DE1944418B2 - Verfahren zur herstellung eines stabilisierten in wasser unloeslichen enzympraeparates - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines stabilisierten in wasser unloeslichen enzympraeparates

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Description

Enzym — Z— Silan
gebunden wird, worin Z eine der folgenden Gruppen bezeichnet:
OH S
!I I Il
— C —N-. — N— C-NH-.
O
Il —c—o—c—. —c—o—c—
—C—S—S—C—
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Silankupplungsmittel die allgemeine Formel aufweist
in der Y ein Amino, Carbonyl, Carboxy, Hydroxyphenyl, oder Sulfhydryl, R einen Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy und Halogen bezeichnet und π einen ganzzahligen Wert von 1 bis 3 darstellt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Silankupplungsmittel die allgemeine Formel
(Y'R>SiR4-„
aufweist, in der Y' ein Amino, Carbonyl, Carboxy, Isocyano, Diazo, Isothiocyano, Nitroso, Sulfhydryl oder Halocarbonyl, R einen Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy und Halogen, R' einen Rest der Gruppe niederes Alkyl, niederes Alkylphenyl, und Phenyl bezeichnet und η einen ganzzahligen Wert von 1 bis 3 darstellt.
5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einem siliziumhaUigen Material besteht.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einem nicht siüziumhaltigen Metalloxid besteht.
7. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kupplungsmittel zunächst an den Träger und sodann das Enzym an den Träger-Kupplungsmittel-Komplex gebunden wird.
65 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten, in Wasser unlöslichen Enzympräparates durch Binden eines Enzyms an einen anorganischen Träger.
Es ist bekannt, Enzyme durch Binden an organische Träger zu stabilisieren, d. h. wasserunlöslich zu machen, um sie nach einer Anwendung, z.B. zur Katalyse bestimmter Umsetzungen ohne aufwendige Rückgewinnung und möglichst unter Beibehaltung ihrer enzymetischen Wirkung oder Aktivität erneut und gegebenenfalls wiederholt verwenden zu können. So beschreibt z. B. die niederländische Offenlegungsschrift 67 08 738 die Bindung von Proteinen oder Enzymen an organische Polymere über Amidbindungen, oder das Enzym wird an ein Polyacrylamidgel gebunden (Science, 142, 678 [1963]) oder über Diazobindung an Cellulose-Derivate gekoppelt (Biochem. J., 107,669[1968]).
Organische Träger haben aber schwerwiegende Nachteile. Mikrobenbefall kann die Bindung lösen und das Enzym entstabilisieren oder deaktivieren. Das oft stark ausgeprägte Quellvermögen behindert den Enzymeinsatz in Kolonnen, z. B. in der Chromatographie; Durchlauf und Substratdiffusion können verlangsamt oder gehemmt werden.
Diese Nachteile können durch Verwendung anorganischer Träger zwar vermieden werden, jedoch standen dem bisher nachteilig die geringe stabilisierende Wirkung und Verluste der Aktivität gegenüber. Nach der US-PS 27 17 852 wird z.B. für die Dextroseherstellung Stärke-Glucogenase auf anorganischen Trägern wie Lehm, Silicagel u. dgl. adsorbiert. Jedoch wird durch die bloße physikalische Adsorption eine weniger gute und dauerhafte Stabilisierung erzielt, und auch die Aktivität kann auf die Dauer unbefriedigend sein.
Die DT-OS 19 05681 schlägt demgegenüber zur Verbesserung der Stabilisierung ein Verfahren zur Herstellung stabilisierter, wasserunlöslicher Enzympräparate vor, nach dem ein Enzym mit freien Aminogruppen an einen anorganischen, eine große Oberfläche und reaktive Silanolgruppen aufweisenden Träger durch Amino-Silikat- und Wasserstoffbindungen gekoppelt wird.
Es wurde nun gefunden, daß bei dieser unmittelbaren Kopplung des Enzyms an den Träger offenbar auch die aktiven Enzymstellen besetzt werden können und jedenfalls trotz erzielter höherer Stabilität die Enzymaktivität in vielen Fällen verbesserungsbedürftig ist.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Enzympräparat bereitzustellen, welches unter Beibehaltung der gegenüber organischen Trägern bestehenden Vorteile anorganischer Enzymträger eine verbesserte Stabilität und Aktivität des Enzympräparates erzielt.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren der Erfindung dadurch gelöst, daß das Enzym an einen freie Hydroxyl- oder Oxidgruppen aufweisenden anorganischen Träger vermittels eines Silankupplungsmittels kovalent gebunden wird, wobei der Siliziumteil des Silankupplungsmittels an den Träger und der organische Teil an das Enzym gekoppelt wird.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß diese bisher anorganischen Trägern entgegenstehenden Nachteile durch Zwischenschaltung eines Kupplungsmittels in Form eines Silans beseitigt werden, ohne wesentliche Eigenschaften wie Immunität gegen Mikrobenbefall, Quellungsfreiheit u. dgl. zu verlieren.
