DE1944418A1 - Stabilisiertes Enzympraeparat und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Stabilisiertes Enzympraeparat und Verfahren zu seiner Herstellung

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Description

Anmelderin: Corning Glass Works
Corning, New York, USA
Stabilisiertes Enzympräparat und Verfahren zu seiner
Herstellung
Die Erfindung betrifft die Stabilisierung von Enzymen durch chemische Kuppelung der Enzyme an eine anorganische Trägersubstanz vermittels eines Kupplungsmittels in Form eines Silans, wobei das Enzym unlöslich wird und über einen längeren Zeitraum verwendet und wieder verwendet werden kann.
Ein Enzym ist ein biologischer Katalysator, der fähig ist, eine chemische Reaktion in Gang zu setzen, zu fördern und zu leiten, ohne dass es beim Prozess aufgebraucht oder zu einem Teil des gebildeten Produkts wird. Enzyme werden z. B. durch Pflanzen, Tiere und Mikroorganismen synthetisiert.
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Alle bisher isolierten Enzyme sind Proteine, d. h. Peptidpolymere von Aminosäuren. Ein Enzym kann prosthetische Gruppen wie Flavin-adenin-dinucleotid, Porphyrin, Diphosphopyridin-nucleotid usw. enthalten. Enzyme sind im allgemeinen Makromoleküle, mit einem Molekulargewicht über 6000. Der isoelektrische Punkt der Enzyme liegt bei einem pH-Wert von etwas weniger als 1,0 bis 11,0. Bei oder in der Nähe dieser Wasserstoffionenkonzentration neigen die Enzym-Proteine gewöhnlich zum Koagulieren.
Die besonderen Eigenschaften der Enzyme und ihre Fähigkeit, Eeaktionen von Substraten bei niedrigen Konzentrationen zu katalysieren, ist in der chemischen Analyse von besonderem Interesse. Durch Enzyme katalysierte Eeaktionen sind seit einiger Zeit zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Substraten, Beschleunigern, Verzögerern, und auch von Enzymen selbst verwendet worden. Bis in die jüngste Zeit haben die bei Verwendung von Enzymen auftretenden Nachteile ihre Brauchbarkeit stark eingeschränkt. Einwände gegen die Verwendung von Enzymen sind ihre !Instabilität, ihr Mangel an Verfügbarkeit, geringe Genauigkeit, sowie der Arbeitsaufwand zur Durchführung der Analyse. Weiterhin sind die Ko sten bei Verwendung grosser Enzymmengen in der analytischen Chemie, besonders bei Rout ine analy sen, ein besonders schwieriges Problem. Da die bekannten Enzyme Proteine sind, werden
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sie wie diese unter "bestimmten Bedingungen, z. B. Temperaturen, pH-Werten, Konzentrationen, Mikrobenbefall, Autohydrolyse und dergleichen denaturiert.
Es sind Versuche unternommen worden, Enzyme in gebundener Form ohne Verlust ihrer Wirksamkeit herzustellen, so dass eine Probe kontinuierlich viele Stunden benutzt werden kann. Das gebundene Enzym wird in der gleichen Weise verwendet wie lösliche Enzyme, d. h. zur Bestimmung der Konzentration eines Substrates, eines Inhibitors, der das Enzym inaktiviert, oder eines Aktivators, der eine Beschleunigung der Enzymaktivität bewirkt, wobei aber die Genauigkeit verbessert ist. Enzyme sind diazotiert an Celluloseteilchen und Polyaminostyrοlperlen worden. Auch wurde versucht, die Enzyme durch Adsorption, Absorption oder durch Ionenaustausch physikalisch einzuhüllen. Enzyme sind auch an Polystyrolpolypeptide gebunden, und in Kollodiummatrizen in Stärke- oder Polyacrylamidgelen, Agar, usw. und in semipermeable Mikrokapseln aus synthetischen Polymerisaten eingeschlossen worden.
Alle bisher zum Binden der Enzyme verwendeten Trägersubstanzen waren organische Substanzen, besonders organische Polymerisate. Der Hauptnachteil bei Verwendung von organischem Material beruht darauf, dass sie gegen Mikrobenbefall infolge der Anwesenheit von C-Atomen in der polymeren Kette anfällig sind, wobei der Träger aufgebrochen und das Enzym löslich gemacht wird. Weiterhin erfolgt die Kupplung mit Hilfe von Diazo-
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bindung durch, eine Kupplungsgruppe, wobei die Enzymmoleküle an den Träger nur an verschiedenen Punkten entlang der Enzymkette gebunden sind. In wässriger Lösung können die Moleküle auseinanderfallen, wobei das Protein denaturiert und dementsprechend ein Verlust an Enzymwirksamkeit auftritt.
In vielen Fällen wird die Substratdiffusion zum Grenzwert der Umsetzungsgeschwindigkeit und vermindert die scheinbare Enzymaktivität. Bei Verwendung in chromatographischen Säulen bewirken die pH-Werte und Lösungsverhältnisse eine Zu- oder Abnahme der Anschwellung, die den Substratdurchsatz in der Säule unkontrolliert und unerwünscht beeinflussen.
