DE10227042A1

DE10227042A1 - Method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte

Info

Publication number: DE10227042A1
Application number: DE10227042A
Authority: DE
Inventors: Emil Palecek; Hans Kosak
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 2002-03-08
Filing date: 2002-06-17
Publication date: 2003-09-25
Anticipated expiration: 2022-06-18
Also published as: DE10227042B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren eines in einer ersten Flüssigkeit enthaltenen Analyten 10 mit folgenden Schritten: DOLLAR A a) Inkontaktbringen und Inkubieren des Analyten 10 mit jeweils einer eine Affinität zu dem Analyten 10 aufweisenden ersten 20 und zweiten Sonde 22, wobei die Affinität der ersten Sonde 20 durch eine spezifische Affinität zu mindestens einer ersten Bindungsstelle 12 des Analyten 10 bewirkt wird und das Inkubieren unter Bedingungen erfolgt, unter denen die erste 20 und die zweite Sonde 22 an den Analyten 10 binden, DOLLAR A b) Markieren der ersten Sonde 20 durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren ersten Marker 24, zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist, DOLLAR A c) Markieren der zweiten Sonde 22 durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren zweiten Marker 26, zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist, DOLLAR A d) Absondern der an den Analyten 10 gebundenen ersten 20 und zweiten Sonde 22, DOLLAR A e) Detektion eines durch die abgesonderte erste Sonde 20 oder den ersten Marker 24 verursachten ersten elektrochemischen Signals Si1 und eines durch die abgesonderte zweite Sonde 22 oder den zweiten Marker 26 verursachten zweiten elektrochemischen Signals Si2 und DOLLAR A f) Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren des Analyten 10 mittels eines Verhältnisses zwischen dem ersten Si1 und dem zweiten Signal Si2.The invention relates to a method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte 10 contained in a first liquid, comprising the following steps: DOLLAR A a) Contacting and incubating the analyte 10 with in each case a first 20 and a second probe having an affinity for the analyte 10 22, wherein the affinity of the first probe 20 is brought about by a specific affinity for at least one first binding site 12 of the analyte 10 and the incubation takes place under conditions under which the first 20 and the second probe 22 bind to the analyte 10, DOLLAR A b ) Marking the first probe 20 by at least one electrochemically specifically detectable first marker 24, at least if it is not already electrochemically specifically detectable, DOLLAR A c) Marking the second probe 22 by at least one electrochemically specifically detectable second marker 26, at least if it is not already electrochemically specific det is, DOLLAR A d) secretion of the first 20 and second probe 22 bound to the analyte 10, DOLLAR A e) detection of a first electrochemical signal Si1 caused by the secreted first probe 20 or the first marker 24 and one by the secreted second probe 22 or the second marker 26 caused second electrochemical signal Si2 and DOLLAR A f) detecting, quantifying and / or characterizing the analyte 10 by means of a ratio between the first Si1 and the second signal Si2.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren eines Analyten in einer Flüssigkeit. The invention relates to a method for detecting Quantify and / or characterize an analyte in one Liquid.

Mit elektrochemischen Verfahren können redoxaktive Analyte untersucht und spezifiziert werden. Die Umsetzung der Analyte findet an einer Arbeitselektrode statt. Zur stromlosen Messung der Spannung wird eine Referenzelektrode verwendet. Der über die Arbeitselektrode fließende Strom oder die Spannung, welche zwischen der Arbeits- und der Referenzelektrode abfällt, wird über eine Gegenelektrode gesteuert. Die elektrochemische Detektion von Analyten kann potentiometrisch oder amperometrisch erfolgen. In einem potentiometrischen Messprotokoll wird die über der Arbeits- und Referenzelektrode abfallende Spannung zeitabhängig gemessen. Während dieser Messung kann ein kontrollierter Stromverlauf angelegt werden. Im Falle eines konstanten Stroms wird diese Messung als Konstantstrom-Chronopotentiometrie bezeichnet. Die Untersuchung von an einer Arbeitselektrode adsorbierten oder komplexierten Analyten mittels Konstantstrom-Chronopotentiometrie wird auch als Konstantstrom-Potentiometrische-Stripping-Analyse (KSPSA) bezeichnet. Die Kathodische-Konstantstrom-Potentiometrische- Stripping-Analyse beinhaltet ein Verfahren in dem durch das Anlegen eines positiven Stromes sukzessive Analyte oxidiert werden. Aus diesen spannungsabhängigen Oxidationsreaktionen können Rückschlüsse auf oxidierbare Analyte gezogen werden. Die Anodische-Konstantstrom-Potentiometrische-Stripping-Analyse beinhaltet ein Verfahren, bei dem ein negativer Strom angelegt wird, um aus dem erhaltenen Spannungsverlauf Rückschlüsse auf reduzierbare Analyte schließen zu können. With electrochemical methods, redox-active analytes be examined and specified. Implementation of the analytes takes place on a working electrode. For currentless A reference electrode is used to measure the voltage. The current or voltage flowing through the working electrode, which is between the working and the reference electrode drops, is controlled via a counter electrode. The electrochemical detection of analytes can be potentiometric or amperometric. In a potentiometric The measurement protocol is the one above the working and reference electrode falling voltage measured over time. During this A controlled current profile can be created during the measurement. in the In the case of a constant current, this measurement is called Constant current chronopotentiometry. The investigation of adsorbed or complexed on a working electrode Analytes using constant current chronopotentiometry will also as constant current potentiometric stripping analysis (KSPSA) designated. The cathodic constant current potentiometric Stripping analysis involves a process by which Applying a positive current successively oxidizes analytes become. From these voltage-dependent oxidation reactions conclusions can be drawn about oxidizable analytes. The Anodic constant current potentiometric stripping analysis involves a method in which a negative current is applied to from the voltage curve obtained To be able to draw conclusions about reducible analytes.

In einem amperometrischen Messprotokoll wird die Spannung, welche zwischen der Referenz- und der Arbeitselektrode abfällt, über eine Gegenelektrode nach einem vorgegebenen Protokoll verändert. Gleichzeitig wird der Strom gemessen, welcher über die Arbeitselektrode fließt. Je nach angelegter Spannung können redoxaktive Analyte reduziert oder oxidiert werden. Durch eine Auswertung des Stromverlaufs können Rückschlüsse auf die Analyte gezogen werden. Ein elektrochemisches Messverfahren mit einer stationären Arbeitselektrode, in welchem eine Strom-Spannungskennlinie aufgenommen wird, wird auch als Voltammetrie und die zugehörige grafische Darstellung als Voltammogramm bezeichnet. Für sehr sensitive Messungen von Redoxprozessen wurden spezielle Messprotokolle entwickelt, bei welchen neben den Redoxprozessen stattfindende die Messung beeinflussende kapazitive Prozesse weit gehend unterdrückt werden. Ein sehr effizientes Messprotokoll ist die Differenzielle-Puls-Voltammetrie (DPV). In an amperometric measurement report, the voltage, which between the reference and the working electrode drops, via a counter electrode according to a predetermined Protocol changed. At the same time the current is measured which flows over the working electrode. Depending on the created Voltage can reduce or oxidize redox-active analytes become. By evaluating the current profile Conclusions can be drawn about the analytes. On electrochemical measuring method with a stationary working electrode, in which a current-voltage characteristic is recorded, is also called voltammetry and the associated graphic Represented as a voltammogram. For very sensitive Measurements of redox processes were special measurement protocols developed in which in addition to the redox processes capacitive processes that influence the measurement largely be suppressed. A very efficient measurement protocol is differential pulse voltammetry (DPV).

Aus der US 6,100,045 ist ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyten bekannt. Dabei wird der Analyt mit einer redoxaktiven Substanz markiert und an eine feste Phase gebunden. Bei der festen Phase kann es sich um magnetische Mikropartikel handeln. Die feste Phase ist in der Nähe einer Elektrode angebracht. Mittels der redoxaktiven Markierung wird die Bindung des Analyten an die feste Phase als amperometrisches Signal über die Elektrode nachgewiesen. Das bekannte Verfahren kann vor allem Informationen über das Vorhandensein des Analyten, kaum aber über dessen Eigenschaften liefern. Weiterhin ist es nicht besonders sensitiv. Zu dessen Durchführung ist eine relativ kompliziert aufgebaute Vorrichtung erforderlich. From US 6,100,045 is a method for detecting a Known analytes. The analyte is used with a redox-active substance marked and bound to a solid phase. at The solid phase can be magnetic microparticles act. The solid phase is near an electrode appropriate. By means of the redox-active marking, the Binding of the analyte to the solid phase as an amperometric Signal detected via the electrode. The known Above all, the procedure can provide information about the existence of the Analytes, but hardly provide about its properties. Furthermore, it is not particularly sensitive. To that Implementation is a relatively complicated device required.

Aus der US 5,871,918 ist es bekannt, einen Analyten, z. B. eine DNA, mit einer an eine Elektrode gebundenen Fänger-Sonde zu hybridisieren. Nach dem Inkontaktbringen des Analyten mit einer Reporter-Sonde erfolgt der elektrochemische Nachweis der Hybridisierung. Dazu werden die Basen einer Reporter- Sonde nach der Bindung an die Ziel-DNA mit Übergangsmetallkomplexen zu elektrochemisch nachweisbaren Markern umgesetzt. Dabei werden auch Basen der Ziel-DNA umgesetzt und erzeugen beim Nachweis ein elektrochemisches Signal. Das beschränkt die Nachweisempfindlichkeit dieses Verfahrens. From US 5,871,918 it is known to use an analyte, e.g. B. a DNA with a capture probe bound to an electrode to hybridize. After contacting the analyte with A reporter probe is used for the electrochemical detection of hybridization. To do this, the bases of a reporter Probe after binding to the target DNA Transition metal complexes converted to electrochemically detectable markers. Bases of the target DNA are also converted and generated an electrochemical signal upon detection. That limits the detection sensitivity of this method.

