DE10393406T5

DE10393406T5 - Parallele Beladung von Arrays

Info

Publication number: DE10393406T5
Application number: DE10393406T
Authority: DE
Inventors: Roland D. Madison Green; Mark Madison McCormick; Gary Madison Barrett
Original assignee: Nimblegen Systems GmbH; Nimblegen Systems Inc
Current assignee: Nimblegen Systems GmbH; Roche Sequencing Solutions Inc
Priority date: 2002-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2005-12-22
Also published as: US20040101949A1; GB2409455A; GB2409455B; WO2004031399A2; JP4471927B2; CA2500936A1; US8129196B2; US20090069197A1; AU2003282885A1; AU2003282885A8; JP2006517653A; WO2004031399A3; GB0508821D0; CA2500936C; US7482170B2

Abstract

Verfahren zum Laden von Proben auf ein Mikroarray, das aus einer Vielzahl von Sub-Arrays auf einem gemeinsamen Träger besteht, beinhaltend folgende Schritte:
Platzierung der zu ladenden Proben auf ein Probenladungsarray, die Probenanordnung auf dem Probenladungsarray dabei physisch auf die Lage der Sub-Arrays auf dem Mikroarray ausgerichtet; und
Platzierung des Probenladungsarrays in Kontakt mit dem Mikroarray unter Bedingungen, so dass Moleküle in den Proben mit den Sonden in den ausgerichteten Sub-Arrays hybridisieren können.

Description

QUERVERWEIS ZU VERWANDTEN ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Patentanmeldung USSN 60/415 118 eingereicht am 30. September 2002 und der vorläufigen US-Patentanmeldung USSN 60/415 090 eingereicht am 1. Oktober 2002.
Die Einführung von DNA Mikroarray-Technologie ermöglicht den Aufbau eines Arrays von hunderttausenden DNA-Sequenzen auf einer sehr kleinen Fläche, wie z. B. der Größe eines Mikroskopierträgers. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 6 375 903 und US-Patent Nr. 5 143 854, die hiermit durch Verweis in vollem Umfang inkorporiert werden. Die Offenbarung von Patent Nr. 6 375 903 ermöglicht die Herstellung sogenannter maskenfreier Array-Synthesizer (MAS) Instrumente in denen Licht dazu verwendet wird um DNA-Sequenzen zu synthetisieren, wobei die Lichtausrichtung mit Hilfe einer digitalen Mikrospiegeleinrichtung (DMD) durchgeführt wird. Bei der Verwendung eines MAS-Instruments befindet sich die Auswahl der DNA-Sequenzen die im Mikroarray konstruiert werden sollen unter Software-Kontrolle, so dass individuell angepasste Arrays auf Anfrage hergestellt werden können. Im Allgemeinen erlaubt die Verwendung von MAS-basierter DNA-Mikroarray-Synthesetechnologie die parallele Herstellung von über 800 000 einmaligen Oligonukleotiden auf einer sehr kleinen Fläche auf einem Standard Mikroskopierträger. Bei vielen Anwendungen wird die Gesamtheit des synthetisierten Arrays dazu verwendet, um eine Probe von Testnukleotiden zu bewerten. Bei diesen Anwendungen ist die gesamte Fläche des Mikroarrays in einer kleinen Kammer eingeschlossen um die Auftragung der einen Probe zu ermöglichen, wodurch ein sehr effizientes Verfahren zur Messung des Expressionsniveaus einer sehr großen Zahl von Genen in dieser einen Probe ermöglicht wird. Eine typische Anwendung dieser Art ist die Analyse von Genexpressionsprofilen.
Die Verfügbarkeit von Mikroarrays revolutioniert die Art und Weise in der Forscher Daten über die Expression von Genen in Zellen und Organismen sammeln. Durch geeignete Wahl der Probesequenzen kann das Genexpressionsprofil in einer Zelle oder einem Gewebe aufgedeckt werden. Da Mikroarrays hunderttausende Features haben können, wobei jedes Feature eine Menge identischer DNA-Proben trägt, kann das Mikroarray dazu verwendet werden um eine gewaltige Datenmenge parallel zu sammeln. Z. B. wurde DNA-Mikroarray-Technologie in vielen Gebieten angewendet wie Genexpression und Entdeckung, Mutationsdetektion, allelische und evolutionäre Sequenzvergleiche und Genomkartierung. Für manche Anwendungen ist der Umfang des Datensammelpotentials eines Mikroarrays schlichtweg zu groß, denn manchmal involvieren die zu sammelnden Daten weit weniger Sonden als die volle Kapazität eines Mikroarrays.
