DE10204606C1

DE10204606C1 - Vorrichtung und Verfahren für Lipoproteine hoher Dichte

Info

Publication number: DE10204606C1
Application number: DE10204606A
Authority: DE
Inventors: Ronald M Jones; Anthony Nugent; Thomas E Worthy
Original assignee: Cholestech Corp
Current assignee: Cholestech Corp
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2002-02-05
Publication date: 2003-10-16
Anticipated expiration: 2022-02-06
Also published as: ATE297018T1; AU2003210544B2; US20050208609A1; DE60204418T2; JP2005515453A; US20030166291A1; KR20040090974A; US6881581B2; EP1329724B1; US7582484B2; JP4379588B2; PT1329724E; EP1329724A3; ES2241911T3; CA2473244C; EP1329724A2; WO2003061569A3; HK1057610A1; CA2473244A1; KR100990888B1

Abstract

Eine Untersuchungsvorrichtung und ein Verfahren zum Messen der Konzentration von HDL in Verbindung mit Cholesterin einer flüssigen Blutprobe sind beschrieben. Die Vorrichtung gestattet den gleichzeitigen Ablauf von mehreren Untersuchungen auf der Basis eines gesteuerten Betrages einer einzelnen Probe, während das Risiko einer Probenverunreinigung durch Fällungsreagenzien minimiert ist.

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Lipoproteinen hoher Dichte (High Density Lipopro teins = HDL) in Verbindung mit Cholesterin einer Blutprobe und auf eine diagno stische Untersuchungsvorrichtung zum Ausführen des Verfahrens.

2. Hintergrund der Erfindung

Der Anteil von Cholesterin im Blut steht bekanntermaßen in Verbindung mit dem Risiko koronarer, arterieller Erkrankungen. Cholesterin zirkuliert im Blut über wiegend in Protein gebundener Form. Die Proteine, die das Cholesterin transpor tieren, sind Lipoproteine, die sich basierend auf ihrer Dichte in drei Klassen un terteilen lassen. Die Lipoproteine sehr geringer Dichte (Very Low Density Lipo proteins = VLDL) sind triglyceridreiche Lipoproteine, die in der Leber syntheti siert werden und schließlich in Lipoproteine niedriger Dichte (Low Density Lipo proteins = LDL) umgewandelt werden, die den größten Teil des Plasmacholeste rins im menschlichen Körper transportieren. Die Lipoproteine hoher Dichte (High Density Lipoproteins = HDL) sind Lipoproteine, die in den Katabolismus von trigylceridreichen Lipoproteinen und in das Entfernen des Cholesterins von den peripheren Geweben und in den Transport zur Leber involviert sind. Eine rezipro ke Beziehung zwischen den Niveaus des Serum-HDL und dem Risiko von koro naren Erkrankungen ist festgestellt worden. Das Risiko von koronaren Erkran kungen ist insbesondere erhöht, wenn der Anteil von Serumcholesterin in Verbin dung mit HDL niedrig ist.

Im Hinblick auf die Bedeutung der Niveaus von relativem Serumcholesterin in der Risikoeinschätzung und im Umgang mit arterogenen Erkrankungen wurden beachtliche Anstrengungen unternommen, um große Bevölkerungsgruppen so wohl normaler als auch gefährdeter Individuen im Hinblick auf das Serumniveau von HDL, LDL sowie von Gesamtcholesterin und Triglyceriden zu untersuchen. Die Effektivität von Behandlungen von gefährdeten Individuen ist in regulären Untersuchungen des Serumniveaus des Cholesterins in den verschiedenen Lipo proteingruppen gezeigt worden.

Ein Verfahren zur spezifischen HDL-Cholesterinuntersuchung basiert auf dem gezielten Ausfällen von Nicht-HDL-Lipoproteinen in Serum durch polyanioni sche Verbindungen, wie beispielsweise Dextransulfat, Heparin und Phosphor wolframat bei Anwesenheit eines Kations der zweiten Hauptgruppe, wie bei spielsweise Mg²⁺, Mn²⁺ und Cr²⁺. Die Genauigkeit und der Grad der Fällung hän gen von einer Vielzahl von Faktoren ab einschließlich des Typs und der Konzen tration des Polyanion/Metall-Agens. Im Allgemeinen ist die Ordnung der Fällung der Serumcholesterinpartikel mit zunehmender Konzentration des Polyanions VLDL, LDL und HDL. HDL bleibt für gewöhnlich löslich bei Konzentrationen von Heparin oder Dextransulfat, die vollständig Partikel niedrigerer Dichte aus fällen, obwohl geringe ApoE-Arten von HDL mit den Teilchen geringer Dichte mit ausgefällt werden können. Durch die gezielte Ausfällung von Teilchen gerin ger Dichte kann der Gehalt von HDL-Serumcholesterin bestimmt werden.

