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Die
Erfindung betrifft einen Behälter
zur Aufnahme einer wässrigen
Lösung,
und insbesondere von Zellen, Zellderivaten, subzellulären Partikeln und/oder
Vesikeln, welcher zumindest teilweise von einer äußeren Begrenzung gebildet ist,
die einen Innenraum zur Aufnahme der Lösung bildet, und welcher mindestens
einen Bereich aufweist, der beim Anlegen einer elektrischen Spannung
und einer anschließenden
Entladung als Elektrode dient.
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Das
Einbringen biologisch aktiver Moleküle, wie beispielsweise DNA,
RNA oder Proteine, in lebende Zellen stellt ein wichtiges Instrument
zur Untersuchung biologischer Funktionen dieser Moleküle dar.
Eine bevorzugte Methode zum Einbringen von Fremdmolekülen in die
Zellen ist dabei die Elektroporation, welche im Gegensatz zu chemischen
Methoden geringere unerwünschte
Veränderungen
der biologischen Struktur und Funktionen der Zielzelle bewirkt.
Bei der Elektroporation werden die Fremdmoleküle aus einer wässrigen
Lösung,
vorzugsweise einer an die Zellen angepassten Pufferlösung oder
einem Zellkulturmedium, durch einen kurzzeitigen Stromfluss, d.h.
den Puls eines sich entladenden Kondensators, in die Zellen eingebracht,
wobei durch die Wirkung der kurzen elektrischen Pulse die Zellmembran
für die
Fremdmoleküle
durchlässig
gemacht wird. Die Lösung
bzw. Zellsuspension befindet sich dabei häufig in einer sogenannten Küvette, d.h. einem
schmalen, nach oben offenen Gefäß, die in der
Nähe ihres
Bodens zwei gegenüberliegende,
parallele Elektroden in den Seitenwänden aufweist, welche zum Anlegen
der elektrischen Spannung dienen. Durch die kurzzeitig entstehenden „Poren" in der Zellmembran
gelangen die biologisch aktiven Moleküle zunächst in das Zytoplasma, in
dem sie ggf. bereits ihre zu untersuchende Funktion ausüben können, und
daraufhin unter bestimmten Bedingungen auch in den Zellkern. Insbesondere
beim Einbringen von DNA in tierische Zellen, der sogenannten Transfektion,
entstehen aber häufig
aufgrund der Labilität der
Zellen besondere Probleme bei der Elektroporation, da die Überlebensrate
der Zellen als wichtiger Parameter die Effizienz der Transfektion
beeinflusst.
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Durch
das kurzzeitige Anlegen eines starken elektrischen Feldes, d.h.
eines kurzen Pulses mit hoher Stromdichte, können darüber hinaus auch Zellen, Zellderivate,
subzelluläre
Partikel und/oder Vesikel fusioniert werden. Bei dieser sogenannten
Elektrofusion werden die Zellen beispielsweise zunächst durch
ein inhomogenes elektrisches Wechselfeld in engen Membrankontakt
gebracht. Durch das anschließende
Anlegen eines elektrischen Feldpulses kommt es dann zur Interaktion
von Membranteilen, die schließlich
zur Fusion führt.
Für die
Elektrofusion können
dabei vergleichbare apparative Vorrichtungen verwendet werden, wie
für die
Elektroporation.
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Behälter der
eingangs genannten Art sind bekannt und werden vor allem bei der
Elektroporation oder Elektrofusion in Form von Küvetten mit eingelegten Elektroden
aus Metall eingesetzt. Die für
diesen Zweck verwendeten Behälter
sind meist schmale, nach unten geschlossene und nach oben offene Gefäße, deren
Innenraum aus jeweils zwei Paaren parallel und gegenüberliegend
angeordneter Seitenwände
gebildet wird. Der Innenraum dient dabei der Aufnahme der Zellsuspension,
d.h. in der Regel einer wässrigen
Pufferlösung
oder eines Zellkulturmediums, in dem die zu behandelnden Zellen
suspendiert sind. Zum Anlegen einer elektrischen Spannung weisen
solche Küvetten
zumeist im unteren Bereich eines Paares gegenüberliegender Seitenwände ein Elektrodenpaar
auf. Bei einer elektrischen Entladung fließt zwischen den beiden Elektroden
ein elektrischer Strom durch die Zellsuspension, der einen Transport
der Nukleinsäuren
oder anderer Moleküle in
die Zellen bewirkt oder je nach den gewählten Bedingungen zur Zellfusion
führt.
Die Elektroden bestehen dabei zumeist aus Metall, wobei häufig Aluminium
verwendet wird. Diese bekannten, handelsüblichen Küvetten haben aber den Nachteil,
dass bei der elektrischen Entladung Metall-Ionen in die Pufferlösung abgegeben
werden, die in geringer Konzentration zu einer unerwünschten
Stimulierung der Zellen führen
können
und in höherer
Konzentration toxisch auf die Zellen wirken. So konnte beispielsweise
bei der Verwendung von Aluminium-Küvetten ein negativer Effekt
durch die Freisetzung von Al3+-Ionen nachgewiesen
werden (Loomis-Husselbee et al., Biochem J 1991, 277 (Pt 3), 883–885). Darüber hinaus
kann es bei der Verwendung von Küvetten
mit Metallelektroden zur Bildung von unerwünschten Präzipitaten kommen, die ebenfalls
aufgrund der Freisetzung von Metall-Ionen aus den Elektroden gebildet
werden. Dabei kann es sich möglicherweise
um Metallhydroxyde oder Komplexe von Metall-Ionen mit biologischen
Makromolekülen
aus der Pufferlösung
handeln (Stapulionis, Bioelectrochem Bioenerg 1999, 48(1), 249–254). Aluminium-Küvetten haben
schließlich auch
den Nachteil, dass der Widerstand in der Küvette während der Entladung absinkt,
vermutlich weil eine Schicht aus oxidiertem Aluminium mit höherem Widerstand
durch den Stromfluss von der Elektrode abgelöst wird. Küvetten mit Metallelektroden
sind zudem schwierig herzustellen und daher sehr teuer.
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Aus
der nachveröffentlichten
Patentanmeldung
DE
101 16 211 A1 ist eine Kammer zur Aufnahme einer Zellsuspension
bekannt, die zumindest zwei Elektroden aufweist, welche aus einem
elektrisch leitenden Material bestehen. Dabei kann das elektrisch
leitfähige
Material beispielsweise ein Kunststoff sein, dem als Dotierung Kohlenstoff
beigemischt ist.
