DE1272591B - Reagens zur Bestimmung von Human-chorion-gonadotropin - Google Patents

Reagens zur Bestimmung von Human-chorion-gonadotropin

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DE1272591B DEW33782A DEW0033782A DE1272591B DE 1272591 B DE1272591 B DE 1272591B DE W33782 A DEW33782 A DE W33782A DE W0033782 A DEW0033782 A DE W0033782A DE 1272591 B DE1272591 B DE 1272591B
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Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
DEUTSCHES
PATENTAMT
AUSLEGESCHRIFT
Int. CL:
GOIn
Deutsche KI.: 421-3/54
Nummer: 1272591
Aktenzeichen: P 12 72 591.6-52 (W 33782)
Anmeldetag: 25. Januar 1963
Auslegetag: 11. Juli 1968
Diese Erfindung betrifft ein immunologisches Reagens für die Ermittlung und Bestimmung von Humanchorion-gonadotropin (weiterhin HCG bezeichnet) mit HCG-sensitivierten roten Blutkörperchen von Säugern zur Diagnose der Schwangerschaft.
Die Schwangerschaft kann durch Ermitteln und Bestimmen von HCG in Urin, in welchem es während der Schwangerschaft auftritt, während es andererseits normalerweise abwesend ist, diagnostiziert werden (Acta Endocrinologica, Bd. 35, 1960, S. 261 bis 267). Wegen der antigenen Eigenschaften von HCG kann der Test auf immunologischem Wege unter Verwendung von HCG-Antikörper und durch Beobachten der Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt werden (belgische Patentschriften 605 826 und 610 085).
Hierbei wird die immunologische Reaktion in Gegenwart einer Suspension von HCG-sensitivierten roten Blutkörperchen von Säugern durchgeführt, wobei eine äquivalente Menge HCG-Antikörper (eine Menge, welche gerade ausreicht, die vollkommene Agglutination der sensitivierten Zellen in Abwesenheit von irgendwelchem zusätzlichem HCG zu bewirken) verwendet wird. Wenn eine ausreichende Menge HCG in der Urinprobe vorhanden ist, werden die sensitivierten Zellen nicht agglutiniert. Die Konzentration von HCG in dem Urin kann durch eine Verdünnungsreihe des Urins und durch Auffinden der größten Verdünnung, welche noch die Agglutination verhindert, bestimmt werden.
Um die sensitivierten Zellen herzustellen, werden frische rote Blutkörperchen von Säugetieren mit einem Aldehyd und einem Bindemittel und mit HCG behandelt. Die Zellen von Schafen sind geeignet, jedoch können Zellen anderer Spezien, einschließlich Rind, Pferd, Kaninchen und Menschen, verwendet werden. Der Aldehyd ist üblicherweise Formaldehyd, obgleich andere Aldehyde, wie Acetaldehyd oder Pyrualdehyd, verwendet werden können. Als Bindemittel kann Gerbsäure (belgische Patentschrift 605 826), Bis-diazobenzidin (belgische Patentschrift 610 085), l,3-Difluor-4,6-dinitrobenzol oder irgendein anderes in gleicher Weise bifunktionelles Reagens verwendet werden. Sensitivierte Zellen hoher Qualität können durch Behandeln der frischen Zellen in einem Arbeitsgang mit einem Hydrochinon und Formaldehyd und dann durch Sensitivieren derselben mit HCG hergestellt werden.
Die sensitivierten Zellen und das Antiserum werden für die Schwangerschaftsbestimmung üblicherweise gefriergetrocknet, entweder getrennt oder zusammen in äquivalenten Mengen angeboten. Ein wasserlöslicher Aufnahmestoff (meist ein Zucker wie Saccharose) Reagens zur Bestimmung von
Human-chorion-gonadotropin
Anmelder:
The Wellcome Foundation Limited, London
Vertreter:
Dr. M. Eule, Dr. W. Berg
und Dipl.-Ing. O. Stapf, Patentanwälte,
8000 München 2, Hilblestr. 20
Als Erfinder benannt:
Arthur James Fulthorpe, London
Beanspruchte Priorität:
Großbritannien vom 5. Februar 1962 (4435),
vom 6. Juni 1962 (21 976)
wird verwendet, um die Unversehrtheit der Zellen während der Gefriertrocknung zu erhalten und deren Wiederdispergieren in wäßrigem Medium zu unterstützen. Vor der Verwendung werden die gefriergetrockneten Zubereitungen in dem wäßrigen Medium, in welchem der Test durchgeführt wird, wieder aufbereitet. Das gleiche Medium wird verwendet, um den Urin für den Test zu verdünnen.
