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Die
Erfindung betrifft in Scanmikroskop mit einer Vorrichtung zum Ermitteln
von Eigenschaften eines Lichtstrahles, die ein Mittel zum Abspalten
eines Messstrahles von dem Lichtstrahl und mindestens einen Detektor
beinhaltet, der den Messstrahl zumindest teilweise empfängt, wobei
im Strahlengang des Messstrahles ein Polarisationsbeeinflussungsmittel
vorgesehen ist.
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In
der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet,
um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht
zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit
Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen
durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei
die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein
Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung
der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen
bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird
in Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente
mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell
in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus
eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales
Scanmikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik,
mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog.
Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis
des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird
beispielsweise über
einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über die
Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht,
das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen
Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine
Punktinformation erhält,
die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen
Bild führt.
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Anstelle
des Strahlteilers kann zum Einkoppeln des Anregungslichts mindestens
einer Lichtquelle in das Mikroskop und zum Ausblenden des am Objekt
gestreuten und reflektierten Anregungslichts bzw. der Anregungswellenlänge aus
dem über
den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Lichts auch eine
als akustooptisches Bauteil ausgestaltete optische Anordnung vorgesehen
sein, wie beispielsweise aus der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 199 06 757 A1 bekannt
ist.
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Meist
wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme
erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem
Objekt idealer Weise einen Mäander
beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position,
anschließend
x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung
auf die nächste
abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position,
diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise
Bilddatennahme zu ermöglichen,
wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht
verschoben und so die nächste
abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Zum
Transport des Beleuchtungslichts von der Lichtquelle in ein Scanmikroskop
wird üblicherweise
eine Lichtleitfaser verwendet. Im Allgemeinen ist die Polarisationsrichtung,
mit der das Beleuchtungslicht die Faser verlässt, nicht konstant, sondern abhängig von
der Temperatur, der Biegung der Lichtleitfaser (beispielsweise infolge
von Doppelbrechung) oder anderen äußeren Einflüssen beliebig verdreht. Dieser
störende
Effekt tritt selbst bei sog. polarisationserhaltenden Lichtleitfasern
auf.
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Insbesondere
der Strahlteiler bzw. das stattdessen verwendbare akustooptisches
Bauteil zeigen in Abhängigkeit
der Polarisation des Lichtstrahles ein unterschiedliches Verhalten;
beispielsweise in Bezug auf das Teilungsverhältnis des Strahlteilers oder
in Bezug auf die Amplitude des von der akustischen Welle des akustooptischen
Bauteils gebeugten Lichts. Auch die übrigen Komponenten des Scanmikroskops
zeigen ein polarisationsabhängiges
Verhalten, so dass es durch Veränderungen
der Polarisation des Beleuchtungs-Lichtstrahls zwangsläufig zu störenden Änderungen
der Lichtleistung am Ort der Probe kommt.
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Bei
vielen Anwendungen werden Proben mit mehreren Markern, beispielsweise
mehreren unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen präpariert.
Diese Farbstoffe können
sequentiell, beispielsweise mit Beleuchtungslichtstrahlen, die unterschiedliche
Anregungswellenlängen
aufweisen, angeregt werden. Auch eine simultane Anregung mit einem
Beleuchtungslichtstrahl, der Licht mehrerer Anregungswellenlängen beinhaltet,
ist üblich.
Aus der
EP 0 495 930 B1 : „Konfokales
Mikroskopsystem für
Mehrfarbenfluoreszenz" ist
beispielsweise eine Anordnung mit einem einzelnen mehrere Laserlinien
emittierenden Laser bekannt. Derzeit sind in der Praxis solche Laser
meist als Mischgaslaser, insbesondere als ArKr-Laser, ausgebildet.
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Die
Lichtleistung des Beleuchtungslichtes ist auf Grund verschiedener
Effekte zeitlichen Schwankungen unterworfen, was sich negativ bei
der Untersuchung von Proben auswirkt.