In dem Patent der früheren Anmeldung P 19 05 681.6-41 ist bereits ein im wesentlichen wasserunlösliches, stabilisiertes Enzympräparat und ein Verfahren zu seiner Herstellung beschrieben, in dem das freie Aminogruppen aufweisende Enzym an einen anorganischen, eine grosse Oberfläche und reaktive Silanolgruppen aufweisenden Träger durch Amino-Silikat- und Wasserstoffbindungen gekuppelt ist. Die Kupplung des Enzyms an den Träger ist eine unmittelbare. Dies hat den Nachteil, dass bei eventueller Bindung an die aktiven Stellen des Enzymmoleküls die Aktivität gegebenenfalls beeinträchtigt werden kann.
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Überraschenderweise wurde gefunden, dass dieser Nachteil durch Zwischenschaltung eines geeigneten Kupplungsmittels in 3?orm eines Silans überwunden werden kann. Dabei werden die übrigen, gegenüber dem obenbezeichneten Stand der Technik erreichten Vorteile, insbesondere verbesserte langwährende Stabilität, weitgehende Immunität gegen Mikrobenbefall etc. ebenfalls erzielt.
Der erfindungsgemässe Lösungsvorschlag geht dahin, dass ein Enzym an einen anorganischen, freie Hydroxyl- oder Oxidgruppen aufweisenden Träger vermittels eines Silankupplungsmittels kovalent gebunden ist, wobei der Siliziumteil des Silanmoleküls an den Träger und der organische Teil an das Enzym gebunden ist.
Die erfindungsgemäss stabilisierbaren Enzyme sind ausserordentlich zahlreich und lassen slcja. in drei Hauptgruppen einteilen: Hydrolasen, Redoxenzyme und Transferase-Enzym. Zu den Hydrolasen gehören proteolytische Enzyme wie Papain, Ficin, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Bromelin, Keratinase; Oarbohydrasen wie Oellulase, Amylase, Maltase, Pectinase, Chitinase; Esterasen wie Lipase, Cholinesterase, Lecithinase, alkalische und saure Phosphatasen; Nucleasen wie Ribonuclease, Desoxyribonuclease; und Amidasen wie Arginase, Asparaginase, Glutaminase und Urease. Die zweite Gruppe besteht aus Redoxenzymen, die Oxydations- ader Reduktionsreaktionen kifealy-
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sieren. Zu ihnen gehören Glucoseoxydase, Katalase, Peroxydase, Lipoxydase und cytochrome Reduktase. Die dritte Gruppe, die Transferasen, übertragen Gruppen von einem Molekühl zum anderen. Beispiele hierfür sind Glutamin-pyruvin-transaminase, Glutamin-oxalsäure-trans-aminase, Transmethylase, Phosphopyruvin-trans-phosphorylase.
Als Träger dienen verfügbare Oxid- oder Hydroxidgruppen aufweisende anorganische Substanzen, die im wesentlichen wasserunlöslich und schwache Säuren oder Basen sind. Sie können nach ihrer chemischen Zusammensetzung in siliziumhalt ige Substanzen und nichtsiliziumhaltige Metalloxide eingeteilt werden. Als siliziumhaltiger Träger kommt vorzugsweise Glas in Betracht, entweder in Form von Feststoffpartikeln oder als selbsttragendes Stück, wie z. B. als Scheibe oder Zylinder. Glas hat den Vorteil, dass es in seiner Abmessung stabil ist und beispielsweise durch Sterilisieren gründlich gereinigt werden kann. Als Träger geeignetes poröses Glas ist ohne weiteres verfügbar und bei Corning Glass Works unter der Codebezeichnung 7930 erhältlich. Derartiges poröses Glas kann mit verschiedenen Porendurchmessern, z. B. nach dem US-Patent 2 106 774 oder dem französischen Patent 1 534 990 hergestellt werden. Andere geeignete anorganische Träger sind kolloidale Kieselerde (SiO2), die unter dem Handelsnamen "Cab-O-Sil" erhältlich ist, ferner Wollastonit, ein in der Natur vorkommendes Ca-Silikat, sowie getrocknetes Silikagel, Bentonit usf.
