DE10217098A1

DE10217098A1 - Incident lighting arrangement for a microscope

Info

Publication number: DE10217098A1
Application number: DE2002117098
Authority: DE
Inventors: Rainer Danz; Dieter Brocksch
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2002-04-17
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2003-11-06
Anticipated expiration: 2022-04-18
Also published as: WO2003087914A2; WO2003087914A3; DE10217098B4

Abstract

Bei einer Auflicht-Beleuchtungsanordnung für ein Mikroskop (1) mit einem Objektiv (4), die aufweist: eine Beleuchtungsquelle (11), die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlbündel (9) abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse (O) propagiert, und eine Umlenkeinrichtung (14), die das Beleuchtungsstrahlbündel (9) umlenkt und parallel zur optischen Achse (O) in das Objektiv (4) einkoppelt, ist vorgesehen, daß das von der Beleuchtungsquelle (11) abgegebene Beleuchtungsstrahlbündel (9) s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz d aufweist und die Umlenkeinrichtung (14) das Beleuchtungsstrahlbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n mal 180 DEG - d)/60 DEG gilt und n eine ganze Zahl ist.In an incident light illumination arrangement for a microscope (1) with a lens (4), which comprises: an illumination source (11) which, in operation, emits a polarized illumination beam (9) which propagates at an angle to the optical axis (O), and a deflection device (14) which deflects the illuminating beam (9) and couples it parallel to the optical axis (O) into the objective (4), it is provided that the illuminating beam (9) emitted by the illuminating source (11) s- and p -Polarization directions with a phase difference d and the deflection device (14) reflects the illuminating beam x times, where x = (n times 180 ° - d) / 60 ° and n is an integer.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Auflicht-Beleuchtungsanordnung für ein Mikroskop mit einem Objektiv, die aufweist: eine Beleuchtungsquelle, die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert, und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt. The invention relates to a reflected light illumination arrangement for a microscope a lens that has: a lighting source that is polarized during operation Emits illuminating beam which propagates at an angle to the optical axis, and a deflection device that deflects the illuminating beam and parallel to the optical one Coupled axis into the lens.

Solche Auflicht-Beleuchtungsanordnungen sind insbesondere bei der sogenannten Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (auch TIRF-Mikroskopie bezeichnet) im Einsatz, wenn die Beleuchtungsstrahlung unter definierten Winkelbedingungen auf eine Probe fallen muß. Such incident light lighting arrangements are particularly so-called Total reflection fluorescence microscopy (also called TIRF microscopy) in use when the illuminating radiation must fall on a sample under defined angular conditions.

Bei der TIRF-Mikroskopie wird eine hohe axiale Auflösung erreicht, indem Beleuchtungsstrahlung so eingestrahlt wird, daß an der Probenoberfläche Totalreflexion auftritt. Dadurch wird eingestrahlte Leistung nur als evaneszente Welle ins optisch dünnere Probenmedium eingebracht. Dabei werden grenzflächennahe Moleküle zur Fluoreszenz angeregt. Die Anregungsintensität fällt exponentiell mit dem Abstand von der Grenzfläche ab, so daß die Eindringtiefe der Anregung auf eine Größenordnung von maximal 200 nm begrenzt werden können. Da die Eindringtiefe weiter durch den Einfallswinkel des Lichtes auf die Grenzfläche variiert werden kann, erhält man eine sensible und sehr hoch auflösende Tiefensonde für die Erforschung von Geometrie oder Biodynamik von Zellen, Membranen und anderen Grenzflächen. In TIRF microscopy, a high axial resolution is achieved by Illumination radiation is irradiated in such a way that total reflection occurs on the sample surface. This means that the radiated power is only an evanescent wave into the optically thinner one Sample medium introduced. Molecules close to the surface become fluorescence stimulated. The excitation intensity decreases exponentially with the distance from the interface, so that the depth of penetration of the excitation is limited to a maximum of 200 nm can be. As the depth of penetration continues through the angle of incidence of the light Interface can be varied, you get a sensitive and very high resolution Depth probe for the research of geometry or biodynamics of cells, membranes and other interfaces.