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Eine
bekannte Methode, Kurzzeitschwankungen, beispielsweise der Beleuchtungslichtleistung,
auszugleichen, beruht darauf, mit Hilfe eines Strahlteilers vom
Beleuchtungsstrahl einen Referenzstrahl abzuteilen und zur Bilderzeugung/-berechnung
das Verhältnis
der gemessenen Leistungen von Referenz- und Detektionslichtstrahl
zu verwenden; das sich so instantane Leistungsschwankungen aufheben.
Dies ist offenbart in: G.J. Brakenhoff, Journal of Microscopy, Vol.
117, Pt 2, November 1979, S. 233-242. Diese Methode hat. einige
Nachteile. Beispielsweise ist Herausrechnen der Laserleistungsschwankungen
im Nachhinein bei der Bildberechnung aufwändig und nicht immer eine voll
befriedigende Korrekturmethode. Bei einer Verhältnisbildung aus gemessener
Leistung von Referenz- und Detektionslichtstrahl kürzen sich
Offsetanteile nicht heraus. Darüber
hinaus wird das errechnete Rasterbild an den Orten sehr niedriger
Detektionslichtleistungen verwaschen, da das Signal-zu-Rausch-Verhältnis es nicht
mehr zulässt,
dem abgerasterten Bildpunkt eine Färbung oder Helligkeit korrekt
und eindeutig zuzuordnen.
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Aus
der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 100 33 269 A1 ist eine Vorrichtung zum
Einkoppeln von Licht in ein konfokales Rastermikroskop bekannt, die
zum Ziel hat, diese Schwankungen der Beleuchtungslichtleistung zu
kompensieren bzw. zu vermeiden. Die Vorrichtung zum Einkoppeln von
Licht weist ein optisch aktives Bauteil, das insbesondere zur Selektion
der Wellenlänge
und zur Einstellung der Leistung des eingekoppelten Lichts dient,
auf. Die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass zur Beeinflussung
des eingekoppelten Lichts das Bauteil als Stellglied einer Regelung
dient. Nachteilig an dieser Vorrichtung ist, dass der Strahlteiler,
der den Beleuchtungslichtstrahlengang vom Detektionsstrahlengang
trennt, zwangsläufig
eine polarisations- und wellenlängenabhängige Reflexivität aufweist.
Der Regelungsvorgang wird dadurch aufwändig und kompliziert und macht
aufwändige
Kalibrationsmessungen nötig.
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In
der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 197 02 753 A1 wird vorgeschlagen, permanent
die Leistung der in den Scankopf eingekoppelten Laserstrahlung,
insbesondere jeder einzelnen Laserlinie, zu überwachen und Schwankungen
am Laser direkt oder mit einem nachgeschalteten Intensitätsmodulator
(ASOM, AOTF, EOM, Shutter) zu kompensieren. Die bereits erläuterte Strahlteiler-Problematik
ist auch in Bezug auf diese Offenbarung relevant.
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Aus
DE 196 21 802 A1 ist
eine Vorrichtung zum Steuern der Strahlungsintensität bekannt.
Die Vorrichtung umfasst einen Strahlteiler zum Aufteilen des Strahlungsflusses
einer Lasers in einen Hauptstrahlungsfluß und einen Monitorstrahlungsfluß. Es ist
ein Sensor vorgesehen, der die Strahlungsintensität es Monitorflusses
detektiert. Vor dem Sensor kann ein Polarisationsfilter angeordnet
sein.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Scanmikroskop anzugeben,
das eine zuverlässigere und
reproduzierbare Überwachung
der Lichtleistung des an der Probe ankommenden Beleuchtungs-Lichtstrahles
ermöglicht.
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Die
Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass ein Verarbeitungsmodul vorgesehen ist, das in Abhängigkeit von
zumindest einer mit dem Detektor gemessenen Lichtleistung, die Lichtleistung
und/oder die Polarisation des Lichtstrahls steuert bzw. regelt und
dass als Stellglied eines Regelkreises ein weiteres Polarisationsbeeinflussungsmittel
im Strahlengang des Lichtstrahls angeordnet ist.