Aus Authier et al., (2001), Anal. Chem. 73, Seiten 4450 bis 4456 ist es bekannt, eine Nukleinsäure als Ziel-DNA unspezifisch an einer inneren Oberfläche eines Gefäßes zu binden. Die Ziel-DNA wird mit einer mit einem Goldpartikel markierten Oligonukleotid als Reporter-Sonde hybridisiert. Die Reporter- Sonde wird elektrochemisch unter Verwendung von einmalig zu verwendenden Mikroband-Elektroden nachgewiesen. Dieses Verfahren hat zahlreiche Nachteile. Die Verwendung eines Gefäßes zum Binden der Ziel-DNA macht es unmöglich, die Ziel-DNA in einem kleinen Volumen zu konzentrieren. Das beschränkt die Nachweisempfindlichkeit. Weiterhin kann die unspezifische Bindung von Substanzen, insbesondere der Reporter-Sonde, an die innere Oberfläche des Gefäßes zu einem hohen Hintergrundsignal und einer Wechselwirkung mit der elektrochemischen Detektion führen. From Authier et al., (2001), Anal. Chem. 73, pages 4450 to 4456 it is known to have a nucleic acid as the target DNA bind non-specifically to an inner surface of a vessel. The target DNA is labeled with a gold particle Oligonucleotide hybridized as a reporter probe. The reporters- Probe is electrochemically used once using microband electrodes. This The process has numerous disadvantages. The use of a vessel to bind the target DNA makes it impossible to insert the target DNA into to concentrate a small volume. That limits the Detection sensitivity. Furthermore, the non-specific Binding of substances, especially the reporter probe the inner surface of the vessel to a high Background signal and an interaction with the electrochemical Lead detection.

Aus der WO 93/20230 ist ein polarografisches elektrochemisches Verfahren zum Nachweis einer DNA-Hybridisierung bekannt. Bei diesem Verfahren wird eine Elektrode zunächst mit einzelsträngiger DNA in Kontakt gebracht und ein polarografisches Signal für diese einzelsträngige DNA gemessen. Anschließend wird eine Oligonukleotid-Sonde unter Hybridisierungsbedingungen hinzugefügt, überschüssiges Reagenz entfernt und ein polarografisches Signal ermittelt. Durch Vergleich der beiden ermittelten Signale kann festgestellt werden, ob es zu einer Hybridisierung gekommen ist. Mit dem Verfahren können nur wenige Informationen über die Eigenschaften der untersuchten DNA gewonnen werden. WO 93/20230 is a polarographic electrochemical method for the detection of DNA hybridization known. With this method, an electrode is first used single-stranded DNA contacted and a polarographic signal measured for this single-stranded DNA. Then an oligonucleotide probe is placed under Hybridization conditions added, excess reagent removed and determined a polarographic signal. By comparison of the two signals determined, it can be determined whether hybridization has occurred. With the procedure can provide little information about the properties of the examined DNA can be obtained.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein möglichst schnell und einfach durchführbares Verfahren mit hoher Sensitivität zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren eines Analyten angegeben werden. Das Charakterisieren kann dabei z. B. im Hinblick auf die Länge bzw. Größe des Analyten erfolgen. The object of the invention is to overcome the disadvantages of the prior art of technology to eliminate. In particular, it should be as possible fast and easy to perform procedure with high Sensitivity for detection, quantification and / or Characterize an analyte. The characterization can z. B. with regard to the length or size of the Analytes are done.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 2 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 3 bis 33. This object is achieved by the features of claims 1 and 2 solved. Appropriate configurations result from the Features of claims 3 to 33.

Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren eines in einer ersten Flüssigkeit enthaltenen Analyten mit folgenden Schritten vorgesehen:

a) Inkontaktbringen und Inkubieren des Analyten mit jeweils einer eine Affinität zu dem Analyten aufweisenden ersten und zweiten Sonde, wobei die Affinität der erste Sonde durch eine spezifische Affinität zu mindestens einer ersten Bindungsstelle des Analyten bewirkt wird und das Inkubieren unter Bedingungen erfolgt, unter denen die erste und die zweite Sonde an den Analyten binden,
b) Markieren der ersten Sonde durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren ersten Marker, zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist,
c) Markieren der zweiten Sonde durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren zweiten Marker, zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist,
d) Absondern der an den Analyten gebundenen ersten und zweiten Sonde,
e) Detektion eines durch die abgesonderte erste Sonde oder den ersten Marker verursachten ersten elektrochemischen Signals und eines durch die abgesonderte zweite Sonde oder den zweiten Marker verursachten zweiten elektrochemischen Signals und
f) Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren des Analyten mittels eines Verhältnisses zwischen dem ersten und dem zweiten Signal.

According to the invention, a method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte contained in a first liquid is provided with the following steps:

a) contacting and incubating the analyte with a respective first and second probe having an affinity for the analyte, the affinity of the first probe being brought about by a specific affinity for at least one first binding site of the analyte and the incubation taking place under conditions under which the bind the first and the second probe to the analyte,
b) marking the first probe by at least one electrochemically specifically detectable first marker, at least if it is not already electrochemically specifically detectable,
c) marking the second probe by at least one electrochemically specifically detectable second marker, at least if it is not already electrochemically specifically detectable,
d) separating the first and second probes bound to the analyte,
e) detection of a first electrochemical signal caused by the secreted first probe or the first marker and a second electrochemical signal caused by the secreted second probe or the second marker and
f) Detecting, quantifying and / or characterizing the analyte by means of a ratio between the first and the second signal.

Weiterhin ist ein Verfahren zum Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren eines in einer ersten Flüssigkeit enthaltenen Analyten mit folgenden Schritten vorgesehen:

a) Inkontaktbringen und Inkubieren des Analyten mit jeweils einer eine Affinität zu dem Analyten aufweisenden ersten Sonde, wobei die Affinität der erste Sonde durch eine spezifische Affinität zu mindestens einer ersten Bindungsstelle des Analyten bewirkt wird und das Inkubieren unter Bedingungen erfolgt, unter denen die erste Sonde an den Analyten bindet,
b) Markieren der ersten Sonde durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren ersten Marker, zumindest wenn sie nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist,
c) Markieren des Analyten durch mindestens einen elektrochemisch spezifisch nachweisbaren zweiten Marker, zumindest wenn der Analyt nicht bereits elektrochemisch spezifisch nachweisbar ist,
d) Absondern des von der ersten Sonde gebundenen Analyten und der von dem Analyten gebundenen ersten Sonde,
e) Detektion eines durch die abgesonderte erste Sonde oder den ersten Marker verursachten ersten elektrochemischen Signals und eines durch den abgesonderten Analyten oder den zweiten Marker verursachten zweiten elektrochemischen Signals und
f) Nachweisen, Quantifizieren und/oder Charakterisieren des Analyten mittels eines Verhältnisses zwischen dem ersten und dem zweiten Signal.

Furthermore, a method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte contained in a first liquid is provided with the following steps:

a) contacting and incubating the analyte in each case with a first probe which has an affinity for the analyte, the affinity of the first probe being brought about by a specific affinity for at least one first binding site of the analyte and the incubation taking place under conditions under which the first probe binds to the analyte,
b) marking the first probe by at least one electrochemically specifically detectable first marker, at least if it is not already electrochemically specifically detectable,
c) labeling the analyte by at least one electrochemically specifically detectable second marker, at least if the analyte is not already electrochemically specifically detectable,
d) separating the analyte bound by the first probe and the first probe bound by the analyte,
e) detection of a first electrochemical signal caused by the secreted first probe or the first marker and a second electrochemical signal caused by the secreted analyte or the second marker and
f) Detecting, quantifying and / or characterizing the analyte by means of a ratio between the first and the second signal.

Der Begriff "Analyt" umfasst insbesondere einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuren, Proteine und sonstige Biomoleküle. Bei der ersten oder zweiten Sonde kann es sich um monoklonale oder polyklonale Antikörper, Antikörperfragmente, Rezeptoren, Nukleinsäuren oder Liganden handeln. Unter "Nukleinsäuren" im Sinne dieser Erfindung sind neben DNA und RNA auch Nukleinsäureanaloga wie Peptidnukleinsäuren (PNA) sowie Hybride und Chimäre aus DNA und RNA und Analoga von Nukleinsäuren zu verstehen. The term "analyte" includes in particular single or double-stranded nucleic acids, proteins and others Biomolecules. The first or second probe can be monoclonal or polyclonal antibodies, antibody fragments, Act receptors, nucleic acids or ligands. Under "Nucleic acids" in the sense of this invention are in addition to DNA and RNA also nucleic acid analogues such as peptide nucleic acids (PNA) as well Hybrids and chimera from DNA and RNA and analogues of Understand nucleic acids.

"Spezifisch" im Hinblick auf die elektrochemische Nachweisbarkeit bedeutet, dass die erste oder zweite Sonde, der Analyt oder der erste oder zweite Marker jeweils elektrochemisch, d. h. durch eine Redoxreaktion, getrennt voneinander und gegebenenfalls von anderen, z. B. weiteren in der ersten Flüssigkeit enthaltenen, Substanzen nachgewiesen werden können. Das kann durch ein spezifisches Signal möglich sein oder dadurch, dass das Signal in anderer Weise von anderen Signalen, insbesondere auch Hintergrund- oder Störsignalen, differenziert werden kann. Das ist z. B. durch ein differenzielles Ablösen der ersten Sonde und/oder Aufreinigungsprozesse möglich. "Specific" in terms of electrochemical Detectability means that the first or second probe, the Analyte or the first or second marker each electrochemically, d. H. by a redox reaction, separated from each other and optionally by others, e.g. B. more in the first Contained liquid, substances can be detected can. This can be possible with a specific signal or in that the signal is different from others Signals, especially background or interference signals, can be differentiated. That is e.g. B. by a differential Detachment of the first probe and / or purification processes possible.

Zum spezifischen Nachweisen können die erste und/oder zweite Sonde und/oder der Analyt jeweils durch mindestens einen elektrochemisch nachweisbaren Marker bzw. eine elektrochemisch nachweisbare Markergruppe markiert werden. Durch Markierung mit mehreren Markern bzw. Markergruppen können deutlich intensivere Signale erzeugt werden als mit einem elektrochemisch selbst nachweisbaren Analyten oder einer elektrochemisch selbst nachweisbaren Sonde. Die Sensitivität und die Spezifität des Verfahrens können dadurch erhöht werden. Auch wenn der Analyt oder die Sonde ohne Markierung elektrochemisch nachweisbar sind, wie z. B. Nukleinsäuren, welche eine Purinbase, wie Guanin oder Adenin enthalten, können sie markiert werden. Das Markieren kann dadurch erfolgen, dass ein elektrochemisch nachweisbarer Marker über ein Affinitätsmolekül, z. B. Avidin, an einem an dem Analyten oder der ersten oder der zweiten Sonde angeordneten dazu korrespondierenden Affinitätsmolekül, z. B. Biotin, bindet. Unter einem Affinitätsmolekül wird ein Molekül verstanden, welches eine spezifische hohe Affinität zu einem korrespondierenden weiteren Affinitätsmolekül aufweist. Die Markierungsschritte lit. b und lit, c müssen vor Schritt lit. e, können aber jeweils vor oder nach Schritt lit. a oder lit. d durchgeführt werden. The first and / or second can be used for specific verification Probe and / or the analyte in each case by at least one electrochemically detectable marker or a electrochemically detectable marker group are marked. By Marking with several markers or marker groups can significantly more intense signals are generated than with a electrochemically self-detectable analyte or one electrochemically self-detectable probe. The sensitivity and the This can increase the specificity of the method. Also if the analyte or probe is unlabeled are electrochemically detectable, such as. B. nucleic acids, which a They can contain purine bases such as guanine or adenine be marked. The marking can be done by a electrochemically detectable marker via a Affinity molecule, e.g. B. avidin, on one of the analyte or the first or the second probe arranged corresponding thereto Affinity molecule, e.g. B. biotin binds. Under a Affinity molecule is understood to be a molecule that has a specific high affinity for a corresponding further one Has affinity molecule. The marking steps lit. b and lit, c must be before step lit. e, but can before each or after step lit. a or lit. d be carried out.

