DE10217098B4 - Incident lighting arrangement for a microscope - Google Patents

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    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/082—Condensers for incident illumination only

Abstract

Auflicht-Beleuchtungsanordnung für ein Mikroskop (1) mit einem eine optische Achse (0) aufweisenden Objektiv (4), wobei die Beleuchtungsanordnung aufweist:
– eine Beleuchtungsquelle (11), die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlbündel (9) abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse (0) propagiert, und
– eine Umlenkeinrichtung (14), die das Beleuchtungsstrahlbündel (9) umlenkt und parallel zur optischen Achse (0) in das Objektiv (4) einkoppelt,
dadurch gekennzeichnet, daß
– das von der Beleuchtungsquelle (11) abgegebene Beleuchtungsstrahlbündel (9) s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer konstanten Phasendifferenz d = n·60° aufweist, wobei n eine ganze Zahl ist, und
– die Umlenkeinrichtung (14) das Beleuchtungsstrahlbündel x-mal oder ein ganzzahliges Vielfaches davon reflektiert, wobei x = ((n + 1)·180° – d)/60° gilt, so daß linear polarisiertes Licht in das Objektiv (4) fällt.Incident light illumination arrangement for a microscope (1) with a lens (4) having an optical axis (0), the illumination arrangement comprising:
- An illumination source (11) which emits a polarized illuminating beam (9) during operation, which propagates at an angle to the optical axis (0), and
A deflection device (14) which deflects the illuminating beam (9) and couples it into the objective (4) parallel to the optical axis (0),
characterized in that
- The illumination beam (9) emitted by the illumination source (11) has s and p polarization directions with a constant phase difference d = n · 60 °, where n is an integer, and
- The deflection device (14) reflects the illuminating beam x times or an integer multiple thereof, where x = ((n + 1) · 180 ° - d) / 60 °, so that linearly polarized light falls into the lens (4) ,

Figure 00000001
Figure 00000001

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Auflicht-Beleuchtungsanordnung für ein Mikroskop mit einem eine optische Achse aufweisenden Objektiv, die aufweist: eine Beleuchtungsquelle, die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert, und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt.The invention relates to a Incident lighting arrangement for a microscope with a lens having an optical axis, the comprises: an illumination source which, in operation, has a polarized one Lighting beam emits that propagates at an angle to the optical axis, and a deflection device that deflects the illuminating beam and couples into the lens parallel to the optical axis.

Solche Auflicht-Beleuchtungsanordnungen sind insbesondere bei der sogenannten Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (auch TIRF-Mikroskopie bezeichnet) im Einsatz, wenn die Beleuchtungstrahlung unter definierten Winkelbedingungen auf eine Probe fallen muß.Such incident light lighting arrangements are especially in so-called total reflection fluorescence microscopy (also called TIRF microscopy) in use when illuminating radiation must fall on a sample under defined angular conditions.

Bei der TIRF-Mikroskopie wird eine hohe axiale Auflösung erreicht, indem Beleuchtungsstrahlung so eingestrahlt wird, daß an der Probenoberfläche Totalreflexion auftritt. Dadurch wird eingestrahlte Leistung nur als evaneszente Welle ins optisch dünnere Probenmedium eingebracht. Dabei werden grenzflächennahe Moleküle zur Fluoreszenz angeregt. Die Anregungsintensität fällt exponentiell mit dem Abstand von der Grenzfläche ab, so daß die Eindringtiefe der Anregung auf eine Größenordnung von maximal 200 nm begrenzt werden kann. Da die Eindringtiefe weiter durch den Einfallswinkel des Lichtes auf die Grenzfläche variiert werden kann, erhält man eine sensible und sehr hoch auflösende Tiefensonde für die Erforschung von Geometrie oder Biodynamik von Zellen, Membranen und anderen Grenzflächen.TIRF microscopy uses a high axial resolution achieved by irradiating illuminating radiation so that at the Sample surface total reflection occurs. This means that radiated power is only evanescent Wave into the optically thinner Sample medium introduced. Molecules close to the surface become fluorescence stimulated. The excitation intensity falls exponentially with the distance from the interface so that the Penetration depth of the excitation to a maximum of 200 nm can be limited. As the depth of penetration continues through the angle of incidence of light on the interface can be varied a sensitive and very high-resolution depth probe for research of geometry or biodynamics of cells, membranes and others Interfaces.