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Die
DE 198 26 153 A1 offenbart
eine Vorrichtung zum Nachweis einer Nucleotidsequenz in einer Probe
mittels PCR, die u. a. aus einem Träger mit einer Kavität und einem
zu dieser Kavität
komplementär
ausgebildeten Deckel besteht. Der Deckel kann aus einem elektrisch
leitfähigen
Kunststoff hergestellt sein, so dass mittels einer an dem Träger angeordneten
Platinelektrode ein elektrisches Feld in der Vorrichtung erzeugt
werden kann.
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Aus
den Dokumenten
DE
199 42 347 A1 ,
DE 689
10 813 T2 und
FR
2 661 280 A1 sind ferner Kohlenstoff- bzw. Graphitelektroden
bekannt, die mit leitfähigen
Polymeren beschichtet sind.
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Aus
der
US 6,001,617 ist
eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen bekannt, die gleichzeitig zur
Elektroporation oder Elektrofusion von Zellen verwendet werden kann.
Die Vorrichtung besteht aus einem runden Behälter, der einen optisch transparenten
Boden aufweist, auf dem eine Zellschicht anhaften und wachsen kann.
Der Boden des Behälters kann
dabei aus einem optisch transparenten, nicht leitfähigen Material
bestehen, das mit einem elektrisch leitfähigen Material beschichtet
ist, oder vollständig
aus einem optisch transparenten und elektrisch leitfähigen Material
hergestellt sein. Der elektrisch leitfähige Boden wird über eine
im Wandbereich umlaufende, bandförmige
Elektrode aus Metall kontaktiert. Als Gegenelektrode ist ebenfalls
ein ringförmig
umlaufendes Band vorgesehen. Diese bekannte Vorrichtung hat zunächst den
Nachteil, dass sie vor allem für
die Elektroporation von adhärenten Zellen
vorgesehen und geeignet ist. Eine Transfektion von suspendierten
Zellen ist hiermit nur sehr eingeschränkt und mit geringer Effizienz
möglich.
Aufgrund der ringförmigen,
umlaufenden Kontaktierung der Bodenelektrode und der ebenfalls im
Wandbereich umlaufenden Gegenelektrode kann kein homogenes elektrisches
Feld erzeugt werden, so dass keine gleichmäßige Transfektion aller Zellen
möglich
ist. Dieser Effekt wird noch dadurch verstärkt, dass die verwendeten intrinsisch
leitenden Kunststoffe als dünne
Beschichtung einen hohen Widerstand aufweisen, so dass die im Zentrum
der Bodenfläche
anhaftenden Zellen nur mit sehr geringer Effizienz transfiziert
werden können.
Aufgrund seines komplexen Aufbaus und der Tatsache, dass die verwendeten
intrinsisch leitenden Kunststoffe nicht spritzfähig sind, ist der bekannte
Behälter
darüber
hinaus auch sehr teuer in der Herstellung.
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Der
Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Behälter der
eingangs genannten Art zu schaffen, welcher die bestehenden Nachteile
vermeidet, einfach und kostengünstig
herzustellen ist und darüber
hinaus eine effiziente Behandlung von Zellen, Zellderivaten, subzellulären Partikeln und/oder
Vesikeln mit elektrischem Strom ermöglicht.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe dadurch gelöst,
dass mindestens eine Elektrode aus einem leitfähigen Kunststoffmaterial besteht,
das als Hauptbestandteil einen Kunststoff enthält, der mit mindestens einem
leitfähigen
Stoff dotiert ist, wobei die Dotierung in dem Kunststoff in einer
Konzentration von 30–80
Gew.-% vorliegt. Durch die Verwendung eines leitfähigen Kunststoffmaterials
aus dotiertem Kunststoff wird eine Freisetzung von Metall-Ionen vermieden,
so dass toxische Effekte beispielsweise auf lebende Zellen, wie
beispielsweise bei der Freisetzung von Al3+-Ionen,
vermieden werden. Hierdurch kann auch die medizinische Kompatibilität der entstehenden
Produkte erhöht
werden, so dass beispielsweise die mögliche Verwendung von transfizierten
primären Zellen
zur ex vivo – Gentherapie
positiv beeinflusst wird. Durch die Dotierung des Kunststoffs mit
leitfähigen
Stoffen konnte bei der Entladung ein Stromfluss zwischen den beiden
Elektroden erreicht werden, der dem Stromfluss bei herkömmlichen
Küvetten
mit Metallelektroden entspricht. Es hat sich ferner überraschenderweise
herausgestellt, dass bei den verwendeten dotierten Kunststoffen
bei der Elektroporation in Bezug auf die Transfektionseffizienzen
verbesserte Ergebnisse gegenüber
der Verwendung von beispielsweise Küvetten mit Aluminiumelektroden
erzielt werden können.
Dabei ist durch die Vermeidung der toxischen Effekte durch das Freisetzen
von Metall-Ionen das Verhältnis
von Transfektionseffizienz zu Mortalität der Zellen deutlich verbessert.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Behälter liegt darin, dass sich
bei der elektrischen Entladung keine Präzipitate in der Lösung bilden,
die an den Zellen anhaften und bei der weiteren Untersuchung bzw.
Verwendung der transfizierten Zellen störend wirken können. Ein
weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Behälter liegt offenbar auch darin,
dass die verwendeten Elektroden aus dotiertem Kunststoff weniger
von der verwendeten Pufferlösung
beeinflusst werden. Es hat sich nämlich herausgestellt, dass
sich bei der Verwendung von Aluminium-Küvetten bei der Verwendung von
phosphathaltigen Puffern ohne Chlorid im Verlauf der Entladung ein
sehr hoher Widerstand an der Elektrodenoberfläche aufbaut, der bei gleichem Anfangsstrom
zu einem drastischen Abfallen des Stromflusses führt. Überraschenderweise ist dies
bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Behälter bzw. Elektroden nicht
der Fall. Die erfindungsgemäßen Behälter verhalten
sich also nur entsprechend der Leitfähigkeit der Lösung und
werden ansonsten von den verwendeten Puffern nicht nachteilig beeinflusst.
Da dotierte Kunststoffe im Gegensatz zu intrinsisch leitenden Kunststoffen
spritzfähig
sind, können die
erfindungsgemäßen Behälter im
2-Komponenten-Spritzguss in einer Form gespritzt werden, so dass
sie sehr einfach und kostengünstig
herzustellen sind. Die Dotierung liegt in dem Kunststoff in einer Konzentration
zwischen insgesamt 30 und 80 Gew.-% vor. Unterhalb von 30 % ist
die Leitfähigkeit des
Kunststoffmaterials nicht mehr ausreichend, während oberhalb von 80 % die
Spritzbarkeit des Kunststoffs zu stark beeinträchtigt wird.