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Typische, nicht siliziumhaltige Metalloxide sind z. B. Aluminiumoxid, Hydroxyapatit und Nickeloxid. Die in Frage kommenden anorganischen Träger lassen sich entsprechend der folgenden Tabelle zusammenfassen:
Siliziumhaltig Nichtsiliziumhaltige Metalloxide
Übergangsmetalle
MeO saures MeO basisches MeO
Amorph Kristallin
Glas Bentonit
Silikagel Wollastonit
Kiesel
säure
kollid
NiO -^lpO, Hydroxy
Apatit
Die als Kupplungsmittel dienenden Silane sind Molekühle mit zweifacher, verschiedener Reaktivität. Es handelt sich um organisch-funktionelle und silizium-funktionelle Siliziumverbindungen, deren Siliziumteil eine Affinität für anorganische Substanzen, z. B. Glas oder Aluminiumsilikate und deren organischer Teil eine Affinität für organische Verbindungen besitzt. Hauptaufgabe des Kupplungsmittels ist, das Enzym als organische Substanz mit dem Träger als anorganischer Substanz zu kuppeln. Theoretisch ist die mögliche Vielzahl der verwendbaren organisch-funktionellen Silane nur durch die Zahl der bekannten organisch-funktionellen Gruppen und der .zur Bindung verfügbaren Stellen am Enzymmolekül begrenzt. Als Kupplungsmittel kommen die zahlreichen Silane der folgenden generellen Formel in Betracht:
QQ9817/16A7 - 8 -
In dieser Formel bezeichnet Y1 eine Verbindung der Gruppe Amino, Carbonyl, Carboxy, Isocyano, Diazo, Isothiocyano, Nitroso, Sulfhydryl, Halocarbonyl; R1 einen Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy, Halo; und η einen ganzzahligen Wert 1-5.
Nach weiterer günstiger Ausgestaltung ist das Kupplungsmittel durch die generelle Formel Y SiR^ gekennzeichnet, du der Y eine Verbindung der Gruppe Amino, Carbonyl, Carboxy, Hydroxyphenyl und Sulfhydryl, R ein Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy und Halo, und η ein ganzzahliger Wert 1-3 ist.
Die am Leichtesten zugänglichen Kupplungsmittel besitzen die generelle Formel RCH2CH2CHp-Si(OCH,)^, in der R eine reaktive organische Gruppe darstellt, die so ausgebildet ist, dass sie der Reaktivität in dem jeweiligen System entspricht. Die möglichen Umsetzungen der organisch-funktonellen Gruppe können der Fachliteratur entnommen werden und bedürfen daher keiner näheren Erläuterung.
Einige wichtige typische Bindungen des Kupplungsmittels mit den Enzym seien beispielhaft aufgeführt.
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Art der Bindung
Amide Struktur der
Bindung		 Reaktive Gruppen
Sulfonamide 0
Il
-c - NH-		 Enzyme Kupplungsmittel
Bindungstyp S
-N-S-NH- 		-GOOH
-NH2 		-NH9
-COOH
1. Azobindung OH
I		 -NH2 S
-NH2 + ClCCl
2. Äther -n=n— y y
R-O-R Tyrosin
Histidin
Lysin		 -N2 +Cl"
3. Ester 0 -C-ONa -R-X
4. Disulfid -C-O-R
R-S-S-R -COOH -R-OH
5. R-SH R-SH
6.
Zur Auswahl der optimalen Kupplungsmittel müssen die aktiven Stellen des Enzymmoleküls berücksichtigt werden, die nach Möglichkeit freigehalten werden sollen. Das Kupplungsmittel soll die Enzymaktivität nicht wesentlich beeinträchtigen, z. B. im Falle von Trypsin durch Bindung an die Carboxyl- oder Sulfhydrylgruppe des Enzyms. Auch soll die Bindung bei das Enzym oder den Träger nicht zerstörenden Temperatur- und pH-Werten erfolgen können. Ferner soll die von dem Jeweils verwendeten Kupplungsmittel in grossem Masse abhängende Art der Bindung unter den Einsatzbedingungen stabil sein.
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- ίο -
Die Bindung des Enzyms an den Träger erfolgt als zweistufige Umsetzung. Als erste Stufe wird das Kupplungsmittel an den Träger und als zweite Stufe das Enzym an das bereits mit dem Träger verbundene Kupplungsmittel gebunden. Die Menge des gekuppelten Enzyms hängt offenbar von der zur Umsetzung' verfügbaren Oberfläche des Trägers ab. Die Enzymaktivität hängt dabei von nicht zu scharfen Kupplungsbedingungen, nicht dagegen notwendigerweise von der Struktur der aktiven Stellen ab.
Bei der Herstellung des Trägers für die Enzymbindung ist es häufig notwendig, den Träger vorzubehandeln, um verschiedene, z. B. organische Verunreinigungen zu entfernen, die die ver fügbaren Oxid- oder Hydroxidgruppen besetzen. Die Art der Reinigung hängt bis zu einem gewissen Grade vom Träger ab. Eine typische Reinigung für poröses Glas ist folgende: Ein poröses Glasmuster wird in einer verdünnten Salpetersäurelösung gereinigt, mit dest. Wasser abgespült und in Sauerstoff auf etwa 625° erhitzt.