Die TIRF-Mikroskopie, wie sie beispielsweise in der Veröffentlichung Axelrod, D.: "Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflexion fluorescence", J. Cell Biol. 89 (1981) 141–145, beschrieben ist, ist somit auf unter einem großen Winkel auf die Grenzfläche von Objektträger und Probe einfallende Strahlung angewiesen. Die gattungsbildende Veröffentlichung Axelrod, D., Journal of Biomedical Optics, 6, 2001, schlägt dazu vor, einen Laser als Beleuchtungsquelle einzusetzen, dessen Strahlung über ein Planglas in das Mikroskop-Objektiv eingekoppelt wird. Mit Hilfe einer geeignet angeordneten Schiebelinse kann dann der Winkel der Totalreflexion eingestellt werden. Da der dingseitige Brennpunkt der Schiebelinse mit dem dingseitigen Brennpunkt des Objektives zusammenfällt, gelangt, wie erwünscht, paralleles Licht zur Totalreflexion. Die Effizienz ist allerdings durch mangelhafte Polarisation der auf die Probe fallenden Strahlung verbesserungswürdig.TIRF microscopy, such as that used for example in the publication Axelrod, D .: "Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence ", J. Cell Biol. 89 (1981) 141-145, is thus at a large angle to the interface of slides and sample incident radiation. The generic publication Axelrod, D., Journal of Biomedical Optics, 6, 2001, suggests this propose to use a laser as a source of illumination, the radiation of which emits a Plane glass is coupled into the microscope objective. With help a suitably arranged sliding lens can then the angle of Total reflection can be set. Because the focal point of the thing Sliding lens coincides with the focal point of the lens on the other side, as desired parallel light for total reflection. The efficiency is, however due to poor polarization of the radiation falling on the sample improvement.

Die DE 689 12 343 T2 beschreibt eine Auflicht-Beleuchtungsanordnung für ein TIRF-Mikroskop mit einstellbarem Einfallswinkel. Die JP 09229861 A shildert ein Fluoreszenzmikroskop mit elliptisch polarisiertem Beleuchtungslicht, bei dem die Phasendifferenz zwischen der s- und p-Polarisation einstellbar ist, und die US 59 43 129 betrifft ein Fluoreszenzmikroskop mit linear polarisiertem Auflicht-Beleuchtungslicht, bei dem das Fluoreszenzlicht hinsichtlich seiner Orthogonalkomponente registriert wird.The DE 689 12 343 T2 describes an incident light illumination arrangement for a TIRF microscope with an adjustable angle of incidence. The JP 09229861 A depicts a fluorescence microscope with elliptically polarized illuminating light, in which the phase difference between the s and p polarization is adjustable, and the US 59 43 129 relates to a fluorescence microscope with linearly polarized incident light illumination light, in which the fluorescence light is registered with regard to its orthogonal component.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Auflicht-Beleuchtungsanordnung der eingangs genannten Art soweit zu bilden, daß eine hocheffiziente Anregung erreicht wird.The invention has for its object a Incident light lighting arrangement of the type mentioned so far to form that a highly efficient excitation is achieved.

Diese Aufgabe wird bei einer Auflicht-Beleuchtungsanordnung der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer konstanten Phasendifferenz d = n·60° aufweist, wobei n eine ganze Zahl ist, und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlbündel x-mal oder ein ganzzahliges Vielfaches davon reflektiert, wobei x = ((n + 1)·180° – d)/60° gilt, so daß linear polarisiertes Licht in das Objektiv fällt.This task is done with a reflected light lighting arrangement of the type mentioned in that the emitted from the lighting source Lighting beam s and p polarization directions with a constant phase difference d = n · 60 °, where n is a whole Is number, and the deflection device the illuminating beam x times or an integer multiple thereof, where x = ((n + 1) · 180 ° - d) / 60 ° applies, see above that linear polarized light falls into the lens.