Die TIRF-Mikroskopie, wie sie beispielsweise in der Veröffentlichung Axelrod, D.: "Cellsubstrate contacts illuminated by total internal reflexion fluorescence", J. Cell Biol. 89 (1981) 141-145, beschrieben ist, ist somit auf unter einem großen Winkel auf die Grenzfläche von Objektträger und Probe einfallender Strahlung angewiesen. Die gattungsbildende Veröffentlichung Axelrod, D., Journal of Biomedical Optics, 6, 2001, schlägt dazu vor, einen Laser als Beleuchtungsquelle einzusetzen, dessen Strahlung über ein Planglas in das Mikroskop-Objektiv eingekoppelt wird. Mit Hilfe einer geeignet angeordneten Schiebelinse kann dann der Winkel der Totalreflexion eingestellt werden. Da der dingseitige Brennpunkt der Schiebelinse mit dem dingseitigen Brennpunkt des Objektives zusammenfällt, gelangt, wie erwünscht, paralleles Licht zur Totalreflexion. Die Effizienz ist allerdings durch mangelhafte Polarisation der auf die Probe fallenden Strahlung verbesserungswürdig. TIRF microscopy, as described for example in the publication Axelrod, D .: "Cellsubstrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence", J. Cell Biol. 89 ( 1981 ) 141-145, is thus at a large angle relying on the interface of the slide and sample of incident radiation. The generic publication Axelrod, D., Journal of Biomedical Optics, 6, 2001, suggests using a laser as the illumination source, the radiation of which is coupled into the microscope objective via a plane glass. The angle of the total reflection can then be set with the aid of a suitably arranged sliding lens. Since the focal point of the sliding lens coincides with the focal point of the lens, parallel light reaches the total reflection as desired. However, the efficiency is in need of improvement due to poor polarization of the radiation falling on the sample.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Auflicht-Beleuchtungsanordnung der eingangs genannten Art soweit zu bilden, daß eine hocheffiziente Anregung erreicht wird. The invention has for its object a incident light lighting arrangement of the beginning mentioned type to the extent that a highly efficient excitation is achieved.

Diese Aufgabe wird bei einer Auflicht-Beleuchtungsanordnung der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz d aufweist, und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n.180° - d)/60° gilt und n eine ganze Zahl ist. This task is performed in a reflected light lighting arrangement of the type mentioned solved in that the illuminating beam emitted by the illuminating source s and has p-polarization directions with a phase difference d, and the deflection device the illuminating beam reflects x times, where x = (n.180 ° - d) / 60 ° and n is a whole Number is.

Die erfindungsgemäße Beleuchtungsanordnung koppelt die Eigenschaften der Beleuchtungsquelle hinsichtlich der Polarisation des abgegebenen Lichtes und die Eigenschaften der Umlenkeinrichtung so, daß im Endeffekt linear polarisiertes Licht über das Objektiv auf die Probe fällt. Gibt die Beleuchtungsquelle, beispielsweise ein Laser, linear polarisierte Strahlung ab, bei der bekanntermaßen die Phasendifferenz zwischen s- und p- Polarisationsrichtung Null ist, so sind die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Umlenkeinrichtung so vorgegeben, daß eine dreimalige Reflexion des Beleuchtungsstrahlbündels erfolgt. Da jede Reflexion eine Phasendifferenz von 60° zwischen s- und p-Polarisation zur Folge hat, tritt am Ausgang der Umlenkeinrichtung wieder linear polarisiertes Licht aus. Natürlich kann die Umlenkeinrichtung auch ein Vielfaches von drei Reflexionen ausführen; unter dem Gesichtspunkt möglichst minimaler Lichtabschwächung ist jedoch regelmäßig eine Umlenkeinrichtung mit der geringsten möglichen Anzahl an Reflexionen zu bevorzugen. The lighting arrangement according to the invention couples the properties of the Illumination source with regard to the polarization of the emitted light and the Properties of the deflection device so that in the end linearly polarized light over the Objectively tested. Gives the lighting source, such as a laser, linearly polarized radiation, in which the phase difference between s- and p- Polarization direction is zero, so are the properties of the invention Deflection device so specified that a three times reflection of the Illumination beam is carried out. Since each reflection has a phase difference of 60 ° between s- and p-polarization results, occurs linearly again at the output of the deflection device polarized light. Of course, the deflection device can also be a multiple of three Carry out reflections; is from the point of view minimal light attenuation however, a deflecting device with the lowest possible number of reflections on a regular basis to prefer.