In einem typischen Lipiduntersuchungsverfahren wird Blut geringen Volumens abgezogen und zentrifugiert, um eine klare flüssige Plasma- oder Serumprobe herzustellen. Die Probenflüssigkeit wird dann zu gleichen Teilen auf verschiedene Untersuchungsröhrchen verteilt, um (a) das Gesamtserumcholesterin, (b) Trigly ceride und (c) HDL-Cholesterin zu bestimmen. Die HDL-Probe wird ausgefällt, wie oben beschrieben, und die Teilchen geringerer Dichte werden durch Filtration oder Zentrifugation vor der Cholesterinbestimmung entfernt. Die Probe reagiert dann mit einem Enzymmix, der Cholesterinesterase, Cholesterinoxidase, Peroxi dase und einen Farbstoff enthält, der bei Vorhandensein von H₂O₂ zu einem merklichen Farbprodukt oxidiert werden kann. Die Röhrchen können spektro phometrisch gelesen und die gewünschten Gesamt-HDL- und LDL-Werte be stimmt werden.

Trotz der Genauigkeit und der Verlässlichkeit, die mit der gerade beschriebenen Flüssigphasencholesterinuntersuchung erzielt werden kann, weist die Untersu chung eine Anzahl von Einschränkungen bei der Verwendung in weit verbreiteten Methoden auf. Erstens verwendet das Verfahren eine venöse Blutprobe, wobei ein ausgebildeter Techniker erforderlich ist, um die Blutprobe abzunehmen, zu frak tionieren und das behandelte Blut zu gleichen Teilen auf einzelne Untersuchungs röhrchen zu verteilen. Zumindest eines der Probenröhrchen (für die HDL- Bestimmung) muss mit einem Fällungsmittel behandelt werden und weiter verar beitet werden, um das ausgefällte Material zu entfernen. Obwohl einige dieser Verfahrensschritte automatisiert werden können, sind für diesen Zweck konstru ierte analytische Maschinen teuer und nicht weit verbreitet außerhalb von großen Hospitälern.

Die US-Patente 5 213 964, 5 213 965, 5 316 196 und 5 451 370 offenbaren Ver fahren und Untersuchungsvorrichtungen, die im Wesentlichen viele der oben er wähnten Probleme in Verbindung mit Flüssiguntersuchungsverfahren zum Mes sen von Serumcholesterinniveaus überwinden. In einer Ausführungsform ist eine Vorrichtung zum Messen der Konzentration von HDL in Cholesterin einer Blut probe konstruiert, wobei die Blutprobe ebenfalls LDL und VLDL-Partikel enthält. Die Vorrichtung enthält eine Siebmatrix, die in der Lage ist, lösliche und ausge fällte Lipoproteine abzutrennen, wenn eine flüssige Probe durch die Matrix wan dert. Ein der Matrix zugeordnetes Reservoir ist derart konstruiert, dass ein Fäl lungsmittel freigegeben wird, um gezielt LDL und VLDL auszufällen, wenn eine flüssige Probe in und durch die Matrix gezogen wird. Dies gestattet die HDL- Trennung von den ausgefällten Lipoproteinen basierend auf der schnelleren HDL- Migration durch die Trennungsmatrix. Die dadurch von Nicht-HDL- Lipoproteinen befreite flüssige Probe wandert dann durch eine Testoberfläche, wo sie auf Cholesterin untersucht wird.

Lipoproteinen befreite flüssige Probe wandert dann durch eine Testoberfläche, wo sie auf Cholesterin untersucht wird.

Es wurde gefunden, dass die Behandlung von Blut mit Reagenzien, die bei der gezielten Ausfällung von Nicht-HDL-Blutlipoproteinen verwendet werden, in ein Binden eines Anteils des in der Probe enthaltenen HDL an nicht beschichtete Glasfasern resultiert und dass ein solches Binden des HDL an die Glasfasern während des Filterns oder des Transportes oft in verfälschte, niedrige HDL- Cholesterinwerte resultiert. Dieses Problem wird durch das US-Patent 5 451 370 behandelt, in dem die Glasfasern in der Matrix zur Fällung/Sieben und Transport der gefilterten Probe mit einem hydrophilen Polymer oder mit einem silylgruppenhaltigen Reagens beschichtet werden.

In Ergänzung zu der Notwendigkeit einer solchen Beschichtung zur Minimierung des HDL-Verlustes enthalten die Vorrichtungen, auf die oben Bezug genommen wurde, ebenfalls die Möglichkeit der Kontaminierung des Durchflusstransportpfades mit Fällungsmitteln. Solche Reagenzien könnten Störungen in anderer Untersuchungschemie verursachen, die in anderen Bereichen der Mehrfachuntersuchungsvorrichtung genutzt wird. Die vorliegende Erfindung behandelt und überwindet diese Probleme.

In Abhängigkeit von dem Testverlauf der Systeme des Standes der Technik können diese in zwei Gruppen unterteilt werden. Die auch geschichtlich erste Gruppe umfasst kontinuierliche Systeme, wie sie beispielsweise in der US-A-5 135 716 oder in der EP-A-0 408 223 offenbart sind. Die zweite Gruppe umfasst die diskontinuierlichen Systeme. Diese Systeme werden in ihrem zeitlichen Ablauf vor dem abschließenden Nachweisschritt bzw. der Farbreaktion gestoppt und nach einer beliebigen Zeitspanne wieder fortgesetzt. Ein solches System ist in der DE 39 29 032, der EP-A-0 415 298 und in der DE 691 32 513 T2 offenbart.