Bei manchen Anwendungen ist es erwünscht, eine kleinere Anzahl von Genen zu untersuchen. Bei manchen dieser Anwendungen ist es erwünscht eine große Zahl von Proben gegen eine kleinere Menge von Sonden zu testen als sie die volle Kapazität des Mikroarrays zur Verfügung stellt. Um Untersuchungen für diese Anwendung durchzuführen kann das Mikroarray logischerweise in jede beliebige Anzahl von kleineren Sub-Arrays unterteilt werden wobei jedes die gleichen oder ähnliche Nukleotidsonden enthält, ein Konzept das manchmal als ein Array von Arrays bezeichnet wird. Anstelle eines einzelnen Mikroarrays, mit beispielsweise 100 000 Features oder Sondenbereichen, kann das Mikroarray in 1000 Sub-Arrays mit je 100 Features unterteilt werden. Um ein Array von Arrays effizient verwenden zu können werden zahlreiche Proben parallel in einem einzigen Experiment hybridisiert, wobei jede Probe an einen festgelegten und vorbestimmten Bereich des Mikroarrays hybridisiert wird, einen Bereich der eins der Sub-Arrays des Arrays von Arrays darstellt. Diese parallele Beladungsstrategie ermöglicht die effiziente Verwendung der hohen Syntheseka pazität des Mikroarrays. Um zahlreiche Proben auf ein Mikroarray aus Sub-Arrays zu laden und dabei eine Überkreuzkontamination der Proben zu vermeiden, muss ein Mechanismus bereitgestellt werden um das Auslaufen aller Proben in angrenzende Sub-Arrays zu verhindern. Gegenwärtig werden bei Mikroarrays die zu diesem Zweck gebaut werden (z. B. US-Patent Nr. 5 874 219) physikalische Vertiefungen verwendet um Sondengruppen für verschiedene Proben voneinander zu trennen. Dieser Ansatz ist unter Umständen nicht optimal für Array von Array Mikroarrays, die eine große Anzahl von Sub-Arrays haben, wo die Ausrichtung der physikalischen Vertiefungen mit den Sub-Arrays schwierig sein könnte.
Eine weitere technische Herausforderung, die sich aus der Verwendung von Sub-Arrays ergibt, ist die Anlieferung und Kontrolle der Probenvolumina die in jedes der kleinen Sub-Arrays angeliefert werden. Es ist vorgesehen, dass die Probenvolumina bis auf 200 nl pro Probe bei der Verwendung von Sub-Arrays sinken werden. Wenn die Probengrößen so gering sind, werden sowohl die Verdunstung von Flüssigkeiten als auch die Anlieferung von Proben zu ernsten Problemen. Diese Erfindung beschreibt ein Verfahren und einen Apparat zur Überwindung der Probleme der Probenanlieferung zu den Sub-Arrays und stellt ein Verfahren zur Verfügung um Hybridisierungsreaktionen in kleinen Volumina auf dem Array von Arrays durchzuführen.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird zusammengefasst als ein Apparat und ein Verfahren zur parallelen Ladung mehrerer Proben auf ein Mikroarray, das eine Vielzahl von Sub-Arrays enthält. Das Verfahren macht Gebrauch von einem Mikroarray das zahlreiche Sub-Arrays enthält, von einem Ladekanalarray, und einem Automaten zur Handhabung von Flüssigkeiten oder einem Automaten oder einer Maschine zur Bestückung.