Die Bindung der zweiten Sonde kann spezifisch oder unspezifisch erfolgen. Bei einem aus Nukleinsäure bestehenden Analyten wird unter einer spezifischen Bindung bevorzugt eine sequenzspezifische Hybridisierung verstanden. Es kann sich dabei auch um eine sequenzspezifische Bindung eines Proteins handeln. Die Bindung einer aus Nukleinsäure bestehenden ersten oder zweiten Sonde an einen aus Nukleinsäure bestehenden Analyten kann auch über eine Hoogsteen-Basenpaarung, welche eine Triplex-Struktur bildet, erfolgen. Dies geschieht bevorzugt bei einer Bindung von PNA an einen aus doppelsträngiger DNA bestehenden Analyten. Als zweite Sonde kann z. B. ein sequenzunabhängig an den Analyten bindender Nukleinsäureindikator, wie ein DNA-Interkalator, dienen. The binding of the second probe can be specific or unspecific. In the case of a nucleic acid Analyte is preferred under a specific binding understood sequence-specific hybridization. It can also a sequence-specific binding of a protein act. Binding of a nucleic acid first or second probe to a nucleic acid Analytes can also have a Hoogsteen base pair, which forms a triplex structure. this happens preferred when binding PNA to one of double-stranded DNA existing analytes. As a second probe z. B. a binding to the analyte regardless of sequence Nucleic acid indicators, such as a DNA intercalator, are used.

Unter dem Absondern wird ein weitgehendes Trennen der gebundenen von den ungebundenen ersten bzw. zweiten Sonden oder des gebundenen vom ungebundenen Analyten verstanden. Es kann z. B. durch Abbau ungebundener erster oder zweiter Sonden oder des ungebundenen Analyten oder durch Zentrifugieren, Binden oder Waschen erfolgen. Das Trennen der gebundenen von der ungebundenen ersten Sonde und des von der ersten Sonde gebundenen Analyten von dem ungebundenen Analyten kann auch in einem Schritt erfolgen, z. B. indem der gebildete Komplex aus Analyt und erster Sonde abzentrifugiert oder gebunden und anschließend gewaschen wird. Beim Waschen wird der Komplex in einer weiteren Flüssigkeit aufgenommen. Die Detektion des ersten und des zweiten Signals kann gleichzeitig oder nacheinander und mit ein und demselben oder verschiedenen elektrochemischen Verfahren erfolgen. Die Detektion umfasst gegebenenfalls auch ein Quantifizieren der Signale. Das kann auch eine mathematische Operation, insbesondere eine Integration, beinhalten. A large separation of the bound by the unbound first or second probes or of the bound from the unbound analyte understood. It can z. B. by dismantling unbound first or second probes or of the unbound analyte or by centrifugation, binding or washing. The separation of the bound from the unbound first probe and that of the first probe bound analyte from the unbound analyte can also be in one Step take place, e.g. B. by the complex formed from analyte and first probe centrifuged or bound and is then washed. When washing the complex is in one more liquid added. The detection of the first and the second signal can be simultaneously or sequentially and with one and the same or different electrochemical processes. The detection includes possibly also quantifying the signals. That can also be one mathematical operation, especially an integration, include.

Das Verfahren ist besonders gut geeignet, um eine Nukleinsäure durch ihre Länge zu charakterisieren. Wird das zweite Signal beispielsweise durch einen DNA-Interkalator als zweite Sonde verursacht und weist die DNA eine spezifische Bindungsstelle für eine erste Sonde auf, so gibt das Verhältnis des ersten Signals zum zweiten Signal Auskunft über die Länge der Nukleinsäure. Weiterhin kann die Länge von Nukleinsäuren mit sich häufig wiederholenden Sequenzen bspw. dadurch bestimmt werden, dass die erste Sonde spezifisch an eine nur einmal in dem Molekül vorkommende Sequenz bindet während die zweite Sonde spezifisch an die sich wiederholenden Sequenzen bindet. Das erste Signal kann für das zweite Signal einen internen Standard darstellen, der, insbesondere wenn ein zu erwartendes erstes Signal bekannt ist, eine Differenzierung eines spezifischen Anteils von einem unspezifischen Anteil des zweiten Signals erlaubt. Dadurch wird eine hohe Sensitivität bzw. Spezifität des Verfahrens erreicht. Unspezifische zweite Signale können z. B. durch nicht restlos abgesonderte ungebundene zweite Sonden verursacht werden. The method is particularly well suited to a Characterize nucleic acid by its length. Will the second Second signal, for example, by a DNA intercalator Probe causes and assigns a specific DNA Binding site for a first probe, so the ratio of information about the length of the first signal to the second signal Nucleic acid. Furthermore, the length of nucleic acids can be repetitive sequences, for example be that the first probe is specific to one only once sequence occurring in the molecule binds while the second Probe specifically binds to the repeating sequences. The first signal can be an internal one for the second signal Represent the standard, especially if one too expected first signal is known, a differentiation of a specific portion of an unspecific portion of the second signal allowed. This creates a high sensitivity or specificity of the method achieved. Unspecific second Signals can e.g. B. by not completely secreted unbound second probes.

Vorzugsweise wird eine zur Detektion eingesetzte Elektrode nicht mit der ersten Flüssigkeit in Kontakt gebracht. Dadurch kann die Empfindlichkeit des Verfahrens deutlich erhöht werden, weil in der ersten Flüssigkeit, wie z. B. Blutserum, enthaltene Substanzen dadurch nicht unspezifisch an die Elektrode binden und bei der Detektion unspezifische Signale erzeugen können. Unspezifische Hintergrundsignale können so weitgehend vermieden werden. Erreicht werden kann das beispielsweise indem der Analyt vor dem Schritt lit. e von der ersten Flüssigkeit abgetrennt und in eine zweite Flüssigkeit überführt wird. Bevorzugt wird der Analyt vor Durchführung des Schritts lit. a von der ersten Flüssigkeit abgetrennt und in eine zweite Flüssigkeit überführt. Dadurch können in der ersten Flüssigkeit enthaltene Stoffe abgetrennt werden, die an die erste oder zweite Sonde binden, sie abbauen oder in anderer Hinsicht deren Funktion stören. Weiterhin können Stoffe abgetrennt werden, die bei der Detektion stören. Das können z. B. Stoffe sein, die ein ähnliches elektrochemisches Signal wie die erste oder zweite Sonde erzeugen. Es können auch Stoffe sein, die die Funktion der zur elektrochemischen Detektion verwendeten Elektroden stören. Zum Abtrennen kann der Analyt, insbesondere spezifisch, von einem Fänger-Molekül gebunden werden. An electrode used for detection is preferred not brought into contact with the first liquid. Thereby can significantly increase the sensitivity of the procedure be because in the first liquid, such as. B. blood serum, contained substances thereby not unspecific to the Bind electrode and non-specific signals during detection can generate. Unspecific background signals can largely avoided. That can be achieved for example, by the analyte before step lit. e from the first Liquid separated and into a second liquid is transferred. The analyte is preferred before carrying out the Step lit. a separated from the first liquid and in transferred a second liquid. This allows in the substances contained in the first liquid are separated bind, disassemble or in the first or second probe otherwise disrupt their function. Furthermore, fabrics be separated, which interfere with the detection. The skill z. B. substances that have a similar electrochemical signal how to generate the first or second probe. It can too Substances that have the function of being electrochemical Detection used to interfere with electrodes. To separate the Analyte, especially specific, from a scavenger molecule be bound.

Die Bindung des Analyten an dem Fänger-Molekül kann durch eine, vorzugsweise sequenzspezifische, Hybridisierung erfolgen. Das Fänger-Molekül kann, insbesondere vor dem Binden des Analyten, an einer ersten oder zweiten Oberfläche immobilisiert werden. Dadurch wird das Abtrennen des Analyten von der ersten Flüssigkeit vereinfacht. Durch die Immobilisierung der Fänger-Moleküle kann der Analyt in einem kleinen Volumen angereichert werden. Das erhöht die Nachweisempfindlichkeit des Verfahrens. The binding of the analyte to the capture molecule can be done by a, preferably sequence-specific, hybridization is carried out. The scavenger molecule can, especially before binding the Analytes, immobilized on a first or second surface become. This will separate the analyte from the first liquid simplified. By immobilizing the Catcher molecules can be analyzed in a small volume be enriched. This increases the detection sensitivity of the Process.

Das Fänger-Molekül kann eine Nukleinsäure, ein Analogon einer Nukleinsäure, insbesondere eine Peptidnukleinsäure (PNA), ein Antikörper oder ein Rezeptor sein. Bevorzugt weist das Fänger-Molekül ein Affinitätsmolekül, insbesondere Streptavidin, Avidin oder Biotin, oder ein biotinyliertes Oligonukleotid auf. Dieses Affinitätsmolekül kann entweder dazu dienen, das Fänger-Molekül an der ersten oder zweiten Oberfläche zu immobilisieren, oder den Analyten zu binden. The capture molecule can be a nucleic acid, an analogue of one Nucleic acid, in particular a peptide nucleic acid (PNA) Antibodies or a receptor. This preferably indicates Catcher molecule an affinity molecule, especially streptavidin, Avidin or biotin, or a biotinylated oligonucleotide on. This affinity molecule can either serve the Catcher molecule on the first or second surface too immobilize, or bind the analyte.