Der Test wird vorzugsweise unter leicht alkalischen Bedingungen durchgeführt. Unter diesen Bedingungen neigen jedoch verschiedene Urinproben zur Bildung einer Ausfällung, welche den Test beeinträchtigen kann. Die Ursache der Störung ist möglicherweise das im Urin enthaltene Calcium, welches unlösliche Phosphatkomplexe zu bilden vermag. Unter diesen Umständen wird die Durchführung des Testes in einem Phosphatpuffer, wie dies z. B. in der belgischen Patentschrift 605 826 oder in Acta Endocrinologica, 35, S. 261 bis 267 (1960), beschrieben ist, spürbar gestört.
Es wurde nunmehr gefunden, daß ausgezeichnete Ergebnisse dann erhalten werden, wenn mit einem Boratpuffer gearbeitet wird. Der Boratpuffer kann in der vorausbestimmten Menge in Form einer Tablette konfektioniert sein, um dann in einem vorausbestimmten Wasservolumen gelöst zu werden. Solche Tabletten können nach bekannten Verfahren gege-
809 569/270
3 4
benenfalls unter Zugabe irgendwelcher tabletten- Schwangerschaftstest durchzuführen. Die Lösung bildenden Stoffe hergestellt werden. wurde ebenso verwendet, um Verdünnungsreihen des
Es ist vorteilhaft, einen Boratpuffei während der untersuchten Urins herzustellen.
Herstellung und dem Gefriertrocknen der sensitivierten
Zellen zu verwenden. Darüber hinaus ist ein gege- 5 Beispiel4
benenfalls in der sensitivierten Zellsuspension vorhandener Boratpuffer in dem Testmedium verfügbar. Reagens für die Schwangerschaftsuntersuchung
Die Erfindung betrifft also ein immunologisches Frische rote Blutkörperchen von Schafen wurden
Reagens für die Ermittlung und Bestimmung von dreima* mit 20 Volumen physiologischer Kochsalz-Human-chorion-gonadotropion (HCG) mit HCG- io lösung gewaschen und eine l°/oige Suspension in sensitivierten roten Blutkörperchen von Säugern, 5%iger Natriumchloridlösung hergestellt. Zu 10VoIuwelches erfindungsgemäß einen Boratpuffer enthält. men dieser Suspension wurde 1 Volumen Form-Die Herstellung des Reagens erfolgt vorzugsweise aldehyd (40°/0ige Gew./Vol. Formaldehydlösung) durch Gefriertrocknung der HCG-sensitivierten Zellen zugegeben. Das Gemisch wurde 18 Stünden lang bei und der äquivalenten Menge HCG-Antikörper, 15 Zimmertemperatur stehengelassen. Die Zellen wurden gegebenenfalls in Gegenwart eines Gefriertrockmmgs- dann dreimal mit 20 Volumen Borat-Succinat-Puffer Aufnahmestoffs. ' gewaschen, um den Überschuß von Natriumchlorid
Der Boratpuffer wird meist durch Mischen, eines und Formaldehyd zu entfernen. Die Zellen wurden Alkalimetallboiats und einer Säure hergestellt. Bor- in Borat-Succinat-Puffer enthaltendem 0,08°/0igem säure oder eine andere Säure, welche Borsäure zum 20 Formaldehyd als einem Konservierungsmittel wieder Teil in dem Alkalimetallborat ersetzt, kann verwendet suspendiert und wurden dann bei 0 bis 4° C zur Verwerden. Wenn eine andere Säure verwendet wird, Wendung, sofern erforderlich, gelagert,
ist es üblicherweise eine Karbonsäure, wie Bernstein- Die Formaldehyd behandelten Zellen wurden drei-
oder Zitronensäure, welche selbst etwas Pufferwirkung mal mit 20 Volumen Borat-Succinat-Puffer gewaschen besitzt. Für die Herstellung von Boratpuffertabletten ag und wieder in l°/oige Suspension in Edetatpuffer ist Borsäure oder eine feste Karbonsäure erforderlich. - (0,05 Mol Dinatriumdihydrogenäthylendiamintetra-
acetat auf pH 8,4 durch Zugabe von 2n-Natrium-Beispiel 1 hydroxyd gebracht) gebracht. Die Suspension (11)
n~ + c - · +ο«· an wurde auf 37?C erwärmt und 5 ml einer 2°/0igen
Borat-Succmat-Puöer pH 7,5 T.. Λ ~ ■>-..« ., ,- ,. ·. -. , · rJ"
• F ·--' 30 Losung von l,3-Difluor-4,6-dinitrobenzol m Dioxan
Natriumborat Na2B4O7-IOH2O (95,5 g) und Na- zugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang triumchlorid (37,5 g) wurden in destilliertem Wasser unter gelegentlichem Rühren bei 37° C gehalten. Die (51) gelöst. Bernsteinsäure (23,6 g) und Natrium- Zellen wurden dann abzentiifugiert und in 200 ml chlorid (30,0 g) wurden in destilliertem Wasser (41) Edetatpuffer wieder in Suspension gebracht. Gereiniggelöst. Gleiche Volumen der beiden Lösungen wurden 35 tes HCG, 3500 internationale Einheiten in 3 ml Edetatgemischt und das pH auf 7,5 durch Zugabe eines puffer wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei kleinen Volumens von Natriumboratlösung einge- 37° C IVa Stunden lang unter gelegentlichem Rühren stellt. ausgebrütet. Die Zellen wurden dann viermal mit