In einer Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass ein Probenladungsarray zur Verfügung gestellt wird, das eine Vielzahl von Mikrokanälen aufweist, wobei jeder Kanal eine longitudinale Achse besitzt die durch sein Zentrum geht und das Zentrum des Kanals definiert, und dadurch das ein Mikroarray zur Verfügung gestellt wird, dass eine Vielzahl von Sub-Arrays hat, wobei jedes Sub-Array eine Achse besitzt die senkrecht durch sein Zentrum führt und das Zentrum des Sub-Arrays definiert. Eine Dialysemembran wird im Kontakt mit einer Seite des Kanalarrays angeordnet um die Mikrokanäle zu verschließen und den selektiven Durchtritt von Flüssigkeiten und Molekülen durch die Membran und durch die Mikrokanäle zu ermöglichen. Nach der Verbindung werden die Proben den Mikrokanälen durch das Ende auf der Gegenseite der Membran angeliefert, wobei ein Anlieferungssystem verwendet wird, das dazu in der Lage ist gleichzeitig Proben an mehreren Stellen zuzuführen. Die Kombination aus Membran und Kanalarray wird dann in Wasser oder Pufferlösung gelegt, wobei nur die Membranseite des Probenladungsarrays das Wasser oder den Puffer berührt, bis Gleichgewicht erreicht ist. Nachdem die Proben die Möglichkeit hatten ins Gleichgewicht zu kommen, werden Kanalarray und Mikroarray mit einer Dichtung verbunden, so dass eine Hybridisierungskammer entsteht, wobei das Zentrum der Kanäle auf das Zentrum der Sub-Arrays ausgerichtet ist. Nachdem die Hybridisierungskammer gebildet ist werden die Proben in jedem individuellen Mikrokanal in Kontakt mit dem korrespondierenden Sub-Array gebracht indem entweder Zentrifugalkräfte oder Druck wie z. B. Vakuum verwendet werden.
Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwenden verschiedene Versionen des Probenladungsarrays. In jedem Falle ist das Probenladungsarray mit Proben vorbeladen und wird in Kontakt mit dem Mikroarray gebracht, wobei die Proben auf die Sub-Arrays des Mikroarrays ausgerichtet sind.
Verschiedene Versionen des Probenladungsarrays sind in Abhängigkeit von der Anzahl und Größe der Sub-Arrays vorteilhaft.
Die vorliegende Erfindung bietet zahlreiche Vorteile. Erstens ermöglicht die Erfindung die parallele Prozessierung einer großen Zahl von Proben. Außerdem ermöglicht sie die genaue Anlieferung kleiner Probenvolumina, die Ausschaltung von Verdunstung als einem Problem, und ist relativ simpel und kostet wenig.
Weitere Gegenstände, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen ersichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER VERSCHIEDENEN ANSICHTEN DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Seitenschnittansicht von einer Ausführungsform des Probenladungsarrays entsprechend der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt eine Aufsicht auf ein Kanalarray mit Dichtung und geeignet dazu 12 Sub-Arrays aufzunehmen.
3 zeigt eine Seitenansicht eines Mikroarrays mit 12 Sub-Arrays und mit Probenzufuhr durch ein Kanalarray.
4 ist eine auseinandergezogene Perspektivansicht einer anderen Ausführungsform eines Probenladungsarrays.
5 ist eine Seitenschnittansicht die die Anordnung der Teile in einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen Apparat und ein Verfahren zur parallelen Ladung von zahlreichen Proben auf ein Mikroarray zur Verfügung, das eine Vielzahl von Sub-Arrays enthält. Die Idee verwendet ein Probenladungsarray in das Proben abgelegt werden können. Das Probenladungsarray wird dann im Kontakt mit dem Mikroarray angeordnet, so dass die Proben den angemessenen Sub-Arrays angeliefert werden. Die Hybridisierungsreaktionen können dann in einer Art von Sandwich durchgeführt werden, wobei der Reaktionsbereich für jede Reaktion zwischen dem Mikroarraysubstrat und dem Träger des Probenladungsarrays definiert ist.
