DE1192367B - Verfahren zur Herstellung eines immunologischen Reagens - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines immunologischen Reagens

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DE1192367B DEW34624A DEW0034624A DE1192367B DE 1192367 B DE1192367 B DE 1192367B DE W34624 A DEW34624 A DE W34624A DE W0034624 A DEW0034624 A DE W0034624A DE 1192367 B DE1192367 B DE 1192367B
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Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
DEUTSCHES
PATENTAMT
AUSLEGESCHRIFT
Int. α.:
A61k
Deutsche Kl.: 30 h-2/04
Nummer: 1192367
Aktenzeichen: W 34624IV a/30 h
Anmeldetag: 30. Mai 1963
Auslegetag: 6. Mai 1965
Diese Erfindung betrifft die Herstellung von immunologischen Reagenzien zur Verwendung bei einem Haemagglutinationstest. Diese Reagenzien umfassen antigensensibilisierte rote Blutkörperchen von Säugern, welche in Gegenwart von entsprechenden Antikörpern agglutinieren. Die agglutinierten Zellen können ebenso bei Vorhandensein weiterer freier Antigene disagglutiniert werden. Diese Reaktionen können verwendet werden, um Proteinantigene z. B. in Körperflüssigkeiten nachzuweisen. Zu solchen Antigenen gehören Chorion-gonadotropin (HCG), Serumalbumin, y-Globulin, Insulin, Tetanus-toxoid und Diphtherie-toxoid. Bei Verwendung zum Nachweis von HCG bei Schwangerenurin bildet die Reaktion die Grundlage für einen In-vitro-Test für Schwangerschaft.
Die verwendeten roten Blutkörperchen sind herkömmlicherweise solche, welche von Schafen erhalten werden, jedoch können Blutkörperchen von anderen Säugetierarten, einschließlich Rind, Pferd, Kaninchen und Mensch, verwendet werden.
Nach einem bestehenden Verfahren zur Herstellung antigensensibilisierter roter Blutkörperchen werden die Zellen zuerst durch Behandlung in einem wäßrigen Medium mit einem Aldehyd, gewöhnlich Formaldehyd, obgleich andere Aldehyde, wie Acetaldehyd und Brenztraubensäurealdehyd, verwendet werden können, aufbereitet (konserviert). Die Zellen werden dann sorgfältig frei von Aldehyd gewaschen und in einem wäßrigen Medium mit einem'Beizmittel, welches herkömmlicherweise Gerbsäure ist, behandelt. Der Überschuß an Beizmittel wird entfernt und die Zellen werden schließlich durch Behandeln in einem wäßrigen Medium mit einem ausgewählten Antigen, beispielsweise HCG, sensibilisiert. Bei diesem Verfahren ist das viele erforderliche Waschen lästig, wenn die Herstellung in großem Ausmaß durchgeführt wird und ebenso ist die Gerbsäure ein etwas unbefriedigendes Beizmittel. Es wurde nunmehr gefunden, daß antigensensibilisierte Zellen zuverlässig unter Verwendung eines Polyphenols oder Chinons von niederem Molekulargewicht (unter 200) als Beizmittel hergestellt werden können. Solch ein Beizmittel wird vorzugsweise den frischen Zellen vor der Zugabe des Aldehyds zugegeben, obgleich gleichwertige Ergebnisse in bestimmten Fällen durch Zugabe des Aldehyds vor dem Beizmittel oder durch Zugabe eines Gemisches von Beizmittel und dem Aldehyd zu den roten Blutkörperchen, erhalten werden können. Es kann erforderlich sein, ein Puffermittel anzuwenden, um ein Abfallen des pH, das durch Mischen des Beizmittels mit dem Aldehyd erfolgt, zu verringern. So behandelte Verfahren zur Herstellung eines
immunologischen Reagens
Anmelder:
The Wellcome Foundation Limited, London
Vertreter:
Dr. M. Eule,
Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. W. J. Berg
und Dipl.-Ing. O. F. Stapf, Patentanwälte,
München 13, Kurfürstenplatz 2
Als Erfinder benannt:
Arthur James Fulthorpe, London
Beanspruchte Priorität:
Großbritannien vom 6. Juni 1962 (21 976),
vom 22. August 1962 (32 345),
Südafrika vom 7. Januar 1963 (63/72)
Zellen können mit einem Antigen nach verhältnismäßig kurzem Waschen sensibilisiert werden. Sie sind verhältnismäßig stabil und können, wenn erforderlich, viele Tage gelagert werden, bis sie für die Sensibilisierung mit einem Antigen benötigt werden.