Die nach dem Verfahren der Erfindung stabilisierbaren Enzyme sind außerordentlich zahlreich und lassen sich in drei Hauptgruppen einteilen:
Hydrolasen, Redoxenzyme und Transerase-Enzym.
Zu den Hydrolasen gehören
proteolytische Enzyme wie Papaiii, Ficin, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Bromelin, Keratinase; Carbohydrasen wie Cellulase, Amylase, Maltase, Pectinase, Chitinase;
Esterasen wie Lipase, Cholinesterase, Leckhinase, alkalische und saure Phosphatasen;
Nucleasen wie Ribonuclease, Desoxyribonuclease, und
Amidasen wie Arginase, Asparaginase, Glutaminase und Urease.
Die zweite Gruppe besteht aus Redoxenzymen, die Oxydations- oder Reduktionsreaktionen katalysieren. Zu ihnen gehören Glucoseoxydase, Katalase, Peroxyda- ^e, Lipoxydase und Cytochrom-Reduktase.
Die dritte Gruppe, die Transferaren, übertragen Gruppen von einem Molekül zum anderen. Beispiele hierfür sind Glutaminsäure-pyruvat-transaminase, Glutaminsäure-oxalsäure-iransaminase, Trans-
methylase,Phosphopyruvatransphosphorylase.
Als Träger dienen verfügbare Oxid- oder Hydroxidgruppen aufweisende anorganische Substanzen, die im wesentlichen wasserunlösliche und schwache Säuren oder Basen sind. Sie können nach ihrer chemischen Zusammensetzung in siliziumhaltige Substanzen und nichtsiliziumhaltige Metalloxide eingeteilt werden. Als siliziumhaltiger Träger kommt verzugsweise poröses Glas in Betracht, entweder in Form von Feststoffpartikeln oder als selbsttragendes Stück, wie z.B. als Scheibe oder Zylinder, das abmessungsstabil, leicht sterilisierbar und leicht zu reinigen ist und beispielsweise mit verschiedenen Porendurchmessern nach US-PS 2106 744 oder FR-PS 15 34 990 hergestellt werden kann. Andere geeignete anorganische Träger sind z. B. kolloidale Kieselerde (S1O2), Wollastonit, getrocknetes Silikagel, Bentonit usw.
Typische, nichtsiliziumhaltige Metalloxide sind z.B. Aluminiumoxid, Hydroxyapatit und Nickeloxid. Die in Frage kommenden anorganischen Träger lassen sich entsprechend der folgenden Tabelle zusammenfassen:
Siliziumhaltig
Amorph
Kristallin
Nichtsiliziumhaltige Metalloxide
ÜbergangsmetaHe
MeO saures MeO basisches MeO
Glas
Silikagel
Kieselsäurekolloid
Bentonit
Wollastonit
AI2O3
Hydroxy
Apatit
Die als Kupplungsmittel dienenden Silane sind Moleküle mit zweifacher, verschiedener Reaktivität. Es handelt s.ich um organisch-funktionelle und siliziumfunktionelle Siliziumverbindungen, deren Siliziumteil eine Affinität für anorganische Substanzen, z. B. Glas oder Aluminiumsilikate und deren organischer Teil eine Affinität für organische Verbindungen besitzt. Hauptaufgabe des Kupplungsmittels ist, das Enzym als organische Substanz mit dem Träger als anorganischer Substanz zu kuppeln. Theoretisch ist die mögliche Vielzahl der verwendbaren organisch-funktionellen Silane nur durch die Zahl der bekannten organisch-funktionellen Gruppen und der zur Bindung verfügbaren Stellen am Enzymmolekül begrenzt. Als Kupplungsmittel kommen die zahlreichen Silane der folgenden generellen Formel in Betracht:
(Y'R')/)SiR4-n.