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Die
Erfindung hat den Vorteil, dass Veränderungen der Polarisation
und der Lichtleistung des Beleuchtungs-Lichtstrahles am Ort der
Probe zuverlässig
und effizient detektierbar und damit kompensierbar oder korrigierbar
sind.
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Vorzugsweise
ist ein Speichermodul vorgesehen, in dem Referenzdaten, beispielsweise
aus Kalibrationsmessungen, ablegbar sind, um von den gemessenen
Eigenschaften des Messstrahles auf die Eigenschaften des Lichtstrahles,
insbesondere am Ort der Probe, schließen zu können.
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Das
Polarisationsbeeinflussungsmittel ist in einer bevorzugten Ausgestaltung
ein senkrecht zur optischen Achse des Messstrahles angeordneter
und um die optische Achse drehbar gelagerter Linear-Polarisationsfilter,
der vorzugsweise von einem Motor kontinuierlich um die optische
Achse gedreht wird. Aus der Modulation des Signals auf dem bzw.
auf den Detektoren kann dann auf den Polarisationsgrad des Lichtstrahles
geschlossen werden.
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In
einer anderen Variante beinhaltet das Polarisationsbeeinflussungsmittel
ein LCD-Element, das kontinuierlich zwischen mindestens zwei Polarisationszuständen hin
und her schaltet. Als Polarisationsbeeinflussungsmittel kann beispielsweise
auch ein EOM (Elektro-Optischer-Modulator)
vorgesehen sein. Vorteilhafter Weise werden hierbei keine mechanisch
beweglichen Bauteile benötigt.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung ist ein Mittel zur simultanen farbselektiven
Detektion des Messstrahles vorgesehen. Das Mittel beinhaltet vorzugsweise ein
räumlich
spektral aufspaltendes Element, das beispielsweise als Prisma ausgeführt ist. Es
kann beispielsweise auch als Gitter, insbesondere als Transmissionsgitter,
ausgeführt
sein. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung bildet eine, vorzugsweise
beschichtete Fläche
des Prismas den Strahlteiler. Es kann sich bei der Beschichtung
beispielsweise um eine Teilverspiegelung handeln. Ein Prisma hat
den Vorteil, dass Mehrfachreflexionen nicht zu Interferenzerscheinungen
auf dem Detektor führen,
da es bei einem Prisma keine parallelen Flächen gibt. Zur Vermeidung von
Reflexen, die nach mehrmaligem Umlenken innerhalb der Prismas schließlich auf
den Detektor treffen und dort das Signal verfälschen, können einzelne Flächen des
Prismas aufgeraut sein.
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Vorzugsweise
sind mehrere Einzeldetektoren vorgesehen, die jeweils spektral unterschiedliche Anteile
des Messlichts empfangen. Der Detektor bzw. die Einzeldetektoren
können
beispielsweise eine Photodiode oder einen Photomultiplier oder eine Photodiodenzeile
oder ein Photodiodenarray oder ein CCD-Element oder ein Photomultiplierarray
oder eine Photomultiplierzeile beinhalten. Die Einzeldetektoren
sind vorzugsweise einzeln jeweils für die Wellenlänge kalibriert,
die sie empfangen.
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Es
ist ein weiteres Polarisationsbeeinflussungsmittel im Strahlengang
des Lichtstrahles angeordnet, das an Hand der gemessenen Eigenschaften des
Messstrahles die Polarisation auf einem Sollwert hält. Hierfür ist ein
Regelkreis vorgesehen, bei dem die Vorrichtung zur Ermittlung das
Messglied und das Polarisationsbeeinflussungsmittel das Stellglied
ist.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung ist ein akustooptisches Bauteil
als Stellglied eines Regelkreises vorgesehen, das die Lichtleistung
des Lichtstrahles an Hand der gemessenen Eigenschaften des Messstrahles
konstant hält.