Unter den Beizmitteln, welche nach der Erfindung verwendet werden können, sind die Hydrochinone, einschließlich Hydrochinon, Toluol-2,5-diol und den Naphthalin-1,4- und -2,6-diolen, ebenso die entsprechenden Chinone und auch die anderen Benzoldiole, Toluoldiole und Naphthalindiole geeignet.
Die Menge an erforderlichem Beizmittel steigt, wie die Menge an verwendetem Aldehyd vergrößert wird. Das Beizmittel und der Aldehyd werden vorzugsweise in einem molaren Verhältnis zwischen 1: 5 und 1:150 verwendet. Mit Blutkörperchen von Schafen ist beispielsweise wenigstens 0,8 % Gew./Vol. Formaldehyd erforderlich, um die Zellen aufzubereiten, wobei die Konzentration von Hydrochinon geringer sein muß als 0,5% Gew./Vol. Bei 2% Gew./Vol. Formaldehyd muß das Hydrochinon weniger als 2,0% Gew./Vol.
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sein, und bei 4% Formaldehyd kann das Benzol- ninchenserum zugegeben, welches ausreichend Anti-
1,4-diol so niedrig sein wie 0,1% Gew./Vol. und jst körper zu HCG enthielt, um eine vollkommene
optimal 0,5 bis 1,0% Gew./Vol. Solche roten Blut- Agglutinierung der sensibilisierten Zellen zu ver-
körperchen ergeben, wenn sie mit humanem Chorion- Ursachen. Das zugegebene Kaninchenserum bestand
gonadotropin sensibilisiert werden, ein Produkt mit 5 aus der erforderlichen Menge (bestimmt durch Er-
einem gleichmäßigen und reproduzierbarem Titer. rechnen des Antikörpertiters) eines Antiserums,
Die sensibilisierten Zellen werden herkömmlicher- welches von Kaninchen, angeregt mit gereinigtem
weise gefriergetrocknet dargeboten, entweder getrennt HCG, erhalten wurde plus einer Menge von normalem
oder zusammen mit einer äquivalenten Menge Anti- Kaninchenserum, um die Gesamtmenge von 20 ml
serum. Ein wasserlöslicher Aufnahmestoff (herkömm- io zu ergeben.
licherweise ein Zucker, wie Saccharose) wird verwendet, Die agglutinierte Suspension wurde in 1-ml-Mengen
um die Unversehrtheit der Zellen während des Kälte- in 5-ml-Ampullen verteilt und in der herkömmlichen
trocknungsverfahrens zu erhalten und hilft dieselben Weise gefriergetrocknet.
leicht wieder zu dispergieren, wenn ein wäßriges Zur Verwendung in einem In-vitro-Schwanger-
Medium zugegeben wird. Vor Verwendung werden 15 schaftstest wurde die Ampulle eines gefriergetrockneten
die gefriergetrockneten Zubereitungen wieder in ein Reagens und eine Kontrollampulle (welche konser-
wäßriges Medium gebracht, in welchem der Test vierte, nicht sensibilisierte Zellen, behandelt mit
durchgeführt wird. normalem Kaninchenserum allein und gefriergetrock-
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. net enthielt) jede wieder in Suspensionen von 5 ml mit
Die Erfindung der beiden verwendeten Pufferlösungen 20 Boratpuffer gebracht. Die menschliche Urinprobe,
wird nachfolgend beschrieben. welche auf HCG getestet werden sollte, wurde durch
_, „ . „ ~. TT „ ^ Zentrifugieren geklärt und mit Boratpuffer verdünnt.
