DE10355593A1 - Method for hybridizing biological macromolecules to PCR products bound to a solid surface - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkörperoberfläche gebundene PCR-Produkte, bei dem eine Festkörperoberfläche mit zumindest einem Spot mit daran gebundenen ersten PCR-Produkten bereitgestellt wird, eine Flüssigkeit mit biologischen Makromolekülen auf diese Festkörperoberfläche aufgebracht wird und eine Reaktionszeit zwischen den biologischen Makromolekülen in der Flüssigkeit und den an dem zumindest einen Spot gebundenen PCR-Produkten abgewartet wird. Die Flüssigkeit wird dann in Bewegung versetzt, um eine lokale Verarmung oberhalb des zumindest einen Spots aufzuheben. Die Temperatur wird dann auf einen Wert erhöht, der die während der Reaktion entstandenen Bindungen und ggf. vorhandene dazu konkurrierende Bindungen von Doppelsträngen der an dem zumindest einen Spot gebundenen PCR-Produkte zumindest teilweise auflöst. Nach Absenken der Temperatur wird eine Reaktionszeit zwischen den biologischen Makromolekülen und den an den Spots gebundenen PCR-Produkten abgewartet.The invention relates to a method for hybridizing biological macromolecules to PCR products bound to a solid surface, in which a solid surface is provided with at least one spot with first PCR products bound thereto, a liquid with biological macromolecules is applied to this solid surface and a reaction time between the biological macromolecules in the liquid and awaited at the at least one spot PCR products is awaited. The liquid is then set in motion to release a local depletion above the at least one spot. The temperature is then raised to a value which at least partially dissolves the bonds formed during the reaction and, if present, any competing bindings of double strands of the PCR products bound to the at least one spot. After lowering the temperature, a reaction time between the biological macromolecules and the PCR products bound to the spots is awaited.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkörperoberfläche gebundene PCR-(Polymerase Chain Reaction, Polymerase-Kettenreaktion)-Produkte, bei dem eine Festkörperoberfläche mit zumindest einem Spot mit ersten daran gebundenen PCR-Produkten bereitgestellt wird und eine Flüssigkeit mit biologischen Makromolekülen auf diese Festkörperoberfläche aufgebracht wird.The The invention relates to a method for hybridizing biological macromolecules bonded to a solid surface PCR (Polymerase Chain Reaction, Polymerase Chain Reaction) products, in which a solid surface with provided at least one spot with first attached PCR products becomes and a liquid with biological macromolecules applied to this solid surface becomes.
Die
PCR ist ein bekanntes Verfahren zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen,
wie es z. B. in
Bei bekannten Microarray-Experimenten werden zunächst Microarrays hergestellt, indem man PCR-Produkte in Form eines ein- bzw. zweidimensionalen Arrays auf eine Festkörperoberfläche aufbringt, z. B. ähnlich einem Ink-Jet-Verfahren spottet oder unter Verwendung eines Kontaktdruckverfahrens. Die PCR-Produkte liegen im allgemeinen doppelsträngig vor und haben eine Länge von etwa 200 bis 2000 Basenpaaren. Die Bindung an der Festkörperoberfläche bzw. die Quervernetzung kann z. B. durch UV-Cross-Linking oder durch Festbacken bei hoher Temperatur erfolgen. Typische Spotdurchmesser liegen bei etwa 100 μm und die Zahl der Spots pro Microarray kann bis zu 100.000 betragen.at microarray experiments are first made microarrays, by making PCR products in the form of a one- or two-dimensional Applying arrays to a solid surface, z. B. similar mocking an ink-jet process or using a contact printing process. The PCR products are generally double-stranded and have a length of about 200 to 2000 base pairs. The bond to the solid surface or the crosslinking can z. B. by UV cross-linking or by Caking at high temperature. Typical spot diameter are about 100 microns and the number of spots per microarray can be up to 100,000.