Die erfindungsgemäße Beleuchtungsanordnung koppelt die Eigenschaften der Beleuchtungsquelle hinsichtlich der Polarisation des abgegebenen Lichtes und die Eigenschaften der Umlenkeinrichtung so, daß im Endeffekt linear polarisiertes Licht über das Objektiv auf die Probe fällt. Gibt die Beleuchtungsquelle, beispielsweise ein Laser, linear polarisierte Strahlung ab, bei der bekanntermaßen die Phasendifferenz zwischen s- und p-Polarisationsrichtung Null ist, so sind die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Umlenkeinrichtung so vorgegeben, daß eine dreimalige Reflexion des Beleuchtungsstrahlbündels erfolgt. Da jede Reflexion eine Phasendifferenz von 60° zwischen s- und p-Polarisation zur Folge hat, tritt am Ausgang der Umlenkeinrichtung wieder. linear polarisiertes Licht aus. Natürlich kann die Umlenkeinrichtung auch ein Vielfaches von drei Reflexionen ausführen; unter dem Gesichtspunkt möglichst minimaler Lichtabschwächung ist jedoch regelmäßig eine Umlenkeinrichtung mit der geringsten möglichen Anzahl an Reflexionen zu bevorzugen.The lighting arrangement according to the invention couples the properties of the illumination source in terms of polarization of the emitted light and the properties of the deflection device so that in Bottom line linearly polarized light on the lens on the sample falls. Gives the illumination source, for example a laser, linearly polarized Radiation, at which the phase difference is known to be between s and p polarization direction is zero, so are the properties the deflection device according to the invention so specified that a three times reflection of the illuminating beam. Because any reflection a phase difference of 60 ° between s and p polarization results, occurs again at the exit of the deflection device. linearly polarized light. Of course, the deflection device also perform a multiple of three reflections; from the point of view if possible minimal light attenuation is, however, regularly one Deflection device with the lowest possible number of reflections to prefer.

Durch die Umlenkeinrichtung kann die Beleuchtungsquelle in beliebigem Abstand zur optischen Achse des Mikroskopes angeordnet werden, so daß die mitunter beim Stande der Technik anzutreffende bauliche Enge im Bereich der Beleuchtungseinheit nicht auftritt. Insbesondere kann die Umlenkeinrichtung eine 90°-Umlenkung bewirken, so daß die Beleuchtungsquelle bei vertikal verlaufender Mikroskopachse mit einem horizontal verlaufenden Beleuchtungsstrahlbündel ausgebildet werden kann.Through the deflection device the lighting source at any distance from the optical axis of the microscope are arranged so that sometimes at the stand the technical constriction in the area of the lighting unit does not occur. In particular, the deflection device can deflect 90 ° cause so that Illumination source with vertical microscope axis with a horizontally extending beam of illumination can be.

Bei der TIRF-Mikroskopie werden optimale Ergebnisse erreicht, wenn der Aperturwinkel, d.h. der Winkel, unter dem ein Beleuchtungsstrahlbündel auf eine Probe fällt, im wesentlichen dem Grenzwinkel der Totalreflexion an der Probe entspricht. Für solche Anwendungen ist deshalb eine Beleuchtungsanordnung anzustreben, mit der der Aperturwinkel verstellt werden kann. Dafür ist eine Weiterbildung der Erfindung zu bevorzugen, bei der die Umlenkeinrichtung das umgelenkte Strahlenbündel in einem Abstand zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt und ein Bauteil mit senkrecht zur optischen Achse verschiebbarer Lage aufweist, wobei der Abstand von der Lage des Bauteils abhängt.In TIRF microscopy, optimal results are achieved if the aperture angle, ie the angle at which an illuminating beam falls on a sample, essentially corresponds to the critical angle of the total reflection on the sample. There is therefore a lighting arrangement for such applications to strive with which the aperture angle can be adjusted. For this purpose, a further development of the invention is to be preferred, in which the deflection device couples the deflected beam into the objective at a distance from the optical axis and has a component with a position that can be displaced perpendicular to the optical axis, the distance depending on the position of the component.

Bei dieser Weiterbildung hängt der Aperturwinkel vom Abstand von der optischen Achse ab, mit dem ein gering divergierendes Strahlenbündel in das Objektiv eingekoppelt wird. Durch die verschiebbare Lage des Bauteils der Umlenkeinrichtung kann damit auf einfache Weise der Aperturwinkel auf den Grenzwinkel der Totalreflexion gestellt werden. Damit lassen sich die Bedingungen so wählen, daß optimale Einkopplung der Anregungsstrahlung in die zu untersuchende Probe auftritt.With this training, the Aperture angle from the distance from the optical axis with which a slightly divergent beam is coupled into the lens. Due to the movable position the component of the deflection device can thus be easily the aperture angle is set to the critical angle of total reflection become. This allows the conditions to be selected so that the optimal coupling of the Excitation radiation occurs in the sample to be examined.