Durch die Umlenkeinrichtung kann die Beleuchtungsquelle in beliebigem Abstand zur optischen Achse des Mikroskopes angeordnet werden, so daß die mitunter beim Stande der Technik anzutreffende bauliche Enge im Bereich der Beleuchtungseinheit nicht auftritt. Insbesondere kann die Umlenkeinrichtung eine 90°-Umlenkung bewirken, so daß die Beleuchtungsquelle bei vertikal verlaufender Mikroskopachse mit einem horizontal verlaufenden Beleuchtungsstrahlbündel ausgebildet werden kann. By means of the deflection device, the illumination source can be at any distance from the optical one Axis of the microscope are arranged so that the sometimes in the prior art structural constriction encountered in the area of the lighting unit does not occur. In particular can the deflection device cause a 90 ° deflection, so that the illumination source at vertical microscope axis with a horizontal one Illumination beam bundle can be formed.

Bei der TIRF-Mikroskopie werden optimale Ergebnisse erreicht, wenn der Aperturwinkel, d. h. der Winkel, unter dem ein Beleuchtungsstrahlbündel auf eine Probe fällt, im wesentlichen dem Grenzwinkel der Totalreflexion an der Probe entspricht. Für solche Anwendungen ist deshalb eine Beleuchtungsanordnung anzustreben, mit der der Aperturwinkel verstellt werden kann. Dafür ist ein Weiterbildung der Erfindung zu bevorzugen, bei der die Umlenkeinrichtung das umgelenkte Strahlenbündel in einem Abstand zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt und ein Bauteil mit senkrecht zur optischen Achse verschiebbarer Lage aufweist, wobei der Abstand von der Lage des Bauteils abhängt. In TIRF microscopy, optimal results are achieved if the aperture angle, i.e. H. the angle at which an illuminating beam falls on a sample is essentially that Limit angle corresponds to the total reflection on the sample. Therefore, for such applications to strive for a lighting arrangement with which the aperture angle can be adjusted. For this, a further development of the invention is preferred, in which the deflection device deflected beams into the lens at a distance from the optical axis and has a component with a position displaceable perpendicular to the optical axis, the Distance depends on the position of the component.

Bei dieser Weiterbildung hängt der Aperturwinkel vom Abstand von der optischen Achse ab, mit dem ein gering divergierendes Strahlenbündel in das Objektiv eingekoppelt wird. Durch die verschiebbare Lage des Bauteils der Umlenkeinrichtung kann damit auf einfache Weise der Aperturwinkel auf den Grenzwinkel der Totalreflexion gestellt werden. Damit lassen sich die Bedingungen so wählen, daß optimale Einkopplung der Anregungsstrahlung in die zu untersuchende Probe auftritt. In this development, the aperture angle depends on the distance from the optical axis a slightly diverging beam is coupled into the lens. Through the displaceable position of the component of the deflection device can thus easily Aperture angle can be set to the critical angle of total reflection. With that, the Select conditions so that optimal coupling of the excitation radiation into the investigating sample occurs.

Das Bauteil der Umlenkeinrichtung, dessen Lage veränderbar ist und den Abstand zur optischen Achse des Objektives festlegt, kann dabei verschiedenartig ausgestaltet werden. In einer zweckmäßigen Ausführung ist das Bauteil ein reflektierendes Element, das das Beleuchtungsstrahlbündel parallel zur optischen Achse umlenkt. Als reflektierende Elemente sind totalreflektierende Prismen bekannt, die vorteilhafterweise einen besonders hohen Reflexionsgrad aufweisen. The component of the deflection device, the position of which can be changed and the distance to sets optical axis of the lens can be designed in various ways. In In an expedient embodiment, the component is a reflective element that Deflecting the light beam parallel to the optical axis. As reflective elements totally reflecting prisms are known which advantageously have a particularly high one Have reflectance.