Gegen die so an der Festkörperoberfläche gebundenen PCR-Produkte werden andere biologische Makromoleküle, z. B. cDNA-Moleküle oder andere PCR-Produkte hybridisiert, deren Sequenzen zumindest teilweise komplementär zu den gespotteten PCR-Produkten sind. Dazu werden die cDNA-Moleküle bzw. die weiteren PCR-Produkte in Lösung auf das Microarray mit den gespotteten PCR-Produkten aufgebracht und so die Reaktion ermöglicht.Versus the so bound to the solid surface PCR products will contain other biological macromolecules, e.g. B. cDNA molecules or other PCR products hybridized, whose sequences are at least partially complementary to the spotted PCR products. For this purpose, the cDNA molecules or the other PCR products in solution applied to the microarray with the spotted PCR products and so the reaction allows.
Nach einer typischen Reaktionszeit kann in bekannter Weise untersucht werden, ob bzw. in welchem Maße eine Reaktion der Moleküle in der Lösung mit den an den Spots gebundenen PCR-Produkten stattgefunden hat. Dazu kann z. B. die Fluoreszenz entsprechend präparierter Moleküle untersucht werden.To a typical reaction time can be studied in a known manner be, whether or to what extent a reaction of the molecules in the solution with the PCR products bound to the spots. This can z. B. examined the fluorescence of prepared molecules become.
An einem Spot des Microarrays findet dabei folgender Reaktionsablauf statt. Während der Hybridisierungsreaktion kommt es zu einer kompetitiven Bindung zwischen dem jeweils ersten Strang (im folgenden auch „Sonde") der an dem Spot gebundenen PCR-Produkte und dem ebenfalls gebundenen Komplementärstrang (im folgenden auch „komplementäre Sonde") einerseits und den biologischen Makromolekülen in der Lösung (im folgenden auch „Probenmoleküle") andererseits. Da lokal in der Regel eine höhere Dichte von Sonden und den ebenfalls gebundenen komplementären Sonden vorliegt als von den Molekülen in der Lösung, ist die Zahl der Sonden, die für eine Reaktion mit den Molekülen aus der Lösung zur Verfügung stehen, eher gering. Typischerweise befinden sich pro Spot eines beispielhaften Durchmessers von 100 μm etwa 106 bis 108 Sonden, von denen aber nur etwa 1 Promille bis 10 Prozent für eine Bindung mit Molekülen in der Lösung zur Verfügung steht. Gründe hierfür sind geometriebedingte sterische Hinderung oder kompetitive Renaturierung (Reassoziation), also die Reaktion mit einer komplementären Sonde. Andererseits sind in einem Genexpressionsexperiment etwa 104 bis 109 biologische Makromoleküle, also z. B. cDNA-Moleküle innerhalb des Diffusionsradius in der Lösung vorhanden, so daß für stark exprimierte Gene innerhalb des typischen Diffusionsradius eines über-Nacht-Experimentes nicht genügend Bindungsstellen zur Verfügung stehen und das Signal in die Sättigung übergeht.The following reaction sequence takes place at a spot of the microarray. During the hybridization reaction there is a competitive bond between the respective first strand (hereinafter also referred to as "probe") of the PCR products bound to the spot and the likewise bound complementary strand (hereinafter also referred to as "complementary probe") on the one hand and the biological macromolecules in FIG On the other hand, since there is typically a higher density of probes and the complementary probes also bound locally than from the molecules in the solution, the number of probes required for reaction with the molecules Typically, about 10 6 to 10 8 probes are found per spot of an exemplary diameter of 100 μm, of which only about 1 per thousand to 10 per cent are available for binding with molecules in the solution Reasons for this are geometric steric hindrance or competitive renaturation (reassociation ), ie the reaction with a complementary probe. On the other hand, in a gene expression experiment about 10 4 to 10 9 biological macromolecules, ie z. For example, cDNA molecules are present within the diffusion radius in the solution, so that for strongly expressed genes within the typical diffusion radius of an overnight experiment, insufficient binding sites are available and the signal becomes saturated.