In dieser Formel bezeichnet Y' eine Verbindung der Gruppe Amino, Carbonyl, Carboxy, Isocyano, Diazo, Isothiocyano, Nitroso, Suifhydryl, Halocarbonyl;
R einen Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy, Halo; R' einen Rest der Gruppe niederes Alkyl, niederes Alkylphenyl und Phenyl; und η einen ganzzahligen Wert von 1 bis 3.
Nach weiterer günstiger Ausgestaltung ist das Kupplungsmittel durch die generelle Formel YnSiR4-n gekennzeichnet, in der Y eine Verbindung der Gruppe Amino, Carbonyl, Carboxy, Hydroxyphenyl und Suifhydryl, R ein Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy und Halo und η ein ganzzahliger Wert 1 bis 3 ist.
Die am leichtesten zugänglichen Kupplungsmittel besitzen die generelle Formel
RCH2CH2CH2-Si(OCH3)3,
in der R eine reaktive organische Gruppe darstellt, die so ausgebildet ist, daß sie der Reaktivität in dem jeweiligen System entspricht. Die möglichen Umsetzungen der organisch-funktionellen Gruppen können dei Fachliteratur entnommen werden und bedürfen dahei keiner näheren Erläuterung.
Einige wichtige typische Bindungen des Kupplungs mittels mit dem Enzym seien beispielhaft aufgeführt:
Art der Bindung
Bindungstyp Struktur der Bindung Reaktive Gruppen
Enzyme		 Kupplungsmittel S
1. Amide O
Il
—C—NH-		 -COOH
-NH2 		-NH2
-COOH		 -NH2 + ClCCl
S
Il
">.. Sulfonamide Il
— N—C—NH-		 -NH,
Fortsetzung Struktur der Bindung Reaktive Gruppen Kupplungsmittel
Bindung'styp Enzyme
OH
I		 -N2 +Cr
-N = N- <) Tyrosin
Histidin
Lysin
3. Azobindung
4. Äther
5. Ester
6. Disulfid
R —O —R
O
Il
—C—O—R
R—S—S—R
Zur Auswahl der optimalen Kupplungsmittel müssen die aktiven Stellen des Enzymmoleküls berücksichtigt werden, die nach Möglichkeit freigehalten werden sollen. Das Kupplungsmittel soll die Enzymaktivität nicht wesentlich beeinträchtigen, z.B. im Falle von Trypsin durch Bindung an die Carboxyl- oder Sulfhydrylgruppe des Enzyms. Auch soll die Bindung bei das Enzym oder den Träger nicht zerstörenden Temperatur- und pH-Werten erfolgen können. Ferner soll die von dem jeweils verwendeten Kupplungsmittel in großem Maße abhängende Art der Bindung unter den Einsatzbedingungen stabil sein.
Die Bindung des Enzyms an den Träger erfolgt als zweistufige Umsetzung. Als erste Stufe wird das Kupplungsmittel an den Träger und als zweite Stufe das Enzym an das bereits mit dem Träger verbundene Kupplungsmittel gebunden. Die Menge des gekuppelten Enzyms hängt offenbar von der zur Umsetzung verfügbaren Oberfläche des Trägers ab. Die Enzymaktivität hängt dabei von nicht zu scharfen Kupplungsbedingungen, nicht dagegen notwendigerweise von der Struktur der aktiven Stellen ab.
Bei der Herstellung des Trägers für die Enzymbindung ist es häufig notwendig, den Träger vorzubehandeln, um verschiedene, z. B. organische Verunreinigungen zu entfernen, die die verfügbaren Oxid- oder Hydroxidgruppen besetzen. Die Art der Reinigung hängt bis zu einem gewissen Grade vom Träger ab. Eine typische Reinigung für poröses Glas ist folgende: Ein poröses Glasmuster wird in einer verdünnten Salpetersäurelösung gereinigt, mit destelliertem Wasser abgespült und in Sauerstoff auf etwa 625° C erhitzt
Beim Einsatz des Kupplungsmittels in Form einer Lösung muß in geeigneter Weise die Umsetzung des silizium-funktionellen Molekülteils erreicht werden, z. B. durch Erhitzen der Lösung auf 60 bis 1400C. Nach bevorzugter Ausgestaltung wird das Silan in Toluol mit einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 Gewichtsprozent gelöst und der Träger mit der Lösung vorzugsweise im Rückfluß erhitzt, wobei das Toluol z. B. 1050C siedet. Die Rückflußdauer beträgt 1 bis 16 Stunden, wobei 4 Stunden in der Regel genügen.