Bei einer Beleuchtungsquelle, die linear polarisiertes Licht abgibt, ist eine Umlenkeinrichtung vorgesehen, die drei Reflexionen oder Vielfache davon aufweist. Unter dem Gesichtspunkt möglichst geringer Verluste ist es deshalb zu bevorzugen, daß die Beleuchtungsquelle ein linear polarisiertes Licht abgibt und die Umlenkeinrichtung ein Prisma aufweist, das das Beleuchtungsstrahlbündel mittels dreier Totalreflexionen umlenkt. Mit einem solchen Aufbau sind die optischen Verluste in der Umlenkeinrichtung minimiert. Gleichzeitig kann insbesondere bei einem hochparallelen Beleuchtungsstrahlbündel wegen der dann vernachlässigbar kleinen Variationsbreite des Beleuchtungswinkels eine nahezu vollständige Totalreflexion und somit eine hohe Effizienz der Beleuchtungsanordnung erreicht werden. In the case of an illumination source which emits linearly polarized light, there is a deflection device provided that has three reflections or multiples thereof. From the point of view As little loss as possible, it is therefore preferable that the lighting source is on emits linearly polarized light and the deflection device has a prism that Illumination beam deflected by means of three total reflections. With such a structure the optical losses in the deflection device are minimized. At the same time, in particular in the case of a highly parallel illuminating beam because of the then negligibly small Variation range of the lighting angle an almost complete total reflection and thus a high efficiency of the lighting arrangement can be achieved.

Wie bereits erwähnt, sind für Aufbauten, bei denen die Beleuchtungsquelle ein Beleuchtungsstrahlbündel abgibt, das senkrecht zur optischen Achse propagiert, Umlenkeinrichtungen vorgesehen, die eine 90°-Umlenkung vorsehen. Ein besonders einfachen und kompakten Aufbau erhält man dabei, wenn die Umlenkeinrichtung ein Berek-Prisma aufweist. Mit einem solchen Berek-Prisma kann die Einstellung des Abstandes zur optischen Achse durch einfache Verschiebung des Prismas senkrecht zur optischen Achse erreicht werden. Ein Berek-Prisma, das drei Totalreflexionen aufweist, ist mit einer Beleuchtungsstrahlquelle kombiniert, die linear polarisiertes Licht abgibt, z. B. mit einem Laser. As already mentioned, are for structures where the lighting source is a Emits an illuminating beam that propagates perpendicular to the optical axis, Deflection devices are provided which provide a 90 ° deflection. A particularly simple one and compact design is obtained if the deflection device is a Berek prism having. With such a Berek prism, the adjustment of the distance to the optical Axis reached by simply moving the prism perpendicular to the optical axis become. A Berek prism that has three total reflections is one Combined illuminating beam source that emits linearly polarized light, e.g. B. with a laser.

Ein Berek-Prisma hat dabei zusätzlich den Vorteil, daß die Polarisation auch bei einer gewissen Variation des Einfallswinkels in das Prisma erhalten bleibt. So zeigte sich bei einer Variation von ±2° keine wesentliche Änderung der Polarisation am Ausgang des Prismas. Die Anordnung mit Berek-Prisma ist deshalb besonders unempfindlich gegen Variationen des Winkels, mit dem die Beleuchtungsstrahlquelle Strahlung abgibt. Insbesondere hat der Divergenzwinkel des Beleuchtungsstrahlbündels keine oder vergleichsweise geringe Auswirkungen auf die Polarisierung der Beleuchtungsstrahlung an der Probe. Bei Verwendung eines Berek-Prismas kann also auch stärker divergierende Beleuchtungsstrahlung verwendet werden, und der Justieraufwand sinkt. A Berek prism has the additional advantage that the polarization even with a certain one Variation of the angle of incidence in the prism is retained. This was shown in a variation of ± 2 ° no significant change in polarization at the exit of the prism. The order with Berek prism is therefore particularly insensitive to variations in the angle at which the illuminating beam source emits radiation. In particular, the divergence angle of Illumination beam bundle no or comparatively little impact on the Polarization of the illuminating radiation on the sample. When using a Berek prism more divergent illuminating radiation can also be used, and the Adjustment effort decreases.

Möchte man einen solchen Laser, die linear polarisiertes Strahlung abgibt, mit einer Umlenkeinrichtung kombinieren, die nicht genau drei Reflexionen ausführt, so muß man die Beleuchtungsquelle so fortbilden, daß sie die entsprechende Phasenverschiebung zwischen s- und p-Polarisationen erzeugt. Für solche Anwendungen ist es bevorzugt, daß die Beleuchtungsquelle einen linear polarisierte Strahlung abgebenden Laser und ein optisches Element zur Einstellung eines Polarisationswinkels aufweist. Ein solches optisches Element kann beispielsweise eine entsprechende Verzögerungsplatte sein, d. h. ein doppelbrechendes Element, das für s- und p-Polarisationsrichtungen unterschiedliche Ausbreitungsgeschwindigkeiten längs der optischen Achse aufweist. Auch ist eine Kombination aus Polteilern mit einer geeigneten Verzögerungsleitung möglich. Would you like such a laser that emits linearly polarized radiation with a Combine deflector that does not perform exactly three reflections, so you have to Develop the lighting source so that it has the corresponding phase shift between s and generated p polarizations. For such applications it is preferred that the Illumination source a linearly polarized radiation emitting laser and an optical Has element for setting a polarization angle. Such an optical element can be, for example, a corresponding delay plate, i. H. a birefringent Element that is different for s and p polarization directions Has propagation speeds along the optical axis. Is also a combination possible from pole dividers with a suitable delay line.

