DE1598049A1

DE1598049A1 - Verfahren und Vorrichtung zur technischen Durchfuehrung der Saeulenchromatographie

Info

Publication number: DE1598049A1
Application number: DE19651598049
Authority: DE
Inventors: Stoeck Dr-Ing Georg; Dr Rer Nat Karl Lauer
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1965-06-03
Filing date: 1965-06-03
Publication date: 1969-12-11
Also published as: AT266049B; BE817880Q; FI41876C; US3539505A; SE338187B; GB1075920A; DE1598049B2; CH462116A; NL6607638A; FR1481755A; JPS5110115B1; NL149603B; FI41876B

Description

Verfahren und Vorrichtung zur technischen Durchführung der

Die Säulenchromatographie ist in den letzten Jahren zu einer geläufigen Laboratoriumsmethode zum Reinigen und Trennen von Substanzen geworden. Beim Versuch, diese Methodik in den technischen Maßstab zu übertragen, treten eine Reihe von Schwierigkeiten auf, die bisher die Rentabilität und die Durchführbarkeit der technischen Säulenchromatographie in Präge stellen. Besonders grosse Schwierigkeiten bereitet mit wachsender Länge und Durchmesser der Säulen das "Schieflaufen" der Fronten, was zu einer schlechten Ausnutzung der Säulenkapazität führt und insbesondere bei geringen Trennfaktoren technische Trennungen unmöglich macht.

Das "Schieflaufen" der Fronten ist auf die verschiedensten Faktoren zurückzuführen, wie z.B. ungleichmässige Füllung der Säule, Temperatur-, Viskositätsund Volumenschwankungen, Kanalbildung, Randgängigkeit etc. Dieses "Sohieflaufen" lässt sich erfahrungsgemäss auch bei noch so sorgfältigem Arbeiten nicht vermeiden. Während also im Idealfall das Konzentrations/Zeit-Diagramm eines Stoffes, der eine Chromatographiesäule durchlaufen hat, eine mehr oder weniger steile Gauß'sche Glockenkurve darstellt, sind bei technischen Säulen diese Diagramme zu völlig ungleichmässigen, lang gezogenen Gebilden entartet.

Eb wurde nun gefunden, daß man die Störungen, die bei technischen Chromatographie-Säulen durch das "Schieflaufen" der Fronten entstehen, beseitigen kann, wenn man die achsial wandernde Flüssigkeit in gewissen Abständen auf

-2-

9 0 9 8 5 0/1229 BAD

engem Raum radial durchmischt. Konzentrations/Zeit-Diagranune von Stoffen, die eine derartig modifizierte Säule durchlaufen haben, stellen nahezu ideale, steile Gauß'sche Glockenkurven dar. Man findet also die Trenn- und Reinigungseffekte, die bei den wesentlich kleiner dimensionierten Chromatographiesäulen des Laboratoriums beobachtet werden, bei dem erfindungsgemässen Verfahren auch im technischen Mr. atab.

Dieses Ergebnis war nicht vorherzusehen^ weil an sich jede radiale Vermischung zwangsläufig mit einer achsialen Vermischung (Rückvermischung) verbunden ist; diese Rückvermischung bewirkt generell eine Verschlechterung der Trennleistung von Säulen und führt obendrein zu einer Verflachung der Konzentrations/Zeit-Diagramme. Normalerweise versucht man also, Rückvermischungen zu vermeiden oder so klein wie möglich zu halten. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren führt jedoch die in gewissen Abständen vorgenommene radiale Vermischung überraschenderweise zu einer Frontbegradigung und damit zu einer derartigen Leistungssteigerung der Säule, daß die Rückvermischungseffekte nicht mehr ins Gewicht fallen.

Die Abstände, in denen bei dem erfindungsgemässen Verfahren die radialen Vermischungen durchgeführt werden sollen, sind in erster Linie abhängig vom Säulendurchmesser; aber auch die Art und Korngrösse des Adsorptionsmittels , die Durchflussgeschwindigkeit der flüssigen Phase und die spezifischen Trenafaktoren sind von Bedeutung. In der Praxis wird man die optimalen Abstände jeweils empirisch bestimmen. Sind die Abstände zwischen je zwei Mischzonen zu gross, so können immer noch Störungen durch "Schieflaufen" der Fronten auftreten; sind die Abstände hingegen zu klein, so verflachen die Elutionskurven merklich, insbesondere wenn das Volumen der Mischzonen im Verhältnis zum Volumen der Trennzonen zu gross wird. Gute Ergebnisse werden bei Abständen zwischen dem drei- bis fünfzehnfachen Durchmesser der Säule gefunden.