Hier wird in Erwägung gezogen, dass das Mikroarray auf einem planaren Träger hergestellt ist, typischerweise einem gläsernen Mikroskopierträger. Das Mikroarray ist unterteilt in zahlreiche Features, wobei ein Feature der physikalische Bereich auf dem Träger ist in der alle einzelsträngigen DNA-Proben eine gemeinsame Sequenz oder Sequenzen haben sollten. Das Mikroarray zum Zwecke dieser Erfindung ist ein solches, das ein Array von Arrays enthält. In anderen Worten, eine Gruppe von Features wird zwei oder mehr Mal über das Mikroarray wiederholt. Die Gruppe der Features die wiederholt werden wird hier häufig mit Sub-Arrays bezeichnet. Obwohl es typisch ist, dass die Sub-Arrays alle identisch sind ist das nicht notwendig. Sub-Arrays sind Bereiche innerhalb eines Mikroarrays, die eine Menge von Features enthalten, die, wenn sie zusammengenommen werden, alle Sonden von Interesse enthalten, die in einer einzigen Hybridisierung mit einer gemeinsamen experimentellen Probe getestet werden sollen. Üblicherweise können Sub-Arrays bezüglich ihrer Größe variieren, abhängig davon, wie viele Features in jedem Sub-Array untergebracht sind, d. h. wenn sich mehr Features in jedem Sub-Array befinden dann können weniger Sub-Arrays auf dem Mikroarray unterge bracht werden. Ein Sub-Array kann außerdem Leerpositionen enthalten (eine Position die für ein Feature mit Sonden zur Verfügung steht aber keine Sonden enthält) und jede beliebige Anzahl von Kontrollfeatures. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung spielt die Form jedes Sub-Arrays keine Rolle.
Vorzugsweise aber nicht notwendigerweise sind die Sub-Arrays voneinander getrennt durch Barrieren wie z. B. hydrophobe Barrieren die die Grenzen jedes Sub-Arrays definieren. Eine Begrenzung dieser Art dient dazu den Flüssigkeitsaustausch zwischen jedem Sub-Array während der Hybridisierung zu inhibieren um dazu beizutragen sicherzustellen, dass die Hybridisierungsreaktion in einem Sub-Array nicht mit der in einem anderen interferiert. In einer Ausführungsform wird die hydrophobe Barriere hergestellt unter Verwendung eines Mikroarray-Syntheseinstruments, das Trityl-geschützte oder andere hydrophobe Gruppen-tragende Phosphoramidite ablegt. Es wird jedoch erwartet, dass andere Verbindungen oder Moleküle außerdem als hydrophobe Barrieren benutzt werden können.
In der Praxis ist die Herstellung der hydrophoben Barriere eine leichte Variation der normalen Mikroarray-Syntheseprozedur. Während bei der normalen Methode der Mikroarray-Synthese mit der Synthese einer kurzen DNA-basierten Linkersequenz auf der Gesamtheit der zur Verfügung stehenden Arrayfläche begonnen wird, unterteilt die vorliegende Erfindung Arrayflächenbereiche in zwei grundlegende Typen: Barriereflächenbereiche und Sub-Array-Flächenbereiche.
Um die hydrophoben Barrierenflächenbereiche herzustellen wird das aktivierte Substrat in den Barriereflächenbereichen mit hydrophobe Gruppen-tragenden Phosphoramiditen wie z. B. Trityl-geschützten Phosphoramiditen verknüpft. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dieser Schritt im Anschluss an die Synthese der DNA-Proben durchgeführt, wobei NPPOC- geschützte Phosphoramiditchemie verwendet wird. Das Ergebnis ist ein Gitter von Sub-Arrays, wobei jedes Element im Gitter von Substratarealen begrenzt wird, an die noch keine Nukleotide addiert wurden. Diese Barriere oder Grenzflächenbereiche können die Orte sein die als Features verwendet werden könnten wenn die volle Kapazität des Mikroarrays verwendet würde, aber diese Orte sind hier für Barrieren zwischen den Sub-Arrays reserviert. Dann werden die Barrieren oder Grenzflächenbereiche entschützt und hydrophobe Gruppen-tragende Phosphoramidite dem Array ausgesetzt. Die hydrophoben Gruppen werden auf diese Weise an die Barriereflächenbereiche des Mikroarrays addiert und trennen auf diese Weise die Sub-Arrays durch hydrophobe Flächenbereiche.