100 Volumen Borat-Succinat-Puffer gewaschen.
Beispiel2 40 Die sensitivierten Zellen wurden wieder in 100 ml
τ, t ff _ TTool·.· s 3 Borat-Succinat-Puffer, welcher 10% Gew./Volum,
tforatputter pH 8,z bis «,J Saccharose enthielt, suspendiert. Hierzu wurde 80 ml
Ein Gemisch von Natriumborat Na2B4O7' 10H2O Borat-Succinat-Puffer und 20 ml Kaninchenserum (3,0 g), Borsäure H3BO3 (4,4 g) und Natriumchlorid zugegeben, welches letztere ausreichend Gegenkörper (7,6 g) wurde in destilliertem Wasser (11) gelöst. 45 enthielt gegenüber HCG, um vollkommene Agglutination der sensitivierten Zellen zu verursachen. Das
Beispiel 3 zugegebene Kaninchenserum bestand aus der erforder-
liehen Menge (bestimmt durch Errechnung aus dem
Boratpurtertabletten Antikörpertiter) eines Antiserums, erhalten aus Kanin-
Tabletten, wobei jede Natriumborat Na2B4O7 · 50 chen, welche mit gereinigtem HCG zur Bildung ange-10H2O (86 mg), Borsäure H3BO3 (80 mg), Natrium- regt wurden, zusätzlich einer Menge von normalem chlorid (150 mg) und Milchzucker (92 mg) enthielt, Kaninchenserum, um die Gesamtmenge auf 20 ml wurden wie folgt hergestellt. Die feinverteilten Be- zu bringen.
standteile wurden in den gewünschten Anteilen ge- Die agglutinierte Suspension wurde in 1-ml-Mengen
mischt. Das Gemisch wurde mit wäßrigem Alkohol 55 in 5-ml-Ampullen aufgeteilt und in üblicher Weise granuliert. Die weichen Granulate wurden durch ein kältegetrocknet.
Sieb mit einer Öffnungsgröße von 965 μ gesiebt, bei
50°C getrocknet und erneut durch ein Sieb einer Beispiel 5
Offhungsgröße von 965 μ gesiebt. Etwas Borsäure _ „.. „ , , . ,
wurde als Gleitmittel zugegeben und das Gemisch in 60 ReaSens fur Schwangerschaftsuntersuchung
Tabletten von 408 mg in einer geeigneten Tabletten- Frische rote Blutkörperchen von Schafen wurden
presse geformt. dreimal mit 20 Volumen physiologischer Kochsalz-
Zur Verwendung wurde eine Tablette in 4 ml lösung gewaschen und als l%ige Suspension in 5%iger heißem destilliertem Wasser gelöst und ausreichend Natriumchloridlösung hergestellt, welche 0,15 °/0 Benkaltes destilliertes Wasser zugegeben, um das Volumen 6g zol-l,4-diol enthielt, gepuffert auf pH 7,0 mit 0,15 Mol auf 20 ml zu ergänzen. Dieses Volumen wurde ver- Phosphat. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei wendet, um das gefriergetrocknete Reagens von Zimmertemperatur stehengelassen. Zu 10 Volumen Beispiel 5 wieder in Dispersion zu bringen, um den der Suspension wurde 1 Volumen Formaldehyd
(40°/0ige Gew./Volum. Formaldehydlösung) zugegeben. Das Gemisch wurde 18 Stunden lang bei Zimmertemperatur gehalten. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert und l°/oig m einem Borat-Succinat-Puffer wieder zur Suspension gebracht.
Die roten Blutkörperchen von 11 der l°/oigen Suspension wurden dann dreimal in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wieder suspendiert in 200 ml Edetatpuffer. Gereinigtes HCG, 3500 internationale Einheiten in 3 ml Edetatpuffer wurden zugegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden lang bei 37° C unter gelegentlichem Rühren bebrütet. Die Zellen wurden dann viermal mit 100 Volumen Borat-Succinat-Puffer gewaschen.
Nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise wurden die sensitivierten Zellen wiedersuspendiert in Borat-Succinat-Puffer, welcher Saccharose enthielt, und mit Kaninchenserum agglutiniert, welches HCG-Antikörper enthielt, und die agglutinierte Suspension wurde gefriergetrocknet.