-3-

90985 0/1229

Zur Durchführung dee erfindungsgemässen Verfahrens baut man in die Säule in gewissen Abstände;! je zwei Siebplatten (S) ein, 7wißchen denen eine radiale Vermischung des Elutionsmittels stattfinden kann. Durch die Siebplatten wird das Adsorptionsmittel aus der Mischzone ferngehalten und daa Elutionsmittel kann naoh erfolgter Durchmischung durch die untere Siebplatte gleichmassig verteilt wieder in die nächste Trennzone der Säule eintreten.

Im einfachsten Fall genügt die Vermischung, die selbsttätig in einem solchen Raum zwischen zwei Siebplatten eintritt. Bei grösseren Säulendurchmessern istfdiese freiwillige radiale Vermischung nicht mehr ausreichend. Es empfiehlt sich daher, zwischen den Siebplatten eine Vorrichtung einzubauer, die eine gründliche Zwangsvertnischung der Flüssigkeit innerhalb des Zwischenraumes gewährleistet. Als Mischvorrichtungen kommen mechanisch angetriebene Rührer, Magnetrührer, Vibratoren, Ultraschall etc. in Frage, wobei natürlich die Dimensionen und das Baumaterial der Säule die Auswahl der möglichen und optimalen Mischvorrichtung bestimmen. In der Praxis hat sich der Einbau einer Zentrierplatte (j) zwischen den Siebplatten (S) besonders bewährt, da hierbei mit konstruktiv einfachen, wartungsfreien Mitteln eine gründliche, radiale Vermischung gewährleistet wird. Bei sehr groesen Säulendurchmessern empfiehlt es sich,, unterhalb der Zentrierplatte noch einen Verteilerkopf zu montieren.

Eine radiale Vermischung kann auch (mit oder ohne zusätzliche Zentrierplatte) dadurch herbeigeführt werden, dass die Löcher der Siebplatte nicht achsenparallel gebohrt werden, sondern schräg zur Achse, so dass der durch die Löcher durchtretende Flüssigkeitsstrom eine Rotationsrichtung um die Achse erhält. Beiieatsprechender Dicke der Siebplatte und genügender Schräge der Bohrungen wird durch die Rotation der Flüssigkeitssäule zwischen den beiden Siebplat-fcen eine ausreichend© Vermischung und gleichmässige Auftragung über den ganzen Bereich der unteren Siebplatte gewährleistet.

-4,

BADOHIGlNAt. 9098BQ/122t

Der Einbau der Siebplatten in die Säule kann durch Einflanschen erfolgen; es hat sich aber als besonders vorteilhaft erwiesen, nur eine lange Säuleneinheit zu verwenden und in diese anmehreren Stellen eine achsial verschiebbare Kombination aus zwei Siebplatten und einer Zentrierplatte einzupassen, wobei die Fixierung durch eine Runddichtung (4) erfolgt. Die beiden Siebplatten und die Zentrierplatte werden dabei gegebenenfalls mit einem oder zwei Distanzringen (5)» deren äusserer Durchmesser etwas kleiner als die lichte Weite der Säule ist, zu einem Bauelement vereinigt. Diese bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung kann nun an beliebigen Stellen variabel in die Säulen eingepasst werden. Eine einmal installierte Säule lässt sich in dieser Weise schnell und einfach auf die jeweiligen Bedingungen, die eich aus der Art des Adsorptionsmittel, der Durchflussgeschwindigkeit usw. ergeben, umetell#n , so daß man stete unter optimalen Bedingungen arbeiten kann. Bei Verwendung von stark quellenden und je nach Beladungsgrad stark "atmenden" Säulenfüllungen (beispielsweise Ionenaustauschern) empfiehlt es sich sogar, die quetschbaren Runddichtungen nur so weit anzuziehen, daß Adsorptionsmittel und Elutionsflüssigkeit nicht mehr am Rande vorbeiströmen können» Das oben genannte Bauelement kann dann der "Atmung" der Säulenfüllung durch achsiale Bewegung leicht folgen.