Das Bauteil der Umlenkeinrichtung, dessen Lage veränderbar ist und den Abstand zur optischen Achse des Objektives festlegt, kann dabei verschiedenartig ausgestaltet werden. In einer zweckmäßigen Ausführung ist das Bauteil ein reflektierendes Element, das das Beleuchtungsstrahlbündel parallel zur optischen Achse umlenkt. Als reflektierende Elemente sind totalreflektierende Prismen bekannt, die vorteilhafterweise einen besonders hohen Reflexionsgrad aufweisen.The component of the deflection device, its position changeable and defines the distance to the optical axis of the lens, can be designed in different ways. It is in an appropriate design the component is a reflective element that parallel the illuminating beam deflects optical axis. As reflective elements are totally reflective Prisms known, which advantageously have a particularly high degree of reflection respectively.

Bei einer Beleuchtungsquelle, die linear polarisiertes Licht abgibt, ist eine Umlenkeinrichtung vorgesehen, die drei Reflexionen oder Vielfache davon aufweist. Unter dem Gesichtspunkt möglichst geringer Verluste ist es deshalb zu bevorzugen, daß die Beleuchtungsquelle ein linear polarisiertes Licht abgibt und die Umlenkeinrichtung ein Prisma aufweist, das das Beleuchtungsstrahlbündel mittels dreier Totalreflexionen umlenkt. Mit einem solchen Aufbau sind die optischen Verluste in der Umlenkeinrichtung minimiert. Gleichzeitig kann insbesondere bei einem hochparallelen Beleuchtungsstrahlbündel wegen der dann vernachlässigbar kleinen Variationsbreite des Beleuchtungswinkels eine nahezu vollständige Totalreflexion und somit eine hohe Effizienz der Beleuchtungsanordnung erreicht werden.With a lighting source that emits linearly polarized light, a deflection device is provided, that has three reflections or multiples thereof. From the point of view preferably low loss, it is therefore preferable that the lighting source emits a linearly polarized light and the deflection device has a prism that the illuminating beam by means of three total reflections deflects. With such a structure, the optical losses are in the deflection device minimized. At the same time, in particular with a highly parallel illuminating beam because of the then negligible small variation of the illumination angle an almost complete total reflection and thus achieved a high efficiency of the lighting arrangement become.

Wie bereits erwähnt, sind für Aufbauten, bei denen die Beleuchtungsquelle ein Beleuchtungsstrahlbündel abgibt, das senkrecht zur optischen Achse propagiert, Umlenkeinrichtungen vorgesehen, die eine 90°-Umlenkung vorsehen. Ein besonders einfachen und kompakten Aufbau erhält man dabei, wenn die Umlenkeinrichtung ein Berek-Prisma aufweist. Mit einem solchen Berek-Prisma kann die Einstellung des Abstandes zur optischen Achse durch einfache Verschiebung des Prismas senkrecht zur optischen Achse erreicht werden. Ein Berek-Prisma, das drei Totalreflexionen aufweist, ist mit einer Beleuchtungsstrahlquelle kombiniert, die linear polarisiertes Licht abgibt, z.B. mit einem Laser.As already mentioned, for structures where the Illumination source emits an illuminating beam that is perpendicular propagated to the optical axis, deflection devices provided that a 90 ° deflection provide. A particularly simple and compact structure is obtained when the deflection device has a Berek prism. With one Berek prism can adjust the distance to the optical axis by simply moving the prism perpendicular to the optical one Axis can be reached. A Berek prism that has three total reflections is combined with an illuminating beam source that emits linearly polarized light, e.g. with a laser.

Ein Berek-Prisma hat dabei zusätzlich den Vorteil, daß die Polarisation auch bei einer gewissen Variation des Einfallswinkels in das Prisma erhalten bleibt. So zeigte sich bei einer Variation von ±2° keine wesentliche Änderung der Polarisation am Ausgang des Prismas. Die Anordnung mit Berek-Prisma ist deshalb besonders unempfindlich gegen Variationen des Winkels, mit dem die Beleuchtungsstrahlquelle Strahlung abgibt. Insbesondere hat der Divergenzwinkel des Beleuchtungsstrahlbündels keine oder vergleichsweise geringe Auswirkungen auf die Polarisierung der Beleuchtungsstrahlung an der Probe. Bei Verwendung eines Berek-Prismas kann also auch stärker divergierende Beleuchtungsstrahlung verwendet werden, und der Justieraufwand sinkt.A Berek prism has the additional advantage that the Polarization even with a certain variation in the angle of incidence remains in the prism. This was shown in a variation of ± 2 ° no significant change the polarization at the exit of the prism. The arrangement with Berek prism is therefore particularly insensitive to variations in the angle, with which the illuminating beam source emits radiation. In particular the divergence angle of the illuminating beam has no or comparatively little impact on the polarization of illuminating radiation at the rehearsal. When using a Berek prism, it can also stronger divergent illuminating radiation are used, and the adjustment effort sinks.