In einer bevorzugten Ausgestaltung enthält die erste oder zweite Sonde oder der Analyt ein Affinitätsmolekül, insbesondere Biotin, Avidin oder Streptavidin. Die Affinitätsmoleküle sind dabei derart zu wählen, dass es nicht zu Bindungen kommen kann, welche die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hindern. Insbesondere soll es nicht über die Affinitätsmoleküle zu Bindungen zwischen der ersten und der zweiten Sonde oder zu Bindungen der ersten Sonde an den Analyten kommen. Dadurch ist es auf einfache Weise möglich, den Analyten von der ersten Flüssigkeit abzutrennen. Weiterhin ermöglicht das Affinitätsmolekül ein Binden eines Markers an der ersten oder zweiten Sonde oder dem Analyten oder auch ein Immobilisieren des Analyten. Der Analyt kann eine, insbesondere ein Poly-T-Ende oder ein Poly-A-Ende aufweisende, Nukleinsäure sein. Die Nukleinsäure kann doppel- oder einzelsträngig ausgebildet sein. Auch an eine doppelsträngige Nukleinsäure ist eine sequenzspezifische Bindung, z. B. durch eine Hoogsteen- Bindung einer aus PNA bestehenden ersten oder zweiten Sonde möglich. Das Poly-T-Ende oder das Poly-A-Ende ermöglicht die Bindung des Analyten an eine eine Poly-A-Sequenz oder eine Poly-T-Sequenz aufweisende als Fänger-Molekül dienende Nukleinsäure. Dadurch kann der Analyt leicht aus der Flüssigkeit abgetrennt werden. Weiterhin ermöglicht ein Poly-T-Ende eine Markierung mit mehreren Osmium-Komplexen. In einer besonderen Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt das Charakterisieren durch das Bestimmen der Länge der Nukleinsäure. In a preferred embodiment, the first or second probe or the analyte is an affinity molecule, especially biotin, avidin or streptavidin. The affinity molecules are to be chosen in such a way that there are no bonds can come, which is the implementation of the invention Prevent proceedings. In particular, it should not be about the Affinity molecules for bonds between the first and the second Probe or to bind the first probe to the analyte come. This makes it possible to easily analyze the analyte to separate from the first liquid. Furthermore allows the affinity molecule binds a marker to the first or second probe or the analyte or also a Immobilize the analyte. The analyte can be a, in particular a Poly-T end or a poly-A end, nucleic acid his. The nucleic acid can be double or single-stranded be trained. It is also a double-stranded nucleic acid a sequence specific binding, e.g. B. by a Hoogsteen Binding of a first or second probe consisting of PNA possible. The poly-T end or the poly-A end enables that Binding of the analyte to a poly-A sequence or Poly-T sequence serving as catcher molecule Nucleic acid. As a result, the analyte can easily be removed from the Liquid to be separated. Furthermore, a poly-T end enables a label with several osmium complexes. In a this takes place in a special embodiment of the method Characterize by determining the length of the nucleic acid.

Bevorzugt wird der Analyt vor oder während Schritt lit. a mittels einer Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion, insbesondere einer PCR, vervielfältigt. Das erhöht die Sensitivität des Verfahrens deutlich. Als Analyt wird dann im Wesentlichen das Produkt der Vervielfältigungsreaktion nachgewiesen, quantifiziert und/oder charakterisiert. Das gilt auch dann, wenn das Produkt wegen der für die Vervielfältigungsreaktion verwendeten Primer nicht völlig mit dem Analyten übereinstimmt oder es sich um ein zu dem Analyten komplementäres Produkt der Vervielfältigungsreaktion handelt. Bei der PCR kann als Primer das Fänger-Molekül oder die erste oder zweite Sonde dienen. Durch die PCR können in den Analyten spezifische Bindungssequenzen eingeführt werden. The analyte is preferably used before or during step lit. a by means of a nucleic acid amplification reaction, especially a PCR, reproduced. That increases the Sensitivity of the process clearly. The analyte is then in Essentially the product of the replication reaction proven, quantified and / or characterized. This is also true then if the product because of that for the The amplification reaction did not fully use primers with the analyte agrees or it is complementary to the analyte Product of the replication reaction. In the PCR can be the primer molecule or the first or second Serve probe. The PCR can be used in the analyte specific binding sequences are introduced.

Der Analyt kann vor dem Schritt lit. d, insbesondere vor dem Schritt lit. a an der ersten oder zweiten Oberfläche immobilisiert werden. Das kann auch über die Bindung an das Fänger- Molekül erfolgen. Das erleichtert das Abtrennen von der ersten Flüssigkeit und das Absondern gemäß lit. d, das dann z. B. durch Waschen der ersten Oberfläche erfolgen kann. Die erste Oberfläche kann die Oberfläche eines, insbesondere superparamagnetischen, Partikels sein. Ein superparamagnetisches Partikel kann auf einfache Weise mittels eines Magnetfelds abgetrennt werden. Das Partikel kann ansonsten auch durch Zentrifugation abgetrennt werden. Es ermöglicht eine Konzentrierung des Analyten. Weiterhin ist es durch Partikel möglich, eine große Bindungsoberfläche bereitzustellen. Das Partikel weist vorzugsweise einen Durchmesser von 10 nm bis 100 µm, insbesondere 1 bis 10 µm, auf. Diese Partikelgröße ermöglicht es, die Partikel in der Flüssigkeit zu suspendieren und dadurch einen intensiven Kontakt des Analyten mit der ersten und ggf. zweiten Sonde herzustellen. Before the step lit. d, especially before Step lit. a on the first or second surface be immobilized. This can also be done by binding to the catcher Molecule. This makes it easier to separate from the first liquid and the secretion according to lit. d, that then z. B. can be done by washing the first surface. The first surface can be the surface of a, in particular be superparamagnetic, particle. On superparamagnetic particle can be easily by means of a Magnetic field are separated. The particle can otherwise be separated by centrifugation. It enables one Concentration of the analyte. Furthermore, it is due to particles possible to provide a large binding surface. The Particle preferably has a diameter of 10 nm to 100 microns, especially 1 to 10 microns. This particle size allows the particles in the liquid to become too suspend and thereby intensive contact of the analyte with the to produce the first and possibly the second probe.

In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird der Analyt vor Durchführung des Schritts lit. a mittels eines Fänger-Moleküls an der ersten Oberfläche immobilisiert. Das Fänger-Molekül kann dabei vor oder nach der Bindung an den Analyten an der ersten Oberfläche immobilisiert werden. Anschließend erfolgt ein Waschschritt, bei welchem die erste Flüssigkeit entfernt und durch eine zweite Flüssigkeit ersetzt wird. Die zweite Flüssigkeit kann dabei so gewählt werden, dass optimale Bedingungen für das Binden der ersten oder der ersten und der zweiten Sonde beim Schritt lit. a gegeben sind. Schritt lit. d wird bevorzugt durchgeführt, indem der immobilisierte Analyt mit daran gebundener erster oder erster und zweiter Sonde zum Entfernen der nicht gebundenen ersten bzw. ersten und zweiten Sonde gewaschen wird. Dabei kann die zweite Flüssigkeit durch eine dritte Flüssigkeit ersetzt werden. Die dritte Flüssigkeit ist dabei bevorzugt so gewählt, dass die Detektion gemäß lit. e darin unter optimalen Bedingungen durchgeführt werden kann. In a preferred embodiment, the analyte is pre Execution of step lit. a by means of a Catcher molecule immobilized on the first surface. The Catcher molecule can be attached to the analyte before or after binding immobilized on the first surface. Subsequently there is a washing step in which the first liquid removed and replaced with a second liquid. The second liquid can be chosen so that optimal conditions for binding the first or the first and the second probe in step lit. a are given. step lit. d is preferably carried out by the immobilized Analyte with attached first or first and second Probe to remove the unbound first or first and second probe is washed. The second Liquid can be replaced by a third liquid. The third liquid is preferably chosen so that the Detection according to lit. e in it under optimal conditions can be carried out.

Vorzugsweise ist die zweite Oberfläche eine zur Detektion dienende, insbesondere einen elektrisch leitfähigen Kunststoff oder ein elektrisch leitfähiges Polymer, Quecksilber, Amalgam, Gold, Platin, Kohlenstoff oder Indium-Zinnoxid enthaltende, Elektrode. The second surface is preferably one for detection serving, in particular an electrically conductive Plastic or an electrically conductive polymer, mercury, Amalgam, gold, platinum, carbon or indium tin oxide containing electrode.

Bevorzugt weist die zweite Sonde eine spezifische Affinität zu mindestens einer spezifischen zweiten Bindungsstelle des Analyten auf. Aus dem Verhältnis zwischen dem ersten und dem zweiten Signal lässt sich dann eine Information über das Verhältnis der Zahl der ersten zur Zahl der zweiten Bindungsstellen gewinnen. Vorzugsweise weist der Analyt eine bekannte Anzahl erster Bindungsstellen und eine unbekannte Anzahl zweiter Bindungsstellen auf. Das Charakterisieren kann dann in dem Ermitteln der unbekannten Anzahl der zweiten Bindungsstellen durch das Verhältnis von gebundener ersten zu gebundener zweiten Sonde bzw. das Verhältnis des ersten Signals zum zweiten Signal erfolgen. Das Signalverhältnis bzw. die Zahl der daraus ermittelten zweiten Bindungsstellen kann mit der Länge des Analyten korreliert werden. Der Analyt kann ein DNA-Fragment sein, welches infolge einer Triplex-Ausdehnungskrankheit, wie dem fragilen X-Syndrom, der Huntingtonschen Krankheit, der bulbären Muskelatrophie, der spinozerebellaren Ataxie Typ I, der myotonischen Dystrophie oder der Friedreich Ataxie, repetetive Sequenzen aufweist. Derartige Krankheiten werden üblicherweise über eine Polymerase-Kettenreaktion mit anschließendem Southern-Blot nachgewiesen. Im Verhältnis zum erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die repetetiven Sequenzen als zweite Bindungsstellen dienen können, ist das sehr aufwändig und dauert lange. The second probe preferably has a specific affinity to at least one specific second binding site of the Analytes on. From the relationship between the first and the second signal can then be information about the Ratio of the number of the first to the number of the second Win binding sites. The analyte preferably has a known one Number of first binding sites and an unknown number second binding sites. The characterization can then in finding the unknown number of the second Binding sites by the ratio of bound first to bound second probe or the ratio of the first signal to the second signal. The signal ratio or The number of second binding sites determined from this can be calculated using the length of the analyte can be correlated. The analyte can DNA fragment, which is due to a Triplex expansion disease, such as fragile X syndrome, HD Disease, bulbar muscular atrophy, spinocerebellar Type I ataxia, myotonic dystrophy or Friedreich Ataxia that has repetitive sequences. Such diseases are usually using a polymerase chain reaction subsequent Southern blot detected. In relation to inventive method in which the repetitive Sequences can serve as second binding sites, that's very much complex and takes a long time.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erste Sonde von dem Analyten und/oder der Analyt von der ersten oder zweiten Oberfläche zwischen Schritt lit. d und Schritt lit. e, insbesondere durch Hitzedenaturierung, chemische Denaturierung, enzymatischen Verdau oder chemischen Abbau, freigesetzt. Das Freisetzen von der Oberfläche ermöglicht das Aufkonzentrieren des Analyten oder der ersten Sonde in einem sehr kleinen Flüssigkeitsvolumen und erhöht damit die Sensitivität des Verfahrens. Es ermöglicht ferner einen engen Kontakt der ersten Sonde oder des Analyten mit der zur Detektion eingesetzten Elektrode. Weiterhin ist es somit möglich die Detektion durchzuführen, ohne dass die Elektrode mit der ersten Oberfläche in Kontakt kommt. Dadurch können mögliche Störungen der elektrochemischen Detektion durch die erste Oberfläche vermieden werden. Es können auch Materialien als erste Oberfläche eingesetzt werden, welche die elektrochemische Detektion normalerweise stören würden. Beispielsweise können Streptavidin-beschichtete Partikel als erste Oberfläche und Cystein-markierte PNA als erste Sonde verwendet werden, ohne dass bei der elektrochemischen Detektion der Cystein- Markierung durch die Cystein-Reste des Streptavidins Störungen auftreten können. Weiterhin ist es durch das Freisetzen der ersten Sonde von dem Analyten möglich, das erste und das zweite Signal getrennt voneinander zu detektieren. Dadurch ist die Durchführung des Verfahrens auch möglich, wenn das erste und das zweite Signal identisch sind, etwa weil es von jeweils identischen Markern verursacht wird. In a preferred embodiment, the first probe of the analyte and / or the analyte from the first or second Surface between step lit. d and step lit. e, especially by heat denaturation, chemical denaturation, enzymatic digestion or chemical degradation, released. The Release from the surface allows concentration of the analyte or the first probe in a very small Volume of liquid and thus increases the sensitivity of the Process. It also enables close contact between the first probe or analyte with the one for detection used electrode. Detection is also possible to perform without the electrode with the first Surface comes into contact. This can cause possible malfunctions electrochemical detection through the first surface be avoided. You can also use materials first Surface are used, which is the electrochemical Detection would normally interfere. For example, you can Streptavidin-coated particles as the first surface and Cysteine-labeled PNA can be used as the first probe without that in the electrochemical detection of the cysteine Labeling by the cysteine residues of streptavidin Faults can occur. Furthermore, it is due to the release the first probe of the analyte possible, the first and the to detect the second signal separately. Thereby the procedure can also be carried out if that the first and the second signal are identical, for example because it is from identical markers are caused in each case.