Die Siebplatten bestehen im allgemeinen aus einer Lochplatte (i)t die mit einem feinen, gegen das.Elutionsmittel beständigen Metall- oder Kunststoff» netz (2) überzogen ist. Die Löcher in der Platte müssen ausreichend gross sein, damit das Elutionsmittel ohne grossen Widerstand hindurchtreten kann, dürfen aber nicht zu gross sein, damit die Netzgewebe nicht zu stark mechanisch beansprucht werden. Bohrweiten von 2 bis 15 mm, vorzugsweise 5»-6 mm haben sich bewährt. Stärke und Maschenweite der zu verwendenden Netze hängen von der Korngrösse des verwendeten Adsorptionsmittels ab und können dementsprechend

-5-

909850/1229

weitgehend variiert werden. Maachenweiten von 0,02 bis 1 mm, vorzugsweise 0,1 bis 0,2 mm, wurden mit Erfolg eingesetzt. Stets müssen jedenfalls die Dimensionen von Lochplatte, Bohrlöchern und Netzen so gewählt werden, daß weder das Adsorptionsmittel hindurchtreten kann, noch die Siebplatten verstopft werden; außerdem muss natürlich die Siebplatte als Ganzes der Druckbelastung der Säulenfüllung einschlieaslich Spüldruck ohne Durchbiegen standhalten.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren können im Prinzip alle bislang nur im Laboratoriumsmaßatab durchführbaren Reinigungen und Trennungen mit Hilfe der Säulenchromatographie grosstechnisch durchgeführt werden, wobei als Säulenfüllung die üblichen Adsorptionsmlttel wie Kieselsäuren, Aluminiumoxyde, Zellulosepulver, Aktivkohle, Kreide sowie die verschiedenen Arten von Anionen- und Kationen-austauschern in Frage kommen.

In den nachfolgenden Beispielen ist die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens näher erläutert. Durch Vergleichsversuche wird weiterhin die Überlegenheit des neuen Verfahrens gegenüber dem herkömmlichen Arbeiten bewiesen, und an Hand einer Zeichnung (Fig. 1) wird eine bevorzugte AusführungÄ-form der erfindungegemässen Vorrichtung aufgezeigt.

W 3 Säulenwand .

SP= Säulenfüllung

1 - Lochplatten Ί

2 . Netzgewebe ) Siebplatte «S«

3 = Zentrierplatte

4 = Runddichtung

5 = Distanzring

Fig. 1a und 1b zeigen weitere Ausführungsformen der Zentrierplatte 3·

-6-

8AD ORIQiNAL 909850/ 1 229

Beispiel 1

■ν

a) Eine Chromatographie-Säule von 8 m Höhe und 15C mm lichter Weite wird mit einen Kationenaustauscher in der H -Form ("Dowex ·}Ο Wx 4") mit Wasser eingeschlämmt. Nach jeweils 1 m Austauscherhöhe wird eine Vorrichtung eingepasst, die aus zwei mit einem Kunststoffnetz 2 (Polyvinylidenchlorid oder Polypropylen; Maschenweite 0,1 mm) überzogenen Lochplatten I^ (145 mm lurchmesaer; Bohrlöcher 6 l.~ Durchmesser), einer Zentrierplatte ^ (145 mm Durchmesser)_; einem Distanzring _5_ (145 mm Durchmesser, 60 mm Höhe) und einer Runddichtung 4, besteht (vgl. Fig. 1). Beim Einschlämmen ist darauf zu achten, daß der Austauscher etets mit Wasser bedeckt ist und keine Luftblasen ein3chliesst. 2 Ltr. einer wässrigen Farbstofflösung (hochnxlekularer Farbstoff auf Polydextran-Basis, der vom Ionenaustauscher nicht irreversibel gebunden wird und unter dem Handelsnamen "Blue Dextran 2000" bekannt ist) wird auf die Säule aufgetragen und mit einer Geschwindigkeit von 18-20 Ltr/Std· ^i* Wasser eluiert. Die am unteren Säulenende austretenden Fraktionen werden fortlaufend photcmetrisch auf ihren Farbstoffgehalt untersucht- Die Vierte 3ind in einem Konzentrations/Zeit-Diagramm eingetragen und zeigen den Verlauf einer nahezu idealen Gauß'sehen Glockenkurve (Fig. 2, Diagramm I, Kurve A).

b) Vergleichsversucli

Die gleiche Säule wie unter a) beschrieben wird mit demselben Ionenaustauscher beschickt, jedoch chne Einfügung der erfindungsgemäesen Vorrichtung. Die gleiche Menge Farbstoff wird unter identischen Bedingungen mit V/asser eluiert und der Farbstoffgehalt der austretenden Fraktionen in das gleiche Diagramm eingetragen (Fig. 2, Diagramm I, Kurve B).

