DE10361898A1

DE10361898A1 - Carrier for growing cells comprises microbial cellulose, useful for culturing e.g. multipotent, mesenchymal stem cells or keratinocytes

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Publication number: DE10361898A1
Application number: DE10361898A
Authority: DE
Inventors: Michael Hornung; Maria Dr.-Ing. Ludwig; Hans-Peter Prof. Dr. Schmauder; Ingo Dr. Wilke; Igor Ponomarev
Original assignee: FZMB FORSCHUNGSZENTRUM fur ME; Fzmb Forschungszentrum fur Medizintechnik und Biotechnologie Ev
Current assignee: FZMB FORSCHUNGSZENTRUM fur ME; Fzmb Forschungszentrum fur Medizintechnik und Biotechnologie Ev
Priority date: 2003-12-15
Filing date: 2003-12-15
Publication date: 2005-07-14
Also published as: DE20321115U1

Abstract

Carrier (A) for growing cell cultures consists of microbial cellulose.

Description

Die Erfindung betrifft einen Träger für Zellkulturen.The The invention relates to a carrier for cell cultures.

Tierische Zellkulturen wachsen in der Regel in Monolayer-Schichten auf der Oberfläche von Trägermaterialien, an denen die Zellen durch adsorptive Prozesse fixiert werden. Derartige Techniken der Oberflächenkultur kommen für die Kultur tierischer oder menschlicher Zellen zum Einsatz, wobei die Festigkeit der physikalischen Bindung durch spezifische Eigenschaften der Trägersubstanzen definiert werden. Diese Festigkeit wird oftmals durch äußere Faktoren, z.B. pH – Wert-Verschiebungen, Änderungen in der Ionenstärke der eingesetzten Medien, deutlich beeinflusst. Besonders für das Gebiet des Tissue Engineering, in dem besonderer Wert auf strukturierte dreidimensionale Ausprägung der Kulturen gelegt wird, spielen Eigenschaften des eingesetzten Trägers eine besondere Rolle.animal Cell cultures usually grow in monolayer layers on the surface of carrier materials, where the cells are fixed by adsorptive processes. such Surface culture techniques come for the culture of animal or human cells is used, wherein the strength of the physical bond through specific properties the vehicles To be defined. This strength is often due to external factors, e.g. pH value shifts, changes in ionic strength the media used, clearly influenced. Especially for the area of tissue engineering, where special emphasis is placed on structured three-dimensional expression the cultures are placed, play characteristics of the used carrier a special role.

Die für das Tissue Engineering eingesetzten Materialien stammen meist aus natürlichen Quellen. Sie müssen daher in der Reinheit den Ansprüchen des "Medical Grade" genügen. Häufig sind sie chemisch modifiziert zur besseren Adsorption der Zellen. Sie dürfen aber nicht toxisch bzw. zytotoxisch und sollten im Idealfall biologisch abbaubar sein. Diese Bedingungen müssen zumindest teilweise erfüllt sein, so dass mit den Materialien gute bis hervorragende zelluläre Interaktionen möglich sind. Je nach zu untersuchendem bzw. zu gewinnendem Gewebe müssen diese Materialien zudem bestimmte Voraussetzungen erfüllen.The for the Tissue engineering materials are mostly natural ones Sources. You need to therefore in purity meet the requirements of "Medical Grade". Frequently they are chemically modified for better adsorption of the cells. she allowed to but not toxic or cytotoxic and should ideally be biological be degradable. These conditions must be at least partially met, so that with the materials good to excellent cellular interactions possible are. Depending on the tissue to be examined or harvested, these must Materials also meet certain requirements.