Es ist auch möglich, die erste und die zweite Sonde von dem Analyten oder die erste Sonde von dem Analyten und den Analyt von der ersten oder zweiten Oberfläche jeweils getrennt voneinander freizusetzen und dann zu detektieren. Auch dadurch ist eine Differenzierung zwischen identischen Signalen nach dem verursachenden Molekül möglich. Weiterhin ist eine Aufkonzentrierung in einem kleinen Flüssigkeitsvolumen möglich. It is also possible to use the first and the second probe of that Analyte or the first probe of the analyte and the analyte separated from the first or second surface in each case release from each other and then detect. That too is a differentiation between identical signals according to the causative molecule possible. Furthermore, one Concentration possible in a small volume of liquid.

Alternativ ist es auch möglich, den ersten Marker und/oder den zweiten Marker, insbesondere jeweils getrennt voneinander, von der ersten und/oder zweiten Sonde oder dem Analyten freizusetzen und dann zu detektieren. Das Freisetzen kann durch enzymatischen Verdau oder chemischen Abbau erfolgen. Beispielsweise könnte der erste und/oder der zweite Marker jeweils über eine Nukleinsäuresequenz mit einer spezifischen Restriktionsschnittstelle an die erste oder zweite Sonde oder den Analyten gebunden sein. Ein spezifisches Freisetzen ist dann durch Restriktionsenzyme möglich. Alternatively, it is also possible to use the first marker and / or the second marker, in particular separately from each other, from the first and / or second probe or the analyte release and then detect. The release can by enzymatic digestion or chemical degradation. For example, the first and / or the second marker could each via a nucleic acid sequence with a specific Restriction interface to the first or second probe or bound to the analyte. There is a specific release then possible through restriction enzymes.

Die erste und/oder zweite Sonde kann eine Nukleinsäure oder ein Analogon einer Nukleinsäure, insbesondere eine Peptidnukleinsäure (PNA), sein. Bevorzugt bindet die erste und/oder zweite Sonde sequenzspezifisch, insbesondere durch Hybridisierung, an den Analyten. Die Sonde kann dabei beispielsweise eine Nukleinsäure sein, welche komplementär zu einer Sequenz des Analyten ist. Bei der Sonde kann es sich aber auch um einen Antikörper handeln, welcher eine bestimmte Aminosäuresequenz in einem aus einem Protein bestehenden Analyten erkennt. The first and / or second probe can be a nucleic acid or an analog of a nucleic acid, especially one Peptide nucleic acid (PNA). The first and / or preferably binds second probe specific to the sequence, in particular by Hybridization, on the analytes. The probe can for example be a nucleic acid which is complementary to a sequence of the analyte. But the probe can also be act an antibody that a specific Amino acid sequence in an analyte consisting of a protein recognizes.

Das erste oder zweite Signal kann jeweils von einer durch den ersten oder zweiten Marker bewirkten katalytischen Wasserstofffreisetzung verursacht werden. Bevorzugt ist der erste und/oder der zweite Marker reversibel reduzierbar oder oxidierbar. Der erste oder der zweite Marker kann einen Osmium- Komplex, ein Nanogold-Partikel, eine Cystein-, Ferrocenyl-, Daunomyzin-, Benzochinon-, Naphthochinon-, Anthrachinon- oder p-Aminophenol-Gruppe oder einen Farbstoff, insbesondere Indophenol, Thiazin oder Phenazin, aufweisen. The first or second signal can each by one through the first or second marker caused catalytic Hydrogen release can be caused. The first is preferred and / or the second marker can be reversibly reduced or oxidizable. The first or the second marker can be an osmium Complex, a nanogold particle, a cysteine, ferrocenyl, Daunomycin, benzoquinone, naphthoquinone, anthraquinone or p-aminophenol group or a dye, in particular Indophenol, thiazine or phenazine.

Bevorzugt ist die erste oder die zweite Sonde durch mehrere Marker markiert. Dadurch ist es möglich, eine Sonde für verschiedene elektrochemisch unterschiedlich nachweisbare Analyten zu verwenden. Bevorzugt weist die erste oder zweite Sonde eine linieare Primärstruktur auf, an deren einem Ende der Marker angeordnet ist. Durch die endständige Anordnung des Markers wird die Gefahr der Beeinflussung der Wechselwirkung zwischen der ersten oder der zweiten Sonde mit dem Analyten minimiert. The first or the second probe is preferred by several Markers marked. This makes it possible to use a probe for different electrochemically different detectable To use analytes. The first or second probe preferably has a linear primary structure, at one end of which the Marker is arranged. Due to the final arrangement of the Markers becomes the danger of influencing the interaction between the first or the second probe with the analyte minimized.

Die Detektion des ersten und des zweiten Signals kann an derselben Elektrode und/oder durch dasselben elektrochemische Nachweisverfahren erfolgen. Die Detektion erfolgt vorzugsweise mittels kathodischer Stripping-Voltammetrie (CSV), Rechteckwellen-Voltammetrie, zyklischer Voltammetrie oder Chronopotentiometrie. Die Detektion kann mittels eines reversiblen Redoxprozesses oder einer katalytischen Wasserstoffentwicklung erfolgen. The detection of the first and the second signal can be on the same electrode and / or by the same electrochemical Verification procedures are carried out. The detection takes place preferably by means of cathodic stripping voltammetry (CSV), Square wave voltammetry, cyclic voltammetry or Chronopotentiometry. The detection can be done using a reversible Redox process or a catalytic Hydrogen evolution take place.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen: The invention is described below with reference to Embodiments explained in more detail. Show it:

Fig. 1 eine schematische Darstellung der Markierung einer ersten Sonde durch Osmiumtetroxid und 2, 2'-Bipyridin, Fig. 1 is a schematic representation of the labeling of a first probe by osmium tetroxide and 2, 2'-bipyridine,

Fig. 2a, b DPV-Voltammogramme zur Bestimmung der Nachweisgrenze, FIG. 2a, b DPV voltammograms for determining the detection limit,

Fig. 3a, b, c schematische Darstellung des Nachweises eines aus Nukleinsäure bestehenden Analyten durch Hybridisierung mit einer Osmium-markierten ersten Sonde, Fig. 3a, b, of a group consisting of nucleic acid analytes labeled osmium-c schematic representation of the detection by hybridization to a first probe,

Fig. 4 DPV-Voltammogramm zum Nachweis des aus Nukleinsäure bestehenden Analyten durch Hybridisierung mit einer Osmiummarkierten ersten Sonde, Fig. 4 DPV voltammogram for detecting the group consisting of nucleic acid analytes first by hybridization with a probe Osmiummarkierten,

Fig. 5a, b Voltammogramme einer Chronopotentiometrischen Stripping Analyse (CPSA) zur Bestimmung der Sensitivität von Cystein- PNA-Sonden, Fig. 5a, b voltammograms a chronopotentiometric Stripping Analysis (CPSA) to determine the sensitivity of cysteine PNA probes,

Fig. 6a-f schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer ersten und einer zweiten Sonde, FIGS. 6a-f schematic representation of a method according to the invention with a first and a second probe,

Fig. 7a-f schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer sequenzspefizischen ersten und einer sequenzunspezifischen zweiten Sonde, Fig. 7a-f schematic representation of a method according to the invention with a sequenzspefizischen first and a sequence-nonspecific second probe,

Fig. 8a-f schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei eine erste Sonde und der Analyt zur Erzeugung elektrochemischer Signale verwendet werden und FIG. 8a-f schematic representation of an inventive method, wherein a first probe and the analyte are used to generate electrochemical signals and

Fig. 9a-g eine schematische Darstellung der Bestimmung der Anzahl von für eine Triplex- Krankheit spezifischen reversiblen Sequenzen. Fig. 9a-g is a schematic representation of the determination of the number of specific for a disease reversible triplex sequences.

