;s:;ö€t,^C;t=o ⁷U^ Perlen ©a mit β liier Mspeimoia ¥on sos-ptifeu }χΧΧϋιάΧ&1<&~·\ -jr^

SAD ORiGIMAL

Dispersion kann aus einem käuflichen Ibnenaustauscherharz hergestellt werden» _ ~ Die Perlen werden wieder gewaschen und getrocknet. Anschließend werden die Perlen in einer Siliciumoxidsollösung gerührt. Die überschüssige Sollösung wird entfernt und die Perlen werden mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Das abwechselnde Überziehen Arird drei weitere Male wie oben wiederholt und nachdem die letzte Siliciumoxidsollösung entfernt-worden ist, werden die Perlen mit Isopropanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Der Mikroteilchenüberzug, der den porösen Überzug bildet, kann aus jeder beliebigen Anzahl-von Schichten bestehen und macht normalerweise zwischen 0,002 und 25 % des gesamten Volumens eines Makroteilchens aus und hat eine Dicke von 0,01 bis 2.AX. Die Gesamtgröße der Makroteilchen hängt in erster Linie von der Größe der undurchlässigen Kerne und etwas von der Dicke des porösen Überzugs ab. Der mittlere Durchmesser der Makroteilchen beträgt zwischen 5 und 500/u, wobei die spezielle Größe, die verwendet wird, von der Art der durchgeführten Trennung bestimmt wird. Kleine Makroteilchen führen zu einem geringen Höhenäquivalent der theoretischen Böden der Säule. Die Mikroteilchen sind von kolloidaler Größe und werden aus einer Dispersion adsorbiert. Der mittlere Durchmesser kann zwischen 0,005 bis 1 Ai betragen, die normalerweise verwendete Größe liegt zwischen 0,01 und 0,2 Ai. Die einheitlichen Poren in dem porösen Überzug haben Durchmesser von 2 bis 500 m/u, je nach der Größe und Form der Mikroteilchen. Die Mikroteilchen und Makroteilchen können jede beliebige Form haben und sind günstiger-

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weise sphärisch. Eine Kapillare mit einem inneren Durchmesser von 5 bis 500 yu. kann als undurchlässiger Kern dienen, wobei die Mikrοteilchen auf der Innenseite abgeschieden werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden _ die sphärischen aus Glas oder Siliciumoxid bestehenden W" Makroteilchen mit einem Durchmesser von 37 bis 4-4/u durch Adsorption von abwechselnden Monoschichten beschichtet, die aus 100 bis 500m ax großen kationischen organischen Polymermikroteilchen und aus sphärischen Mikroteilchen aus" amorphem Siliciumoxid mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 15 ¹¹¹Z¹¹ bestehen. Das Siliciumoxid stellt so . Zwischenschichten zwischen den Schichten von organischen Teilchen dar. Bei einer anderen· günstigen Ausführungsart werden 5 bis 100 /u große sphärische Glas- oder Siliciumoxidmakroteilchen durch Adsorption von abwechselnden Monoschichten aus anionischen organischen polymeren Mikroteilchen mit einer Größe von 100 bis 1000 mvu und Boehmit- | Mikrofasern mit einem mittleren Durchmesser von 50 £ und Längen von 1000 A beschichtet.

Der poröse Überzug, der am besten geeigneten Produkte besteht aus Schichten von Mikroteilchen mit einer Gesamtdicke von 0,1 bis 2 /u. .