Beispiel 6
Verwendung des Reagens
Eine Ampulle gefriergetrocknetes Reagens und eine Kontrollampulle (welche konservierte nichtsensitivierte Zellen, nur mit normalem Kaninchenserum behandelt und gefriergetrocknet, enthielt) wurden jede in Suspensionen in 5 ml mit Boratpuffer gebracht. Die Probe menschlichen Urins, welche untersucht werden sollte, wurde durch Zentrifugieren geklärt und mit Boratpuffer verdünnt. Verdünnungen von 1J2, Vb> Vio> 1Uo und 1^oOi ebenso eine Kontrolle des Puffers allein wurden in 1,0-ml-Mengen in zwei Versuchsreihen mit Glasröhrchen mit rundem Boden (vorzugsweise mit den Ausmaßen von 0,195 · 7,6 cm) in geeigneten Haltevorrichtungen mit der Pipette eingebracht. Das wieder in Suspension gebrachte Reagens wurde in Mengen von 0,1 ml jedem Glasröhrchen der ersten Versuchsreihe zugegeben und die Kontrollsuspension in gleicher Weise jedem Glasröhrchen in der zweiten Reihe. Der Inhalt der Gläschen wurde durch Schütteln oder durch Drehen der Reagensgläser gemischt, und die Gemische werden über Nacht bei Zimmertemperatur, frei von Zug und Vibrieren, stehengelassen. Das Ergebnis der Untersuchung wurde am nachfolgenden Morgen durch Beobachtung des Agglutinationsbildes am Boden der Reagenzgläser bestimmt. Bei den Kontrollen mit dem Puffer allein und ohne Urin waren die Suspensionen des Reagens völlig agglutiniert, und die Kontrollsuspensionen waren nicht agglutiniert. Wenn HCG in dem Urin vorhanden war, waren die Suspensionen des Reagens in den Gläsern, beginnend mit einer halben Verdünnung, disagglutiniert und zeigten das Erscheinungsbild der nichtagglutinierten Kontrollen. Der Titer der Urinprobe wurde als die Verdünnung der Probe in dem letzten Reagenzglas ausgedrückt, in welchem die eindeutige Disagglutinierung der Suspension des Reagens beobachtet wurde. Gelegentlich wurden bei Verdünnungen von einhalb oder einem Fünftel sowohl die Reagens- als auch die Kontrollsuspensionen agglutiniert; dies zeigte das Vorhandensein eines nichtspezifischen Agglutinins in dem Urin an. Wenn nur kleine Mengen von HCG in dem Urin vorhanden waren, konnte diese nicht spezifische Agglutinierung die Disagglutinierungsreaktion verdecken, und es war bei einigen wenigen Fällen erforderlich, die Untersuchung mit einer frischen Urinprobe zu wiederholen.
Die Ergebnisse von Schwangerschaftsuntersuchungen an Urinproben von hundertsiebenundzwanzig klinisch diagnostizierten Schwangerschaften, in der Tabelle geordnet nach dei Dauer der Schwangerschaft (Wochen), sind in der Tabelle 1 aufgezeigt. Mit Ausnahme eines Falles, der ein negatives Ergebnis erbrachte und bei dem nach erneuter klinischei Übeiprüfung gefunden wurde, daß keine Schwangerschaft vorlag, wurden die gesamten Schwangerschaften später bestätigt.
Tabelle 1
Schwangerschaftsdauer Untersuchungsergebnis negativ
(Wochen) positiv 0
6 bis 8 15 1
9 bis 12 39 2
13 bis 16 33 0
17 bis 20 8 0
21 bis 24 7 0
25 bis 28 14 0
>28 8
Die Ergebnisse, insgesamt negativ, der Untersuchungen an zweihundertelf nichtschwangeren Frauen, nach Altersgruppen (Jahren) in der Tabelle geordnet, sind in Tabelle 2 aufgefühlt.
Tabelle 2 Anzahl der Frauen
Altersgruppe
(Jahre)		 41
56
23
37
54
17 bis 20
20 bis 30
30 bis 40
40 bis 50
>50

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Immunologisches Reagens für die Ermittlung und Bestimmung von Human-chorion-gonadotropin (HCG) mit HCG-sensitivierten roten Blutkörperchen von Säugern, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Boratpuffer enthält.
2. Reagens gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Alkalimetallborat, Borsäure oder eine feste Karbonsäure und einen Tablettierungszusatz enthält.
In Betracht gezogene Druckschriften:
Belgische Patentschriften Nr. 605 826, 610 085; Acta Endocrinologica, 35 (1960), S. 261 bis 267.
809 569/270 7.68 © Bundesdruckerei Berlin
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