Möchte man einen solchen Laser, der linear polarisiertes Strahlung abgibt, mit einer Umlenkeinrichtung kombinieren, die nicht genau drei Reflexionen ausführt, so muß man die Beleuchtungsquelle so fortbilden, daß sie die entsprechende Phasenverschiebung zwischen s- und p-Polarisationen erzeugt. Für solche Anwendungen ist es bevorzugt, daß die Beleuchtungsquelle einen linear polarisierte Strahlung abgebenden Laser und ein optisches Element zur Einstellung eines Polarisationswinkels aufweist. Ein solches optisches Element kann beispielsweise eine entsprechende Verzögerungsplatte sein, d.h. ein doppelbrechendes Element, das für s- und p-Polarisationsrichtungen unterschiedliche Ausbreitungsgeschwindigkeiten längs der optischen Achse aufweist. Auch ist eine Kombination aus Polteilern mit einer geeigneten Verzögerungsleitung möglich.Would like to such a laser that emits linearly polarized radiation, combine with a deflection device that does not have exactly three reflections executing, so you have to train the lighting source so that they have the corresponding phase shift generated between s and p polarizations. For such applications it is preferred that the lighting source a linearly polarized radiation-emitting laser and an optical one Has element for setting a polarization angle. On such an optical element can, for example, be a corresponding one retardation plate be, i.e. a birefringent element for s and p polarization directions has different speeds of propagation along the optical axis. Also is a combination of pole dividers with a suitable delay line possible.

Die erfindungsgemäße Beleuchtungsanordnung eignet sich, wie erwähnt, besonders für die TIRF-Mikroskopie. Sie kann dort mit besonderem Vorteil eingesetzt werden. Die erfindungsgemäße Aufgabe wird deshalb weiter gelöst durch ein TIRF-Mikroskop mit einer Auflicht-Beleuchtungsanordnung mit einem eine optische Achse aufweisenden Objektiv, die eine Beleuchtungsquelle aufweist, die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert, und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt, wobei das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer konstanten Phasendifferenz d = n·60° aufweist, wobei n eine ganze Zahl ist, und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlbündel x-mal oder ein ganzzahliges Vielfaches davon reflektiert, wobei x = ((n + 1)·180° – d)/60° gilt, so daß linear polarisiertes Licht in das Objektiv fällt.The lighting arrangement according to the invention is suitable as mentioned especially for TIRF microscopy. It can be used there with particular advantage. The task according to the invention will therefore continue to be resolved through a TIRF microscope with a reflected light illumination arrangement with a lens having an optical axis, which is an illumination source which emits a polarized illuminating beam during operation, that propagates at an angle to the optical axis, and one Deflection device that deflects the illuminating beam and parallel to it optical axis into the lens, which is from the illumination source emitted illuminating beam s and p polarization directions with a constant phase difference d = n · 60 °, where n is an integer, and the deflection device the illuminating beam x times or an integer multiple thereof, where x = ((n + 1) · 180 ° - d) / 60 ° applies, see above that linearly polarized Light falls into the lens.

Wenn die Beleuchtungsanordnung die Einstellung des Abstandes zur optischen Achse ermöglicht, kann der Aperturwinkel besonders exakt auf den Grenzwinkel der Totalreflexion eingestellt werden. Es ist deshalb ein Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskop zu bevorzugen, bei dem ein Aperturwinkel, unter dem das umgelenkte Beleuchtungsstrahlbündel auf eine Probe fällt durch Einstellung des Abstandes wählbar ist. Mit einem solchen Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskop kann optimale Anregung von Fluoroforen in einer Probe erreicht werden.If the lighting arrangement enables the distance to the optical axis to be set, the aperture angle can be set particularly precisely to the critical angle of the total reflection. It is therefore preferable to use a total reflection fluorescence microscope in which an aperture angle at which the deflected illuminating beam falls on a sample can be selected by adjusting the distance. With such a total reflection flow orescent microscope can achieve optimal excitation of fluorofores in a sample.