Eine Ausführungsart des beanspruchten chromatographischen Verfahrens besteht darin, daß die zu trennenden Materialien in einer Trägerphase durch die trennende Zone einer chromatographischen Säule hindurchgehen,, in der sie mit den beschriebenen Makroteilchen in Berührung kommen. Die Trennung wird durch die selektive Retention der zu trennenden Materia-

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lien erreicht, deren Ausmaß durch eine Vielzahl von Verfahren gemessen werden kann, einschließlich kontinuierlicher Messung. Die Messung der Retentionszeit und /ler Mengen der Komponenten eines Gemisches ergibt bei der Analyse ein Chromatogramm, durch das die abgetrennten Komponenten identifiziert werden können. Abwandlungen und Modifikationen der einzelnen Schritte bei den chromatographischen Verfahren und der Apparatur sind in elementaren Texten beschrieben worden. Die Makroteilchen dieser Erfindung sind im allgemeinen für die Chromatographie verwendbar und die Situationen, für die sie verwendet werden können, entsprechen den bekannten.

Beispiel 1

Ein Beispiel für chromatographische Makroteilchen der vorliegenden Erfindung sind Glasperlen mit einem Überzug, der ausgehend von der Oberfläche aus einer Schicht von Teilchen aus "Amberlite ZE-255" (Böhm & Haas Co., Philadelphia, Pa.) einem stark basischen Anionenaustauscherharz mit Durchmessern von 100 bis 500 myu_feiner Schicht von "LudöX AiI" (einem mit Aluminium modifizierten Siliciumoxid) und einer weiteren Schicht von "Amberlite XE-255"-Teilchen besteht.

Diese können hergestellt v/erden, indem 60 g von 24- bis 52 Ai großen Natronkalkglasperlen ungefähr 1 h in eine 0,5%ige Lösung eines alkalischen Laborglasreinigers gegeben werden. Die gereinigten Perlen v/erden sorgfältig mit Wasser gewaschen, um das Detergenz zu entfernen. Die naiien Perlen werden auf einen grob gesinterten gläsernen Büchner-Trichter gegeben und auf dem !filter luftgetrocknet, und-anschließend 1 h böi 115°G an der loift getrocknet.

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Zu diesen sauberen Perlen wird eine Suspension von U,5 % einer Suspension von 100 bis 500 m/u. großen Mikroteilchen eines quaternären Ammoniumchlorids von einem vernetzten stark basischen Polystyrolionenaustauscherharz, wie z.B. "Amberlite XE-255" gegeben, so daß eine dünne Aufschlämmung der Perlen gebildet wird.

Dieses Gemisch wird dann 20 min stehen gelassen, wobei ungefähr alle 5 min leicht gerührt wird. Die überschüssige Suspension wird durch vorsichtige Vakuumfiltration entfernt und die behandelten Glasperlen werden 5mal unter leichtem Rühren mit destilliertem Wasser gewaschen. Die behandelten Perlen werden dann auf dem Filter luftgetrocknet. Die Perlen sind so mit einer¹ Monoschicht aus Mikroteilchen des Ionenaustauscherharzes beschichtet. Die beschichteten Perlen werden wieder auf den !Trichter gegeben und ein "Überschuß einer 1%igen Lösung von "Ludox AM" wird zugegeben. Dieses kolloidale Siliciumoxid besteht aus 15 m/u großen sphärischen Teilchen aus amoi'phen Siliciumoxid^ ' , die bei pH 7 bis 9 aufgrund der Aluminosilicationen eine negative Ionenladung auf der Oberfläche der Teilchen tragen. Das entstehende Gemisch wird 5 min stellen gelassen und das überschüssige "Ludox"-Sol wird durch Valmumfiltration entfernt. Die Perlen werden mit destil-..liertem Wasser gewascheiis bis das Fiitrat klar ist und das entstehende Material wird auf dem Filter luftgetrocknet. Die Perlen werden in einen Takuumofen gegeben und 1 h auf 50 0 erhitzt» Die Mikroteilchen des Karses sind mm mit Mikr ο teilchen von Siliciumoxid überzogen*

Die behandelten Perlen werden wieder auf den Büchner-Trichter gegeben und ein Überschuß der 5%igen Ionenaustauscherauf schlämmung wird augegeben« Die Behandlung wird wie oben fortgesetzt, um eine zweite Schicht der ilikroionenaustauscherteilchen auf der Oberfläche der Glasperlen su erzeugen» Nach der Behandlung und dem Trocknen wird eine dritte Schicht der lonenaustausclierteilchen auf die Perlen gegeben₃ wobei 'das oben beschriebene Verfahren angewendet wird. Die .letzten

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Endes entstehende Probe wird im Yakuumofen 1 h lang auf 50°. erwärmt. Die Glasperlen sind nun mit Mikroteilchen aus Ionenaustauscherharz abwechselnd mit Zwischenschichten aus noch kleineren Mikroteilchen von Siliciumoxid überzogen.