Das akustooptische Bauteil ist vorzugsweise als AOTF (acousto optical tunable
filter) oder als AOM (akustooptischer Modulator) ausgeführt. Akustooptische
Filter sind weithin bekannt. Nur beispielsweise ist hier die Deutsche
Offenlegungsschrift
DE
197 13 254 A1 oder die bereits erwähnte Deutsche Offenlegungsschrift
DE 199 06 757 A1 zu
nennen. In akustooptischen Filtern (AOTF) wird mit Hilfe eines Schallerzeugers,
beispielsweise einem Piezoelement, das von einer elektromagnetischen
Steuerfrequenz angesteuert wird, eine mechanische Welle erzeugt,
die den AOTF durchläuft
und an dem eine Lichtwelle beugbar bzw. streubar ist. Akustooptische
Filter sind idealer Weise derart aufgebaut, dass nur der Anteil
der zur Steuerfrequenz korrespondierenden Wellenlänge von
dem übrigen einfallenden
Licht durch Beugung getrennt wird. Durch geeignete Wahl der Amplitude
der Schallwelle, ist die Leistung des gebeugten Lichts einstellbar.
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In
einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltung ist das Scanmikroskop
ein konfokales Scanmikroskop.
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In
der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt
und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder
gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind.
Dabei zeigen:
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1 eine Vorrichtung zum Ermitteln
der Eigenschaften eines Lichtstrahls und
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2 ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop.
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1 zeigt eine Vorrichtung 27 zum
Ermitteln der Eigenschaften eines Lichtstrahls 1. Von dem Lichtstrahl 1 wird
mit einem Strahlteiler 3 ein Messstrahl 5, dessen
Lichtleistung wenige Prozent der Lichtleistung des Lichtstrahles
aufweist, abgespalten. Dieser trifft auf ein Polarisationsbeeinflussungsmittel 7,
das als Linear-Polarisationsfilter 9 ausgeführt ist.
Das Polarisationsbeeinflussungsmittel 7 ist senkrecht zur
optischen Achse des Messstrahles 5 angeordnet und um die
optische Achse drehbar gelagert. Die Drehung erfolgt kontinuierlich
mit einem Antriebsmittel 11, das als Linearmotor 13 ausgeführt ist.
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Nach
Passieren des Polarisationsbeeinflussungsmittels 7 trifft
der Messstrahl 5 auf ein räumlich spektral aufspaltendes
Element 15, das als Prisma 17 ausgeführt ist
und anschließend
auf einen Detektor 19, der als Photodiodenzeile 21 ausgeführt ist.
In den Einzeldetektoren 23 der Photodiodenzeile 21 werden
zur Lichtleistung des jeweiligen spektralen Anteils proportionale
elektrische Signale erzeugt, die über die Leitung 25 zu
einem Verarbeitungsmodul geleitet werden können. Aus der Modulation des
Signals kann auf den Polarisationsgrad des Lichtstrahles geschlossen
werden.
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2 zeigt schematisch ein
erfindungsgemäßes Scanmikroskop 29,
das als konfokales Scanmikroskop ausgeführt ist. Der von einem Beleuchtungssystem 31 kommende
Lichtstrahl 1 wird mit der Einkoppeloptik 33 in
eine Glasfaser 35 eingekoppelt und trifft nach der Auskopplung
aus der Glasfaser 35 mit Hilfe der Auskoppeloptik 37 auf
die Beleuchtungslochblende 39, passiert diese und gelangt
zu einer Vorrichtung 27 zur Ermittlung der Eigenschaften
eines Lichtstrahls 1, die analog zu der in 1 beschriebenen ausgeführt ist,
so dass auf diesen Teil der Beschreibung verwiesen werden kann.
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Der
Lichtstrahl 1 gelangt über
den Hauptstrahlteiler 43 zum kardanisch aufgehängten Scanspiegel 45,
der den Lichtstrahl 1 durch die Scanoptik 47,
die Tubusoptik 49 und das Objektiv 51 hindurch über bzw.
durch die Probe 53 führt.
Der Lichtstrahl 1 wird bei nicht transparenten Proben 53 über die
Probenoberfläche
geführt.