Die Erfindung wird nachfolgend beispielhalber unter Bezugnahme auf die Zeichnungen noch näher erläutert. Die einzige Figur der Zeichnung zeigt eine schematische Schnittdarstellung durch ein Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskop mit einer Auflicht-Beleuchtungsanordnung.The invention is illustrated below by way of example explained in more detail with reference to the drawings. The only figure of the Drawing shows a schematic sectional view through a total reflection fluorescence microscope with a reflected light lighting arrangement.

Das in der Figur mit Bezugszeichen 1 versehene Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskop (im folgenden TIRF-Mikroskop) weist einen Empfänger 2 auf, der ein Zwischenbild aufnimmt, welches von einer Tubuslinse 3 erzeugt wird. Der Tubuslinse 3 ist ein Objektiv 4 vorgeordnet, das ein Bild einer Probe 5 aufnimmt. Empfänger 2, Tubuslinse 3 und Objektiv 4 befinden sich auf einer optischen Achse 0.That in the figure with reference numerals 1 provided total reflection fluorescence microscope (in the following TIRF microscope) has a receiver 2 on, which takes an intermediate image, which is from a tube lens 3 is produced. The tube lens 3 is a lens 4 preceded by a picture of a sample 5 receives. receiver 2 , Tube lens 3 and lens 4 are on an optical axis 0 ,

Über der Probe 5 liegt ein Deckglas 6, und zwischen Deckglas 6 und Objektiv 4 ist eine Ölimmersion 7 angeordnet.Over the sample 5 there is a cover slip 6 , and between coverslip 6 and lens 4 is an oil immersion 7 arranged.

Aus einer Beleuchtungsanordnung 8 wird ein Beleuchtungsstrahl 9 in einem Abstand A zur optischen Achse 0 in das Objektiv 4 eingekoppelt, so daß er unter einem Aperturwinkel α auf die Grenzfläche zwischen Probe 5 und Deckglas 6 fällt.From a lighting arrangement 8th becomes an illuminating beam 9 at a distance A from the optical axis 0 into the lens 4 coupled so that it is at an aperture angle α on the interface between the sample 5 and coverslip 6 falls.

Das Mikroskop, bei dem es sich beispielsweise um ein Mikroskop des Bautypes Axioplan der Carl Zeiss, Deutschland, handeln kann, erlaubt damit die Einkopplung der Energie aus evaneszenten Wellen in das optisch dünnere Medium der Probe 5, wodurch grenzflächennahe Moleküle zur Fluoreszenz angeregt werden können. Durch den scharfen Abfall der Intensität mit dem Abstand von der Grenzfläche wird trotz einer Wellenlänge zwischen 350 und etwa 700 μm eine deutlich darunter liegende Eindringtiefe erreicht, z.B. 50 bis 200 μm; die Tiefenauflösung ist also besser, als es die zu verwendende Wellenlänge eigentlich erwarten ließe.The microscope, which can be, for example, an Axioplan microscope from Carl Zeiss, Germany, allows the coupling of the energy from evanescent waves into the optically thinner medium of the sample 5 , which can stimulate near-surface molecules to fluoresce. Due to the sharp drop in intensity with the distance from the interface, a penetration depth which is significantly lower, for example 50 to 200 μm, is achieved despite a wavelength between 350 and about 700 μm; the depth resolution is therefore better than the wavelength to be used would actually be expected.

Es kann somit mit sehr guter Tiefenauflösung ein fluoreszierendes Objekt 16 der Probe 5 mit dem Mikroskop 1 erfaßt werden. Da die Eindringtiefe durch den Einfallswinkel bzw. Aperturwinkel α der Strahlung aus dem Beleuchtungsstrahl 9 auf die Grenzfläche variiert, ist die Beleuchtungsanordnung 8 so ausgebildet, daß der Aperturwinkel α verändert werden kann.It can therefore be a fluorescent object with very good depth resolution 16 the sample 5 with the microscope 1 be recorded. Since the penetration depth is due to the angle of incidence or aperture angle α of the radiation from the illuminating beam 9 varies on the interface is the lighting arrangement 8th designed so that the aperture angle α can be changed.

Das an der Probe 5 total reflektierte Licht wird dann über einen Spiegel 10 wieder ausgekoppelt, so daß die Erfassung des Objektes 16 im Mikroskop 1 nicht durch Falschlicht gestört wird.That at the rehearsal 5 totally reflected light is then transmitted through a mirror 10 uncoupled again, so that the detection of the object 16 in the microscope 1 is not disturbed by false lights.