Beim Einsatz des Kupplungsmittels in Form einer Lösung muss in geeigneter Weise die Umsetzung des silizium-funktionellen Molekülteils erreicht werden, z. B. durch Erhitzen der Lösung auf 60' - 140°. Nach bevorzugter Ausgestaltung wird das Silan in Toluol mit einer Konzentration von ca. 0,1 - 10 Gew.% gelöst und der Träger mit der Lösung vorzugsweise im Rück-
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- li -
fluss erhitzt, wobei das Toluol z. B. bei IO50 siedet. Die Rückflussdauer beträgt 1-16 Std., wobei 4- Std. in der Regel genügen.
Nach Bindung des Kupplungsmittels an den Träger kann zur Bildung gewün-schter Verbindungen der organisch-funktionelle Teil des Silans modifiziert werden. Die meisten Kupplungsmittel sind im Handel erhältlich, andere in bekannter Weise unschwer darstellbar. So kann z. B. das Diazoderivat aus /ς-Aminopropyltriäthoxysilan nach Bindung an den Träger durch Umsetzung mit p-llitrobenzoe säure, Reduktion der Nitrogruppe zum Amin und Diazotierung mit salpetriger Säure hergestellt werden. Bei gleichem Ausgangsmaterial kann z. B. das Isothiocyanoalkylsilanderivat durch Umsetzung der funktioneilen
■4
Aminogruppe mit Thiophosgen hergestellt werden.
Nunmehr wird das Enzym mit dem organisch-funktioneilen Teil des Silans umgesetzt. Zunächst wird das Enzympulver in einem Puffer gelost und geprüft. Die wässerige Enzymlösung wird dann mit dem behandelten Träger bei einer in der Regel unter Zimmertemperatur liegenden Temperatur in Kontakt gebracht. Besonders bei Proteasen liegt die Kontakttemperatur günstigerweise bei 5°> da Enzyme bei niedrigeren Temperaturen meist beständiger sind. In einigen Fällen, z; B. Glucoseoxidase wird eine raschere Kupplung dagegen bei höheren Temperaturen, vorzugsweise Zimmertemperatur, bei einer Kontaktdauer von 1-2 Std. bevorzugt.
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Nach einer Kontaktdauer von ca. 1-72 Std. ist das Enzym an den Träger gebunden und ein etwaiger Überschuss wird entfernt. Wichtig dabei ist, den pH-W.ert der Lösung in einem die irreversible Denaturierung des Enzyms vermeidenden Bereich zu halten. Die Kupplungsreaktion kann u. U. auch einen bestimmten pH-Bereich nötig machen, da z. B. die Azobindung am besten bei pH 8 - 9 "erfolgt. Im Falle von Proteasen erfolgt die Kupplung günstigerweise im pH-Bereich niederer Enzymaktivität. Anschliessend wird das gekuppelte Enzym geprüft und schliesslich an der Luft getrocknet, Jedoch nicht bis zur Exsiccation, und gelagert. Die Lagerung kann auch in Wasser oder einer gepufferten Lösung bei oder unter Zimmertemperatur erfolgen.
Das erhaltene Produkt ist ein wasserunlösliches, stabilisiertes Enzym mit lang anhaltender, konstanter Aktivität. Bei Lagerung bei 5°, oder selbst bei Zimmertemperatur, selbst für mehrere Monate, wird die konstante Aktivität selbst nach wiederholter Einwirkungen von Prüfbedingungen aufrechterhalten.
Anhand der folgenden, nicht beschränkenden Beispiele sei die Erfindung weiter erläutert.
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Beispiel I
Eine Probe von porösem Glaspulver mit 96% KieselSäuregehalt (950 Ä - 50 Ä Porengrösse, 16 m /g Oberfläche) wurde in HNO^, 0,2 N", bei 80° unter ständiger Schallbehandlung wenigstens 3 Std. lang gewaschen. Das Glas wurde mehrere Male mit dest. Wasser durch Abdekantieren nachgewaschen und dann über Nacht in Gegenwart von Op auf 625° erhitzt.
Das Glas wurde gekühlt und in eine Hasche mit rundem Boden gegeben. Je 2 g des Glases wurden 100 ml einer 10%igen Lösung von v^-Aminopropyltriäthyoxysilan in Toluol zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht im Rücklauf erhitzt und mit Azeton gewaschen. Das Endprodukt wurde an der Luft getrocknet und gelagert. Das erhaltene Derivat (nachfolgend als Aminoalkylsilanderivat bezeichnet) enthielt 0,171 meq (= milliäquivalente Teile) Silanrückstände/g Glas, ermittelt auf Grund des gesamten Stickstoffgehalts.
1 g des so behandelten Glases wurde 3j5 ml dest. Wasser mit einem Gehalt von 100 mg krist. Trypsin zugegeben und das Ganze einer Mischung von N'-Dicyclohexylcarbodiimid, 0,5 ml N, in 0,5 ml Tetrahydrofuran (TEP) beigegeben und die Umsetzungsteilnehmer über Nacht gerührt. Das Produkt wurde gründlich mit NaHOO5 Lösung, 0,001 Mol HOl und dest. Wasser gewaschen. Das unlöslich gemachte Trypsin wurde in 0,001 Mol HOl bei 5° gelagert.