Bei biologischen Proben 53 (Präparaten) oder transparenten
Proben kann der Lichtstrahl 1 auch durch die Probe 53 geführt werden. Dies
bedeutet, dass verschiedene Fokusebenen der Probe 53 nacheinander
durch den Lichtstrahl 1 abgetastet werden können. Das
von der Probe 53 ausgehende Detektionslicht 55 gelangt
durch das Objektiv 51, die Tubusoptik 49 und die
Scanoptik 47 hindurch und über den Scanspiegel 45 zum
Hauptstrahlteiler 43, passiert diesen und trifft auf eine
Detektorvorrichtung 57, die als Multibanddetektor 59 ausgeführt ist. In
der Detektorvorrichtung 57 werden spektral selektiv, zur
Leistung des Detektionslichts 55 proportionale elektrische
Detektionssignale erzeugt und über
die Leitung 61 an die Verarbeitungseinheit 41 weitergegeben.
In der Verarbeitungseinheit 41 werden die eingehenden Analogsignale
zunächst
digitalisiert und dann digital miteinander verrechnet und an Hand der
Signale der Vorrichtung 27 zum Ermitteln der Eigenschaften
des Lichtstrahls 1 korrigierte Detektionslichtleistungen
ermittelt. Diese werden an einen PC 63 weitergegeben. Die
korrigierten Detektionslichtleistungen werden anhand eines Positionssignals des
kardanisch aufgehängten
Spiegels der Position des zugehörigen
Rasterpunktes zugeordnet und die Daten aller Rasterpunkte werden
zu einem Abbild 65 der Probe 53 zusammengesetzt,
das auf einem Display 67 dargestellt ist. Das bei einem
konfokalen Scanmikroskop üblicherweise
vorgesehene Beleuchtungspinhole 39 und das Detektionspinhole 69 sind der
Vollständigkeit
halber schematisch eingezeichnet. Weggelassen sind wegen der besseren
Anschaulichkeit hingegen einige optische Elemente zur Führung und
Formung der Lichtstrahlen. Diese sind einem auf diesem Gebiet tätigen Fachmann
hinlänglich
bekannt.
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Die
Signale der Vorrichtung 27 zur Ermittlung der Eigenschaften
eines Lichtstrahls 1 werden über die Leitung 25 an
ein Verarbeitungsmodul 71 übergeben, das ein weiteres
Polarisationsbeeinflussungsmittel 73, das als weiterer
Linear-Polarisationsfilter 75 ausgeführt ist, über einen Schrittmotor 77 steuert und
an Hand der gemessenen Eigenschaften des Messstrahles die Polarisation
des Lichtstrahles 1 auf einem Sollwert hält. Der
weitere Linear-Polarisationsfilter 75 ist im Strahlengang
des Lichtstrahles 1 angeordnet.
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Die
Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es
ist jedoch selbstverständlich,
dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- Lichtstrahl
- 3
- Strahlteiler
- 5
- Messstrahl
- 7
- Polarisationsbeeinflussungsmittel
- 9
- Linear-Polarisationsfilter
- 11
- Antriebsmittel
- 13
- Linearmotor
- 15
- räumlich spektral
aufspaltendes Element
- 17
- Prisma
- 19
- Detektor
- 21
- Photodiodenzeile
- 23
- Einzeldetektoren
- 25
- Leitung
- 27
- Vorrichtung
zum Ermitteln der Eigenschaften eines Lichtstrahls 1
- 29
- Scanmikroskop
- 31
- Beleuchtungssystem
- 33
- Einkoppeloptik
- 35
- Glasfaser
- 37
- Auskoppeloptik
- 39
- Beleuchtungslochblende
- 41
- Verarbeitungseinheit
- 43
- Hauptstrahlteiler
- 45
- Scanspiegel
- 47
- Scanoptik
- 49
- Tubusoptik
- 51
- Objektiv
- 53
- Probe
- 55
- Detektionslicht
- 57
- Detektorvorrichtung
- 59
- Multibanddetektor
- 61
- Leitung
- 63
- PC
- 65
- Abbild
- 67
- Display
- 69
- Detektionspinhole
- 71
- Verarbeitungsmodul
- 73
- weiteres
Polarisationsbeeinflussungsmittel
- 75
- weiterer
Linear-Polarisationsfilter
- 77
- Schrittmotor