Die Oberfläche des endgültigen Materials, die durch ein Stickstof fstromverfahren an einer Probe, die 16 h bei 50 C im Vakuum getrocknet wurde, bestimmt worden ist, beträgt ungefähr 0,5 m /g. * .

Die Fig. 2 zeigt die chromatographische Arbeitsweise von zwei Ionenaustauschersäulen, die mit den beschriebenen " Makroteilchen gefüllt sind, verglichen mit derjenigen einer Säule, die mit den "oberflächlichen" Anionenaustauscherteilchen, die von Horvath, Preiss und Lipsky (Anal. Chem. 39 ί 1422, 1967) beschrieben worden sind, gefüllt sind. Bei den Kurven A, B und C ist das Höhenäquivalent eines theoretischen Bodens (HÄPT.) in mm gegen die lineare Trägergeschwindigkeit in cm pro see aufgetragen. Die Kurve A gibt die von Horvath et al. gefundenen Werte an, die mit einer Säule von 193 cm Länge und 1 mm innerem Durchmesser erhalten wurden, die mit 0,053 - 0,044 mm (270 - 325 mesh), großen "oberflächlichen" Anionenaustauschteilchen gefüllt war, wobei 5^l-Uridin-monophosphorsäure als Testverbindung verwendet wurde. Diese Daten sind die besten dieser Art, die bisher in der Literatur angegeben sind. Die Kurve B beschreibt die Daten, die mit einer Säule erhalten worden sind, die das füllmaterial dieser Erfindung enthielt, wobei die Glasperlen 0,062 - 0,053 mm (230 mesh.) groß waren. Diese Werte wurden mit einer Säule erhalten,die 100 cm lang war und einen inneren Durchmesser von 2,1 mm besaß und bei 60⁰C arbeitete mit einer Träger-

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flüssigkeit von 0,02 η KH₂PO₄ zu 0,002 η H₅PO₄. Wie aus der Zeichnung zu ersehen ist, wächst die Äquivalenthöhe der theoretischen Böden nicht so schnell mit der linearen Trägergeschwindigkeit, wie bei der -Füllung der Säule A. Wenn die Mikroteilchenbeschichtung des Füllmaterials dünner war wie in Kurve B, konnte das Verhältnis von Äquivalenthöhe der theoretischen Böden zur linearen Trägergeschwindigkeit weiter verbessert, d.h. erniedrigt werden. Die Kurve C gibt die Werte an, die mit einem Füllmaterial erhalten wurden, das durch Abscheiden von sehr feinen Teilchen von "Amberlite XE-255" auf Glasperlen von weniger als 0,037 mm (400 mesh) erhalten wurde. Es kann leicht ersehen werden, daß die Säule C die höchste Verbesserung darstellt. · ., ■

Die Wirkungsweise der Versuchsaustauscherfüllungen wurde durch die Trennung von Nucleotidtestsystemeh gezeigt. Im folgenden sind die Strukturen der zwei Ribonucleosidmonophosphorsäuren angegeben. .