Die erfindungsgemäße Beleuchtungsanordnung eignet sich, wie erwähnt, besonders für die TIRF-Mikroskopie. Sie kann dort mit besonderem Vorteil eingesetzt werden. Die erfindungsgemäße Aufgabe wird deshalb weiter gelöst durch ein TIRF-Mikroskop mit einer Auflicht-Beleuchtungsanordnung mit einem Objektiv, die eine Beleuchtungsquelle aufweist, die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert, und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt, wobei das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz d aufweist, und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n.180° - d)/60° gilt und n eine ganze Zahl ist. As mentioned, the lighting arrangement according to the invention is particularly suitable for TIRF microscopy. It can be used there with particular advantage. The The object of the invention is therefore further achieved by a TIRF microscope with a Incident light illumination arrangement with a lens, which has an illumination source, the emits a polarized illuminating beam during operation, which is at an angle to propagates optical axis, and a deflection device that the illuminating beam deflects and couples parallel to the optical axis in the lens, which of the Illumination source emitted illumination beam bundles s and p polarization directions having a phase difference d, and the deflection device the illuminating beam Reflected x times, where x = (n.180 ° - d) / 60 ° and n is an integer.

Wenn die Beleuchtungsanordnung die Einstellung des Abstandes zur optischen Achse ermöglicht, kann der Aperturwinkel besonders exakt auf den Grenzwinkel der Totalreflexion eingestellt werden. Es ist deshalb ein Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskop zu bevorzugen, bei dem ein Aperturwinkel, unter dem das umgelenkte Beleuchtungsstrahlbündel auf eine Probe fällt durch Einstellung des Abstandes wählbar ist. Mit einem solchen Totalreflexionsfluoreszenz- Mikroskop kann optimale Anregung von Fluoroforen in einer Probe erreicht werden. If the lighting arrangement the adjustment of the distance to the optical axis enables, the aperture angle can be particularly precise to the critical angle of total reflection can be set. It is therefore preferable to use a total reflection fluorescence microscope which is an aperture angle at which the deflected illuminating beam onto a sample falls by setting the distance is selectable. With such a total reflection fluorescence Microscope can achieve optimal excitation of fluorofores in a sample.

Die Erfindung wird nachfolgend beispielhalber unter Bezugnahme auf die Zeichnungen noch näher erläutert. Die einzige Figur der Zeichnung zeigt eine schematische Schnittdarstellung durch ein Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskop mit einer Auflicht-Beleuchtungsansordnung. The invention will now be described by way of example with reference to the drawings explained in more detail. The only figure in the drawing shows a schematic sectional view through a total reflection fluorescence microscope with an incident light illumination arrangement.

Das in der Figur mit Bezugszeichen 1 Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskop (im folgenden TIRF-Mikroskop) weist einen Empfänger 2 auf, der ein Zwischenbild aufnimmt, welches von einer Tubuslinse 3 erzeugt wird. Der Tubuslinse 3 ist ein Objektiv 4 vorgeordnet, das ein Bild einer Probe 5 aufnimmt. Empfänger 2, Tubuslinse 3 und Objektiv 4 befinden sich auf einer optischen Achse O. The total reflection fluorescence microscope (hereinafter referred to as the TIRF microscope) with reference number 1 in the figure has a receiver 2 which records an intermediate image which is generated by a tube lens 3 . The tube lens 3 is preceded by an objective 4 , which takes an image of a sample 5 . Receiver 2 , tube lens 3 and lens 4 are on an optical axis O.

Über der Probe 5 liegt ein Deckglas 6, und zwischen Deckglas 6 und Objektiv 4 ist eine Ölimmersion 7 angeordnet. A cover glass 6 lies over the sample 5 , and an oil immersion 7 is arranged between the cover glass 6 and the objective 4 .