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Die Hydrolyse des Benzoyl-Argininäthylesters (BAEE) wurde bei pH 8,1 in 0,1 Mol Glycin vorgenommen· Eine Aktivitätseinheit ist dabei gleich der Hydrolyse von 1 /U-Mol Substrat/ Minute bei 25° und pH 8,1.
Mehrere in dieser Weise hergestellte Proben wurden folgendermassen geprüft. 1 g des Glas-Enzympräparates wurde 50 ^l Substrat enthaltend 0,08 mg BAEE/ml Puffer zugegeben. Die Umsetzungsteilnehmer wurden mit einem Magnetrührer bewegt und alle drei Minuten eine Probe entnommen, und diese jeweils filtriert und spektral-photometrisch bei 24-7 m/u gemessen. Die durchschnittliche Änderung der optischen Dichte/Minute wurde ermittelt und die Aktivität errechnet.
Drei typische, in der beschriebenen Weise geprüfte Proben enthielten 8,5 bzw. 25»2 bzw. 12 Einheiten pro g Glas. Dies entspricht aktivem Enzym in Mikrogramm Quantitäten. Die gesamte nach diesem Verfahren gekuppelte Enzymmenge betrug 0,437 mg/g Glas, ermittelt nach dem Gesamtsticksto ff gehalt.
Beispiel II
2 g des nach Beispiel I hergestellten Aminoalkylsilanderivats von porösem Glas (780 Ä - 50 & Porengrösse) wurden mit 1 g p-nitrobenzoesäure versetzt und das Ganze 2 Tage bei Zimmertemperatur in 10%iger Lösung DCOI in absolutem Methanol ge-
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19V4418
rührt. Das -umgesetzte Material wurde gründlich, in Methanol gewaschen, 500 ml dest. Wasser enthaltend 5 g Natriumdithionit zugegeben und 30 Minuten gewaschen. Das p-Aminobenzoesäureamid des Iminoalkylsilanglases (nachfolgend als Aminoarylsilanderivat bezeichnet) wurde mit dest. Wasser gewaschen, mit Azeton nachgewaschen und an der Luft getrocknet.
Das Aminoarylsilan wurde in HGl, 0,1 N, durch Zusatz eines Überschusses von festem NaNOg bei 0° diazotiert. 1 g des Produkts (nachfolgend als Diazoarylsilan bezeichnet) wurde 14-mg krist. Trypsin in 50 ml NaHCO, Lösung zugesetzt und bei 5° über Nacht weiter umgesetzt. Anschliessend wurde das chemisch gebundene Trypsin in NaHCO, Lösung und dest. Wasser gewaschen.
Die Proben wurden im wesentlichen in der im Beispiel I beschriebenen Weise geprüft, nur enthielt das Substrat 0,08 mg BAEE/ml, gelöst in 0,07 Mol Phosphatpuffer, auf pH 7 eingestellt. Das chemisch gekuppelte Trypsin enthielt das Äquivalent von 0,189 mg aktives Enzym/g Glas. Die beibehaltene Enzymaktivität betrug 3,2% des gesamten gekuppelten Trypsins.
Eine Säule wurde bereitet und mit 1 g des chemisch gekuppelten Trypsins gefüllt. Der Durchmesser der gepackten Säule betrug 1 cm, die Länge 5 cm. Das Substrat - 0,08 mg/ml BAEE,
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gelöst in 0,07 Mol Phosphatpuffer, pH 7 - wurde durch, die Säule mit einem Durchsatz von 0,5 ml/Min, geführt, mit einer 90%igen Umwandlung des Substrats in das Produkt. Der Betrieb der Säule war kontinuierlich bei 23° - 1°» und das Produkt wurde ebenfalls kontinuierlich bei 253 nyu in. einer 1 cm Durchflusszelle gemessen.
Zum Nachweis der ZeitStabilität des chemisch gekuppelten Trypsins im Vergleich zum freien,(nicht gekuppelten)Trypsin diente ein Vergleichsversuch bei 23°. Krist. Trypsin mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml wurde in 0,07 Mol Phosphatpufferlösung gegeben. In Abständen wurden 0,05 ml Proben entnommen, 3 nil Substrat zugesetzt und auf Aktivität geprüft.
Die Vergleichsergebnisse für freies und chemisch gekuppeltes Enzym (% Aktivität als Zeitfunktion bei Zimmertemperatur) sind der graphischen Darstellung der Figur 1 zu entnehmen. Für das freie Enzym wurden dabei die Aktivitätswerte als % der ursprünglichen Aktivität des gelösten Enzyms abgetragen. In weniger als 2 Std. war die gesamte Enzymaktivität durch Autohydrolyse des freien Trypsins zerstört. Die ursprüngliche Umwandlungsrate des chemisch gekuppelten Enzyms wurde dabei willkürlich auf 100% Aktivität festgesetzt. Kein Aktivität sverlust konnte nach 154· Std. ständiger Prüfung festgestellt werden. Danach setzte ein geringer Aktivitätsverlust
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ein, jedoch "bestand erhebliche Aktivität noch nach 397 Stunden.