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Es
hat sich im Hinblick auf die Leitfähigkeit des Kunststoffmaterials
als besonders vorteilhaft herausgestellt, wenn die Dotierung aus
Kohlefasern, Graphit, Ruß und/oder
Kohlenstoffnanotubes besteht. Für
die Verwendung der erfindungsgemäßen Behälter bei
der Elektroporation oder Elektrofusion von Zellen, Zellderivaten,
subzellulären
Partikeln und/oder Vesikeln hat sich in Bezug auf die Leitfähigkeit
ein Anteil der Dotierung von insgesamt 30–60 Gew.-% als besonders vorteilhaft
erwiesen.
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In
Bezug auf die Spritzfähigkeit
des Kunststoffmaterials hat es sich als besonders vorteilhaft herausgestellt,
wenn der Kunststoff Polycarbonat, Polyetheretherketon, Polypropylen,
Polyamid, Polyphenylensulfid oder ein Gemisch dieser Polymere ist oder
eines oder mehrere dieser Polymere als Hauptbestandteil enthält und/oder
wenn der Kunststoff ein intrinsisch leitender Kunststoff ist.
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Falls
der Kunststoff seinerseits mit einem intrinsisch leitenden Kunststoff
dotiert ist und/oder aus intrinsisch leitendem Kunststoff besteht,
ist in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung vorgesehen, dass
der intrinsisch leitende Kunststoff ein Polyanilin, Polyacethylen,
Poly-para-phenylen, Poly-para-phenylensulfid,
Polypyrrol, Polythiophen oder Polypropylen ist oder eines oder mehrere
dieser Polymere als Hauptbestandteil enthält.
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In
weiterer vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen,
dass die äußere Begrenzung
aus Kunststoff, vorzugsweise transparentem Kunststoff, gebildet
ist, da somit eine einfache und kostengünstige Herstellung des gesamten
Behälters im
Spritzgussverfahren möglich
ist. Dabei kann es vorteilhaft sein, dass die Begrenzung aus dem
gleichen Kunststoff besteht, den auch die zumindest eine Elektrode
enthält.
Bei dieser Ausgestaltung können sich
Vorteile bei der Verarbeitung des Kunststoffmaterials im 2-Komponenten-Spritzguß ergeben.
Hierdurch wird einerseits die Herstellung vereinfacht und andererseits
eine Reduzierung der Herstellungskosten erreicht. Für besondere
Anwendungen kann die äußere Begrenzung
aber auch aus anderen Materialien bestehen.
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In
besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist ferner vorgesehen,
dass die zumindest eine Elektrode in die äußere Begrenzung integriert ist,
so dass der Behälter
in einer Form gespritzt werden kann.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist vorgesehen, dass der Behälter zumindest zwei Elektroden
aufweist, die aus dem gleichen Material bestehen. Bei den meisten
Anwendungen werden Behälter
bzw. Küvetten
verwendet, die zwei gegenüberliegende,
parallel angeordnete Elektroden aus identischem Material aufweisen.
Diese beiden Elektroden werden auf geeignete Weise kontaktiert und
so an eine an die jeweiligen Anforderungen angepasste Spannungsquelle
angeschlossen. In besonderen Fällen
kann es aber auch von Vorteil sein, wenn zumindest zwei Elektroden
aus unterschiedlichen Materialien bestehen. Dabei kann beispielsweise
die Anode oder die Katode aus dem dotierten Kunststoff bestehen,
während
die jeweilige Gegenelektrode aus einem anderen Material, beispielsweise Edelstahl
oder einem intrinsisch leitenden Kunststoff, besteht.
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Als
besonders vorteilhaft für
die Transfektion von lebenden Zellen haben sich die Behälter mit Elektroden
aus einem leitfähigen
Kunststoffmaterial gemäß einem
der Ansprüche
10 bis 14 erwiesen. Diese Behälter
vereinen eine hohe Leitfähigkeit
mit leichter Verarbeitbarkeit des Elektrodenmaterials.
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Die
erfindungsgemäßen Behälter eignen sich
in besonders vorteilhafter Weise auch zur Verwendung in Form von
Behälteranordnungen
bestehend aus wenigstens 2, vorzugsweise 6, 12, 24, 48, 96 oder
mehr, zu einer Einheit verbundenen Behältern, d.h. sogenannten „multi-wells".
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Ein
besonderer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die erfindungsgemäßen Behälter oder
Behälteranordnungen
in einem Verfahren hergestellt werden können, bei dem der Behälter oder
die Behälteranordnung
im 2-Komponenten-Spritzguß hergestellt
werden kann, wobei zunächst
die äußere Begrenzung
mit mindestens einem ausgesparten Fenster gespritzt wird und anschließend in
das mindestens eine Fenster das leitfähige Kunststoffmaterial aus
dotiertem Kunststoff eingespritzt wird, oder wobei zunächst die
mindestens eine Elektrode aus dem dotierten Kunststoff gespritzt
wird und anschließend um
die mindestens eine Elektrode herum die äußere Begrenzung gespritzt wird.
Im Gegensatz zur Herstellung von Behältern bzw. Küvetten mit
Metall-Elektroden, bei denen die Elektroden vor oder nach dem Spritzen
der Behälter
manuell oder maschinell in die gespritzten Rahmen bzw. Formen eingelegt
werden müssen,
ist erfindungsgemäß ein sehr
einfaches und kostengünstiges
Herstellungsverfahren möglich.
Die erfindungsgemäßen Behälter oder
Behälteranordnungen
können
in einer Form in zwei Schritten gespritzt werden, so dass sie hinsichtlich
der Herstellungskosten deutlich unterhalb der herkömmlichen Kosten
für Küvetten für die Elektroporation
oder Elektrofusion liegen.
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Die
erfindungsgemäßen Behälter oder
Behälteranordnungen
eignen sich in besonders vorteilhafter Weise für die Verwendung in Verfahren
zur Behandlung von Zellen, Zellderivaten, subzellulären Partikeln
und/oder Vesikeln mit elektrischem Strom, insbesondere zur Elektroporation
oder Elektrofusion, bei denen die Zellen, Zellderivate, subzellulären Partikel
und/oder Vesikel zunächst
in den Innenraum zumindest eines Behälters oder zumindest eines
Behälters
einer Behälteranordnung überführt werden,
wobei der Behälter
mindestens eine Elektrode aus dem dotierten Kunststoff aufweist,
sowie zumindest eine weitere Elektrode vorgesehen ist, und dann
eine elektrische Spannung an die Elektroden angelegt und ein Stromfluss
im Innenraum des Behälters
erzeugt wird. Dabei kann der elektrische Strom eine Stromdichte
von bis zu 120 A/cm2, vorzugsweise 80 A/cm2, erreichen.