Aus einer Beleuchtungsanordnung 8 wird ein Beleuchtungsstrahl 9 in einem Abstand A zur optischen Achse O in das Objektiv 4 eingekoppelt, so daß er unter einem Aperturwinkel α auf die Grenzfläche zwischen Probe 5 und Deckglas 6 fällt. From an illumination arrangement 8 , an illumination beam 9 is coupled into the objective 4 at a distance A from the optical axis O, so that it falls onto the interface between sample 5 and cover glass 6 at an aperture angle α.

Das Mikroskop, bei dem es sich beispielsweise um ein Mikroskop des Bautypes Axioplan der Carl Zeiss, Deutschland, handeln kann, erlaubt damit die Einkopplung der Energie aus evaneszenten Wellen in das optische dünnere Medium der Probe 5, wodurch grenzflächennahe Moleküle zur Fluoreszenz angeregt werden können. Durch den scharfen Abfall der Intensität mit dem Abstand von der Grenzfläche wird trotz einer Wellenlänge zwischen 350 und etwa 700 µm eine deutlich darunter liegende Eindringtiefe erreicht, z. B. 50 bis 200 µm; die Tiefenauflösung ist also besser, als es die zu verwendende Wellenlänge eigentlich erwarten ließe. The microscope, which can be, for example, an Axioplan microscope from Carl Zeiss, Germany, thus allows the energy from evanescent waves to be coupled into the optically thinner medium of sample 5 , as a result of which molecules near the surface can be excited to fluoresce. The sharp drop in intensity with the distance from the interface, despite a wavelength between 350 and about 700 microns, a significantly lower penetration depth is reached, z. B. 50 to 200 microns; the depth resolution is therefore better than the wavelength to be used would actually be expected.

Es kann somit mit sehr guter Tiefenauflösung ein fluoreszierendes Objekt 16 der Probe 5 mit dem Mikroskop 1 erfaßt werden. Da die Eindringtiefe durch den Einfallswinkel bzw. Aperturwinkel α der Strahlung aus dem Beleuchtungsstrahl 9 auf die Grenzfläche variiert, ist die Beleuchtungsanordnung 8 so ausgebildet, daß der Aperturwinkel α verändert werden kann. A fluorescent object 16 of the sample 5 can thus be detected with the microscope 1 with a very good depth resolution. Since the depth of penetration varies by the angle of incidence or aperture angle α of the radiation from the illumination beam 9 onto the interface, the illumination arrangement 8 is designed such that the aperture angle α can be changed.

Das an der Probe 5 total reflektierte Licht wird dann über einen Spiegel 10 wieder ausgekoppelt, so daß die Erfassung des Objektes 16 im Mikroskop 1 nicht durch Falschlicht gestört wird. The light totally reflected on the sample 5 is then coupled out again via a mirror 10 , so that the detection of the object 16 in the microscope 1 is not disturbed by false light.

Die Amplitude, mit der sich die inhomogene Welle im optische dünneren Medium der Probe 5 fortpflanzt bzw. exponentiell abklingt, hängt vom Polarisationszustand des einfallenden Beleuchtungsstrahls 9 ab und hat dann ein Maximum, wenn linear polarisiertes Licht auf die Grenzfläche zwischen dünnerem Medium, d. h. Probe 5, und optisch dichterem Medium, d. h. Deckglas 6, fällt. Die Polarisationsrichtung wird dabei experimentell eingestellt. The amplitude with which the inhomogeneous wave propagates or decays exponentially in the thinner optical medium of sample 5 depends on the polarization state of the incident illuminating beam 9 and then has a maximum when linearly polarized light hits the interface between the thinner medium, ie sample 5 , and optically denser medium, ie cover glass 6 , falls. The direction of polarization is set experimentally.

Die Beleuchtungsanordnung 8, die den Beleuchtungsstrahl 9 im gewünschten Abstand A zur optischen Achse O und mit der erforderlichen Polarisationsrichtung bereitstellt, weist einen Laser 11 auf, der linear polarisiertes Licht emittiert. Dieses passiert eine rotierende Mattscheibe 12, die die Kohärenz des Laserlichts stört. The illumination arrangement 8 , which provides the illumination beam 9 at the desired distance A from the optical axis O and with the required direction of polarization, has a laser 11 which emits linearly polarized light. This passes through a rotating screen 12 , which interferes with the coherence of the laser light.