Die Amplitude, mit der sich die inhomogene Welle im optisch dünneren Medium der Probe 5 fortpflanzt bzw. exponentiell abklingt, hängt vom Polarisationszustand des einfallenden Beleuchtungsstrahls 9 ab und hat dann ein Maximum, wenn linear polarisiertes Licht auf die Grenzfläche zwischen dünnerem Medium, d.h. Probe 5, und optisch dichterem Medium, d.h. Deckglas 6, fällt. Die Polarisationsrichtung wird dabei experimentell eingestellt.The amplitude with which the inhomogeneous wave is in the optically thinner medium of the sample 5 propagates or decays exponentially depends on the polarization state of the incident illuminating beam 9 and then has a maximum when linearly polarized light hits the interface between the thinner medium, ie sample 5 , and optically denser medium, ie cover glass 6 , falls. The direction of polarization is set experimentally.

Die Beleuchtungsanordnung 8, die den Beleuchtungsstrahl 9 im gewünschten Abstand A zur optischen Achse 0 und mit der erforderlichen Polarisationsrichtung bereitstellt, weist einen Laser 11 auf, der linear polarisiertes Licht emittiert. Dieses passiert eine rotierende Mattscheibe 12, die die Kohärenz des Laserlichts stört.The lighting arrangement 8th that the illuminating beam 9 at the desired distance A from the optical axis 0 and provides with the required polarization direction, has a laser 11 that emits linearly polarized light. This passes a rotating screen 12 that disrupts the coherence of the laser light.

Das derart inkohärent gewordene Laserlicht durchläuft dann eine azimutal drehbare Halbwellenplatte 13, mittels der der Polarisationsazimut einstellbar ist, um das vorerwähnte Maximum erreichen zu können. Das von der derart aufgebauten Beleuchtungsquelle propagierende, linear polarisierte Beleuchtungsstrahlbündel fällt dann in ein Berek-Prisma 14, in dem es drei inneren Totalreflexionen unterworfen und dabei insgesamt um 90°, d.h. nunmehr parallel zur optischen Achse 0 umgelenkt wird.The laser light that has become incoherent in this way then passes through an azimuthally rotatable half-wave plate 13 , by means of which the polarization azimuth can be adjusted in order to be able to reach the aforementioned maximum. The linearly polarized illumination beam propagating from the illumination source constructed in this way then falls into a Berek prism 14 , in which it is subjected to three total internal reflections and thereby a total of 90 °, ie now parallel to the optical axis 0 is redirected.

Bei jeder Totalreflexion wird zwischen s- und p-Polarisationsrichtungen eine Phasenverschiebung von 60° bewirkt, so daß an der Austrittsfläche des Prismas wiederum linear polarisiertes Licht parallel zur optischen Achse 0 und im Abstand A dazu austritt.With each total reflection, a phase shift of 60 ° is effected between the s and p polarization directions, so that in turn linearly polarized light parallel to the optical axis at the exit surface of the prism 0 and exits at a distance A.

Das als Immersionsobjektiv ausgebildete Objektiv 4 bewirkt dann, daß der parallele Beleuchtungsstrahl 9 mit geringer Winkeldifferenz unter einem Apertunrwinkel α auf die Probe fällt. Der Aperturwinkel hängt dabei sowohl von der numerischen Apertur des Objektivs 4 als auch von der Brechzahl Ölimmersion 7 sowie der Brechzahl des Deckglases 6 und der optisch dünneren Probe 5 ab.The lens designed as an immersion lens 4 then causes the parallel illuminating beam 9 falls on the sample with a small angle difference at an aperture angle α. The aperture angle depends on both the numerical aperture of the lens 4 as well as from the refractive index of oil immersion 7 and the refractive index of the cover slip 6 and the optically thinner sample 5 from.