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Die
Zellen, Zellderivate, subzellulären
Partikel und/oder Vesikel können
dabei in suspendierter Form, adhärent
oder in sonstiger immobilisierter Form eingesetzt werden.
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Die
erfindungsgemäßen Behälter oder
Behälteranordnungen
eignen sich also neben anderen denkbaren Anwendungen beispielsweise
für die Elektroporation,
d.h. Verfahren zum Einbringen von biologisch aktiven Molekülen in lebende
Zellen mittels elektrischen Stroms, wobei lebende Zellen und biologisch
aktive Moleküle,
insbesondere Nukleinsäuren,
in der Lösung
gelöst
sind und beispielsweise durch einen Spannungspuls mit einer Feldstärke von 2
bis 10 kV·cm–1 und
einer Dauer von 10 bis 200 μs ein
Einbringen dieser biologisch aktiven Moleküle in die lebenden Zellen erreicht
wird. Auf diesen Spannungspuls kann bei besonderen Anwendungen beispielsweise
ein ohne Unterbrechung folgender Stromfluss mit einer Stromdichte
von 2 bis 14 A/cm2, vorzugsweise 5 A/cm2, und einer Dauer von 1–100 ms, vorzugsweise 50 ms,
folgen. Die Zellen können dabei
beispielsweise in Suspension oder in Form einer adhärenten Zellschicht
verwendet werden.
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Die
erfindungsgemäßen Behälter oder
Behälteranordnungen
eignen sich darüber
hinaus beispielsweise auch für
die Elektrofusion, d.h. Verfahren zur Fusion von Zellen, Zellderivaten,
subzellulären Partikeln
und/oder Vesikeln mittels elektrischen Stroms, bei dem beispielsweise
die Zellen, Zellderivate, subzellulären Partikel und/oder Vesikel
zunächst
in zweckmäßiger Dichte
in einer wässrigen Lösung suspendiert
werden, die Suspension anschließend
in zumindest einen Behälter
oder eine Behälteranordnung
gemäß der vorliegenden
Erfindung überführt wird,
und schließlich
eine elektrische Spannung an die Elektroden angelegt und ein Stromfluss durch
die Suspension erzeugt wird. Alternativ können beispielsweise auch adhärente Zellen,
Zellderivate, subzelluläre
Partikel und/oder Vesikel oder aber auch beispielsweise adhärente Zellen
mit suspendierten Zellen, Zellderivaten, subzellulären Partikeln
oder Vesikeln fusioniert werden.
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Die
Erfindung wird im weiteren anhand der Figuren näher erläutert.
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Es
zeigt
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1 eine
perspektivische Darstellung einer Versuchsanordnung zur Demonstration
der vorliegenden Erfindung,
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2 Stromverläufe von
elektrischen Entladungen bei Verwendung von erfindungsgemäßen Elektroden
aus Polycarbonat mit 20 % Kohlefasern und 15 % Graphit (PC + CF
+ Gr mit einer Elektrodendicke von 1,65 mm) im Vergleich zur Verwendung von
Aluminium-Elektroden jeweils mit zwei unterschiedlichen Pufferlösungen (Lösung A:
100 mM Natriumphosphat, pH 7,1 und 25 mM Kaliumchlorid; Lösung B:
140 mM Natriumphosphat, pH 7,1; Ordinate: Strom, 1 A pro Kästchen;
Abszisse: Zeit, 10 ms pro Kästchen),
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3 eine
perspektivische Darstellung einer gegenüber 1 abgewandelten
Versuchsanordnung mit eingelegten Kupferdrähten,
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4 Stromverläufe von
elektrischen Entladungen bei Verwendung von Elektroden aus Polycarbonat
mit 20 % Kohlefasern (Elektrodendicke 2 mm) für eine Versuchsanordnung gemäß 1(a) und 3(b),
Ordinate: Strom, 1 A pro Kästchen
und Abszisse: Zeit, 10 ms pro Kästchen,
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5 Diagramme
einer durchfluss-zytometrischen Analyse transfizierter CHO-Zellen
(Chinesische Hamster-Ovarzellen) bei Verwendung unterschiedlicher
erfindungsgemäßer Kunststoff-Elektroden
im Vergleich zu Aluminium-Elektroden, a) Anzahl transfizierter Zellen
pro 25000 Zellen, b) Prozentualer Anteil von mit Propidiumjodid
angefärbten
toten Zellen, PC/CF/Gr = Polycarbonat + 20 Kohlefasern + 15 % Graphit
mit einer Elektrodendicke von 1,65 mm, PEEK/CF = Polyetheretherketon
+ 40 % Kohlefasern mit einer Elektrodendicke von 1 mm,
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6 Diagramme
einer durchfluss-zytometrischen Analyse transfizierter HL-60-Zellen
(Humane Lymphomzellen) bei Verwendung unterschiedlicher erfindungsgemäßer Kunststoff-Elektroden
im Vergleich zu Aluminium-Elektroden, a) Anzahl transfizierter Zellen
pro 15000 Zellen, b) Prozentualer Anteil von mit Propidiumjodid
angefärbten
toten Zellen, PC/CF/Gr = Polycarbonat + 20 % Kohlefasern + 15 % Graphit
mit einer Elektrodendicke von 1,65 mm, PEEK/CF = Polyetheretherketon
+ 40 % Kohlefasern mit einer Elektrodendicke von 1 mm,
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7 Diagramme
einer durchfluss-zytometrischen Analyse transfizierter Jurkat-Zellen
(Humane T-Zelllinie) bei Verwendung erfindungsgemäßer Kunststoff-Elektroden
im Vergleich zu Aluminium- Elektroden,
a) Anzahl transfizierter Zellen pro 25000 Zellen, b) Prozentualer
Anteil von mit Propidiumjodid angefärbten toten Zellen, PA/CF =
Polyamid 66 + 30 % Kohlefasern mit einer Elektrodendicke von 1 mm,
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8 Diagramme
einer durchfluss-zytometrischen Analyse transfizierter HUVEC-Zellen
(Humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen) bei Verwendung erfindungsgemäßer Kunststoff-Elektroden
im Vergleich zu Aluminium-Elektroden, a) Anzahl transfizierter Zellen