Um Proben parallel zu laden ist ein Probenladungsarray nötig. In einer Ausführungsform ist das Probenladungsarray ein planares Bauteil, z. B. eine Glasplatte oder ein Objektträger, ähnlich dem Mikroarray-Substrat, mit einer Vielzahl von Mikrokanälen, die sich durch das Bauteil erstrecken, wobei die Kanäle Zentren besitzen, die mit den Zentren der Sub-Arrays übereinstimmen. Für jedes Sub-Array existiert wenigstens ein Kanal im Probenladungsarray. Die Glasoberfläche des Probenladungsarrays die zum Mikroarray hinzeigt kann behandelt werden, so dass das Oberflächenareal zwischen den Kanälen auf dem Probenladungsarray ebenfalls hydrophob ist. Auf der Oberfläche des Probenladungsarrays auf der dem Mikroarray abgekehrten Seite ist die Oberfläche der Mikrokanäle durch eine Membran verschlossen, wie z. B. einer Dialysemembran, die auf dieser Seite des Probenladungsarrays befestigt ist. Die Membran erlaubt den Durchtritt von Wasser, aber ist in ihrer Größe so ausgelegt, dass biologische Moleküle wie Nukleinsäuren nicht hindurch können. Die Membran kann hergestellt werden aus jedem flächigen porösen Material, das den Durchtritt niedermolekularer Moleküle erlaubt, wie z. B. Salz und Wasser, aber Nukleinsäuren ausschließt. Die andere Seite von jedem Ka nal, auf der Seite die auf das Mikroarray aufgelegt werden soll, wird offengelassen.
Dieses Konzept ist in 1 abgebildet. Das Mikroarray ist mit 10 bezeichnet und ist auf einem Substrat 12 aufgebracht. Das Mikroarray enthält Sub-Arrays die mit 14 bezeichnet sind und Flächenbereiche zwischen den Sub-Arrays die vorzugsweise hydrophob gemacht wurden, mit 16 bezeichnet. Das Probenladungsarray ist mit 20 bezeichnet und beinhaltet ein planares Bauteil 22 in dem sich Kanäle 24 befinden, ein Kanal für jedes Sub-Array des Mikroarrays 12. Eine planare mikroporöse Membran 26 ist auf der Rückseite des Probenladungsarrays 20 angebracht.
Die Proben werden in die Mikrokanäle des Probenladungsarrays 20 gegeben, von der Seite die an das Mikroarray angebracht werden soll, d. h. die Seite gegenüber der Membran 26, wobei ein Automat zur Handhabung von Flüssigkeiten verwendet wird. In der bevorzugten Ausführungsform wird eine Kapillare und/oder Mikrokanal und ein Reservoir pro Sub-Array verwendet. Ein Roboter zur Herstellung gespotteter Arrays eignet sich gut für diese Anwendung. An dieser Stelle ist Verdunstung kein Problem und den Proben kann erlaubt werden zu verdunsten ohne dass Schaden entsteht, denn die Proben werden vor der Hybridisierung rehydratisiert werden. Alternativ könnte das Probenladungsarray bereits durch die membrangebundene Seite des Probenladungsarrays in Kontakt mit Wasser oder Puffer sein. Das würde ein Austrocknen der Proben verhindern und den angemessenen Hydratisierungsstatus der Probe bewahren. Bei Molekülen die in Bezug auf ihren Hydratisierungsstatus empfindlich sind kann diese Form der kontinuierlichen Hydratisierung bevorzugt sein.
Nachdem alle Proben dem Probenladungsarray angeliefert wurden kann das Probenarray bis zur Hybridisierung gela gert werden. Dann kann die Seite des Kanalarrays mit der Membran 26 in Wasser oder Pufferlösung gelegt werden oder Wasser oder Puffer kann auf die Membran 26 appliziert werden, was ermöglichen wird, dass Wasser in die Mikrokanäle eindringt und die Proben rehydratisiert. Nachdem die Proben die Möglichkeit hatten ins Gleichgewicht zu kommen wird das Probenarray 26 auf das Mikroarray 10 platziert, wobei die offenen Enden der Kanäle auf die Sub-Arrays zeigen. Eine Dichtung wird zwischen Mikroarray und Kanalarray platziert um an dieser Stelle das Verdunsten der Proben in den Sub-Arrays zu verhindern. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Dichtung zweiseitig und semi-adhäsiv. Nach der Probenladung wird der Hybridisierungsreaktion die Möglichkeit gegeben stattzufinden. Flüssigkeitsdruck kann auf die Membran 26 angewendet werden wenn Kraft notwendig ist um das Probenmaterial aus dem Probenarray und in Kontakt mit dem Mikroarray zu bringen.