Claims (8)

Auflicht-Beleuchtungsanordnung für ein Mikroskop (1) mit einem eine optische Achse (0) aufweisenden Objektiv (4), wobei die Beleuchtungsanordnung aufweist: – eine Beleuchtungsquelle (11), die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlbündel (9) abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse (0) propagiert, und – eine Umlenkeinrichtung (14), die das Beleuchtungsstrahlbündel (9) umlenkt und parallel zur optischen Achse (0) in das Objektiv (4) einkoppelt, dadurch gekennzeichnet, daß – das von der Beleuchtungsquelle (11) abgegebene Beleuchtungsstrahlbündel (9) s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer konstanten Phasendifferenz d = n·60° aufweist, wobei n eine ganze Zahl ist, und – die Umlenkeinrichtung (14) das Beleuchtungsstrahlbündel x-mal oder ein ganzzahliges Vielfaches davon reflektiert, wobei x = ((n + 1)·180° – d)/60° gilt, so daß linear polarisiertes Licht in das Objektiv (4) fällt.Incident light illumination arrangement for a microscope ( 1 ) with an optical axis ( 0 ) lens ( 4 ), the lighting arrangement comprising: a lighting source ( 11 ), which in operation is a polarized illuminating beam ( 9 ) that is at an angle to the optical axis ( 0 ) propagates, and - a deflection device ( 14 ) that the illuminating beam ( 9 ) deflected and parallel to the optical axis ( 0 ) into the lens ( 4 ) couples in, characterized in that - that from the illumination source ( 11 ) emitted illuminating beam ( 9 ) has s and p polarization directions with a constant phase difference d = n · 60 °, where n is an integer, and - the deflection device ( 14 ) reflects the illuminating beam x times or an integer multiple thereof, where x = ((n + 1) · 180 ° - d) / 60 °, so that linearly polarized light enters the lens ( 4 ) falls. Beleuchtungsanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umlenkeinrichtung (14) das umgelenkte Strahlenbündel (9) in einem Abstand (A) zur optischen Achse in das Objektiv (4) einkoppelt und ein Bauteil mit senkrecht zur optischen Achse (0) verschiebbarer Lage aufweist, wobei der Abstand (A) von der Lage des Bauteils abhängt.Lighting arrangement according to claim 1, characterized in that the deflection device ( 14 ) the redirected beam ( 9 ) in one ab stood (A) to the optical axis in the lens ( 4 ) and a component with perpendicular to the optical axis ( 0 ) has a displaceable position, the distance (A) depending on the position of the component. Beleuchtungsanordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß durch Änderung des Abstandes (A) zur optischen Achse (0) ein Aperturwinkel (α), unter dem das Beleuchtungstrahlbündel (9) auf eine Probe (5) fällt, einstellbar ist.Lighting arrangement according to claim 2, characterized in that by changing the distance (A) to the optical axis ( 0 ) an aperture angle (α) at which the illumination beam ( 9 ) on a sample ( 5 ) falls, is adjustable. Beleuchtungsanordnung nach Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungsquelle (11) linear polarisiertes Licht abgibt und die Umlenkeinrichtung (14) Prisma aufweist, das das Beleuchtungsstrahlbündel (9) mittels dreier Totalreflexionen umlenkt.Lighting arrangement according to claim 1, 2 or 3, characterized in that the lighting source ( 11 ) emits linearly polarized light and the deflection device ( 14 ) Has prism that the illuminating beam ( 9 ) redirected by means of three total reflections. Beleuchtungsanordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Beleuchtungsstrahlbündel (9) senkrecht zur optischen Achse (0) zur Umlenkeinrichtung (14) propagiert und die Umlenkeinrichtung ein Berek-Prisma aufweist.Lighting arrangement according to claim 4, characterized in that the illuminating beam ( 9 ) perpendicular to the optical axis ( 0 ) to the deflection device ( 14 ) propagated and the deflection device has a Berek prism. Beleuchtungsanordnung nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungsquelle einen linear polarisierende Strahlung abgebenden Laser (11) und ein optisches Element (13) zur Einstellung eines Polarisationswinkels aufweist.Lighting arrangement according to one of the above claims, characterized in that the lighting source is a linearly polarizing radiation-emitting laser ( 11 ) and an optical element ( 13 ) for setting a polarization angle. Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop mit einer Auflichtbeleuchtungsanordnung nach einem der obigen Ansprüche.Total reflection fluorescence microscope with an incident light arrangement according to one of the above claims. Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop nach Anspruch 7 mit einer Beleuchtungsanordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Aperturwinkel, unter dem das umgelenkte Beleuchtungsstrahlbündel (9) auf eine Probe (5) fällt durch Einstellung des Abstandes (A) wählbar ist.Total reflection fluorescence microscope according to claim 7 with a lighting arrangement according to claim 2, characterized in that an aperture angle at which the deflected illumination beam ( 9 ) on a sample ( 5 ) can be selected by setting the distance (A).
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