Um eine Osmium-markierte Sonde herzustellen, ist ein 97mer mit der Sequenz 5-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ATT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT C-3 (SEQ ID NO : 1) aus dem anliegenden Sequenzprotokoll mit 2 mmol/l OsO₄, 2 mmol/l 2,2'-Bipyridin in 100 mmol/l Tris-HCl, pH 7,0, für 180 Minuten bei 37°C inkubiert worden. Anschließend ist freies OsO₄ und Bipyridin durch Dialyse gegen entionisiertes Wasser für 5 Stunden entfernt worden. Schematisch ist die Markierung in Fig. 1 dargestellt. Ein Oligonukleotid, mit einer ersten zu einem Bereich eines aus Nukleinsäure bestehenden Analyten komplementären Sequenz 9 und einer zweiten viele Thymin-Reste T enthaltenden Sequenz wird mit Osmiumtetroxid und 2,2'-Bipyridin behandelt. Dabei bilden die Thymin-Reste spezifische osmiumhaltige Komplexe Os, welche sich als elektrochemische Marker nachweisen lassen. To produce an osmium-labeled probe, a 97mer with the sequence 5-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ATT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT C- 3 (SEQ ID NO: 1) from the attached sequence listing with 2 mmol / l OsO ₄ , 2 mmol / l 2,2'-bipyridine in 100 mmol / l Tris-HCl, pH 7.0, for 180 minutes at 37 ° C incubated. Free OsO ₄ and bipyridine were then removed by dialysis against deionized water for 5 hours. The marking is shown schematically in FIG. 1. An oligonucleotide with a first sequence 9 complementary to a region of an analyte consisting of nucleic acid and a second sequence containing many thymine residues T is treated with osmium tetroxide and 2,2'-bipyridine. The thymine residues form specific osmium-containing complexes Os, which can be detected as electrochemical markers.

Zur Bestimmung der Nachweisgrenze der so hergestellten Sonde werden je 3 µl einer 10, 25, 50, 100, 250 und 500 ng/ml der Osmium-markierten Sonde in Britton Robinson-Puffer (0,04 mol/l H₃BO₃, 0,04 mol/l H₃PO₄ und 0,04 mol/l CH₃COOH gemischt mit 0,2 mol/l NaOH), pH 3,9 mittels Differenzieller Puls-Voltammetrie (DPV) mit einer Scan-Rate von 10 mV/s, einer Amplitude von 50 mV/s, einer Absorbtionszeit von 240 s und einer Scan-Zeit von 120 s bis 240 s vermessen. Das Ergebnis ist dem in Fig. 2a dargestellten DPV-Voltammogramm zu entnehmen. Die Kurven 36, 38, 40, 42, 44 und 45 entsprechen jeweils 500, 250, 100, 50, 25 oder 10 ng/ml der Osmiummarkierten Sonde. Fig. 2b zeigt ein mit demselben Verfahren mit 3 µl einer 250 pg/ml Osmium-markierte Sonde enthaltenden Lösung erzeugtes DPV-Voltammogramm 46 und ein ohne Sonde erzeugtes DPV-Voltammogramm 47. Die Nachweisgrenze der Osmiummarkierten Sonde liegt demnach unter 250 pg/ml. Das entspricht 25 attomol Sonde. To determine the detection limit of the probe produced in this way, 3 .mu.l of a 10, 25, 50, 100, 250 and 500 ng / ml of the osmium-labeled probe in Britton Robinson buffer (0.04 mol / l H ₃ BO ₃ , 0 , 04 mol / l H ₃ PO ₄ and 0.04 mol / l CH ₃ COOH mixed with 0.2 mol / l NaOH), pH 3.9 by means of differential pulse voltammetry (DPV) with a scan rate of 10 mV / s, an amplitude of 50 mV / s, an absorption time of 240 s and a scan time of 120 s to 240 s. The result can be seen from the DPV voltammogram shown in FIG. 2a. Curves 36 , 38 , 40 , 42 , 44 and 45 correspond to 500, 250, 100, 50, 25 or 10 ng / ml of the osmium-labeled probe, respectively. FIG. 2b shows a same method with 3 ul of a 250 pg / ml of osmium labeled probe containing solution produced DPV voltammogram 46 and a probe generated without DPV voltammogram 47th The detection limit of the osmium-labeled probe is therefore below 250 pg / ml. This corresponds to 25 attomol probes.

In Fig. 3a ist ein aus Nukleinsäure bestehender Analyt 10 mit einem Poly-A-Strang (A)_n an einem Ende, welcher mit einem mit Poly-T (T)_n als Fänger-Molekül 8 beschichteten Partikel in Kontakt gebracht wird, dargestellt. Der Analyt 10 bindet an das Partikel 18 durch Hybridisierung von (A)_n mit (T)_n. Der partikelgebundene Analyt wird mit einer Osmium-markierten ersten Sonde 20 in Kontakt gebracht (Fig. 3b). Die erste Sonde 20 weist eine zu dem nicht hybridisierten Bereich des Analyten 10 komplementäre Sequenz auf. Unter den gewählten Bedingungen bindet die erste Sonde 20 an den Analyten 10. Ungebundene erste Sonde 20 wird durch Waschen der Partikel entfernt. Anschließend wird die gebundene erste Sonde 20 von dem Analyten 10 durch Hitzebehandlung freigesetzt (Fig. 3c). Die erste Sonde 20 kann mittels ihrer Osmium-Markierung elektrochemisch detektiert werden. FIG. 3a shows an analyte 10 consisting of nucleic acid with a poly-A strand (A) _n at one end, which is brought into contact with a particle coated with poly-T (T) _n as a capture molecule 8 , The analyte 10 binds to the particle 18 by hybridizing (A) _n with (T) _n . The particle-bound analyte is brought into contact with an osmium-labeled first probe 20 ( FIG. 3b). The first probe 20 has a sequence complementary to the non-hybridized region of the analyte 10 . Under the selected conditions, the first probe 20 binds to the analyte 10 . Unbound first probe 20 is removed by washing the particles. The bound first probe 20 is then released from the analyte 10 by heat treatment ( FIG. 3c). The first probe 20 can be detected electrochemically by means of its osmium marking.

Der Nachweis kann beispielsweise mit folgenden Komponenten durchgeführt werden: The following components can be used as proof be performed:

1. Analyte

5'-CTT TT CCT TCT CAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA (SEQ ID NO : 2) 5'-CTT TT CCT TCT CAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA (SEQ ID NO: 2)

2. Probe I with a complementary sequence to the analyte:

5'-TTT TTT TTT TGA GAA GGA AAA AG (SEQ ID NO : 3) 5'-TTT TTT TTT TGA GAA GGA AAA AG (SEQ ID NO: 3)

3. Probe II without a sequence complementary to the analyte:

5'-TTT TTT TTT TAG AGA AAG GGA AA (SEQ ID NO : 4) 5'-TTT TTT TTT TAG AGA AAG GGA AA (SEQ ID NO: 4)

Die Thymin-Reste der Sonden I und der zur Kontrolle eingesetzt Sonde II sind mit Osmiumtetroxid und 2,2'-Bipyridin wie oben beschrieben markiert worden. The thymine residues of probes I and control Probe II are used with osmium tetroxide and 2,2'-bipyridine like have been marked as described above.

Zur Immobilisierung des Analyten werden 40 µl superparamagnetische Partikel mit daran immobilisierten Oligo-T-25meren der Firma Dynal, Norwegen zu 40 µl einer 10 µgjml des Analyten in 0,1 mol/l NaCl, 0,05 mol/l Phosphatpuffer, pH 7,4 (Inkubationspuffer) enthaltenden Lösung zugesetzt. Die Suspension wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Partikel werden zwei mal in 100 µl Inkubationspuffer gewaschen und in einem Volumen von 40 µl aufgenommen. 40 µl are used to immobilize the analyte superparamagnetic particles with immobilized oligo-T-25meres Dynal, Norway, to 40 µl of a 10 µgjml of the analyte in 0.1 mol / l NaCl, 0.05 mol / l phosphate buffer, pH 7.4 (Incubation buffer) containing solution. The suspension will incubated for 30 minutes at room temperature. The particles are washed twice in 100 µl incubation buffer and in a volume of 40 ul was added.

Zur Hybridisierung des Analyten mit der Sonde werden 40 µl des 400 ng/ml der Sonde enthaltenden Inkubationspuffers zu den Partikeln gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundene Sonden werden durch viermaliges Waschen in 100 µl Inkubationspuffer entfernt. Die gebundene Sonde wird durch Erhitzen auf 85°C freigesetzt und durch Abtrennen des die Sonde enthaltenden Überstands abgesondert. Zur elektrochemischen Detektion der Osmium-markierten Sonde werden 3 µl des Überstands durch DPV mit einer Absorptionszeit von 2 Minuten in Britton-Robinson-Puffer, pH 3,87 analysiert. Zur Bestimmung einer unspezifischen Bindung wird der Analyt mit der Sonde II in einem separaten Ansatz unter identischen Bedingungen in Kontakt gebracht und Inkubiert. 40 µl are used to hybridize the analyte with the probe of the incubation buffer containing 400 ng / ml of the probe given to the particles and for 30 minutes at room temperature incubated. Unbound probes are replaced by four Wash away in 100 µl incubation buffer. The bound The probe is released by heating to 85 ° C and by Separate the supernatant containing the probe separately. For electrochemical detection of the osmium-labeled probe 3 µl of the supernatant are removed by DPV with a Absorption time of 2 minutes in Britton-Robinson buffer, pH 3.87 analyzed. To determine an unspecific binding, the Analyte with probe II in a separate approach below Identical conditions contacted and incubated.

Das in Fig. 4 dargestellte DPV-Voltammogramm zeigt ein deutliches Signal 48 der Sonde I und ein sehr schwaches Signal 50 der zur Kontrolle eingesetzten Sonde II. The DPV voltammogram shown in FIG. 4 shows a clear signal 48 from probe I and a very weak signal 50 from probe II used for the control.

Zur Bestimmung der Sensitivität der Chronopotentiometrischen Stripping Analyse (CSPA) bei Verwendung von Cystein-PNA-Sonden sind verschiedene Konzentrationen von Cystein-PNA (cys- PNA) in 5 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,0 für eine Absorbtionszeit von 7 Minuten an einer Elektrode absorbiert worden. Fig. 5a zeigt ein dann in 0,2 mol/l Ammoniumphosphatpuffer, pH 8,5 bei einem Stripping Strom von -2 µA aufgenommenes DPV- Diagramm mit den Wasserstoff-Peak-Kurven 52, 54 und 56 von jeweils 0,375, 0,180 und 0,094 ng/ml cys-PNA. Die Nachweisgrenze von cys-PNA lag dabei unter 0,09 ng/ml. Das entspricht 36 attomol cys-PNA in 1 µl. Fig. 5b zeigt ein DPV-Diagramm von Brdicka's Signalkurven 58, 60 und 62 von jeweils 0,750, 0,375 und 0,187 ng/ml cys-PNA in 1 mmol/l Co³⁺, 0,1 mol/l Ammoniumphosphatpuffer, pH 9,47. Dabei lag die Nachweisgrenze von cys-PNA unter 0,19 ng/ml. To determine the sensitivity of the chronopotentiometric stripping analysis (CSPA) when using cysteine-PNA probes, different concentrations of cysteine-PNA (cys-PNA) in 5 mmol / l phosphate buffer, pH 7.0 for an absorption time of 7 minutes at one Electrode has been absorbed. , Fig. 5 a then in 0.2 mol / l ammonium phosphate buffer, pH 8.5 recorded in a stream of stripping uA -2 DPV diagram with the hydrogen peak curves 52, 54 and 56 of respectively 0.375, 0.180 and 0.094 ng / ml cys-PNA. The detection limit of cys-PNA was below 0.09 ng / ml. This corresponds to 36 attomol cys-PNA in 1 µl. Fig. 5b shows a diagram of DPV-Brdicka's signal curves 58, 60 and 62 respectively 0.750, 0.375 and 0.187 ng / ml cys-PNA in 1 mmol / l Co ^3+, 0.1 mol / l ammonium phosphate buffer, pH 9.47 , The detection limit of cys-PNA was below 0.19 ng / ml.