Beispiele für bisher eingesetzte derartige Trägermaterialien sind zum einen als Polymer die Kollagene von Typ I mit heterotrimerer helikaler Struktur. Als häufigstes Polymer von Säugern (Sehnen, Haut, Knochen) ist es relativ leicht zugänglich muss aber sehr gründlich gereinigt werden, um jegliche Kontamination mit BSE-Erregern oder anderen Problemstoffen zu vermeiden. Das Material ist relativ leicht chemisch zu vernetzen bzw. durch partiellen Abbau modifizierbar. Es ist hervorragend zur Zellkultivierung geeignet, aber im allgemeinen zu schnell abbaubar. Es wird auch in der Medizin und Chirurgie verwendet, beispielsweise als Tamponade bzw. bei Milzrupturen, in der Kieferorthopädie.Examples for now used such carrier materials are on the one hand as polymer the collagens of type I with heterotrimeric helical structure. As the most common Polymer of mammals (Tendons, skin, bones) it is relatively easy to access but very thoroughly be cleaned to avoid any contamination with BSE agents or avoid other problem substances. The material is relatively light chemically crosslinked or modifiable by partial degradation. It is excellent for cell cultivation, but in general too quickly degradable. It is also used in medicine and surgery, for example, as a tamponade or in splenic ruptures, in orthodontics.

Zum anderen werden Glykosaminoglykane als natürliche Polymere verwendet. Sie bestehen aus sich wiederholenden Disaccharideinheiten, die überwiegend uronsäurehaltig sind. So werden beispielsweise Chodroitinsulfat und Dermatansulfat verwendet. Auch diese Substanzklasse ist leicht durch Veresterung chemisch modifizierbar. Sie besitzt eine hohe Wasserbindung. Allerdings erfordert der Einsatz im Tissue Engineering und als Unterlage zur Zellkultur einen sehr hohen Reinigungsaufwand. Die Uronsäuregruppen sind leicht mit Calcium komplexierbar, so dass beispielsweise auch Gele, Membranen, Schläuche, Hülsen und Partikel zugänglich sind. Im Gegensatz zu den Kollagenen besitzen die Glykosaminoglykane nur geringe antigene und inflammatorische Eigenschaften, aber geringere adhäsive Eigenschaften.To the Others use glycosaminoglycans as natural polymers. They consist of repeating disaccharide units, predominantly uronsäurehaltig are. For example, chodroitin sulfate and dermatan sulfate uses. This class of substance is also easy to esterify chemically modifiable. It has a high water binding. Indeed requires use in tissue engineering and as a cell culture support a very high cleaning effort. The uronic acid groups are easy with Calcium complexable, so that, for example, gels, membranes, hoses, sleeves and particles accessible are. In contrast to the collagens have the glycosaminoglycans only low antigenic and inflammatory properties, but lower adhesive Properties.

Als dritte natürliche Gruppe sind die Chitosane zu nennen, die Gruppe partiell oder vollständig deacetylierter Chitine. Gewonnen wird es aus Krustaceen-Skeletten. Aufgrund der positiv geladenen Aminogruppe ist es adsorptionsaktiv und des Weiteren chemisch modifizierbar.When third natural Group are called chitosans, the group partially or completely deacetylated Chitins. It is extracted from crustacean skeletons. Due to the It is adsorptively active and chemically charged modifiable.

An synthetische Polymere werden analoge Bedingungen gestellt wie an die Naturstoffe. Die Basis sind meist natürliche Hydroxysäuren, wie Glykol-, Milch,- und Kapronsäuren, die eine hohe Variabilität der mechanischen Eigenschaften in den Polymeren erreichen lassen. Diese Produkte bilden beispielsweise die Basis zur Herstellung von Filmen, Schläuchen oder Vliesen. Sie sind leicht extrudierbar. Weiterhin ist eine Mischung zwischen den Grundmischungen möglich.At Synthetic polymers are given analogous conditions as on the natural substances. The base are mostly natural hydroxy acids, like Glycolic, lactic, and caproic acids, the high variability of the achieve mechanical properties in the polymers. These For example, products form the basis for the production of films hoses or fleeces. They are easily extrudable. Furthermore, it is a mixture between the basic mixtures possible.