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0 4- P — 0

Guanosin-5'-

phosphat (9-ß-n-Ri-

bofuranosylguanin-

5'-phosphat)

ein 5'-Ribonucleotid

HO

OH

HOCH

Thymidin-3' -phosphat (1-ß-n-Deoxyribofuranosylthymin-3'-phosphat)
ein 5'-Deoxyribonucleotid

OPO,

Die Trennung von komplexen Molekülen, wie den angegebenen, verursacht beträchtliche Schwierigkeiten wegen ihres hohen Molekulargewichts und ihrer strukturellen Ähnlichkeit. Das Füllmaterial des Beispiels 1 wurde verwendet, um das Ribonucleosid-5'-monophosphorsaure-System (Cytidin-5'-phosphat,

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Uridin-5¹-phosphat, Adenosin-5¹-phosphat, Guanosin-5¹-phosphat) in der folgenden Weise aufzuspalten.

Das untere Ende einer 1 m langen Säule mit -einem inneren Durchmesser von 2 mm aus genau gebohrtem rostfreien Stahl wurde mit. einer kleinen porösen "Teflon^M-Scheibe versehen. Kleine Teile der trockenen Ionenaustauscherfüllung wurden in das Rohr gegeben und die Unterseite der Säule wurde zwischen den einzelnen Zugaben auf dem Tisch aufgestossen. Die Seite der Säule wurde mit dem hölzernen Griff eines Spatels während des Füllprozesses noch leicht gerieben. Nach dem Pullen der Säule wurde das obere Ende mit einer kleinen Menge Quartzwolle verschlossen. ■

In einer Apparatur für Flüssigkeitschromatographie · (J.J. Kiriiand, Anal. Chem. 40, 391-396, 1968)>urde mit einem Träger aus 0,02 η KH₂PO^ zu 0,002 η H₅PO₄ bei 60⁰C ein Gleichgewicht eingestellt. 5 ml einer 0,5 mg/ml Lösung der Ribonucleosid-^'-monophosphorsäuren wurde dann von oben in die Säule eingegeben, die mit einerTrägergeschwindigkeit von 1,91 ccm/min arbeitete. Unter diesen Bedingungen wurde das in Fig. 3 gezeigte Ghromatοgramm erhalten-, wobei ein "kontinuierlicher Detektor verwendet wurde» der aus einemUltraviolett-Photometer bestand, das bei 254- m/J. mit einer Gesamtempfindlichkeit von ' 0,05 Absorptionseinheiten arbeitete. Eine vollständige Trennung dieser sehr ähnlichen Verbindungen wurde in ungefähr 8 min erreicht. Dies muß mit den mehr als 4-5 min verglichen werden, die für die Trennung der gleichen Verbindungen mit dem schnellsten in der Literatur beschriebenen Verfahren (Horvath et al., s.o.) erforderlich waren,

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Ein anderes Beispiel für die Überlegenheit des chromatographischen Füllmaterials der vorliegenden Erfindung ist die Trennung von Ribonucleosid-2¹ , 3'-inonophosphorsäüre-

DlIt

gemischen. Die Trennung dieses Systems erforderteYder "oberflächlichen".Ionenaustauschersäule von Horvath et al. 1 "bis 1 1/2 h, während die Trennung mit einer Säule, die mit den Makropartikeln dieser Erfindung gefüllt war, nur 13 min erforderte.

Beispiele 2 bis 7

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei " statt der dort angegebenen Materialien die in Tabelle I für die Makroteilchen, die Mikroteilchen und die ungleichen Mikroteilchen (Zwischenschichten) zur aufgegebenen ·.Jz'ur Herstellung verwendet wurden.

Chromatographiesäulen, die mit den oben beschriebenen Materialien gefüllt sind, zeigen gute Trennungseigenschaften. Z.B. sind die in Beispiel 2 beschriebenen Materialien geeignet zur Trennung von Verbindungen mit Hilfe von Kationenaustauschflüssigkeitschromatographie. Die in den Beispielen 3* 4· und 5 beschriebenen Materialien zeigen die Fähigkeit, Verbindungen durch Gasflüssigkeitschromatographie zu trennen. Das Material des Beispiels 6 ist dann, wenn es mit einem dünnen Film aus einer geeigneten Verteilungsflüssigkeit, wie Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 200 bis 400 überzogen ist, geeignet zur Trennung einer großen Vielzahl von organischen Materialien durch Gasflüssigkeits- und Flüssigkeitsflüssigkeitschromatographie. Das Material des Beispiels 7 zeigt nützliche Eigenschaften für Flüssigkeitschromatographietrennungen, be-