Fig. 6a-f zeigen eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem eine erste 20 und eine zweite Sonde 22 sequenzspezifisch an den Analyten 10 binden. Fig. 6a zeigt einen Analyten 10 mit einer singulären ersten Bindungsstelle 12 und drei repetetiven zweiten Bindungsstellen 14. Der Analyt 10 wird an einer ersten Oberfläche 16 eines Partikels 18 immobilisiert (Fig. 6b). Der Analyt 10 wird mit der ersten Sonde 20 und der zweiten Sonde 22 in Kontakt gebracht (Fig. 6c). Die erste Sonde 20 weist eine Affinität zur ersten Bindungsstelle 12 und die zweite Sonde 22 eine Affinität zu den zweiten Bindungsstellen 14 auf. Die erste Sonde 20 ist mit einem ersten elektrochemischen Marker 24 und die zweite Sonde 22 mit einem zweiten elektrochemischen Marker 26 markiert. FIGS. 6a-f show a schematic representation of an inventive method, in which a first 20 and a second probe 22 sequence-specifically bind to the analyte 10. FIG. 6a shows a analyte 10 having a singular first binding site 12 and three repetitive second binding sites 14. The analyte 10 is immobilized on a first surface 16 of a particle 18 ( FIG. 6b). The analyte 10 is brought into contact with the first probe 20 and the second probe 22 ( FIG. 6c). The first probe 20 has an affinity for the first binding site 12 and the second probe 22 has an affinity for the second binding sites 14 . The first probe 20 is marked with a first electrochemical marker 24 and the second probe 22 with a second electrochemical marker 26 .

Unter den gewählten Bedingungen bindet die erste Sonde 20 an die erste Bindungsstelle 12 und die zweite Sonde 22 an die zweiten Bindungsstellen 14 (Fig. 6d). Ungebundene Sonden werden durch Waschen entfernt. Die Sonden werden von dem Analyten freigesetzt und zum Nachweis mit einer zweiten als Elektrode dienenden Oberfläche 27 in Kontakt gebracht (Fig. 6e). Das durch den Marker 24 verursachte Signal Si1 und das durch den Marker 26 verursachte Signal Si2 werden gemessen (Fig. 6f) und zueinander ins Verhältnis gesetzt. Das Verhältnis von Si2 zu Si1 entspricht dem Verhältnis der Zahl der zweiten Bindungsstellen 14 zur ersten Bindungsstelle 12. Fig. 7a-f zeigen eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei eine erste Sonde 20 sequenzspezifisch und eine zweite Sonde 22 sequenzunspezifisch an den Analyten 10 bindet. Under the selected conditions, the first probe 20 binds to the first binding site 12 and the second probe 22 to the second binding site 14 ( FIG. 6d). Unbound probes are removed by washing. The probes are released from the analyte and brought into contact with a second surface 27 serving as an electrode for detection ( FIG. 6e). The signal Si1 caused by the marker 24 and the signal Si2 caused by the marker 26 are measured ( FIG. 6f) and related to each other. The ratio of Si2 to Si1 corresponds to the ratio of the number of second binding sites 14 to the first binding site 12 . Fig. 7a-f show a schematic representation of the method according to the invention, wherein a first probe 20, a sequence-specific and a second probe 22 binds to the analyte sequence-unspecific 10th

Fig. 7a zeigt einen Analyten 10, welcher eine singuläre erste Bindungsstelle 12 aufweist. Der Analyt 10 wird an einer ersten Oberfläche 16 eines Partikels 18 immobilisiert (Fig. 7b). Der Analyt 10 wird mit den ersten Sonden 20 und zweiten Sonden 22 in Kontakt gebracht (Fig. 7c). Die erste Sonde 20 weist eine Bindungsaffinität zur ersten Bindungsstelle 12 auf. Die zweite Sonde 22 weist eine sequenzunspezifische Affinität zu dem Analyten 10 auf. Die zweite Sonde 22 kann beispielsweise ein DNA-Interkalator sein. Die erste Sonde 20 ist durch einen ersten elektrochemischen Marker 24 und die zweite Sonde 22 durch einen zweiten elektrochemischen Marker 26 markiert. Fig. 7a shows an analyte 10, having a singular first binding site 12. The analyte 10 is immobilized on a first surface 16 of a particle 18 ( FIG. 7b). The analyte 10 is brought into contact with the first probes 20 and second probes 22 ( FIG. 7c). The first probe 20 has a binding affinity for the first binding site 12 . The second probe 22 has a sequence-unspecific affinity for the analyte 10 . The second probe 22 can be a DNA intercalator, for example. The first probe 20 is marked by a first electrochemical marker 24 and the second probe 22 by a second electrochemical marker 26 .

Unter den gewählten Bedingungen binden die erste Sonde 20 und die zweite Sonde 22 an den Analyten 10 (Fig. 7d). Ungebundene erste 20 und zweite Sonde 22 werden durch Waschen entfernt. Gebundene erste 20 und die zweite Sonde 22 werden von dem Analyten freigesetzt und mit einer zweiten als Nachweiselektrode dienenden Oberfläche 27 in Kontakt gebracht (Fig. 7e). Under the selected conditions, the first probe 20 and the second probe 22 bind to the analyte 10 ( FIG. 7d). Unbound first 20 and second probe 22 are removed by washing. Bound first 20 and second probe 22 are released from the analyte and brought into contact with a second surface 27 serving as a detection electrode ( FIG. 7e).

Das durch den Marker 24 verursachte erste Signal Si1 und das durch den Marker 26 verursachte zweite Signal Si2 werden gemessen (Fig. 7f) und zueinander ins Verhältnis gesetzt. Das Verhältnis entspricht dem Verhältnis der ersten Bindungsstelle 12 zu der Gesamtlänge des Analyten 10. The first signal Si1 caused by the marker 24 and the second signal Si2 caused by the marker 26 are measured ( FIG. 7f) and related to each other. The ratio corresponds to the ratio of the first binding site 12 to the total length of the analyte 10 .

In Fig. 8a ist ein aus Nukleinsäure bestehender Analyt 10 mit einer singulären ersten Bindungsstelle 12 und einer bestimmten Anzahl von Guanin-Resten G dargestellt. Der Analyt 10 wird an einer erste Oberfläche 16 eines Partikels 18 immobilisiert (Fig. 8b). Er wird mit einer ersten Sonde 20, welche mit einem elektrochemischen Marker 24 markiert ist und eine spezifische Affinität zu der ersten Bindungsstelle 12 aufweist, in Kontakt gebracht (Fig. 8c). Unter den gewählten Bedingungen bindet die erste Sonde 20 an die erste Bindungsstelle 12 (Fig. 8d). Ungebundene erste Sonde 20 wird durch Waschen entfernt. An den Analyten 10 gebundene erste Sonde 20 und die Guanin-Reste G werden von bzw. aus dem Analyten 10, z. B. durch saure Hydrolyse, freigesetzt und mit einer zweiten als Nachweis-Elektrode dienenden Oberfläche 27 in Kontakt gebracht (Fig. 8e). Das durch G erzeugte Signal Si1 und das durch den Marker 24 erzeugte Signal Si2 werden gemessen (Fig. 8f) und zueinander ins Verhältnis gesetzt. Das Verhältnis der Signale Si1 zu Si2 entspricht dem Zahlenverhältnis der ersten Bindungsstelle 12 zu der Gesamtanzahl an G in dem Analyten 10. In Fig. 8a, an existing nucleic acid analyte from 10 having a singular first binding site 12 and a certain number of guanine residues G is illustrated. The analyte 10 is immobilized on a first surface 16 of a particle 18 ( FIG. 8b). It is brought into contact with a first probe 20 , which is labeled with an electrochemical marker 24 and has a specific affinity for the first binding site 12 ( FIG. 8c). Under the selected conditions, the first probe 20 binds to the first binding site 12 ( FIG. 8d). Unbound first probe 20 is removed by washing. First probe 20 bound to the analyte 10 and the guanine residues G are removed from or from the analyte 10 , e.g. B. by acid hydrolysis, released and brought into contact with a second surface 27 serving as a detection electrode ( Fig. 8e). The signal Si1 generated by G and the signal Si2 generated by marker 24 are measured ( FIG. 8f) and related to each other. The ratio of the signals Si1 to Si2 corresponds to the numerical ratio of the first binding site 12 to the total number of G in the analyte 10 .

In Fig. 9a ist ein doppelsträngiges DNA-Fragment 11, welches eine unbekannte Anzahl von für eine Triplex-Krankheit spezifischen repetetiven je eine zweite Bindungsstelle 14 enthaltende Sequenzen und eine singuläre eine erste Bindungsstelle 12 enthaltende Sequenz aufweist. Das DNA-Fragment wird mit einem ersten, an seinem 5'-Ende einen Poly-A-Anteil pA aufweisenden Primer 28 und einem zweiten Primer 30 in Kontakt gebracht. Die ersten 28 und zweiten Primer 30 binden an jeweils einen DNA-Strang des DNA-Fragments 11 und rahmen dabei die zweiten Bindungsstellen 14 und die erste Bindungsstelle 12 ein (Fig. 9b). In Fig. 9a, a double stranded DNA fragment 11 which repetitive an unknown number of specific disease Triplex for each is a second binding site sequences and 14 containing a singular a first binding site has 12-containing sequence. The DNA fragment is brought into contact with a first primer 28, which has a poly-A portion of pA at its 5 'end, and a second primer 30 . The first 28 and second primers 30 each bind to a DNA strand of the DNA fragment 11 and frame the second binding sites 14 and the first binding site 12 ( FIG. 9b).