Eine weitere Alternative besteht einfach darin, dass Probenarray auf dem Mikroarray zu platzieren wobei das Probenarray trocken ist. Dann kann Flüssigkeit, wie z. B. Puffer auf der Membran auf der Rückseite des Probenarrays platziert werden, um die Proben zu rehydratisieren, so dass sie die Sonden der Sub-Arrays berühren.
In einer alternativen Ausführungsform kann Sog verwendet werden, um die Proben parallel dem Mikroarray anzuliefern. Diese Ausführungsform, intendiert zur Verwendung in einer etwas größeren Größenordnung, macht Gebrauch von dem Probenladungsarray das in 2 dargestellt ist. In dieser Ausführungsform ist das Probenladungsarray mit 30 bezeichnet und die Kanäle mit 34. Die Kanäle 34 öffnen sich in sphärische Kammern 38, die sich auf der Frontseite des Probenladungsarraybauteils befinden. Um diese Ausführungsform zu verwenden werden die Proben in wässriger Lösung in die Kanäle geladen. Dann wird das Probenladungsarray in Bezug auf das Mikroarray so angeordnet wie in 3 abgebildet, mit einer Dichtung zwischen dem Probenladungsarray und dem Mikroarray. Ein partielles Vakuum wird im Bereich zwischen dem Mikroarray und dem Probenladungsarray erzeugt um die Proben in Kontakt mit dem Mikroarray zu bringen. Vorzugsweise halten wieder die hydrophoben Bereiche die Flüssigkeiten in den Sub-Arrays. Zusätzlich kann die Membran-verschlossene Seite des Kanalarrays verschlossen werden um Verdunstung aus diesem Ende zu verhindern oder sie kann in Kontakt mit einem Reservoir von Wasser oder Puffer gehalten werden, um durch Verdunstung verlorenes Volumen zu ersetzen.
Sobald das Mikroarray ausgerichtet ist kann ein kleines Vakuum durch den Vakuumkanal gezogen werden. Das Vakuum wird notwendig sein, um die Proben in allen Kapillaren zu verdrängen und jedes der designierten Sub-Arrays auf dem Träger zu füllen. Während sich das Sub-Array füllt muss die Probe in geeigneten hydrophoben Regionen gehalten werden und ins Gleichgewicht mit dem inneren Kammerdruck gelangen. Das ist nötig damit jede Probe aus den Reservoirs und Kapillaren gleiche Kontaktzeiten hat und alle Sub-Arrays in Kontakt kommen ohne dass etwas über die hydrophoben Regionen überläuft. Es ist wünschenswert, dass Überlaufen in angrenzende hydrophobe Regionen zu minimieren um die Integrität jeder Probe zu erhalten und Überkreuzkontaminierung zu verhindern.
Derselbe Effekt kann erreicht werden indem Druck auf die Seite des Probenarrays mit der porösen Membran ausgeübt wird. Wenn Druck auf diese Seite ausgeübt wird wird Puffer in die Mikrokanäle gedrückt und bringt die Proben heraus und in Kontakt mit den Sonden in den Sub-Arrays. Eine andere Alternative um die Proben durch die Mikrokanäle zu drücken wäre Zentrifugalkraft durch Drehung der Anordnung oder auch Gravitation.