pro 15000 Zellen, b) Prozentualer Anteil von mit Propidiumjodid
angefärbten
toten Zellen, PPS/CF = Polyphenylensulfid + 40 Kohlefasern,
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9 mikroskopische
Aufnahmen von CHO-Zellkulturen (CHO = Chinesische Hamster-Ovarzellen)
2 Tage nach einer Elektroporation mit a) Aluminium-Elektroden und
b) Elektroden aus Polyphenylensulfid + 40 % Kohlefasern,
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10 Diagramme
einer durchfluss-zytometrischen Analyse von HUVEC-Zellen (Humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen)
nach Inkubation in unterschiedlich behandelten Lösungen, a) Anzahl der mit Propidiumjodid
gefärbten
toten Zellen, b) Anzahl der mit Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester
(CFDA-SE) gefärbten
lebenden Zellen, PA/CF = Polyamid 66 + 30 % Kohlefasern mit einer Elektrodendicke
von 1 mm, PC/CF/Gr = Polycarbonat + 20 % Kohlefasern + 15 % Graphit
mit einer Elektrodendicke von 1,65 mm,
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11 Diagramme
einer durchfluss-zytometrischen Analyse von CHO-Zellen (Chinesische Hamster-Ovarzellen)
nach Inkubation in unterschiedlich behandelten Lösungen, a) Anzahl der mit Propidiumjodid
gefärbten
toten Zellen, b) Anzahl der mit Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester
(CFDA-SE) gefärbten
lebenden Zellen, PP/CF = Polypropylen + 20 Kohlefasern mit einer
Elektrodendicke von 1 mm, PPS/CF = Polyphenylensulfid + 40 % Kohlefasern,
PA/CF = Polyamid 66 + 30 % Kohlefasern mit einer Elektrodendicke
von 1 mm und
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12 eine
perspektivische Darstellung einer möglichen Ausführungsform
eines erfindungsgemäßen Behälters.
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1 zeigt
eine perspektivische Darstellung einer Versuchsanordnung 1 zur
Demonstration der vorliegenden Erfindung bzw. zum Testen der erfindungsgemäßen Behälter. Die
Versuchsanordnung 1 entspricht dem Aufbau der erfindungsgemäßen Behälter und
besteht aus einer Abstandhalterplatte 2 und zwei beidseitig
an die Abstandhalterplatte 2 angepressten Elektroden 3, 4.
Bei der Abstandhalterplatte 2 handelt es sich um eine 2
mm dicke Platte aus Teflon, die einen u-förmigen Ausschnitt 5 aufweist.
Die Elektroden 3, 4 bestehen aus einem Kunststoff,
der mit mindestens einem leitfähigen
Stoff dotiert ist. Bei dem Kunststoff kann es sich beispielsweise
um Polycarbonat, Polyetheretherketon, Polypropylen, Polyamid, Polyphenylensulfid
oder ein Gemisch dieser Polymere und/oder einen intrinsisch leitenden
Kunststoff handeln. Die 3 Schichten, bestehend aus der Abstandhalterplatte 2 und
den beiden Elektroden 3, 4, werden zu beiden Seiten
mittels der Kupferplatten 6, 7 sandwichartig zusammengepresst.
Die Kupferplatten 6, 7 werden zu diesem Zweck
mittels der Gewindeabschnitte 8, 9 einer schraubstockartigen
Vorrichtung (nicht dargestellt) aufeinander zubewegt. Wenn die genannten
Schichten zusammengepresst sind, entsteht im Bereich des Ausschnitts 5 ein
Innenraum 10, dessen Volumen der Aufnahme der Lösung bzw.
Zellen dient. Der Innenraum 10 kann im dargestellten Beispiel
ein Volumen von 100 μl
aufnehmen. Der Innenraum 10 wird ferner nach unten und
zu zwei Seiten durch die Innenkanten 11 der Abstandhalterplatte 2 und
an den beiden verbleibenden Seiten durch die Elektroden 3, 4 gebildet. Die
Kupferplatten 6, 7 stehen über Drähte in elektrischen Kontakt
mit den Federkontakten eines handelsüblichen Elektroporationsgerätes, d.h.
einer Spannungsquelle. Die Elektroden 3, 4 stehen
ihrerseits über
ihre gesamte äußere Oberfläche unmittelbar
mit den Kupferplatten in Kontakt, so dass eine optimale elektrische
Kontaktierung gewährleistet
ist. Beim Anlegen eines Spannungspulses zwischen den Kupferplatten 6, 7 fließt also
bei der dargestellten Versuchsanordnung 1 ein Strom zwischen
den Elektroden 3, 4 durch den mit der Lösung bzw.
Zellsuspension gefüllten
Innenraum 10.
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2 zeigt
die Stromverläufe
von elektrischen Entladungen bei Verwendung von erfindungsgemäßen Elektroden
aus Polycarbonat mit 20 % Kohlefasern und 15 % Graphit (PC + CF
+ Gr) im Vergleich zur Verwendung von Aluminium-Elektroden. Es wurde dabei der Stromfluss
durch zwei unterschiedliche Pufferlösungen gemessen (Lösung A: 100
mM Natriumphosphat, pH 7,1 und 25 mM Kaliumchlorid; Lösung B:
140 mM Natriumphosphat, pH 7,1). Es wurde jeweils ein erster Spannungspuls
von 1000 Volt und 40 μs
Dauer gesetzt, auf den ohne Unterbrechung ein zweiter Puls mit einer
Anfangsspannung (UAnfang) von 90 V und einer
Ladung von 75 mC folgte. Gezeigt ist hier jeweils der Stromverlauf
des zweiten Pulses. Es zeigte sich dabei überraschenderweise, dass unter
gleichen Bedingungen mit den erfindungsgemäßen Kunststoffelektroden größenordnungsmäßig ein ähnlicher
Stromfluss erzielt werden kann, wie mit den handelsüblichen
Aluminium-Elektroden (Vergleiche a und c). Die dotierten Kunststoffe
eignen sich also besonders zum kurzzeitigen Leiten hoher Stromdichten.
Bei der Verwendung eines Phosphatpuffers ohne Chlorid (Lösung B) zeigt
sich im Gegensatz zur Verwendung eines chloridhaltigen Phosphatpuffers
(Lösung
A), dass sich bei Aluminium-Elektroden
im Verlauf der Entladung ein sehr hoher Widerstand an der Elektrodenoberfläche aufbaut,
der bei gleichem Anfangsstrom zu einem drastischem Abfall des Stromflusses
führt (b).