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sonders bei der Trennung von Makromolekülen, die entweder natürlich vorkommen oder synthetisch hergestellt worden sind aufgrund der Diffusionsgrößentrennung, die in gewissem Sinne den GeIfiltrations- und Geldurchdringungschromatographie tr ennungen ähnlich ist, die mit "bestimmten organischen Gelen als !Füllmaterialien durchgeführt werden. Diffusionsgrößentrennung ist möglich aufgrund der regelmäßigen und vorhersagbaren Porosität des porösen Überzugs.

Die Beispiele zeigen nur einige wenige-Verbindungen aus der Gruppe der sorptiven Materialien. Ein Material ist sorptiv in Beziehung auf ein anderes, wenn der Fluß -des einen durch das andere durch Wechselwirkungen zwischen den Substanzen verzögert wird. Wenn ein Gemisch von Materialien, die getrennt werden sollen, durch die sorptive Füllung einer chromatographischen Säule hindurchgeht, werden die Komponenten des Gemisches unterschiedlich durch das Füllmaterial zurückgehalten und dadurch getrennt. Die Wechselwirkungen können von verschiedener Art sein, wie z.B. Ionenaustausch, Adsorption durch Wasserstoffbrücken oder Van der Waals-Kräfte, Verteilung und selektive Diffusion. Materialien, die gegenüber einer Vielzahl von anderen Materialien sorptiv sind, sind z.B. Kohlenstoff, Graphit, natürliche Kautschuks, wie Alginate, Pectine und Gallactane, Proteine, natürliches Latex und synthetische organische Polymere, wie-Polystyrol, Polyacrylnitril und Polyacrylsäuren. Bestimmte anorganische Verbindungen können ebenfalls sorptiv wirksam sein, wie Metalloxide und Sulfide.

. TABELLE■:■

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Beispiel Makroteilchen A

Mikroteilchen B

Ungleiche Mikroteilchen (Zwischenschichten) G

Größe

Glasperlen

Sand

Kieselgelgranulate

Faseriger Boehmit

kat i oni s ehe s

Polymer

("Eeten"-205) grobvernetzte, 20^37 Ai
stark saure (sulfon- ' ^1; '
saure) Na⁺-JOrBi eines
Polystyrolharzes

Alumosilicat
(Molekularsieb)

50 χ 1000

m/i

Hinderserum- Kaolin Albumin (pH 3) 105-149/1 25 m Ai

10 m/ü

0,1-0,5/1

0,2-0,5/1 100 m/i

α-Tonerde- /. Lineare Methkristalle acrylsäure

Eostfreie Kieselgel Stahlkapillaren

Tonerdeperlen Polystyrol

latex (Dow) Zirkonoxid

74-105/1.

ß-Methacrylyloxyäthyldiäthyl-methylammonium-me thyl - sulf at

Poly-(diäthylamino-

äthyl-methacrylat-

acetat

1 mm.

5 m/a

100 m

25 m/i

25/1 i.D. 0,05-0,1/a 50 m/i

10 m

Claims

195122 Patentansprüche

1.J Füllmaterial für cliomatographische Säulen aus oberflächlich porösen Makroteilchen, dadurch g e k e η η zeichnet, dass jedes Makroteilchen aus einem undurchlässigen Kern besteht, der mit einer Anzahl von Monoschichten aus Mikroteilchen überzogen ist, wobei sich jede Monoschicht von der nächsten angrenzenden unterscheidet und mindestens eine dieser Monoschichteh sorptive organische Mikroteilchen enthält.

2. Füllmaterial nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η «- ζ e ich η· e t, dass die Makroteilchen einen Durchmesser von 5 - 500 /U haben.