Das derart inkohärent gewordene Laserlicht durchläuft dann eine azimutal drehbare Halbwellenplatte 13, mittels der der Polarisationsazimut einstellbar ist, um das vorerwähnte Maximum erreichen zu können. Das von der derart aufgebauten Beleuchtungsquelle propagierende, linear polarisierte Beleuchtungsstrahlbündel fällt dann in ein Berek-Prisma 14, in dem es drei inneren Totalreflexionen unterworfen und dabei insgesamt um 90°, d. h. nunmehr parallel zur optischen Achse O umgelenkt wird. The laser light which has become incoherent in this way then passes through an azimuthally rotatable half-wave plate 13 , by means of which the polarization azimuth can be adjusted in order to be able to achieve the aforementioned maximum. The linearly polarized illumination beam propagating from the illumination source constructed in this way then falls into a Berek prism 14 , in which it is subjected to three total internal reflections and is thereby deflected by a total of 90 °, ie now parallel to the optical axis O.

Bei jeder Totalreflexion wird zwischen s- und p-Polarisationsrichtungen eine Phasenverschiebung von 60° bewirkt, so daß an der Austrittsfläche des Prismas wiederum linear polarisiertes Licht parallel zur optischen Achse O und im Abstand A dazu austritt. With each total reflection there is a between s and p polarization directions Phase shift of 60 ° causes, so that in turn on the exit surface of the prism linearly polarized light emerges parallel to the optical axis O and at a distance A from it.

Das als Immersionsobjektiv ausgebildete Objektiv 4 bewirkt dann, daß der parallel Beleuchtungsstrahl 9 mit geringer Winkeldifferenz unter einem Aperturwinkel α auf die Probe fällt. Der Aperturwinkel hängt dabei sowohl von der numerischen Apertur des Objektivs 4 als auch von der Brechzahl Ölimmersion 7 sowie der Brechzahl des Deckglases 6 und der optisch dünneren Probe 5 ab. The lens 4 designed as an immersion lens then causes the parallel illuminating beam 9 to fall onto the sample with a small angle difference at an aperture angle α. The aperture angle depends both on the numerical aperture of the objective 4 and on the refractive index of oil immersion 7 as well as the refractive index of the cover glass 6 and the optically thinner sample 5 .

Claims

1. incident light illumination arrangement for a microscope ( 1 ) with a lens ( 4 ), comprising:
an illumination source ( 11 ) which, in operation, emits a polarized illumination beam ( 9 ) which propagates at an angle to the optical axis (O), and
a deflection device ( 14 ) which deflects the illuminating beam ( 9 ) and couples it into the objective ( 4 ) parallel to the optical axis (O),
characterized in that
the illumination beam ( 9 ) emitted by the illumination source ( 11 ) has s and p polarization directions with a phase difference (d), and
the deflection device ( 14 ) reflects the illuminating beam x times, where x = (n.180 ° - d) / 60 ° and n is an integer.

2. Lighting arrangement according to claim 1, characterized in that the deflection device ( 14 ) couples the deflected beam ( 9 ) at a distance (A) to the optical axis in the lens ( 4 ) and a component ( 14 ) with perpendicular to the optical axis ( O) has a displaceable position, the distance (A) depending on the position of the component ( 14 ).

3. Lighting arrangement according to claim 1 or 2, characterized in that the illumination source ( 11 ) emits a linearly polarized light and the deflection device has a prism ( 14 ) which deflects the illuminating beam ( 9 ) by means of three total reflections.

4. Lighting arrangement according to claim 3, characterized in that the illuminating beam ( 9 ) perpendicular to the optical axis (O) propagates to the deflection device ( 14 ) and the deflection device has a Berek prism ( 14 ).

5. Lighting arrangement according to one of the above claims, characterized in that the illumination source has a linearly polarizing radiation emitting laser ( 11 ) and an optical element ( 13 ) for setting a polarization angle.

6. Total reflection fluorescence microscope with a reflected light arrangement according to any of the above claims.

7. Total reflection fluorescence microscope according to claim 6 with a lighting arrangement according to claim 2, characterized in that an aperture angle at which the deflected illuminating beam ( 9 ) falls on a sample ( 5 ) can be selected by adjusting the distance (A).