Bei der Verwendung von dotierten Kunststoffen tritt dieser negative
Effekt nicht ein (d), so dass die erfindungsgemäßen Behälter bzw. Elektroden im Gegensatz
zu den herkömmlichen
Küvetten
mit Aluminium-Elektroden auch für
die Verwendung von Phosphatpuffern ohne Chlorid geeignet sind. Durch
die Verwendung der erfindungsgemäßen Behälter ist
man folglich in der Wahl der Pufferlösung weniger eingeschränkt als bei
der Verwendung herkömmlicher
Behälter.
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3 zeigt
eine perspektivische Darstellung einer gegenüber der in 1 dargestellten
Versuchsanordnung 1 abgewandelten Versuchsanordnung 12.
Die Versuchsanordnung 1 gemäß 1 zeigt
einen Aufbau, bei dem die Elektroden 3, 4 nach außen von
den Kupferplatten 6, 7 großflächig mit relativ großem Druck
kontaktiert werden. Da die Kontaktierung der Elektrodenaußenseiten
beispielsweise in einer herkömmlichen
Elektroporationsapparatur nicht auf so großer Fläche und nicht mit so hohem Druck
erfolgt, wurden bei der Versuchsanordnung 12 die Kontaktflächen zu
den Elektroden kleinflächiger gestaltet.
Diese Anordnung entspricht daher eher einer Kontaktierung durch
Federkontakte und somit den tatsächlichen,
in der Praxis vorliegenden Verhältnissen.
Zu diesem Zweck wurden zwischen den Elektroden 3, 4 und
den jeweils benachbarten Kupferplatten 8, 7 runde,
v-förmig gebogene
Kupferdrähte 13, 14 mit
einem Durchmesser von ca. 1,5 mm gelegt. 4 zeigt
im Folgenden im Vergleich die Stromverläufe mit den Versuchanordnungen
gemäß 1 und 3.
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4 zeigt
die Stromverläufe
von elektrischen Entladungen bei Verwendung von Elektroden aus Polycarbonat
mit 20 % Kohlefasern jeweils für die
Versuchsanordnung 1 gemäß 1(a) und die Versuchsanordnung 12 gemäß 3(b). Gezeigt sind jeweils die Stromverläufe des
zweiten Pulses (1. Puls: 100 V, 40 μs; 2. Puls: UAnfang =
90 V, 75 mC). Das gleichförmige
Ergebnis zeigt, dass das elektrische Potential an der Elektrodeninnenseite
offenbar gleichmäßig verteilt
ist und die Kontaktierungsfläche folglich
keinen limitierenden Faktor bezüglich
der Leitfähigkeit
darstellt.
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5 zeigt
Diagramme einer durchfluss-zytometrischen Analyse transfizierter
CHO-Zellen. Um die Funktionalität
der erfindungsgemäßen Behälter biologisch
zu überprüfen, wurden
Transfektionsversuche unter Verwendung der unter 1 beschriebenen
Versuchsanordnung durchgeführt.
Zu diesem Zweck wurden CHO-Zellen in 100 μl einer geeigneten Pufferlösung, beispielsweise
PBS (phosphat buffered saline) unter Zugabe von 5 μg des Expressions-Plasmids pH-2Kk (DNA-Vektor, der für die schwere Kette eines MHC
Klasse I Proteins aus Maus kodiert) suspendiert und in den Innenraum
der Versuchsanordnung überführt. Die
Elektroporation der Zellen erfolgte dann unter Setzen von zwei Pulsen
(1. Puls: 1000 V, 100 μs;
2. Puls UAnfang = 108 V, 100 mC). Anschließend wurde
die Zellsuspension wieder entnommen, in ein geeignetes Medium, beispielsweise
RPMI-Medium, überführt und
nach 20 Stunden Inkubation bei 37°C
und 5 % CO2 geerntet. Adhärente CHO-Zellen
wurden mit PBS gewaschen und mit 0,1 % Trypsin + 1 mM Ethylendiamintetraacetat
in PBS abgelöst.
Die Expression des H-2Kk wurde durch Antikörperfärbung nachgewiesen
(1:100 anti-H-2kk von Becton Dickinson +
1:50 Beriglobin von Aventis Behring in PBS, 10 Minuten bei Raumtemperatur).
Die toten Zellen wurden mit 0,25 μg/ml
Propidiumjodid angefärbt.
Die Analyse erfolgte in einem Durchfluss-Zytometer (FACScalibur,
Becton Dickinson). Die Diagramme a) und b) zeigen, dass bei Verwendung
von Elektroden mit dotiertem Kunststoff (PC/CF/Gr = Polycarbonat
+ 20 % Kohlefasern + 15 % Graphit und PEEK-CF = Polyetheretherketon
+ 40 Kohlefasern) im Vergleich zur Verwendung von Aluminium-Elektroden
zumindest vergleichbare Ergebnisse hinsichtlich der Transfektionseffizienz
erzielt werden können.
Aufgrund der deutlich geringeren Mortalitätsraten bei der Verwendung
der erfindungsgemäßen Elektroden
ergibt sich durch das günstigere
Verhältnis
von Transfektionseffizienz zu Mortalität sogar ein deutlicher Vorteil
gegenüber
der Verwendung von herkömmlichen
Elektroden.
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6 zeigt
Diagramme einer durchfluss-zytometrischen Analyse transfizierter
HL60-Zellen (Humane Lymphomzellen). Die Versuchsdurchführung und
Versuchsbedingungen entsprechen den zu 5 beschriebenen,
mit der Ausnahme, dass die Spannungspulse bei der Elektroporation
abgeändert wurden
(hier: 1 Puls: 1000 V, 70 μs;
2 Puls: UAnfang = 81 V, 22 mC). Auch hier
konnten mit den verwendeten Elektroden aus dotiertem Kunststoff
Ergebnisse erzielt werden, die denen bei Verwendung von Aluminium-Elektroden
zumindest vergleichbar sind.
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7 zeigt
Diagramme einer durchfluss-zytometrischen Analyse transfizierter
Jurkat-Zellen (Humane T-Zelllinie) bei Verwendung erfindungsgemäßer Elektroden
bestehend aus Polyamid 66, welches mit 30 % Kohlefasern dotiert wurde.