Nach Bindung des Kupplungsmittels an den Träger kann zur Bildung gewünschter Verbindungen der organisch-funktionelle Teil des Silans modifiziert werden. Die meisten Kupplungsmittel sind im Handel erhältlich, andere in bekannter Weise unschwer darstellbar. So kann z.B. das Diazoderivat aus -C-ONa
— COOH
R-SH
-R-X
— R —Oll
R-SH
y-Aminopropyltriäthoxysilan nach Bindung an den Träger durch Umsetzung mit p-Nitrobenzoesäure, Reduktion der Nitrogruppe zum Amin und Diazotierung mit salpetriger Säure hergestellt werden. Bei gleichem Ausgangsmaterial kann z. B. das Isothiocyanoalkylsilanderivat durch Umsetzung der funktionellen Aminogruppe mit Thiophosgen hergestellt werden.
Nunmehr wird das Enzym mit dem organisch-funküonellen Teil des Silans umgesetzt. Zunächst wird das Enzympulver in einem Puffer gelöst und geprüft. Die wässerige Enzymlösung wird dann mit dem behandelten Träger bei einer in der Regel unter Zimmertemperatur liegenden Temperatur in Kontakt gebracht. Besonders bei Proteasen liegt die Kontakttemperatur günstigerweise bei 5°C, da Enzyme bei niedrigeren Temperaturen meist beständiger sind. In einigen Fällen, z. B. Glucoseoxidase, wird eine raschere Kupplung dagegen bei höheren Temperaturen, vorzugsweise Zimmertemperatur, bei einer Kontaktdauer von 1 bis 2 Stunden bevorzugt.
Nach einer Kontaktdauer von etwa 1 bis 72 Stunden ist das Enzym an den Träger gebunden, und ein etwaiger Überschuß wird entfernt. Wichtig dabei ist, den pH-Wert der Lösung in einem die irreversible Denaturierung des Enzyms vermeidenden Bereich zu halten. Die Kupplungsreaktion kann unter Umständen auch einen bestimmten pH-Bereich nötig machen, da z. B. die Azobindung am besten bei pH 8 bis 9 erfolgt Im Falle von Proteasen erfolgt die Kupplung günstigerweise im pH-Bereich niederer Enzymaktivität Anschließend wird das gekuppelte Enzym geprüft und schließlich an der Luft getrocknet, jedoch nicht bis zur Exsiccation, und gelagert. Die Lagerung kann auch in Wasser oder einer gepufferten Lösung bei oder unter Zimmertemperatur erfolgen.
Das erhaltene Produkt ist ein wasserunlösliches, stabilisiertes Enzym mit lang anhaltender, konstanter Aktivität. Bei Lagerung bei 50C, oder selbst bei Zimmertemperatur, selbst für mehrere Monate, wird die konstante Aktivität selbst nach wiederholter Einwirkungen von Prüfbedingungen aufrechterhalten.
An Hand der folgenden Beispiele sei die Erfindunj weiter erläutert
Beispiel 1
Eine Probe von porösem Glaspulver mit 96°y Kieselsäuregehalt (950 Ä ± 50 Ä Porengröße, 16 mV Oberfläche) wurde in HNO3, 0,2 N, bei 8O0C unte
9
ständiger Schallbehandlung wenigstens 3 Stunden lang gewaschen. Das Glas wurde mehrere Male mit destilliertem Wasser durch Abdekantieren nachgewaschen und dann über Nacht in Gegenwart von O2 auf 625° C erhitzt.
Das Glas wurde gekühlt und in eine Flasche mit rundem Boden gegeben. Je 2 g des Glases wurden 100 ml einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthyoxysilan in Toluol zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht im Rücklauf erhitzt und mit Azeton gewaschen. Das Endprodukt wurde an der Luft getrocknet und gelagert. Das erhaltene Derivat (nachfolgend als Aminoalkylsilanderivat bezeichnet) enthielt 0,171 mäq( = milliäquivalente Teile) Silanrückstände/g Glas, ermittelt auf Grund des gesamten Stickstoffgehalts.