Beispiel III
10 g des nach dem Beispiel II hergestellten Aminoalkylsilanderivats wurden 100 ml 10% Thiophosgen in Chloroform zugesetzt und mehrere Stunden im Rücklauf erhitzt. Das Produkt wurde gründlich in Chloroform zur Entfernung der Thiophosgenrückstände gewaschen. Das Isothiocyanoalkylsilanderivat wurde an der Luft getrocknet und sofort nach der Synthese zur Kupplung an Trypsin eingesetzt.
2 g des Derivats wurden 50 ml NaHCO^ Lösung, pH 9, enthaltend 100 mg Trypsin zugesetzt, das Ganze 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und dann gründlich in dest. Wasser gewaschen. Das Produkt wurde in dest. Wasser bei 5° his zum Gebrauch gelagert. Das chemisch gekuppelte Trypsin enthielt 2,1 mg Protein,- ermittelt nach dem Gesamtstickstoffgehalt.
Das Substrat bestand aus durch Wärme denaturiertem Kasein mit einer Konzentration von 5 g/l in 0,1 Mol Phosphatpuffer, pH 7· Ig des gekuppelten Enzyms wurde 50 ml des Substrats zugesetzt. Die Mischung wurde ständig gerührt. Alle 60 Sek. wurden Proben entnommen und einem gleichen Volumen 10%iger Trichloressigsäure zugesetzt. Die Ausfällung wurde nach 15
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Minuten abfiltriert und das Filtrat spektralphotometrisch mit einem in der gleichen Weise behandelten Substrat verglichen. Das erhaltene Enzym-Glasprodukt enthielt 0,12 mg aktives Enzym/g Glas·
Beispiel IV
Das Diazoarylsilanderivat von Glas wurde entsprechend dem Beispiel II hergestellt. Das Enzym wurde durch eine Azokupplung in einer l%igen Lösung von rohem Papain gekuppelt und das gekuppelte Glas-Enzym sodann 100 ml 1% Kasein enthaltend 61,5 mg Cystein und 32 mg Dinatriumäthylendiamintetraazetat (Na2H2EDTA) in 0,1 Mol Phosphatpuffer, pH 6,9, zugesetzt. Während der Prüfung wurden 4 ml aliquote Teile entnommen, 4- ml Trichloressigsäure (TOA) zugesetzt, zentrifugiert und bei 280 m/u gemessen. Die optischen Dichten wurden mit einer TGA ausgefällten Probe des Substrats vor Kontakt mit dem Enzym verglichen. Das chemisch gekuppelte Papain enthielt 2,55 mg aktives Enzym/g Glas.
Zum Nachweis der Wärmestabilität des gebundenen Papains wurde der folgende Versuch vorgenommen.
1 g des chemisch gekuppelten Papainpräparats wurde in eine Säule gegossen und aliquote Teile des Elutionsguts ständig geprüft. Das Substrat bestand aus 3% Kasein in 0,1 Mol Phos-
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phatpuffer, pH 6,9· Während des ganzen Versuchs wurde die Säulentemperatur auf 88° gehalten- Der Durchsatz wurde auf 2,8 ml/Min, eingestellt. Das Substrat wurde kontinuierlich durch die Säule geleitet und aliquote Teile für die Prüfung durch TCA Ausfällung gesammelt. Der anfangs erhaltene Grad der Hydrolyse wurde als prozentualer Wert der Änfangsaktivität abgetragen.
Durch lösen von 50 mg in 100 ml Puffer wurde ein freies Enzym hergestellt und die Lösung auf 88° gehalten. Aliquote Teile wurden entnommen, in bekannter Weise geprüft und als prozentualer Wert der Ausgangsaktivität des Enzyms vor Wärmeeinwirkung abgetragen.
Die Figur 2 zeigt die graphische Darstellung der Ergebnisse bei hoher Temperatur (88°), und zwar die prozentuale Aktivität des freien Enzyms und des chemisch gekuppelten Enzyms als Zeitfunktion. Das freie Enzym verlor seine Aktivität sofort und war nach 30 Hin. völlig inaktiv. Demgegenüber zeigte das chemisch gekuppelte Papain keine Abnahme der Enzymaktivität nach 80 Minuten, ein klarer Beweis der verbesserten Wärmebeständigkeit.
Beispiel Y
Ein Nickelsieb mit einer Siebweite von 150 mesh, 0,1 mm äusserer Durchmesser, wurde in Streifen von 2,5^ x 12,7 cm
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geschnitten. Die Streifen wurden zu Zylindern mit einer lichten Weite von ca. 1,25 cm gerollt und festgeschweisst und zunächst 2 Std. in einem auf 700 erhitzten Ofen mit einer Sauerstoff atmosphäre gebracht, um eine FiO Schicht zu bilden.