(Minuth, W. W., Strehl, R., Schumacher, K.: Zukunftstechnologie Tissue Engineering – Von der Zellbiologie zum künstlichen Gewebe. 1. Ed. – 2003, XII, 348 S., ISBN 3-527-30793-1, Wiley-VCH, Weinheim)(Minuth, W.W., Strehl, R., Schumacher, K .: Future Technology Tissue Engineering - From Cell Biology to the artificial Tissue. 1. Ed. - 2003, XII, 348 p., ISBN 3-527-30793-1, Wiley-VCH, Weinheim)

Alle diese Materialien bedürfen eines Reinigungsaufwandes, da sie bei den Verfahren, in denen sie gewonnen werden, nicht als reines Entprodukt vorliegen bzw. nicht allein in den Quellen auftreten, aus denen sie zugänglich gemacht werden. Des Weiteren ist vor allem bei den chemisch-synthetischen Materialien oder bei den chemisch partiell veränderten Polymeren ein hoher Reinigungsaufwand notwendig, um eventuell störende Begleitstoffe abzutrennen und antigene und inflammatorische Eigenschaften auszuschließen.All these materials require a cleaning effort, as they are in the process in which they are not obtained as pure de-product or not occur solely in the sources from which they are made available become. Furthermore, especially with the chemical-synthetic materials or in the chemically partially modified polymers a high Cleaning effort necessary to separate any interfering impurities and to exclude antigenic and inflammatory properties.

Aus der Schrift WO 0161026 A1 und deren Patentfamilie ist bekannt, dass geformte Biomaterialien auf der Basis biosynthetisch gebildeter bakterieller Zellulose in Zylinderform als Blutgefässersatz, zur Ummantelung von Nervenbahnen oder als Teilersatz von Hohlorganen eingesetzt werden können und dass dieses Material sich in Tierexperimenten bewährt hat. Es ist beschrieben, dass sich an der Innenseite Endothelzellen anlagern können. Die Abmessungen dieser geformten Zelluloseformkörper sind allerdings nur mit inneren Durchmessern von 1–3 mm oder kleiner angegeben. Des Weiteren ist die Besiedlungsfähigkeit nur für Endothelzellen aus Tierversuchen beschrieben.It is known from the document WO 0161026 A1 and its patent family that shaped biomaterials based on biosynthetically formed bacterial cellulose in cylindrical form can be used as blood vessel replacement, for sheathing of nerve tracts or as a partial replacement of hollow organs and that this material has been proven in animal experiments. It is described that endothelial cells can accumulate on the inside. However, the dimensions of these shaped shaped cellulose articles are indicated only with inner diameters of 1-3 mm or smaller. Furthermore, the colonization ability is only for animal endothelial cells described.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Träger für Zellkulturen anzugeben, der die vorgenannten Nachteile der bekannten Träger vermeidet und eine universelle Applikation der mit Zellkulturen bewachsenen Träger ermöglicht.The The object of the present invention is to provide a carrier for cell cultures specify that avoids the aforementioned disadvantages of the known carrier and a universal application of the cell cultures overgrown carrier allows.

Überraschenderweise stellt sich ein Träger, bestehend aus mikrobiell gebildete Zellulose, als ein sehr gut geeignetes Trägermaterial für Zellkulturen und zur universellen Applikation dieser dar.Surprisingly imagine a carrier consisting from microbial cellulose, as a very suitable one support material for cell cultures and for universal application of this dar.

Das Biopolymer mikrobielle Zellulose ist stark hydratisiert, hat durch die im Molekül vorhandenen Hydroxylgruppen sehr gute Anheftmöglichkeiten zur Ausbildung stabiler, zumeist physikalischer Bindungsstellen sowohl für die Zellen als auch für benötigte Medienbestandteile und ist gegenüber Abbau stabil. Aufgrund der hohen Hydratisierung durch die Einlagerung von wässrigen Systemen zwischen die Polymerketten ist eine ideale Grundlage für Zellkulturen gegeben.The Biopolymer microbial cellulose is highly hydrated through those in the molecule existing hydroxyl groups very good attachment possibilities for training stable, mostly physical binding sites for both the cells as well as for needed Media components and is opposite Degradation stable. Due to the high hydration by the storage of watery Systems between the polymer chains is an ideal basis for cell cultures given.

Überraschenderweise konnte weiterhin gefunden werden, dass diese biosynthetisch gebildete, nach Wunsch speziell geformte, homogen strukturierte und hochreine Zellulose aufgrund dieses hohen Hydratisierungsgrades als idealer Träger für die meisten zu kultivierenden Zellen menschlicher und/oder tierischer Herkunft geeignet ist.Surprisingly could be further found that these are biosynthetically formed, according to Desired specially shaped, homogeneously structured and high-purity cellulose because of this high degree of hydration as an ideal carrier for most Cells of human and / or animal origin to be cultured suitable is.