Die Elektroporation wurde hier in 100 μl RPMI-Medium ohne Phenolrot
mit 5 μg
des Plasmids pEGFP-C1 durch ein Puls von 150 Volt und 5 μs gefolgt
von einem Puls mit einer Anfangsspannung von 108 V und einer Ladung
von 80 mC durchgeführt.
Die Analyse erfolgte hierbei nach 4 Stunden. Auch bei diesem Beispiel konnte
sowohl die Transfektionseffizienz als auch die Überlebensrate durch die Verwendung
der erfindungsgemäßen Behälter bzw.
Elektroden aus dotiertem Kunststoff im Vergleich zu den herkömmlichen Aluminium-Elektroden
deutlich erhöht
werden. Die in den 5 bis 7 dargestellten
Ergebnisse belegen also eindeutig, dass mit den erfindungsgemäßen Behältern die
Transfektionseffizienzen bei der Elektroporation im Vergleich zu
herkömmlichen
Küvetten deutlich
erhöht
und die Mortalitätsrate
deutlich gesenkt werden kann. Dies ist vor allem dadurch zu erklären, dass
mit den erfindungsgemäßen Elektroden überraschenderweise
vergleichbare Stromflüsse
gewährleistet
sind, während
die bekannten Nachteile durch die Freisetzung von Metall-Ionen aus
den Elektroden und somit toxische Einflüsse auf die Zellen vermieden
werden.
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8 zeigt
Diagramme einer durchfluss-zytometrischen Analyse transfizierter
HUVEC-Zellen (Humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen) bei Verwendung
von erfindungsgemäßen Elektroden aus
Polyphenylensulfid mit 40 Kohlefasern im Vergleich zu herkömmlichen
Aluminium-Elektroden. Die Transfektion erfolgte in einem zellspezifischen
Medium mit 5 μg/100μl Plasmid-DNA, wobei in diesem Fall
zur Kompensation der geringfügig
geringeren Leitfähigkeit
des dotieren Kunststoffs unterschiedliche Spannungspulse gesetzt
wurden (Puls für PPS/CF:
1000 V, 100 μs;
Puls für
Aluminium: 500 V, 100 μs).
Die Zellen wurden nach 60 Stunden Inkubation durchfluss-zytometrisch
auf Expression eines fluoreszierenden Proteins untersucht. Tote
Zellen wurden auch hier mit 0,25 μg/ml
Propidiumjodid angefärbt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäßen Behälter grundsätzlich auch für primäre menschliche
Zellen geeignet sind. Dabei ist auch hier das Verhältnis von
Transfektionseffizienz zu Mortalitätsrate günstiger als bei der Verwendung
von herkömmlichen
Aluminium-Elektroden. Dieser Effekt kann noch dadurch verstärkt werden,
dass man die effektiv höheren
Widerstände
der dotierten Kunststoffe durch eine Erhöhung der angelegten Spannung
kompensiert. Auf diese Weise kann eine Anpassung der elektrischen
Verhältnisse
in der Zellsuspension bei Verwendung von Elektroden aus dotiertem
Kunststoff erfolgen und die Transfektionseffizienz weiter gesteigert
werden.
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9 zeigt
mikroskopische Aufnahmen von CHO-Zellkulturen jeweils 2 Tage nach
einer Elektroporation mit Aluminium-Elektroden (a) und Elektroden
aus Polyphenylensulfid mit 40 % Kohlefasern (b). Auch hier wurde
die geringfügig
geringere Leitfähigkeit
der Elektroden aus dotiertem Kunststoff durch eine Erhöhung des
ersten und zweiten Spannungspulses kompensiert (PPS/CF: 1000 V,
100 μs und UAnfang = 108 V, 100 mC; Aluminium: 500 V,
100 μs und
UAnfang = 76 V, 60 mC). Bei der Verwendung
von Aluminium-Elektroden zeigen sich deutlich sichtbare Präzipitate,
von denen einige in a) durch eingefügte Pfeile gekennzeichnet sind.
Diese Partikel legen sich auf die Zellen. Bei einer Verwendung von
Elektroden aus dotiertem Kunststoff sind solche Partikel nicht nachweisbar,
so dass sich durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Behälter ein
Ausfallen von Präzipitaten
offensichtlich vermeiden lässt.
Dies wirkt sich zum einen positiv auf die Überlebensrate der Zellen und
zum anderen vorteilhaft auf die weitere Handhabung der Zellen aus.
Auch die medizinische Kompatibilität der Elektroporationsprodukte
wird dadurch erhöht,
so dass beispielsweise die mögliche Verwendung
von transfizierten primären
Zellen zur ex vivo – Gentherapie
besonders vorteilhaft beeinflusst wird.
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Die 10 und 11 zeigen
jeweils Diagramme einer durchflusszytometrischen Analyse von Zellen
(10: HUVEC-Zellen, 11: CHO-Zellen), die jeweils
in unterschiedlich behandelten Lösungen
inkubiert wurden. Um die Auswirkung möglicher zellschädigender
Bestandteile zu untersuchen, die aus den unterschiedlichen Elektroden
aus dotiertem Kunststoff und aus Aluminium-Elektroden bei einer
elektrischen Entladung frei werden könnten und über ihre unmittelbare Wirkung
hinaus möglicherweise
erst nach den Pulsen in der Zellkultur Wirkung zeigen, wurden die
erfindungsgemäßen Behälter mit einfachen
Pufferlösungen,
beispielsweise PBS, ohne Zellen beladen und dreimal hintereinander
einem starken Spannungspuls ausgesetzt (Aluminium: 500 V, 100 μs Und UAnfang = 115 V, 100 mC; dotierte Kunststoffe:
1000 V, 100 μs
und UAnfang = 95 V, 112 mC). Anschließend wurden
100 μl der
mittels der unterschiedlichen Elektroden gepulsten Lösungen zu
400 μl Kulturmedium
(EGM-2 BulletKit/Clonetics) gegeben und darin HUVEC-Zellen (18 Stunden – Werte: 5·104 Zellen, 96 Stunden – Werte: 2,5·104 Zellen) bzw. CHO-Zellen (20 Stunden – Werte:
105 Zellen, 72 Stunden – Werte: 2·104 Zellen)
in 24-well-Platten ausgesät. Die Anzahl
der toten bzw. lebenden Zellen wurde nach unterschiedlichen Zeiten
und einer Inkubation bei 37°C
und 5 % CO2 durchfluss-zytometrisch ermittelt.