Zur Lösung dieser Problematik werden heutzutage bereits beim Spotten der PCR-Produkte auf die Festkörperoberfläche denaturierende Substanzen (z. B. DMSO, Dimethylsulfoxid) zugegeben, die verhindern sollen, daß die PCR-Produkte, die an den Spots gebunden sind, renaturieren (reassoziieren). Während der Hybridisierungsreaktion selbst können derartige denaturierende Substanzen allerdings nicht präsent sein, da sonst auch eine Bindung einer an einem Spot gebundenen Sonde mit einem komplementären Molekül aus der Lösung nicht möglich wäre. Während der Hybridisierungsreaktion bildet sich also die doppelsträngige Ausführung des an den Spots gebundenen PCR-Produktes teilweise wieder aus, so daß auch bei dieser bekannten Verfahrensführung die oben beschriebene kompetitive Reaktion stattfindet.to solution These problems are nowadays when spotting the PCR products on the Solid-state surface denaturing Substances (eg DMSO, dimethylsulfoxide) are added to prevent this should that the Renaturate (reassociate) PCR products bound to the spots. During the Hybridization reaction itself may be such denaturing substances, however, should not be present, as otherwise a Binding of a probe bound to a spot with a complementary molecule from the solution not possible would. During the Hybridization reaction thus forms the double-stranded execution of the partially bounded at the spots PCR product, so that even at this known procedure the above-described competitive reaction takes place.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkörperoberfläche gebundene PCR-Produkte anzugeben, bei dem die Zahl der Sonden, die für die Bindung zur Verfügung stehen, erhöht ist und das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert ist.task The present invention is an improved method for Hybridization of biological macromolecules to solid-surface-bound PCR products specify the number of probes available for binding, elevated is and the signal-to-noise ratio is improved.
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren zur Hybridisierung gelöst, das die Merkmale des Anspruches 1 aufweist. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand von Unteransprüchen. Vorteilhafte Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 6 und 7.These Task is solved with a method for hybridization, the having the features of claim 1. Advantageous embodiments are the subject of dependent claims. Advantageous uses of the method according to the invention are the subject matter the claims 6 and 7.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf einer Kombination von Temperaturschritten und dem Mischen bzw. Bewegen der Moleküle in der Lösung.The inventive method is based on a combination of temperature steps and mixing or moving the molecules in the solution.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Festkörperoberfläche bereitgestellt, die zumindest einen Spot aufweist, an dem erste PCR-Produkte gebunden sind. Auf diese Festkörperoberfläche wird eine Flüssigkeit mit biologischen Makromolekülen aufgebracht, die mit den an den Spots gebundenen PCR-Produkten reagieren sollen. Eine typische Reaktionszeit zwischen den verwendeten Makromolekülen und den an den Spots gebundenen PCR-Produkten wird abgewartet. Während dieser Reaktionszeit hybridisieren die Moleküle aus der Flüssigkeit mit den an den Spots gebundenen PCR-Produkten, z. B. bis eine Sättigung erreicht ist. Die Hybridisierungstemperatur kann dabei je nach verwendetem Material z. B. zwischen 35°C und 65°C liegen.at the method according to the invention a solid surface is provided, which has at least one spot to which first PCR products are bound are. On this solid surface is a liquid with biological macromolecules applied, which react with the bound at the spots PCR products should. A typical reaction time between the used macromolecules and the PCR products bound to the spots are awaited. During this Reaction time the molecules hybridize out of the liquid with the PCR products bound to the spots, e.g. B. to saturation is reached. The hybridization temperature can vary depending on the used Material z. B. between 35 ° C. and 65 ° C lie.
Durch diesen Hybridisierungsprozeß von Molekülen aus der Flüssigkeit an den PCR-Produkten der Spots entsteht oberhalb der Spots eine lokale Verarmung an zur Reaktion mit den PCR-Produkten an den Spots zur Verfügung stehenden Molekülen.By this hybridization process of molecules the liquid on the PCR products of the spots arises above the spots one local depletion of reaction to the PCR products at the spots to disposal standing molecules.
In einem weiteren Schritt wird die Flüssigkeit in Bewegung versetzt, um die so entstandene lokale Verarmung aufzuheben. Durch diesen erfindungsgemäßen Schritt ist gewährleistet, daß im Diffusionsradius um die einzelnen Spots herum wieder im wesentlichen die ursprüngliche Anzahl von für die Reaktion zur Verfügung stehenden Makromolekülen in der Flüssigkeit vorliegt.In a further step, the liquid is set in motion, to lift the resulting local impoverishment. Through this step according to the invention is guaranteed that in the Diffusion radius around the individual spots around again substantially the original Number of for the reaction available standing macromolecules in the liquid is present.