Borat-Succmat-Puffer pH 7,5 Verdünnungen von 1: 2,1: 5,1: 10,1: 20 und 1: 200,
Natriumborat Na8B4O7 · 10H2O (95,5 g) und Na- ebenso eine Kontrolle von Puffer allein, wurden in triumchlorid (37,5 g) wurden in destilliertem Wasser 25 1,0-ml-Mengen in zwei Reihen Rundbodenglasröhren (51) gelöst. Bernsteinsäure (23,6) und Natrium- (vorzugsweise in 0,195 · 7,6-cm-Ausmessungen) in chlorid (30,0 g) wurden in destilliertem Wasser (41) einem geeigneten Haltegestell pipettiert. Die wiedergelöst. Gleiche Volumen der beiden Lösungen wurde hergestellte Reagenzsuspension wurde in 0,1-mlgemischt und der pH-Wert auf 7,5 durch Zugabe Mengen zu jedem Röhrchen in der ersten Reihe und eines kleinen Volumens der Natriumboratlösung ein- 30 die Kontrollsuspension in der gleichen Weise zu jedem gestellt. Röhrchen in der zweiten Reihe zugegeben. Die Inhalte BoratDuffer pH 8 2 bis 8 3 wurden durch Schütteln oder Umkehren der Röhren
' gemischt und die Gemische über Nacht bei Zimmer-
Ein Gemisch von Natriumborat Na8B4O7 · 10H2O temperatur frei von Zug und Erschütterung stehen-
(3,0 g), Borsäure H3Bo3 (4,4 g) und Natriumchlorid 35 gelassen. Das Ergebnis des Versuchs wurde am
(7,6 g) wurde in destilliertem Wasser (11) gelöst. nächsten Morgen durch Beobachten der Agglutinationsmuster am Boden der Röhrchen abgelesen. Bei
Beispiel 1 den Kontrollen mit dem Puffer allein und ohne Urin
sowie das mit der Reagenzsuspension waren völlig
Frische rote Blutkörperchen von Schafen wurden 40 agglutiniert, und die mit der Kontrollsuspension
dreimal mit 20 Volumen physiologischer Kochsalz- waren nicht agglutiniert. Sofern HCG im Urin vor-
lösung gewaschen und als eine 1 %ige Suspension in handen war, wurde die Reagenzsuspension in den
5%iger Natriumchloridlösung, welche 0,15% Hy- Gläsern, beginnend mit der 1:2-Verdünnung, dis-
drochinon enthielt und auf pH 7,0 mit 0,15molarem agglutiniert und hatten das Erscheinungsbild der
Phosphat gepuffert, aufbereitet. Die Suspension wurde 45 nicht agglutinierten Kontrollen. Der Titer der Urin-
15 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen ge- probe wurde als die Verdünnung der Probe in dem
lassen. Zu 10 Volumen Suspension wurde 1 Volumen letzten Glas, in welchem die deutliche Disagglu-
Formalin (im Handel erhältliche 40%ige Gew./Vol. tinierung der Reagenzsuspension beobachtet wurde,
Formaldehydlösung) zugegeben. Das Gemisch wurde ausgedrückt. Gelegentlich wurden bei Verdünnungen
18 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehenge- 50 1: 2 oder 1: 5 die Reagenz- und Kontrollsuspensionen
lassen. Die Zellen wurden dann herauszentrifugiert und agglutiniert; es zeigte dies das Vorhandensein eines
mit 1 % in einem Borat-Succinat-Puffer wieder in nicht spezifischen Agglutinins in dem Urin an. Wenn
Suspension gebracht. nur kleine Mengen HCG im Urin vorhanden waren,
Die roten Blutkörperchen von 11 der 1 %igen konnte diese nicht spezifische Agglutination die DisSuspension wurden dann dreimal in physiologischem 55 agglutinierungsreaktion verdecken, und es war in Kochsalz gewaschen und wieder in 200 ml Edetat- seltenen Fällen erforderlich, den Versuch mit einer puffer (0,05molares Dinatrium-dihydrogen-äthylendi- neuen Urinprobe zu wiederholen,