Aus dem Diagramm ist ersichtlich, daß beim herkömmlichen Arbeiten durch die schieflaufenden Fronten der Farbstoff nur sehr ungleichmässig au3 der Säule

-T-

9 0 9 8 5 0/1229

wird, während durch das gelegentliche radiale Vermischen gemäss vorliegender Erfindung dieser Fehler behoben wird.

Beispiel 2

a) Eine mit einem Heizmantel umschlossene Austauschersäule von θ m Höhe und 150mm lichter Weite wird mit einen Kationenaustauscher in der Calcium-Förm ("Dowex 5CWx 4") beladen, wobei wiederum nach jeweils 1 m Säulenfüllung eine Vorrichtung gemäss Beispiel 1a eingefügt wird. Im Gegensatz zum Bei« spiel 1 werden aber die Runddichtungen nur soweit angezogen, daß jedes Bauelement sich noch achsial in der Säule verschieben kann. Die Säule wird »it thermostatisiertem Wasge-r auf 60⁰C aufgeheizt und mit 10 Ltr- 40 $iger wässriger Glukoeelösung beladen· Mit einer Geschwindigkeit von 18-20 Ltr,/ E"td. wird mit 60 warmem Walser eluiert. Die am unteren Säulenende aus- \ .tenden zuckerhaltigen Fraktionen werden analysiert. Die Werte sind in einem Kongentrfttions/geit»Bi&g?*&mm eingetragen und zeigen den nahezu idealen Verlauf ein©? Gsua'pehcm Sl©§kenleu.rve (Fig. 2, Diagram« II, 'Kur?© ä) ,

b) Ve£gl_ei

Unter den gleichen Bedingungen wt§ im Beispiel 2a beschrieben» wird über eine 60 warm© Ienenaujtiau§Qhtr*>Säuli geschickt, ohne, daß die oben genannten Verrichtung en tinfefügt wartn, Sie Analvsenwert© äer den zuckerhaltigen Fraktionen giud in du gleiche Diagram» (Fig, 2, gramm II, Kurvt B) eingetragen.

Aus dem Diagramm ist ereichtlioh, 4»ß ohne die erfindunggfiPÄSien tungen der Zucker völlig uagleiahalgsig aus der Säule austritt» was »uf schieflaufende Fronten zujiiekisufühygn ist.

909850/1229

Beispiel 3

a) Auf die gemäse Beispiel 2a vorbereitete, geheizte Austauechere äule werden 10 Ltr. einer 50 folgen Invertzuokerlöeung gegeben und mit warmem Wasser eluiert. Die auetretenden Fraktionen werden getrennt auf Glucose und Fructose untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 2, Diagramm III (Kurven AG und AF) eingetragen.

Wie aus dem Diagramm ersichtlich ist, werden Glucose und Fructose weitgehend voneinander getrennt; beide Elutionskurven zeigen die Gauß'sche Glockenform.

fc) Vergleichsversuch

Beim Versuch, 10 Ltr. Invertzuckerlöeung analog Beispiel 5 & an einer Ionenaustauschersäule, jedoch ohne die oben beschriebene Vorrichtung, aufzutrennen, treten die beiden Zucker völlig ungleichmässig und wesentlich schlechter voneinander getrennt aus dem Säulenende aus (Fig. 2, Diagramm III, Kurven BG und BF),

—9—

909850/ 1 229

Claims

Patentansprüche

1.) Verfahren fur technischen Durchführung der Säulenchromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß man die achsial wandernde Flüssigkeit in gewissen abständen auf engem Baum radial durchmischt.

2.) Verfahren gemäse Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die radiale Durohmischung zwischen je zwei in die Säule eingebauten Siebplattem durchführt*

5«) Verfahren gemäss Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei Siebplatten - gegebenenfalls mit einer geeigneten Mischvorrichtungzu einem gesonderten Bauelement kombiniert sind.

4·) Vorrichtung z-uor Buchführung des Verfahrens gemäss Ansprüchen 1-3, bestehend aus zwei Siebplatten, die einen die radiale Durchmischung gewährleistenden Zwischenraum umaohliessen, welcher gegebenenfalls eine geeignete Mischvorrichtung enthält.

5.) Vorrichtung geaäes Anspruch 4, bestehend aus zwei Siebplatten, zwischen denen eine Zentrierplatte angeordnet ist.

6.) Vorrichtung gemäes Ansprüchen 4 und/ 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kombination aus Siebplatten und Zentrierplatte mit einer Runddichtung gegen die Bäulenwand abgedichtet ist.

7·) Vorrichtung gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kunddichtung verstellbar ist.