In dem anschließenden Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Temperatur z. B. mit einer Widerstandsheizung auf einen Wert erhöht, bei dem sich die Bindungen, die während der Hybridisierungsreaktion zwischen Makromolekülen aus der Flüssigkeit und den an den Spots gebundenen PCR-Produkten entstanden sind, und ggf. vorhandene dazu konkurrierende Bindungen von an den Spots gebundenen Sonden und an den Spots gebundenen komplementären Sonden zumindest teilweise wieder lösen. Die Temperatur wird also so hoch gewählt, daß auch die ursprünglich auf der Festkörperoberfläche hybridisierten Doppelstränge aufbrechen. Die notwendige Temperaturerhöhung ist abhängig vom verwendeten Material und kann typischerweise z. B. einige wenige Grad betragen. Während dieses Schrittes befindet sich die Flüssigkeit vorteilhafterweise in Ruhe. Durch diesen temperaturinduzierten Bindungslösungsprozeß ergibt sich eine lokale Konzentrationserhöhung der betrachteten biologischen Makromoleküle oberhalb der Spots. Nach Absenken der Temperatur bzw. abkühlen lassen auf die typische Hybridisierungsprozeßtemperatur wird ein weiteres Mal eine typische Reaktionszeit abgewartet, während der Makromoleküle aus der Flüssigkeit mit den PCR-Produkten an den Spots hybridisieren können. Während dieses zweiten Hybridisierungsprozesses konkurriert die lokal erhöhte Konzentration der betrachteten biologischen Makromoleküle in der Flüssigkeit mit der konstant gebliebenen Anzahl von gebundenen komplementären Sonden. Auf diese Weise ist die Zahl der Makromoleküle aus der Flüssigkeit, die eine Bindung eingehen wird, erhöht und das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert sich signifikant.In the subsequent Step of the method according to the invention the temperature is z. B. with a resistance heater on a Value increased, at the bonds that are during the hybridization reaction between macromolecules from the liquid and the PCR products bound to the spots, and possibly existing competing bindings of bound at the spots Probes and bound to the spots complementary probes at least partially solve again. The temperature is chosen so high that the original on the solid surface hybridized duplexes set out. The necessary temperature increase depends on used material and can typically z. B. a few Degrees. While This step, the liquid is advantageously in peace. By this temperature-induced binding solution process results a local concentration increase of the considered biological macromolecules above the spots. After lowering the temperature or allow to cool on the typical hybridization process temperature will be another time a typical reaction time is waited for while the macromolecules from the liquid can hybridize with the PCR products at the spots. During this second hybridization process competes with the locally increased concentration of the considered biological macromolecules in the liquid with the number of bound complementary probes remaining constant. In this way, the number of macromolecules from the liquid, which will bond, increases and improves the signal-to-noise ratio significantly.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf einem einzelnen Spot durchgeführt werden. Vorteilhafterweise wird zur Parallelisierung der Prozeßführung jedoch ein Microarray eingesetzt, wobei ggf. an unterschiedlichen Spots dieses Microarrays unterschiedliche PCR-Produkte gebunden sind.The inventive method can be done on a single spot. advantageously, However, for parallelization of the process control, a microarray used, possibly at different spots of this microarray different PCR products are bound.
Während des ersten und/oder zweiten Hybridisierungsprozesses befindet sich das System bei einer Temperatur unterhalb derjenigen Temperatur, die zum Aufbrechen der Hybridisierungsbindungen notwendig ist. Die Temperaturen während des ersten und des zweiten Hybridisierungsprozesses müssen jedoch nicht gleich sein. Typische Hybridisierungstemperaturen liegen je nach Material z. B. zwischen 35°C und 65°C.During the the first and / or second hybridization process is the System at a temperature below that temperature, the Breaking the hybridization bonds is necessary. The temperatures while However, the first and second hybridization processes must not be the same. Typical hybridization temperatures are ever for material z. B. between 35 ° C. and 65 ° C.
Die
Bewegung in der Flüssigkeit
kann durch einen Rühr-
oder Schüttelprozeß erreicht
werden. Besonders vorteilhaft ist die Applikation von Schallwellen,
vorzugsweise Oberflächenschallwellen
auf der Festkörperoberfläche. Der
Impulsübertrag
derartiger Schallwellen bzw. Oberflächenschallwellen auf die Flüssigkeit
bewirkt eine effektive und präzise
Bewegung der Flüssigkeit
auf der Oberfläche.