Eine weiteres Ausführungsform ist gedacht für die Verwendung mit größeren Volumina, hauptsächlich für den Gebrauch mit Mikroarrays die eine kleinere Anzahl von größeren Sub-Arrays haben. In der Ausführungsform die in 4 dargestellt ist, befinden sich 12 Sub-Arrays und 12 Kompartimente im Probenladungsarray. Das Probenladungsarray 40 besteht aus einer Platte 42 mit Vertiefungen 44 darin. Das Mikroarray ist wiederum mit 10 bezeichnet. Diese Ausführungsform verwendet außerdem die Klammerteile 18 und 19 und eine Dichtung die hier mit 15 bezeichnet ist. Die Proben werden in die Vertiefungen 44 geladen und die Probenladungsplatte wird mit eingeschobener Dichtung 15 gegen das Mikroarray 10 platziert. Die Klammerteile 18 und 19 werden verwendet, um die beiden zusammen abzudichten. Eins der Klammerteile, das untere in 4, besitzt Flüssigkeitsöffnungen, so dass der Bereich zwischen dem Mikroarray und der Probe nach der Hybridisierung gewaschen werden kann. Es ist zu beachten, dass das obere Klammerteil ein Fenster besitzt, so dass das Mikroarray optisch ausgelesen werden kann, nachdem die Hybridisierung durchgeführt wurde. Eine physische Sperre zwischen den Klammerteilen 18 und 19 verhindert dass die Anordnung falsch zusammengesetzt werden kann.
Eine weitere Ausführungsform ist in 5 dargestellt, diese gedacht für ein Mikroarray mit vielen kleineren Sub-Arrays. In dieser Ausführungsform ist das Probenladungsarray ein simples planares Bauteil, in 5 mit 50 bezeichnet. In dieser Ausführungsform wird eine Dichtung 15 verwendet. Bei dieser Version ist es nötig, dass die Flüssigkeitsmenge jeder Probe wohlkontrolliert ist und das Maßnahmen ergriffen werden die ein Austrocknen der Proben verhindern. Diese Ausführungsform verwendet vorzugsweise hydrophobe Barrieren sowohl auf dem Mikroarray zwischen den Sub-Arrays und auf dem Probenladungsarray zwischen den Probenbereichen. Im Wesentlichen sitzen die Proben bei dieser Ausführungsform als Tropfen auf der Oberfläche des Probenladungsarrays. Das Probenladungs array wird dicht beim Mikroarray angeordnet und die Tropfen der Proben überbrücken die Lücke zwischen dem Probenladungsarray und dem Mikroarray. Die Hybridisierung findet statt in der Flüssigkeit, die abgegrenzt wird von den beiden planaren Oberflächen und zwischen den hydrophoben Bereichen auf den beiden Arrays. Nach der Hybridisierung kann das Mikroarray wie normal gewaschen werden bevor die Resultate ausgelesen werden.
Zusammenfassung
Die vorliegenden Erfindungen stellen eine Vorrichtung und ein Verfahren zur parallelen Ladung von mehrerer Proben in einem Mikroarray bereit, das eine Vielzahl von Unterarrays enthält. Das Verfahren macht von einem Mikroarray Gebrauch, das zahlreiche Sub-Arrays, einen Ladekanalarray und einen Automaten zur Handhabung von Flüssigkeiten oder einen Automaten oder eine Maschine zur Bestückung enthält.

Claims

Verfahren zum Laden von Proben auf ein Mikroarray, das aus einer Vielzahl von Sub-Arrays auf einem gemeinsamen Träger besteht, beinhaltend folgende Schritte: Platzierung der zu ladenden Proben auf ein Probenladungsarray, die Probenanordnung auf dem Probenladungsarray dabei physisch auf die Lage der Sub-Arrays auf dem Mikroarray ausgerichtet; und Platzierung des Probenladungsarrays in Kontakt mit dem Mikroarray unter Bedingungen, so dass Moleküle in den Proben mit den Sonden in den ausgerichteten Sub-Arrays hybridisieren können.
Mikroarray-Hybridisierungskammer zum parallelen Laden von Proben, umfassend: ein Probenladungsarray umfassend eine Vielzahl von Mikrokanälen mit einem ersten offenen Ende auf einer ersten Seite des Kanalarrays und einem zweiten offenen Ende auf einer zweiten Seite des Kanalarrays, wobei erwähntes erstes und zweites Ende einen Kanal in Flüssigkeitskontakt mit der ersten Seite des Kanalarrays und der zweiten Seite des Kanalbereichs definieren, wobei jeder Kanal eine Longitudinalachse besitzt, die durch sein Zentrum läuft und das Zentrum des Kanals definiert; ein Mikroarray umfassend eine Vielzahl von Sub-Arrays; eine Membran in Kontakt mit der zweiten Seite des Kanalarrays zum Verschließen der zweiten Seite der Mikrokanäle und zur Ermöglichung des selektiven Durchtritts von Flüssigkeiten und Molekülen durch die Membran und durch die Mikrokanäle; und eine Dichtung, wobei die Dichtung zwischen der ersten Seite des Kanalarrays und dem Mikroarray angeordnet wird, so dass eine Hybridisierungskammer bereitgestellt wird und wobei die Zentren der Kanäle auf die Zentren der Sub-Arrays ausgerichtet sind.