Nach Ablösen
der Zellen durch 1 μg/ml Trypsin
in 1 mM Ethylendiaminthetraacetat in PBS und Vereinigung dieser
Zellen mit dem Kulturüberstand
wurde zur Ermittlung der toten Zellen 0,25 μl/ml Propidiumjodid zugefügt. Zur
Anfärbung
der lebenden Zellen wurde 0,2 μM
Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimdylester (CFDA-SE) in PBS + 0,5
% Rinderserumalbumin zugegeben, und vor der durchfluss-zytometrischen
Analyse für
2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Um die absolute Anzahl von
Zellen in einem Ansatz zu ermitteln, wurde eine definierte Anzahl
von Flow-Count Fluorosphere
Beads (Beckman Coulter) zugefügt,
die sich im FACS von den Zellen unterscheiden lassen. Auf diese
Weise ließ sich
die ermittelte Zellzahl auf das gesamte Volumen in der Zellkulturvertiefung
extrapolieren. Die in den 10 und 11 dargestellten
Ergebnisse zeigen, dass sich bei der Verwendung von Elektroden aus
dotiertem Kunststoff im Vergleich zu Aluminium-Elektroden ein leichter
Vorteil ergibt. Insbesondere nach 4 Tagen sind die unter Verwendung
von Kunststoff-Elektroden gepulsten Lösungen für das Überleben und Wachstum von CHO-Zellen
günstiger. Bei
HUVEC-Zellen kann man schon nach 24 Stunden einen positiven Effekt
der verwendeten Kunststoffelektroden im Vergleich zu den herkömmlichen
Aluminium-Elektroden erkennen. Diese Ergebnisse geben also einen
Hinweis auf eine bessere Verträglichkeit von
Elektroden aus dotiertem Kunststoff im Hinblick auf die Freisetzung
zellschädigender
Bestandteile, wobei hier die negativen Auswirkungen nach dem Stromfluss
untersucht wurden. Durch die Vermeidung der Freisetzung toxischer
Metall-Ionen wird zusätzlich
eine bessere biologische Kompatibilität der erfindungsgemäßen Behälter erreicht.
Diese sind folglich vor allem im Hinblick auf eine weitere Verwendung
der transfizierten Zellen, beispielsweise eine Verwendung von veränderten
primären
Zellen zur ex vivo – Gentherapie,
deutlich gegenüber
herkömmlichen
Behältern
bzw. Küvetten
im Vorteil.
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12 zeigt
eine perspektivische Darstellung einer möglichen Ausführungsform
eines erfindungsgemäßen Behälters. Der
hier dargestellte Behälter 20 weist
im wesentlichen die Form einer herkömmlichen Küvette auf. Der Behälter wird
durch eine äußere Begrenzung 21 gebildet,
welche ihrerseits einen Innenraum 22 bildet, der zur Aufnahme
einer wässrigen
Lösung
dient. In der wässrigen
Lösung können beispielsweise
Zellen, Zellderivate, subzelluläre
Partikel und/oder Vesikel suspendiert sein. Der Behälter kann
beispielsweise zusätzlich
zur wässrigen
Lösung
oder Suspension auch adhärente
Zellen, Zellderivate, subzelluläre
Partikel und/oder Vesikel enthalten. In zwei parallel und gegenüberliegend
angeordneten Seitenwänden 23, 24 der äußeren Begrenzung 21 finden
sich zwei gleichfalls parallele Elektroden 25, 26.
Die beiden Elektroden 25, 26 bestehen aus einem
Kunststoffmaterial, welches erfindungsgemäß mit zumindest einem leitfähigen Stoff dotiert
ist. Bei der Dotierung kann es sich beispielsweise um Kohlefasern,
Graphit, Ruß,
Kunststoffnanotubes oder einen intrinsisch leitenden Kunststoff, oder
aber auch um eine Kombination einer oder mehrerer dieser Stoffe
handeln. Die äußere Begrenzung 21 besteht
aus einem transparenten Kunststoffmaterial, dass elektrisch nicht-leitend
ist. Der erfindungsgemäße Behälter 20 kann
aufgrund der Spritzfähigkeit
aller seiner Komponenten im 2-Komponenten-Spritzguß hergestellt
werden. Dabei wurde im vorliegenden Fall zunächst die äußere Begrenzung 21 aus
dem nicht-leitenden Kunststoff gespritzt. In die ausgesparten Fenster
(nicht mehr sichtbar) wurde durch die Spritzkanäle 27, 28 der
ebenfalls spritzfähige
dotierte Kunststoff eingespritzt. Auf diese Weise ist eine äußerst einfache
und kostengünstige
Herstellung des erfindungsgemäßen Behälters 20 möglich. Ein
solcher Behälter 20 in
Küvettenform
ist vor allem dann vorteilhaft, wenn dieser in einer herkömmlichen
Elektroporationsapparatur verwendet werden soll. Je nach Art der
Anwendung sind allerdings auch alle sonstigen denkbaren und sinnvollen Formen
für einen
erfindungsgemäßen Behälter möglich.
-
Liste der verwendeten
Abkürzungen:
-
Außer den
im Duden gebräuchlichen,
wurden folgende Abkürzungen
verwendet:
- A
- Ampere
- C
- Coulomb
- CHO
- chinese hamster ovary
- cm
- Zentimeter
- DNA
- Desoxyribonukleinsäure
- Gew.-%
- Gewichtsprozent
- HL-60
- human lymphoma 60
- HUVEC
- Humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen
- kV
- Kilovolt
- mC
- Millicoulomb
- mM
- Millimolar
- ms
- Millisekunden
- PBS
- Phosphat buffered
Saline
- pH
- negativer dekadischer
Logarithmus der Wasserstoffionen-Konzentration
- RNA
- Ribonukleinsäure
- RPMI
- Rosewell Park Memorial
Institute
- μg
- Mikrogramm
- μl
- Mikroliter
- μs
- Mikrosekunden
- U
- Spannung
- UAnfang
- Anfangsspannung
- V
- Volt
-
- 1
- Versuchsanordnung
- 2
- Abstandhalterplatte
- 3
- Elektrode
- 4
- Elektrode
- 5
- Ausschnitt
- 6
- Kupferplatte
- 7
- Kupferplatte
- 8
- Gewindeabschnitt
- 9
- Gewindeabschnitt
- 10
- Innenraum
- 11
- Innenkanten
- 12
- Versuchsanordnung
- 13
- Kupferdraht
- 14
- Kupferdraht
- 20
- Behälter
- 21
- äußere Begrenzung
- 22
- Innenraum
- 23
- Seitenwand
- 24
- Seitenwand
- 25
- Elektrode
- 26
- Elektrode
- 27
- Spritzkanal
- 28
- Spritzkanal