Die Verwendung von Oberflächenschallwellen
zur Erzeugung von Bewegung in kleinen Flüssigkeitsmengen ist allgemein
in
Das erfindungsgemäße Verfahrensprotokoll kann mehrfach durchlaufen werden, wobei sich bei jedem Zyklus die Zahl der Bindungen der Makromoleküle aus der Flüssigkeit mit den PCR-Produkten an den Spots erhöht.The Process protocol according to the invention can be traversed several times, with each cycle the number the bonds of the macromolecules from the liquid increased with the PCR products at the spots.
Die typischen Reaktionszeiten zwischen den in der Flüssigkeit vorhandenen Makromolekülen und an den Spots gebundenen PCR-Produkten und die einzusetzenden Temperaturen während des Bindungslösungsprozesses können durch Vorabexperimente bestimmt werden oder aus Werten abgeschätzt werden, die für die Hybridisierung der verwendeten Materialien bzw. für das Aufbrechen der Bindung zwischen diesen Materialien bekannt sind.The typical reaction times between the present in the liquid macromolecules and the spots bound PCR products and the temperatures to be used while the binding solution process can be determined by preliminary experiments or estimated from values, the for the hybridization of the materials used or for the breaking up the bond between these materials are known.
Besonders vorteilhaft läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Hybridisierung von cDNA-Molekülen, genomischer DNA oder RNA-Molekülen an PCR-Produkten und zur Hybridisierung von zweiten PCR-Produkten an den ersten an den Spots gebundenen PCR-Produkten einsetzen.Especially can be advantageous the inventive method for hybridization of cDNA molecules, genomic DNA or RNA molecules to PCR products and for hybridization of second PCR products to the first one use the spots bound PCR products.
Im folgenden wird anhand eines Beispielexperimentes eine Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Detail geschildert.in the The following will be an embodiment based on an example experiment the method according to the invention described in detail.
Zur Erläuterung wird beispielhaft angenommen, daß die Zahl der PCR-Produkte auf einem Spot je Strang 108 betragen soll. Etwa 1 Prozent, also 106 PCR-Produkte stehen dann typischerweise in einem über-Nacht-Experiment zur Hybridisierung zur Verfügung.By way of illustration, it is assumed by way of example that the number of PCR products on a spot per strand should be 10 8 . About 1 percent, ie 10 6 PCR products are then typically available in an overnight hybridization experiment.
Auf die derart vorbereitete Festkörperoberfläche mit den PCR-Produkten an den Spots wird eine Flüssigkeit mit fluoreszenzmarkierten, zu den PCR-Produkten an den Spots zumindest teilweise komplementären Farbstoffmolekülen, z. B. cDNA-Moleküle in einer Menge von z. B. 106 Molekülen in einem Volumen der Dimension eines Diffusionsradius eines typischen Über-Nacht-Experimentes (ca. 1 mm) aufgebracht. Insgesamt stehen auf einem Array von ca. 1 cm2 etwa 108 Moleküle für die Bindung zur Verfügung.On the thus prepared solid surface with the PCR products at the spots, a liquid with fluorescently labeled, to the PCR products at the spots at least partially complementary dye molecules, eg. B. cDNA molecules in an amount of z. B. 10 6 molecules in a volume of the dimension of a diffusion radius of a typical overnight experiment (about 1 mm) applied. Overall, about 10 8 molecules are available for binding on an array of about 1 cm 2 .
Unter den geschilderten Bedingungen wäre das Signal nach einem über-Nacht-Experiment in Sättigung. Weder eine Verlängerung der Hybridisierungszeit noch das Versetzen der Probenlösung in Bewegung führen zu einer Erhöhung des Signales, obwohl nur etwa 1 Prozent der vorhandenen cDNA-Moleküle eine Bindung eingegangen sind. Ein Grund hierfür ist die Konkurrenzreaktion, die aus der Bindung der beiden komplementären Stränge der gebundenen PCR-Produkte besteht.Under that would be the described conditions Signal after an overnight experiment in saturation. Neither an extension the hybridization time still moving the sample solution in motion to lead to an increase of the signal, although only about 1 percent of the existing cDNA molecules have a Binding have been received. One reason for this is the competitive reaction, resulting from the binding of the two complementary strands of bound PCR products consists.