Kammer nach Anspruch 2, wobei die Dichtung zweiseitig und semi-adhäsiv ist.
Kammer nach Anspruch 2, wobei die Sub-Arrays durch hydrophobe Barrieren getrennt sind.
Kammer nach Anspruch 4, wobei die hydrophobe Barriere hydrophobe Gruppen-tragende Phosphoramidite umfasst.
Kammer nach Anspruch 5, wobei die hydrophobe Gruppentragenden Phosphoramidite Trityl-geschützte Phosphoramidite sind.
Verfahren zum parallelen Laden von wenigstens einer Probe auf eine Vielzahl von Sub-Arrays, das Verfahren umfassend folgende Schritte: Bereitstellen eines Probenladungsarrays umfassend eine Vielzahl von Mikrokanälen mit einem ersten offenen Ende auf einer ersten Seite des Probenladungsarrays und einem zweiten offenen Ende auf einer zweiten Seite des Probenarrays, wobei jeder Kanal eine Longitudinalachse besitzt, die durch sein Zentrum läuft und das Zentrum des Kanals definiert; Bereitstellen eines Mikroarrays umfassend eine Vielzahl von Sub-Arrays; Bereitstellen einer Membran in Kontakt mit der zweiten Seite des Probenladungsarrays zum Verschließen des zweiten Endes von wenigstens einem Mikrokanal und zur Ermöglichung des selektiven Durchtritts von Flüssigkeiten und Molekülen durch die Membran und durch die Mikrokanäle; Anlieferung einer Probe in wenigstens einen Mikrokanal durch dessen erstes offenes Ende; und Inkontaktbringen des Probenarrays mit dem Mikroarray, so dass die Proben in den Mikrokanälen in Kontakt mit dem korrespondierenden Sub-Array kommen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Proben entweder durch Zentrifugalkraft oder Druck in Kontakt mit dem Sub-Array gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Proben unter Verwendung von Vakuum in Kontakt mit dem Sub-Array gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei eine Dichtung sich zwischen dem Probenladungsarray und dem Mikroarray befindet.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Sub-Arrays durch eine hydrophobe Barriere getrennt sind.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die hydrophobe Barriere hydrophobe Gruppen-tragende Phosphoramidite umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Proben der Vielzahl von Mikrokanälen unter Verwendung eines Anlieferungssystems angeliefert werden, das dazu in der Lage ist, gleichzeitig Proben zu vielen Orten anzuliefern.
Ein Verfahren zur gleichzeitigen Hybridisierung eines Mikroarrays mit mehreren Sub-Arrays, umfassend folgende Schritte: Bereitstellen eines ersten Mikroarrays das eine Vielzahl von Sub-Arrays umfasst; Ablegen einer Probe für jedes Sub-Array auf einem planaren Probenladungsarray; Platzierung einer Dichtung an das Mikroarray, die die Sub-Arrays mit den Proben umfasst; und Anordnung des Probenladungsarrays im Kontakt mit der Dichtung, so dass jede Probe auf eins der Sub-Arrays ausgerichtet ist und eine Sandwich-Hybridisierungskammer bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Sub-Arrays durch eine hydrophobe Barriere getrennt sind.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die hydrophobe Barriere aus hydrophobe Gruppen-tragenden Phosphoramiditen besteht die an das Substrat gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Probe einer Vielzahl von Sub-Arrays angeliefert wird indem ein Anlieferungssystem verwendet wird das dazu in der Lage ist gleichzeitig Proben zu mehreren Orten anzuliefern.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Anlieferungssystem entweder ein Bündel von Kapillarröhren, eine Automat zur Handhabung von Flüssigkeiten, oder ein Automat zur Herstellung von gespotteten Arrays ist.