amin-tetraacetat auf pH 8,4 gebracht durch Zugabe Die Ergebnisse der Schwangerschaftstests, auf von 2n-Natriumhydroxyd). Gereinigtes HCG (Leo), Grund von Urinproben von hundertsiebenundzwanzig 3500 internationale Einheiten in 3 ml Edetatpuffer 60 klinisch diagnostizierten Schwangerschaften, in der wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden Tabelle geordnet nach der Dauer der Schwangerlang bei 37°C unter gelegentlichem Rühren an- schaft (Wochen), sind in der Tabelle 1 aufgezeigt. Mit gebrütet. Die Zellen wurden dann viermal mit 100 Vo- Ausnahme eines Falles, der ein negatives Ergebnis lumen Borat-Succinat-Puffer gewaschen. erbrachte, und bei dem nach klinischer Überprüfung
Die sensibilisierten Zellen wurden in 100 ml Borat- 6g keine Schwangerschaft festgestellt wurde, wurden
Succinat-Puffer, welcher 10% Gew./Vol. Saccharose alle diese Schwangerschaften später bestätigt. Die
enthielt, wieder zur Suspension gebracht. Zu dieser insgesamt negativen Ergebnisse von Versuchen von
wurden 80 ml Borat-Succinat-Puffer und 20 ml Ka- zweihundertelf nichtschwangeren Frauen sind in der
Tabelle in der Reihenfolge der Altersgruppen (Jahre) geordnet und in Tabelle 2 aufgezeigt.
Tabelle 1 Tabelle 2
Klinisch diagnostizierte
Schwangerschaft
Schwanger Versuchs negativ
schafts- ergebnisse 0
dauer positiv 1
6 bis 8 15 2
9 bis 12 39 0
13 bis 16 33 0
17 bis 20 8 0
21 bis 24 7 0
25 bis 28 14
>28 8
Nichtschwangere
Frauen
Alters Zahl der
gruppe Frauen
17 bis 20 41
20 bis 30 56
30 bis 40 23
45 bis 50 37
>50 54
Beispiel 2
IO
20
In ähnlicher Weise zufriedenstellende Reagenzien wurden durch Modifizieren des Verfahrens vom Beispiel 1 hergestellt. Die Konzentration von Hydrochinon wurde von 0,15 auf 0,5 und 1,0% vergrößert und die Suspensionen 15 bis 30 Minuten lang, vor der Zugabe von Formalin und danach 18 Stunden bis 4 Tage, stehengelassen. Die Inkubationszeit mit HCG wurde von 4 auf 1,5 Stunden verkürzt und die sensibilisierten Zellen wurden dann fünfmal mit 100 Volumen Borat-Succinat-Puffer gewaschen.
Beispiel 3
Frische rote Blutkörperchen von Schafen wurden dreimal mit 20 Volumen physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die kompakten gewaschenen Zellen (100 ml) wurden zu 500 ml einer Lösung von Hydrochinon (2,5 g) in 5%igem Natriumchlorid, auf pH 7,0 mit 0,15 molarem Phosphat gepuffert, zugegeben. Die Suspension wurde 15 Minutenlang bei Zimmertemperatur stehengelassen. Zu dieser wurden 500 ml einer Lösung von p-Formaldehyd (40 g) in 5 % Natriumchlorid, gepuffert auf pH 7,0 mit 0,15molarem Phosphat, zugegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Zellen aus 500 ml Suspension wurden dreimal in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in einer Lösung von humanem y-Globulin (250 mg) in 11 Edetatpuffer mit pH 8,4 (hergestellt durch Mischen von 0,05 molarem Dinatrium-dihydrogen-äthylendiamintetraacetat und 0,5 n-Natriumhydroxyd) wieder in Suspension gebracht. Das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei 370C gebrütet. Die Zellen wurden dann dreimal mit 20 Volumen physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 11 Borat-Succinat-Puffer, welcher 5 % Saccharose und 5 % normales Kaninchenserum enthielt, wieder suspendiert, wobei das Serum zuvor mit hydrochinonfornialdehydbehandelten roten Blutkörperchen absorbiert wurde. Die Suspension wurde in 1-ml-Mengen in 5-ml-Ampullen verteilt und in der herkömmlichen Weise gefriergetrocknet.