Die nach DE 100 22 751 C2 , DE 101 16 602 A1 und WO 02/081725 A1 gewonnene Zellulose wird nach dem Waschen im Autoklav sterilisiert, in benötigte Formen und Größen gebracht und bei Bedarf mit sterilem Nährmedium versetzt. Diese Nährmedien penetrieren in die wässrige Phase der bakteriellen Zellulose und ermöglichen eine homogene Verteilung der Nährstoffe über die gesamte Fläche. Medien mit geringerem Diffusionsvermögen aufgrund ungünstiger Viskositäten oder physikalischer Bindungen lassen sich durch Schütteln, Mischen oder andere Labortechnologien eintragen.The after DE 100 22 751 C2 . DE 101 16 602 A1 and WO 02/081725 A1 cellulose obtained is sterilized after washing in an autoclave, made into required shapes and sizes and added as needed with sterile nutrient medium. These nutrient media penetrate into the aqueous phase of the bacterial cellulose and allow a homogeneous distribution of nutrients over the entire surface. Less diffusible media due to unfavorable viscosities or physical bonds can be introduced by shaking, mixing, or other laboratory technologies.

Die Zellkulturen werden auf üblichem Wege inokuliert auf die Zelluloseträger und bei Temperaturen zwischen 25 und 40°C, vorzugsweise zwischen 32 und 38°C, im Brutschrank bei 75–95%, vorzugsweise 85–92% Feuchtigkeit bebrütet. Es ist prinzipiell jeder Brutschrank geeignet. Als besonders günstig haben sich Brutschränke mit geregeltem CO₂-Gehalt, günstigstenfalls im Bereich von 5%, erwiesen. Bereits nach wenigen Tagen setzte das Wachstum ein und nach 9–14 Tagen waren je nach Zelltyp die Monolayer ausgebildet. Bei etwas längerem Wachstum bildeten sich unter den optimierten Bedingungen auch mehrlagige Schichten aus.The cell cultures are inoculated in the usual way on the cellulose supports and incubated at temperatures between 25 and 40 ° C, preferably between 32 and 38 ° C, in the incubator at 75-95%, preferably 85-92% moisture. In principle, every incubator is suitable. Incubators with controlled CO ₂ content, at best in the range of 5%, have proven to be particularly favorable. After just a few days, growth began and after 9 to 14 days, depending on the cell type, the monolayers were formed. With a somewhat longer growth, multilayer coatings also formed under the optimized conditions.

Mikrobielle Zellulose ist ein Trägermaterial für alle Typen von Zellkulturen. Besonders gut geeignet sind Kulturen der Epithelzellen der Haut, humane Keratinozyten, HaCaT-Zellen, Humane Osteoblasten, SAOS-2, Osteoblasten des Menschen, Osteoblasten vom Pferd, Chondrozyten vom Pferd und multipotente mesenchymale Stammzellen (MSC), z.B. vom Pferd.microbial Cellulose is a carrier material for all types of cell cultures. Particularly suitable are cultures of epithelial cells Skin, Human Keratinocytes, HaCaT Cells, Human Osteoblasts, SAOS-2, human osteoblasts, osteoblasts from horse, chondrocytes from the horse and multipotent mesenchymal stem cells (MSC), e.g. from the horse.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von drei Ausführungsbeispielen der Verwendung von durch Glucoacetobacter xylinum nach DE 100 22 751 A1 gebildeter Zellulose als Träger von Zellkulturen beschrieben. The invention will be based on three embodiments of the use of Glucoacetobacter xylinum after DE 100 22 751 A1 formed cellulose as a carrier of cell cultures.