Die mit NiO überzogenen Siebe wurden dann über Nacht in 10%iger Lösung von y-Aminopropyltriathoxysilan in Toluol im Rücklauf erhitzt. Das Aminoalkylsilanderivat wurde in Azeton gewaschen und getrocknet. Die Siebe wurden über Nacht in 10% Thiophosgen in Chloroform im Rücklauf erhitzt. Das Isothiocyanoalkylsilanderivat wurde mit Chloroform gewaschen und sofort an Glucoseoxidase gekuppelt. Das Derivat wurde einer l%igen Lösung von Glucoseoxidase in 0,1 Mol NaHCO.,, pH 9» zugesetzt und auf Zimmertemperatur "gehalten. Das Ganze wurde 2-3 Stunden gerührt, mit dest. Wasser gewaschen, und das mit NiO überzogene Sieb mit dem chemisch gekuppelten Enzym bei 5° in dest. Wasser gelagert.
Die Enzymaktivität des Produkts wurde als /ug Enzymaktivität im Vergleich zur Aktivität bekannter Mengen des lösbaren Enzyms gemessen. In allen Versuchen wurde als Substrat D-Glucoseanhydrid (Dextrose) im Konzentrationsbereich von 0,00055 - 0,055 Mol,gelöst in 0,01 Mol Phosphat, pH 6, verwendet.
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Die freie Enzymprobe wurde durch Zusatz einer aliquoten Menge von 0,5 ml, enthaltend 250 /ug gereinigter Glucoseoxidase, zu 50 ml Substrat, enthaltend 10 /ug/ml Meerrettichperoxidase und 0,0005% o-Dianisidin geprüft. Die Reagenzien wurden im Magnetrührer bewegt. Zunächst wurde zur Kontrolle eine 2 ml Probe entnommen. Sodann wurden in 1-minutigen Abständen für insgesamt 5 Minuten 2 ml Proben entnommen und in einen Tropfen HCl, 4 N, in 0,5 ml dest. Wasser enthaltende Reagenzgläser gegeben. Die Lösung wurde spektralphotometrisch bei 460 mvu gemessen. Die Versuchstemperatur betrug 23°.
Das mit NiO überzogene Sieb mit dem chemisch gekuppelten Enzym wurde in entsprechender Weise geprüft, wobei jedoch äquivalente Mengen Peroxidase und o-Dianisidin in 0,5 ml Volumenfceilen in die Reagenzgläser gegeben wurden, um eine Adsorption des o-Dianisidins auf dem Sieb zu verhindern. Jedes Reagenzglas wurde zur Entwicklung des Ansatzes vor Zusatz der HCl 1-3 Minuten stehen gelassen.
A. ZeitStabilitätsversuch.
Proben des chemisch gekuppelten Enzyms wurden bei 4° gelagert und während einer 6-Monate währenden Versuchsdauer geprüft. Die folgende Tabelle verzeichnet die Ergebnisse.
- 22 -
009117/1St1I
Prüfung /Ug Enzymaktivität % der Ausgangs
aktivität
Beginn 375 -
Nach 7 Tagen 375 100%
Nach 14 Tagen 300 80%
Nach 21 Tagen 225 60%
Nach 28 Tagen 225 60%
Nach 128 Tagen 225 53%
Die Versuche zeigen deutlich die langanhaltende Stabilität des gekuppelten Enzyms.
B. Wärmestabilitätsversuch.
Die Figur 3 zeigt die thermische Stabilität der chemisch gekuppelten Glucoseoxidaseim Vergleich zum freien Enzym. Das gebundene Enzym wurde 50 ml Substrat bei der gewünschten Temperatur zugesetzt und geprüft. Nach der Prüfung wurde die Probe bei der nächsthöheren Temperatur geprüft. Durch dieses Vergeben wird die Einwirkungsdauer der höheren Temperaturen akkumuliert. Infolgedessen kann der tatsächliche Aktiyitätsunt er schied (basierend auf /ug des aktiven, gebundenen Enzyms) zwischen dem freien und dem gebundenen Enzym grosser sein. Die Ergebnisse sind also als Mindestwerte aufzufassen.
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Für das chemisch gekuppelte Enzym ist also eine verbesserte Wärmebeständigkeit erreicht. Bei 33° ist sogar eine Aktivitätszunahme des gebundenen Enzyms festzustellen, -während die Aktivität des freien Enzyms abgenommen hat. Zur Annäherung an den Aktivitätswert des chemisch gekuppelten Enzyms wurde ein freies Enzym mit 480 /ug Glucoseoxidase verwendet. Das gelöste Enzym einer Temperatur von 23 wurde der erwärmten Pufferlösung "bei jeder der angegebenen Temperaturen zugesetzt. Die Aktivität sank sofort nach Einwirkung zunehmender Temperaturen.
Die Ergebnisse zeigen also klar die verbesserte Wärmebeständigkeit des chemisch gekuppelten Enzyms (Glucoseoxidase) im "Vergleich zum freien Enzym.