3. Füllmaterial nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e' -k e η η ζ ei c h η e t, dass die Mönoschichten 0,002 bis 25 i° des gesamten Volumens des Makroteilchens ausmachen.

4. Füllmaterial nach Anspruch 1 bi3 3, dadurch g e -

k en η ζ e ich net, dass die Mikroteilchen einen mittleren Durchmesser von 0,005 bis T /u besitzen.

5. Füllmaterial nach Anspruch 1 bis 4, dadurch ge -

k en η ze i c h η et, dass die Mikroteilchen einen Durchmesser von 0,01 bis 0,2 /U besitzen.

6. Füllmaterial nach Anspruch 1 bis 5, dadurch" ge'-k en η ζ e i c h η e t, dass der überzug aus Mikroteilchen aus Schichten von Mikroteilohen besteht, die eine Gesamtdioke von 0,1 bis 2 /U besitzen.

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7. Füllmaterial nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die sdrptiveri organischen" Mikroteilchen aus Kohlenstoff, natürlichem Latex, natürlichen Kautschukarten, Proteinen, synthetischen-Polymeren ' · oder Ionenaustauscherharzen bestehen.

8. Füllmaterial nach Anspruch 1 bis 7j dadurch gekennzeichnet, dass bei den Monoschichten solche aus anorganischen Mikroteilchen und solche aus Mikroteilchen aus einem sorptiven "Organischen Material abwechseln.

9. Füllmaterial nach Anspruch T bis 8, dadurch ge- * kennzeichnet, dass die anorganischen Teilchen

aus Siliciumoxid bestehen. . - *

10. Füllmaterial nach Anspruch T bis 9» dadurch ge-.kennzeichnet, dass der undurchlässige Kern- aus Glas, Sand, Tonerde oder einem keramischen Material besteht.

11. Füllmaterial nach Anspruch l/bis 10,. dadurch g e ke η η ζ e i ohne t, dass - aus einer Vielzahl von Makroteilchen besteht, die einen sphärischen Glaskern besitzen, der abwechselnd mit Monoschichten-

aus Siliciumoxid-Mikroteilchen und Ionenaustauscherharz- I

Mikroteilchen überzogen ist. ·

12. Füllmaterial nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der undurchlässige Kern einen Durchmesser von 37 bis 44 /u, die Siliciumoxid-Mikroteilchen einen Durchmesser von 15 in /U, die Ionenaustauscherharz-Mikroteilchen einen mittleren Durchmesser von 100 -. 500 m yu besitzen und die Dicke des Überzuges von Mikroteilchen auf dem Kern 0,1 bis 2 ai beträgt.

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13. Abwandlung des Füllmaterials nach Anspruch 1 bis 11, dadurch. gekennzeichnet, dass anstelle des un- -durchlässigens Kerns Kapillaren mit Innendurchmessemvon

5 -, 500 /u vorhanden sind. .

14. Verfahren zur Herstellung des Füllstoffe nach Anspruch 1 bis 13j dadurch gekennzeichnet, dass man die undurchlässigen Kerne oder Kapillaren der Makroteilchen nacheinander mit einer Reihe "von ungleichen

• gegensätzlich geladenen Monoschichten von gleichen kolloidalen Mikroteilchen überzieht. ~

15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man die Makroteilchen, die eine Oberflächenlaäung besitzen, mit einer kolloidalen Dispersion eines Stoffes, der eine entgegengesetzte Ladung besitzt, zusammenbringt, die hierbei entstehenden Teilchen nach dem Auswaschen und Trocknen in eine zweite kolloidale Dispersion von Hikroteilchen taucht, deren Ladung der der zuerst verwendeten Teilchen entgegengesetzt ist, und diese Behandlung so lange wiederholt, bis die gewünschte Anzahl von Monoschichten gebildet worden ist.

16. Verwendung des Füllmaterials nach Anspruch 1 bis zur Trennung von Kucleotidsystemen.

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