Zu 1 g des so behandelten Glases wurde 3.5 ml destilliertes Wasser mit einem Gehalt von 100 mg kristallisiertem Trypsin zugegeben und das Ganze einer Mischung von N'-Dicyclohexylcarbodiimid, 0,5 ml N, in 0,5 ml Tetrahydrofuran beigegeben und die Umsetzungsteilnehmer über Nacht gerührt. Das Produkt wurde gründlich mit NaHCCb Lösung, 0,001 Mol HCl und destilliertem Wasser gewaschen. Das unlöslich gemachte Trypsin wurde in 0,001 Mol HCl bei 5° C gelagert.
Die Hydrolyse des Benzoyl-Argininäthylesters wurde bei pH 8,1 in 0,1 Mol. Glycin-Lösung vorgenommen. Eine Aktivitätseinheit ist dabei gleich der Hydrolyse von 1 μ-Mol Substrat/Minute bei 25° C und pH 8,1.
Mehrere in dieser Weise hergestellte Proben wurden folgendern"aßen geprüft. 1 g des Glas-Enzympräparates wurde 50 ml Substrat enthaltend 0,08 mg Benzoyl-Argininäthylester/ml Puffer zugegeben. Die Umsetzungsteilnehmer wurden mit einem Magnetrührer bewegt und alle drei Minuten eine Probe entnommen und diese jeweils filtriert unr1 spektralphotornetrisch bei 247 πιμ gemessen. Die durchschnittliche Änderung der optischen Dichte/Minute wurde ermittelt und die Aktivität errechnet.
Drei typische, in der beschriebenen Weise geprüfte Proben enthielten 8,5 bzw. 25,2 bzw. 12 Enzym-Einheiten pro g Glas. Dies entspricht aktivem Enzym in Mikrogramm-Quantitäten. Die gesamte nach diesem Verfahren gekuppelte Enzymmenge betrug 0,437 mg/g Glas, ermittelt nach dem Gesamtstickstoffgehalt.
Beispiel II
2 g des nach Beispiel I hergestellten Aminoalkylsilanderivats von porösem Glas (780 A ± 50 A Porengröße) wurden mit 1 gp-Nilrobenzoesäure versetzt und das Ganze 2 Tage bei Zimmertemperatur in 10%iger Lösung N'-Dicyclohexylcarbodiimid in absolutem Methanol gerührt. Das umgesetzte Material wurde gründlich in Methanol gewaschen, 500 ml destilliertes Wasser enthaltend 5 g Nalriumdithionit zugegeben und 30 Minuten gewaschen. Das p-Aminobenzoesäureamid des Aminoalkylsilanglases (nachfolgend als Aminoarylsilanderivat bezeichnet) wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, mit Azeton nachgewaschen und an der Luft getrocknet
Das Aminoarylsilan wurde in HCl, 0,1 N, durch Zusatz eines Überschusses von festem NaNCh bei 00C diazotiert. t g des Produkt? (nachfolgend als Diazoarylsilan bezeichnet) wurde 14 mg kristallisiertes Trypsin in 50 ml NaHCOj Lösung zugesetzt und bei 50C über Nacht weiter umgesetzt. Anschließend wurde das chemisch gebundene Trypsin in NaHCCb-Lösung und destilliertem Wasser gewaschen.
Die Proben wurden im wesentlichen in der im Beispiel I beschriebenen Weise geprüft, nur enthielt das Substrat 0,08 mg Benzoyl-Argininäthylester/ml, gelöst in 0,07 Mol Phosphatpuffer, auf pH 7 eingestellt. Das chemisch gekuppelte Trypsin enthielt das Äquivalent von 0,189 mg aktives Enzym/g Glas. Die gebundene Enzymaktivität betrug 3,2% des eingesetzten Trypsins.
Eine Säule wurde bereitet und mit 1 g des chemisch gekuppelten Trypsins gefüllt. Der Durchmesser der gepackten Säule betrug 1 cm, die Länge 5 cm. Das Substrat — 0,08 mg/ml Benzoyl-Argininäthylester, gelöst in 0,07 Mol Phosphatpuffer, pH 7 — wurde durch die Säule mit einem Durchsatz von 0,5 ml/Min, geführt, mit einer 90%igen Umwandlung des Substrats in das Produkt. Der Betrieb der Säule war kontinuierlich bei 23° ± 1 ° C, und das Produkt wurde ebenfalls kontinuierlich bei 253 ιτιμ in einer 1 cm Durchflußzelle gemessen. Zum Nachweis der Zeitstabilität des chemisch gekuppelten Trypsins im Vergleich zum freien (nicht gekuppelten) Trypsin diente ein Vergleichsversuch bei 230C Krist Trypsin mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml wurde in 0,07 Mol Phosphatpufferlösung gegeben. In Abständen wurden 0,05 ml Proben entnommen, 3 ml Substrat zugesetzt und auf Aktivität geprüft.