Ein Antiserum, welches von Kaninchen, angeregt mit Human-y-Globulin, erhalten wurde, wurde in geeigneter Weise verteilt und gefriergetrocknet, so daß es nach Wiederherstellung einen Agglutinierungstiter von ungefähr 1 in 200 hat.
Eine Standard-human-Serumzubereitung von bekanntem y-Globulingehalt wurde in geeigneter Weise verdünnt und gefriergetrocknet, so daß zwischen 0,2 und 0,4 ml der wiederhergestellten Zubereitung zu 0,5 ml Antiserum äquivalent waren.
Zur Verwendung wurde eine Ampulle des gefriergetrockneten sensibilisierten Zellenreagens in eine Suspension von 5 ml mit Boratpuffer wiederhergestellt. Das gefriergetrocknete Antiserum und die Standardy-Globulin-Zubereitungen wurden in gleicher Weise wiederhergestellt. Ein humanes Serum, von welchem durch den Versuch der y-Globulingehalt bestimmt werden sollte, wurde in Reihe mit Boratpuffer verdünnt, ebenso die Standard-y-Globulinzubereitung. Durch Vergleich der Minimumvolumen des unter Versuch gestellten Serums und der Standard-y-Globulin-Zubereitung, welche erforderlich war, die Agglutinierung der durch 0,5 ml Antiserum sensibilisierten Zellen zu hemmen, wurde der y-Globulingehalt des getesteten Serums bestimmt. Keine Agglutinierung erfolgte in Abwesenheit von Antiserum oder in Kontrollen bei Verwendung nichtsensibilisierter Zellen, während die vollkommene Agglutinierung der sensibilisierten Zellen in Gegenwart des Antiserums, aber bei Abwesenheit der y-Globulin-Zubereitung erfolgte.
Beispiel 4
Ein Reagens, ähnlich denjenigen von Beispiel 1 und 2, wurde nach dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt, aber unter Verwendung von Hydrochinon in einer Endkonzentration von 1,0% Gew./Vol. und unter Sensibilisierung der Zellen mit HCG, wie dies im Beispiel 2 beschrieben ist.
Beispiel 5
Unter Verwendung ähnlicher Verfahren, wie derjenigen von Beispiel 1 wurden die roten Blutkörperchen von Schafen mit l,0%igen Gew./Vol.-Lösungen von Hydrochinon, Benzol-1,3-diol, Benzol-l,2-diol und 1,4-Benzochinon behandelt und, die Produkte insgesamt mit Rinderserumalbumin sensibilisiert, ergaben zufriedenstellende Reagenzien zur Beobachtung der immunologischen Reaktion von Albumin-Rinderserum und einem entsprechenden Kaninchenantiserum.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von immunologischen Reagenzien, in welchen die roten Blutkörperchen eines Säugers in einem wäßrigen Medium suspendiert, mit einem Beizmittel, einem Aldehyd und einem Proteinantigen behandelt werden, dadurch gekennzeichnet, daß als Beizmittel ein Polyphenol oder Chinon von einem Molekulargewicht unter 200 verwendet wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Beizmittel und der Aldehyd in einem Molarverhältnis zwischen 1: 5 und 1: 150 verwendet werden.
3. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen zuerst mit dem Beizmittel, als nächstes mit dem Aldehyd und dann mit dem Antigen behandelt werden.
4. Verfahren gemäß Anspruch. 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Beizmittel Hydrochinon verwendet wird.
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