Gemäß einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Signal durch folgende Verfahrensführung erhöht. Dabei ist auch ein mehrmaliges Durchlaufen des Zyklus möglich.According to one Embodiment of the method according to the invention the signal is increased by the following procedure. It is also a multiple Going through the cycle possible.
Wie bereits beschrieben, werden zunächst in einem ersten Hybridisierungsschritt die cDNA-Moleküle auf den Spot bei der Hybridisierungstemperatur hybridisiert. Im Ergebnis sind etwa 106 cDNA-Moleküle an einem Spot gebunden.As already described, the cDNA molecules are first hybridized to the spot at the hybridization temperature in a first hybridization step. As a result, about 10 6 cDNA molecules are bound to a spot.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die durch die Hybridisierungsreaktion oberhalb der Spots entstandene lokale Verarmung an cDNA-Molekülen durch Mischen, z. B. durch Applikation von Oberflächenschallwellen, deren Impuls übertrag die Flüssigkeit auf der Oberfläche in Bewegung versetzt, aufgehoben. Innerhalb des Diffusionsradius um den Spot sind dadurch wieder etwa 106 cDNA-Moleküle vorhanden.According to the method of the invention, the local depletion of cDNA molecules resulting from the hybridization reaction above the spots is caused by mixing, e.g. B. by application of surface acoustic waves whose momentum transfer the liquid on the surface set in motion, repealed. Within the diffusion radius around the spot thereby again about 10 6 cDNA molecules are present.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird im folgenden die Temperatur auf einen Wert erhöht, daß die Bindungen sowohl der cDNA-Moleküle mit den an den Spots gebundenen PCR-Produkten als auch die Bindung der komplementären Stränge der gebundenen PCR-Produkte untereinander zumindest teilweise wieder aufschmelzen. Je nach Material liegt diese Temperatur typischerweise z. B. einige Grad höher. Während dieses Schrittes ist die Probenflüssigkeit in Ruhe. Es kommt durch diesen temperaturinduzierten Bindungslösungsprozeß zu einer lokalen Konzentrationserhöhung von cDNA-Molekülen oberhalb des Spots, deren Zahl sich nun mit 2 × 106 gegenüber der Ausgangskonzentration verdoppelt hat. Bei dem folgenden Hybridisierungsschritt nach der Abkühlung konkurriert jetzt die doppelte Zahl von cDNA-Molekülen mit einer konstanten Anzahl komplementärer Sonden von gebundenen PCR-Produkten um eine spezifische Bindung mit gebundenen Sonden im Vergleich zur Ausgangskonzentration. Dadurch wird die Zahl der cDNA-Moleküle, die eine Bindung eingehen wird, erhöht.According to the method of the invention, the temperature is subsequently raised to a value such that the bonds of both the cDNA molecules with the PCR products bound to the spots and the binding of the complementary strands of the bound PCR products with one another are at least partially remelted. Depending on the material, this temperature is typically z. B. a few degrees higher. During this step, the sample fluid is at rest. It comes through this temperature-induced binding solution process to a local concentration increase of cDNA molecules above the spot, whose number has now doubled with 2 × 10 6 compared to the starting concentration. In the subsequent hybridization step after cooling, now double the number of cDNA molecules with a constant number of complementary probes of bound PCR products competes for a specific binding with bound probes compared to the starting concentration. This will increase the number of cDNA molecules that will bind.
Eine Bewegung der Flüssigkeit z. B. durch Applikation von Oberflächenschallwellen während der Hybridisierungsreaktionen ist möglich, darf jedoch nur so geringfügig sein, daß die während der Temperaturerhöhung erzeugte lokale Konzentrationserhöhung erhalten bleibt.A Movement of the liquid z. B. by application of surface acoustic waves during the Hybridization reactions is possible but may only be so minor be that the while the temperature increase generated local concentration increase is maintained.
Gegebenenfalls kann dieses Verfahrensprotokoll mehrmals durchlaufen werden, wobei sich bei jedem Zyklus die Zahl der gebundenen cDNA-Moleküle erhöht.Possibly This procedure protocol can be run through several times, where the number of bound cDNA molecules increases with each cycle.
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