Die Vergleichsergebnisse für freies und chemisch gekuppeltes Enzym (% Aktivität als Zeitfunktion bei Zimmertemperatur) sind der graphischen Darstellung der F i g. 1 zu entnehmen. Für das freie Enzym wurden dabei die Aktivitätswerte als % der ursprünglichen Aktivität des gelösten Enzyms abgetragen. In weniger als 2 Stunden war die gesamte Enzymaktivität durch Autohydrolyse des freien Trypsins zerstört. Die ursprüngliche Umwandlungsrate des chemisch gekuppelten Enzyms wurde willkürlich auf 100% Aktivität festgesetzt Kein Aktivitätsverlust konnte nach 154 Stunden ständiger Prüfung festgestellt werden. Danach setzte ein geringer Aktivitätsverlust ein, jedoch bestand erhebliche Aktivität noch nach 397 Stunden.
Beispiel 111
10 g des nach dem Beispiel II hergestellten Aminoalkylsilanderivats wurden 100 ml 10% Thiophosgen in Chloroform zugesetzt und mehrere Stunden im Rücklauf erhitzt. Das Produkt wurde gründlich in Chloroform zur Entfernung der Thiophosgenrückstände gewaschen. Das Isothiocyanoalkylsilanderivat wurde an der Luft getrocknet und sofort nach der Synthese zur Kupplung an Trypsin eingesetzt 2 g des Derivats wurden 50 ml NaHCCh-Lösung pH 9, enthaltend 100 mg Trypsin zugesetzt, das Ganze 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und danr gründlich in destilliertem Wasser gewaschen. Da: Produkt wurde in destilliertem Wasser bei 5° C bis zurr Gebrauch gelagert Das chemisch gekuppelte Trypsii enthielt 2,1 mg Protein, ermittelt nach den Gesamtstickstoffgehalt
Das Substrat bestand aus durch Wärme denaturier tem Kasein mit einer Konzentration von 5 g/l in 0,1 Mc Phosphatpuffer, pH 7. Ig des gekuppelten Enzym wurde 50 ml des Substrats zugesetzt Die Mischun wurde ständig gerührt Alle 60 Sek. wurden Probe entnommen und einem gleichen Volumen 10%ige Trichloressigsäure (TCE) zugesetzt Die Ausfällun wurde nach 15 Minuten abfiltriert und das Filtn spektralphotometrisch mit einem in der gleichen Weis behandelten Substrat verglichen. Das erhaltene Enzyn Giasprodukt enthielt 0,12 mg aktives Enzym/g Glas.
609508/4
9
Beispiel IV
Das Diazoarylsilanderivat von Glas wurde entsprechend dem Beispiel II hergestellt. Das Enzym wurde durch eine Azokupplung in einer l°/oigen Lösung von rohem Papain gekuppelt und das gekuppelte Glas-Enzym sodann 100 ml 1% Kasein enthaltend 61,5 mg Cystein und 32 mg Dinatriumäthylendiamintetraazetat in 0,1 Mol Phosphatpuffer, pH 6,9, zugesetzt. Während der Prüfung wurden 4 ml aliquote Teile entnommen, 4 ml Trichloressigsäure zugesetzt, zentrifugiert und bei 280 ιτιμ gemessen. Die optischen Dichten wurden mit einer TCE ausgefällten Probe des Substrats vor Kontakt mit dem Enzym verglichen. Das chemisch gekuppelte Papain enthielt 2,55 mg aktives Enzym/g Glas.
Zum Nachweis der Wärmestabilität des gebundenen Papains wurde der folgende Versuch vorgenommen.
1 g des chemisch gekuppelten Papainpräparats wurde in eine Säule gegossen und aliquote Teile des Elutionsguts ständig geprüft. Das Substrat bestand aus 3% Kasein in 0,1 Mol Phosphatpuffer, pH 6,9. Während des ganzen Versuchs wurde die Säulentemperatur auf 880C gehalten. Der Durchsatz wurde auf 2,8 ml/Min, eingestellt. Das Substrat wurde kontinuierlich durch die Säule geleitet und aliquote Teile für die Prüfung durch Trichloressigsäure-Ausfällung gesammelt. Der anfangs erhaltene Grad der Hydrolyse wurde als prozentualer Wert der Anfangsaktivität abgetragen.