Beispiele VI-XVIII
Es wurde im Wesentlichen nach den Beispielen II und III vorgegangen, um verschiedene Enzyme mit einer Reihe von typischen anorganischen Trägern zu kuppeln. In der folgenden Tabelle ist das Ausgangsmaterial, insbesondere das Enzym, der Träger, und das Kupplungsmittel in den Spalten 2, 3 und 4- verzeichnet. Das Kupplungsmittel ist mit grossen Buchstaben angegeben, wobei B das Diazoarylailanderivat (wie im Beispiel II näher -erläutert) und 0 das Isothiocyanoalkylsilanderivat (vgl. Beispiel III) bezeichnet. Die Aktivitätswerte der chemisch gekuppelten Enzyme sind bei Verwendung des Substrats der Spalte 5 in der Spalte 6 wiedergegeben.
009817/1647 -^-
gekuppel
tes Enzym		 - 24 - ' Kupplungs
mittel		 1944 418
Beispiel Papain anorgani
scher Träger		 C Substrat Pro"ben-
aktivi-
tät
mg/g;
VI alkali
sche Pro
tease		 poröses Glas σ Kasein 1,5
VII Ficin kolloidale
Kieselsäure		 B Kasein 92,0
VIII Ficin poröses Glas C Kasein 0,9
IX Urease poröses Glas B Kasein 2,7
X alkali
sche
Phosphate		 poröses Glas B Urea 1,0
XI Glucose
Oxidase		 poröses Glas B p-ITitro-
phenyl-
phosphat		 0,7
XII Glucose
Oxidase		 poröses Glas σ Dextrose 10,1
XIII Glucose
Oxidase		 poröses Glas C Dextrose 11,8
XIV Glucose
Oxidase		 kolloidale
Kieselsäure		 σ Dextrose 24,0
XV Glucose
Oxidase		 Aluminium
oxid		 σ Dextrose 6,0
XVI Peroxi-
dase		 Hydroxy-
apatit		 B Dextrose 10,7
XVII Peroxi-
dase		 poröses Glas σ Wasser
stoff
peroxid		 1,0
XVIII Nickeloxid Wasser
stoff
peroxid		 0,5
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Claims (1)

  1. Patentansprüche
    1. Stabilisiertes, in Wasser unlösliches Enzympräparat, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym an einen anorganischen, freie Hydroxyl- oder Oxidgruppen aufweisenden Träger vermittels eines Silankupplungsmittels kovalent gebunden ist, wobei der Siliziumteil des SilanmoleküTs an den Träger und der organische Teil an das Enzym gebunden ist.
    2. Enzympräparat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Silan an das Enzym entsprechend der Formel
    Enzyme -Z- Silan
    gebunden ist, worin Z eine der folgenden Gruppen bezeichnet:
    OH
    OHS · 0
    -S-N-, -IT-C-KH-, -N=N-(Mj, -σ-0-0-, -S-O-C-, und -C-S-S-G-.
    J. Enzympräparat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Silankupplungsmittel die allgemeine Formel aufweist
    in der T ein Amino, Carbonyl, Carboxy, Hydrophenyl, oder Sulfhydryl, R einen Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy und Halo bezeichnet, und η einen ganzzahligen Wert von 1-3 darstellt.
    QQ3S17/1647
    4. Enzympräparat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Silankupplungsmittel die allgemeine Formel
    aufweist, in der Y1 ein Amino, Carbonyl, Carboxy, Isocyano, Diazo, Isothiocyano, Nitroso, Sulfhydryl oder Halοcarbonyl, R einen Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy, und Halo, R1 einen Rest der Gruppe niederes Alkyl, niederes Alkylphenyi, P und Phenyl bezeichnet, und η einen ganzzahligen Wert von 1-3 darstellt.
    5- Enzympräparat gemäss irgend einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus einem siliziumhaltigen Material, z. B. amorphem oder kristallinem wenigstens 50 Mol% Kieselsäure enthaltendem Material, porösem Glas, kolloidaler Kieselsäure, Bentonit, Wollastonit oder dergleichen besteht.
    6. Enzympräparat gemäss irgend einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus einem nicht siliziumhaltigen Metalloxid, z. B. dem Oxid eines Übergangsmetalls, Nickeloxid, Aluminiumoxid, einer schwachen Säure oder Base, Hydroxyapatit oder dergleichen besteht.
    QQ1817/1647
    7. Enzympräparat gemäss irgend einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ein hydrolytisches Enzym, z. B. Urease, Asparaginase, alkalische Phosphatase, Protease, ζ. B. Trypsin, Papain, licin, Bacillus subtilis, alkalische Protease oder ein Redoxenzym, z. B. Glucoseoxidase, Peroxidase, Transferase oder dergleichen ist.
    8. Verfahren zur Herstellung des Enzympräparats gemäss Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Kupplungsmittel zunächst an den Träger und sodann an diese das Enzym gebunden wird.
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    ze
    Leerseite
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