1. Ausführunspiel1st execution

Es werden rechtwinklig präparierte, 1–1,5 mm dicken Zelluloseschichten mit einer Fläche von ca. 150 × 75 mm hergestellt und mit einer Kulturlösung Ham's F 12 enthaltend 10% FCS, 50 μg Ascorbinsäure/ml, 30 μg Ketoglutarsäure/ml, 100 U Penicillin/ml und 100 μg Streptomycin/ml versetzt. Auf diese Zelluloseträger werden 4 10⁵ multipotente mesenchymale Stammzellen/cm² übertragen und anschließend dieser beschichtete Zelluloseträger im Brutschank bei 90% Feuchtigkeit und 5% CO₂ bei 37°C bebrütet. Nach 10 Tagen werden zelluläre Monolayerschichten ausgebildet, die sich im Verlauf ihres weiteren Wachstums zu Bilayerschichten weiterentwickeln.There are prepared at right angles prepared, 1-1.5 mm thick cellulose layers with an area of about 150 × 75 mm and with a culture solution Ham's F 12 containing 10% FCS, 50 ug ascorbic acid / ml, 30 ug ketoglutaric / ml, 100 U Penicillin / ml and 100 μg streptomycin / ml. 4 10 ⁵ multipotent mesenchymal stem cells / cm ^{2 are} transferred to these cellulose carriers and then this coated cellulose carrier is incubated in the incubator at 90% moisture and 5% CO ₂ at 37 ° C. After 10 days, cellular monolayer layers are formed which evolve to bilayer layers as they grow further.

2. Ausführungsbeispiel2nd embodiment

Es werden Epidermiszellen, entnommen von gesunden Pferden, unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen angezogen bis sich eine stabile mehrschichtige Epidermiszellschicht auf dem Zelluloseträger (Hautstruktur) gebildet hat. Diese Hautstruktur wird anschließend auf schlecht heilende Wunden am Bein eines Pferdes übertragen. Die übertragene Schicht wächst schnell an und deckt die Wunde ab.It are epidermal cells, taken from healthy horses, among the in Example 1 conditions until a stable multilayer epidermis cell layer on the cellulose carrier (skin structure) has formed. This skin structure is subsequently poorly healing Transfer wounds to the leg of a horse. The transferred layer grows quickly and covers the wound.

3. Ausführungsbeispiel3rd embodiment

Es werden humane Keratinozyten, sogenannte HaCaT-Zellen, auf Träger aus Bakteriencellulose aufgetragen und wie in Beispiel 1 beschrieben kultiviert. Diese Zellen werden zur Ermittlung der Biokompatibilität von Testsubstanzen angezogen. Die so gewonnenen Zellen sind ausgezeichnete und sehr empfindliche Markerzellen zur Ermittlung der Biokompatibilität. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der in vitro kultivierten Zellen wird anhand von Markeraktivitäten der Zellen die Beeinflussung der Stoffwechselaktivitäten durch die zugesetzten Testsubstanzen ermittelt. Markeraktivitäten sind beispielsweise

• Zellzahl-Bestimmung nach 24 und 48
• ATP-Bestimmung
• NMP-41-Bestimmung
• Morphologische Bestimmungen

Human keratinocytes, so-called HaCaT cells, are applied to carriers of bacterial cellulose and cultured as described in Example 1. These cells are grown to determine the biocompatibility of test substances. The cells thus obtained are excellent and very sensitive marker cells for determining the biocompatibility. Due to the high sensitivity of the cells cultivated in vitro, the influence of metabolic activities on the added test substances is determined on the basis of marker activities of the cells. Marker activities are for example

• Cell number determination after 24 and 48
• ATP determination
• NMP-41 determination
• Morphological determinations

Durch Anpassung der Formen des Zelluloseträgers an die Bedingungen der Testung können derartige Biokompatibilitätsuntersuchungen ökonomischer und zeiteffektiver gestaltet werden.By Adapting the forms of the cellulose carrier to the conditions of the Testing can Such biocompatibility studies are more economical and be made more effective.

Claims

carrier for growing cell cultures consisting of microbial cellulose.

Use of the carrier according to claim 1, characterized in that the cell cultures by multipotent mesenchymal stem cells are formed.

Use of the carrier according to claim 1, characterized in that the cell cultures by keratinocytes are formed.

Use of the carrier according to claim 1, characterized in that the cell cultures by epidermal cells are formed.

Use of the carrier according to claim 1, characterized in that the cell cultures by osteoblasts are formed.

Use of the carrier according to claim 1, characterized in that the cell cultures by chondrocytes are formed.