Durch eine Vervielfältigungsreaktion wird ein Amplifikationsprodukt 32 erzeugt, welches die zweiten Bindungsstellen 14 und die erste Bindungsstelle 12 sowie den Poly-A-Anteil an einem 5'-Ende enthält (Fig. 9c). Das Amplifikationsprodukts 32 wird durch Denaturierung von seinem Gegenstrang 33 getrennt und mit einem eine Poly-T-Sonde als Fänger-Molekül pT aufweisenden superparamagnetischen Partikel 18 in Kontakt gebracht. Dabei bindet der Poly-A-Anteil pA spezifisch an die Poly-T-Sonde pT (Fig. 9d). An amplification product 32 is generated by a amplification reaction and contains the second binding sites 14 and the first binding site 12 as well as the poly-A portion at a 5 'end ( FIG. 9c). The amplification product 32 is separated from its counter-strand 33 by denaturation and brought into contact with a superparamagnetic particle 18 which has a poly-T probe as the capture molecule pT. The poly-A portion pA specifically binds to the poly-T probe pT ( FIG. 9d).

Das an das Partikel 18 gebundene Amplifikationsprodukt 32 wird mit einer ersten Sonde 20, welche eine spezifische Affinität zu der ersten Bindungsstelle 12 aufweist und einer zweiten Sonde 22, welche eine spezifische Affinität zu den zweiten Bindungsstellen 14 aufweist, in Kontakt gebracht. Die erste Sonde 20 ist mit einem elektrochemischen Marker 24 und die zweite Sonde 22 mit einem elektrochemischen Marker 26 markiert (Fig. 9e). The amplification product 32 bound to the particle 18 is brought into contact with a first probe 20 which has a specific affinity for the first binding site 12 and a second probe 22 which has a specific affinity for the second binding sites 14 . The first probe 20 is marked with an electrochemical marker 24 and the second probe 22 with an electrochemical marker 26 ( FIG. 9e).

Unter den gewählten Bedingungen bindet die erste Sonde 20 an die erste Bindungsstelle 12 und die zweite Sonde 22 an die zweiten Bindungsstellen 14 (Fig. 9f). Der Überschuss an ungebundener erster 20 und zweiter Sonde 22 wird durch Waschen entfernt. Under the selected conditions, the first probe 20 binds to the first binding site 12 and the second probe 22 to the second binding site 14 ( FIG. 9f). The excess of unbound first 20 and second probe 22 is removed by washing.

Gebundene erste 20 und zweite Sonden 22 werden von dem Amplitikationsprodukt 32 freigesetzt und mit einer Nachweiselektrode 27 in Kontakt gebracht (Fig. 9g). Durch die Marker 24 und 26 verursachte elektrochemische Signale werden getrennt voneinander erfasst. Die Anzahl der repetetiven Sequenzen wird aus dem Verhältnis der durch die Marker 24 und 26 erzeugten Signale ermittelt. Das Verfahren ist somit zum Nachweisen und Identifizieren einer Triplex-Krankheit geeignet. SEQUENZPROTOKOLL

Bound first 20 and second probes 22 are released from the amplification product 32 and brought into contact with a detection electrode 27 ( FIG. 9g). Electrochemical signals caused by markers 24 and 26 are recorded separately from one another. The number of repetitive sequences is determined from the ratio of the signals generated by markers 24 and 26 . The method is therefore suitable for the detection and identification of a triplex disease. SEQUENCE LISTING

Claims

1. A method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte ( 10 ) contained in a first liquid with the following steps:

a) contacting and incubating the analyte ( 10 ) with a respective first ( 20 ) and second probe ( 22 ) having an affinity for the analyte ( 10 ), the affinity of the first probe ( 20 ) being due to a specific affinity for at least one first Binding site ( 12 ) of the analyte ( 10 ) is effected and the incubation takes place under conditions under which the first ( 20 ) and the second probe ( 22 ) bind to the analyte ( 10 ),

b) marking the first probe ( 20 ) by at least one electrochemically specifically detectable first marker ( 24 ), at least if it is not already electrochemically specifically detectable,

c) marking the second probe ( 22 ) by at least one electrochemically specifically detectable second marker ( 26 ), at least if it is not already electrochemically specifically detectable,

d) separating the first ( 20 ) and second probe ( 22 ) bound to the analyte ( 10 ),

e) detection of a first electrochemical signal (Si1) caused by the secreted first probe ( 20 ) or the first marker ( 24 ) and a second electrochemical signal (Si2) caused by the secreted second probe ( 22 ) or the second marker ( 26 ) and

f) detecting, quantifying and / or characterizing the analyte ( 10 ) by means of a ratio between the first (Si1) and the second signal (Si2)

2. A method for detecting, quantifying and / or characterizing an analyte ( 10 ) contained in a first liquid with the following steps:

a) contacting and incubating the analyte ( 10 ) with in each case an affinity for the analyte ( 10 ) having the first probe ( 20 ), the affinity of the first probe ( 20 ) by a specific affinity for at least a first binding site ( 12 ) of the Analyte ( 10 ) is effected and the incubation takes place under conditions under which the first probe ( 20 ) binds to the analyte ( 10 ),

c) marking the analyte ( 10 ) by at least one electrochemically specifically detectable second marker ( 26 ), at least if the analyte ( 10 ) is not already electrochemically specifically detectable,

d) discharging the by the first probe (20) bound analyte (10) and from the analyte (10) bound first probe (20),

e) detection of a first electrochemical signal (Si1) caused by the secreted first probe ( 20 ) or the first marker ( 24 ) and a second electrochemical signal (Si2) caused by the secreted analyte ( 10 ) or the second marker ( 26 ) and

3. The method according to claim 1 or 2, wherein an electrode used for detection ( 27 ) is not brought into contact with the first liquid.

4. The method according to any one of the preceding claims, wherein the analyte ( 10 ) before step lit. e, especially before step lit. a, separated from the first liquid and transferred to a second liquid.

5. The method according to any one of the preceding claims, wherein the analyte ( 10 ), in particular specifically, is bound by a scavenger molecule (pT, (T) _n ).

6. The method according to any one of the preceding claims, wherein the capture molecule (pT, (T) _n ) is immobilized on a first ( 16 ) or second surface.

7. The method according to any one of the preceding claims, wherein the capture molecule (pT, (T) _n ) is a nucleic acid, an analogue of a nucleic acid, in particular a peptide nucleic acid (PNA), an antibody or a receptor.

8. The method according to any one of the preceding claims, wherein the scavenger molecule (pT, (T) _n ) has an affinity molecule, in particular streptavidin, avidin or biotin, or a biotinylated oligonucleotide.

9. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first ( 20 ) or second probe ( 22 ) or the analyte ( 10 ) contains an affinity molecule, in particular biotin, avidin or streptavidin.

10. The method according to any one of the preceding claims, wherein the analyte ( 10 ), in particular a poly-T-end (pT, (T) _n ) or a poly-A end (pA, (A) _n ) having nucleic acid is.

11. The method according to any one of the preceding claims, wherein characterizing by determining the length of the Nucleic acid occurs.

12. The method according to any one of the preceding claims, wherein the analyte ( 10 ) before or during step lit. a is amplified by means of a nucleic acid amplification reaction, in particular a PCR.

13. The method according to any one of the preceding claims, wherein the analyte ( 10 ) before step lit. d, especially before step lit. a, is immobilized on the first ( 16 ) or second surface.

14. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first surface ( 16 ) is the surface of a, in particular superparamagnetic, particle ( 18 ).

15. The method according to claim 14, wherein the particle ( 18 ) has a diameter of 10 nm to 100 µm, in particular 1-10 µm.

16. The method according to any one of the preceding claims, wherein the second surface is a serving for detection, in particular an electrically conductive plastic or an electrically conductive polymer, mercury, amalgam, gold, platinum, carbon or indium tin oxide containing electrode ( 27 ).

17. The method according to any one of the preceding claims, wherein the second probe ( 22 ) has a specific affinity for at least one specific second binding site ( 14 ) of the analyte ( 10 ).

18. The method according to the preceding claim, wherein the analyte ( 10 ) has a known number of first binding sites ( 12 ) and an unknown number of second binding sites ( 14 ).

19. The method according to any one of the preceding claims, wherein the analyte ( 10 ) is a DNA fragment which, as a result of a triplex expansion disease, such as fragile X syndrome, Huntington's disease, bulbar muscle atrophy, spinocerebellar ataxia type I, myotonic dystrophy or Friedreich's ataxia, which has repetitive sequences.

20. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first probe ( 20 ) from the analyte ( 10 ) and / or the analyte ( 10 ) from the first ( 16 ) or second surface between step lit. d and step lit. e, in particular by heat denaturation, chemical denaturation, enzymatic digestion or chemical degradation.

21. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first ( 20 ) and the second probe ( 22 ) from the analyte ( 10 ) or the first probe ( 20 ) from the analyte ( 10 ) and the analyte ( 10 ) from the first ( 16 ) or second surface can be released separately from each other and then detected.

22. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first marker ( 24 ) and / or the second marker ( 26 ), in particular each separately from the first ( 20 ) and / or second probe ( 22 ) or the analyte ( 10 ) released and then detected.

23. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first ( 24 ) and / or the second marker ( 26 ) are released by enzymatic digestion or chemical degradation.

24. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first ( 20 ) and / or second probe ( 22 ) is a nucleic acid or an analog of a nucleic acid, in particular a peptide nucleic acid (PNA).

25. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first ( 20 ) and / or second probe ( 22 ) binds to the analyte ( 10 ) in a sequence-specific manner, in particular by hybridization.

26. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (Si1) or second signal (Si2) is caused in each case by a catalytic hydrogen release caused by the first ( 24 ) or second marker ( 26 ).

27. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first ( 24 ) and / or the second marker ( 26 ) is reversibly reducible or oxidizable.

28. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first ( 24 ) or second marker ( 26 ) an osmium complex, a nanogold particle, a cysteine, ferrocenyl, daunomycin, benzoquinone, naphthoquinone, or anthraquinone or p-aminophenol group or a dye, in particular indophenol, thiazine or phenazine.

29. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first ( 20 ) or second probe ( 22 ) is marked by a plurality of markers ( 24 , 26 ).

30. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first ( 20 ) or second probe ( 22 ) has a linear primary structure, at one end of which the marker ( 24 , 26 ) is arranged.

31. The method according to any one of the preceding claims, wherein the detection of the first (Si1) and the second signal (Si2) on the same electrode and / or by the same electrochemical detection method takes place.

32. The method according to any one of the preceding claims, wherein detection using cathodic stripping voltammetry (CSV), square wave voltammetry, cyclic Voltammetry or chronopotentiometry is done.

33. The method according to any one of the preceding claims, wherein detection using a reversible redox process or catalytic hydrogen evolution takes place.