Durch Lösen von 50 mg in 100 ml Puffer wurde ein freies Enzym hergestellt und die Lösung auf 880C gehalten. Aliquote Teile wurden entnommen, in bekannter Weise geprüft und 2h prozentualer Wert Her Ausgangsaktivität des Enzyms vor Wärmeeinwirkung abgetragen.
Die Fig.2 zeigt die graphische Darstellung der Ergebnisse bei hoher Temperatur (880C), und zwar die prozentuale Aktivität des freien Enzyms und des chemisch gekuppelten Enzyms als Zeitfunktion. Das freie Enzym verlor seine Aktivität sofort und war nach 30 Min. völlig inaktiv. Demgegenüber zeigte das chemisch gekuppelte Papain keine Abnahme der Enzymaktivität nach 80 Minuten, ein klarer Beweis der verbesserten Wärmebeständigkeit.
Beispiel V
Ein Nickelsieb mit einer Siebweite von 150 mesh, 0,1 mm äußerer Durchmesser, wurde in Streifen von 2,54 χ 12,7 cm geschnitten. Die Streifen wurden zu Zylindern mit einer lichten Weite von etwa 1,25 cm gerollt und festgeschweißt und zunächst 2 Stunden in einem auf 7000C erhitzten Ofen mit einer Sauerstoffatmosphäre gebracht, um eine NiO-Schicht zu bilden.
Die mit NiO überzogenen Siebe wurden dann über Nacht in 10%iger Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Toluol im Rücklauf erhitzt. Das Aminoalkylsilanderivat wurde in Azeton gewaschen und getrocknet Die Siebe wurden über Nacht in 10% Thiophosgen in Chloroform im Rücklauf erhitzt. Das Isothiocyanoalkylsilanderivat wurde mit Chloroform gewaschen und sofort an Glucoseoxidase gekuppelt Das Derivat wurde einer l°/oigen Lösung von Glucoseoxidase in 0,1 Mol NaHCOa, pH 9, zugesetzt und auf Zimmertemperatur gehalten. Das Ganze wurde 2 bis 3 Stunden gerührt, mit destilliertem Wasser gewaschen, und das mit NiO überzogene Sieb mit dem chemisch gekuppelten Enzym bei 5° C in destilliertem Wasser gelagert
Die Enzymaktivität des Produkts wurde als μg Enzymaktivität im Vergleich zur Aktivität bekannter
45 Mengen des lösbaren Enzyms gemessen. In allen Versuchen wurde als Substrat D-Glucoseanhydrid (Dextrose) im Konzentrationsbereich von 0,00055 bis 0,055 Mol, gelöst in 0,01 Mol Phosphat, pH 6, verwendet.
Die freie Enzymprobe wurde durch Zusatz einer aliquoten Menge von 0,5 ml, enthaltend 250 μg gereinigter Glucoseoxidase, zu 50 ml Substrat, enthaltend ^ig/ml Meerrettichperoxidase und 0,0005% o-Dianisidin geprüft. Die Reagenzien wurden im Magnetrührer bewegt. Zunächst wurde zur Kontrolle eine 2-ml-Probe entnommen. Sodann wurden in 1 minutigen Abständen für insgesamt 5 Minuten 2-ml-Proben entnommen und in einen Tropfen HCl14 N1 in 0,5 ml destilliertem Wasser enthaltende Reagenzgläser gegeben. Die Lösung wurde spektralphotometrisch bei 460 ΐημ gemessen. Die Versuchstemperatur betrug 23° C.
Das mit NiO überzogene Sieb mit dem chemisch gekuppelten Enzym wurde in entsprechender Weise geprüft, wobei jedoch äquivalente Mengen Peroxidase und o-Dianisidin in 0,5 ml Volumenanteilen in die Reagenzgläser gegeben wurden, um eine Adsorption des o-Dianisidins auf dem Sieb zu verhindern, jedes Reagenzglas wurde zur Entwicklung des Ansatzes vor Zusatz der HCl 1 bis 3 Minuten stehengelassen.
A. Zeitstabilitätsversuch
Proben des chemisch gekuppelten Enzyms wurden bei 4°C gelagert und während einer 6 Monate währenden Versuchsdauer geprüft. Die folgende Tabelle verzeichnet die Ergebnisse.
Prüfung
tnzymakiivitäl
% der Äusgangsaktivität
Beginn 375 —
Nach 7 Tagen 375 100
Nach 14 Tagen 300 80
Nach 21 Tagen 225 60
Nach 28 Tagen 225 60
Nach 128 Tagen 225 53
Die Versuche zeigen deutlich die langanhaltende Stabilität des gekuppelten Enzyms.
B. Wärmestabilitätsversuch
Die Fig.3 zeigt die thermische Stabilität der chemisch gekuppelten Glucoseoxidase im Vergleich zum freien Enzym. Das gebundene Enzym wurde zu 50 ml Substrat bei der gewünschten Temperatur zugesetzt und geprüft. Nach der Prüfung wurde die Probe bei der nächsthöheren Temperatur geprüft Durch dieses Vergeben wird die Einwirkungsdauer dei höheren Temperaturen akkumuliert. Infolgedesser kann der tatsächliche Aktivitätsunterschied (basierenc auf μg des aktiven, gebundenen Enzyms) zwischen den freien und dem gebundenen Enzym größer sein. Die Ergebnisse sind also als Mindestwerte aufzufassen.
Für das chemisch gekuppelte Enzym ist also eine verbesserte Wärmebeständigkeit erreicht. Bei 33° C is sogar eine Aktivitätszunahme des gebundenen Enzym festzustellen, während die Aktivität des freien Enzym: abgenommen hat Zur Annäherung an den Aktivitäts wert des chemisch gekuppelten Enzyms wurde ein freie Enzym mit 480 μg Glucoseoxidase verwendet Da gelöste Enzym einer Temperatur von 23° C wurde de erwärmten Pufferlösung bei jeder der angegebene! Temperaturen zugesetzt Die Aktivität sank sofort nacl Einwirkung zunehmender Temperaturen.
11
<*■** *t ι ο
Die Ergebnisse zeigen also klar die verbesserte Wärmebeständigkeit des chemisch gekuppelten Enzyms (Glucoseoxidase) im Vergleich zum freien Enzym.
Beispiele VI bis XVIII
Es wurde im wesentlichen nach den Beispielen II und III vorgegangen, um verschiedene Enzyme mit einer Reihe von typischen anorganischen Trägern zu kuppeln. In der folgenden Tabelle ist das Ausgangsmaterial,
insbesondere das Enzym, der Träger, und di Kupplungsmittel in den Spalten 2, 3 und 4 verzeichne Das Kupplungsmittel ist mit großen Buchstabe angegeben, wobei B das Diazoarylsilanderivat (wie ii Beispiel II näher erläutert) und C das lsothiocyanoalky silanderivat (vgl. Beispiel III) bezeichnet. Die Aktivität; werte der chemisch gekuppelten Enzyme sind b Verwendung des Substrats der Spalte 5 in der Spalte wiedergegeben.
Beispiel Gekuppeltes Enzym
Anorganischer Träger Kupplungs- Substrat
mittel
Probenaktivität mg/g
VI Papain
VII alkalische Protease
VIII Ficin
IX Ficin
X Urease
XI alkalische Phosphate
XII Glucose-Oxidase
XIII Glucose-Oxidase
XIV Glucose-Oxidase
XV Glucose-Oxidase:
XVI Glucose-Oxidase
XVII Peroxidase
XVIII Peroxidase
poröses Glas kolloidale Kieselsäure poröses Glas poröses Glas poröses Glas poröses Glas poröses Glas poröses Glas kolloidale Kieselsäure Aluminiumoxid Hydroxyapatit poröses Glas Nickeloxid
C Kasein 1,5
C Kasein 92,0
B Kasein 0,9
C Kasein 2,7
B Hai nstoff 1,0
i> p-Nitrophenylphosphat 0,7
B Dextrose 10,1
C Dextrose 11,8
C Dextrose 24,0
C Dextrose 6,0
C Dextrose 10,7
B Wasserstoffperoxid 1,0
C Wasserstoffperoxid 0,5
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
7

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten, in Wasser unlöslichen Enzympräparates durch Binden eines Enzyms an einen anorganischen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym an einen freie Hydroxyl- oder Oxidgruppen aufweisenden anorganischen Träger vermittels eines Silankupplungsmittels kovalent gebunden wird, ι ο wobei der Siliziumteil des Silankupplungsmittels an den Träger und der organische Teil an das Enzym gekoppelt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Silan an das Enzym entsprechend der Formel
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