Die kontinuierlichen Systeme zeichnen sich durch einen ununterbrochenen Ablauf der hintereinander geschalteten Testschritte aus. Sobald der Test durch das Aufbringen des Blutserums gestartet worden ist, folgen automatisch und unaufhaltsam das Filtern der zellulären Blutbestandteile, das Durchführen der Fällungsreaktion, das Filtern der Fällungsprodukte und die Nachweisreaktion. Während des unaufhaltsamen Durchlaufens der einzelnen Schritte bewegt sich die Probe in Abhängigkeit von den dort wirkenden Kräften ungleichmäßig durch die Testanordnung. Aus diesem Grund wird die Probe über ständig variierende Zeiträume mit den jeweiligen Chemikalien in Verbindung gebracht, was die Vollständigkeit der vorgesehenen Reaktion, die Reaktionsintensität und daher die Verlässlichkeit des Reaktionsergebnisses unvorhersehbar beeinflusst.

Ein weiterer Nachteil ergibt sich aus der möglichen Blockade der Transportwege der Körperflüssigkeit durch Fällungsprodukte und/oder weitere chemische Reaktionsprodukte. Dies ist der Fall, wenn gleichzeitig oder parallel verschiedene Nachweisreaktionen in der Testvorrichtung vorbereitet werden. Zu diesem Zweck muss beispielsweise ein Universalträger die Filtereigenschaften aller möglichen Reaktionsprodukte in sich vereinen. Zwangsläufig sind zu diesem Zweck Kompromisse erforderlich, die sowohl den Reaktionsablauf als auch die Verlässlichkeit des abschließenden Nachweises nachteilig beeinflussen. Zudem führen die parallelen Reaktionen zu gegenseitiger chemischer Beeinflussung, die den späteren quantitativen Nachweis ebenfalls verfälscht.

Die als Weiterentwicklung im Stand der Technik vorgeschlagenen diskontinuierlichen Systeme überwinden nicht die oben genannten Nachteile. Diese Systeme integrieren lediglich eine Pause vor dem abschließenden Nachweisschritt, um hier eine Temperaturkontrolle oder -einstellung vornehmen zu können. Mit dieser Unterbrechung des Testablaufs werden jedoch weder die physikalische Behinderung des Testablaufs in den Träger- und Filtermaterialien noch die chemischen Kollisionen in den einzelnen Testschritten minimiert oder die Verlässlichkeit der Tests gesteigert.

Die zeitliche Unterbrechung vor dem Nachweisschritt sowie ein zumeist zeitin tensives Temperieren hat eher den entgegengesetzten Effekt. Die Probe, die ent sprechenden Chemikalien und die Reaktionsprodukte befinden sich über einen längeren Zeitraum nebeneinander in der Testvorrichtung. Dieser Umstand ermög licht übergreifende chemische Reaktionen, wobei imprägnierte Fällungsreagenzi en und Zusatzreagenzien weitere Reaktionen basierend auf dem langfristigen Kontakt mit dem Blut hervorrufen. Aufgrund der langfristigen Speicherung und Temperierung werden die Reaktionsprodukte der einzelnen Testabschnitte durch die Trägerfasern festgehalten und können dadurch den Träger verstopfen.

Es ist daher das Problem der vorliegenden Erfindung, eine HDL- Untersuchungsvorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, die die Nachteile des Standes der Technik überwinden und auf diese Weise verlässliche Ergebnisse liefern.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Das obige Problem wird durch eine Untersuchungsvorrichtung gemäß Patentan spruch 1 zum Trennen von Nicht-HDL-Lipoproteinen von biologischen Flüssig keiten, wie beispielsweise einer Blutprobe, gelöst.

Verglichen zum Stand der Technik wird ein vollständig neues Konzept zum Be stimmen des HDL-Gehalts in biologischen Flüssigkeiten bereitgestellt. Dieses Konzept unterteilt sich in zwei bisher nicht verwendete Stufen. In der ersten Stufe wird die Blutprobe physikalisch auf den Test vorbereitet. Diese Vorbereitung be inhaltet beispielsweise das Entfernen zellulärer Blutbestandteile. In der zweiten Stufe wird die biologische Flüssigkeit so schnell wie möglich verarbeitet. Diese Verarbeitung schließt die chemische Behandlung der Probe durch verschiedene Reagenzien, beispielsweise durch Fällungsmittel, eine nachfolgende oder gleich zeitige physikalische Behandlung, beispielsweise durch Filtern, und zumindest einen abschließenden Nachweis ein.

Die Zweistufigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens und dessen Umsetzung in der entsprechenden Vorrichtung verwirklicht ein gänzlich anderes Konzept als die bekannten diskontinuierlichen Verfahren. Zu diesem Zweck stellt die vorliegende Vorrichtung zur Durchführung des vollständigen Verfahrens zwei Zeitfenster zur Verfügung. Innerhalb des ersten Zeitfensters erfolgt die Vorbereitung einer Probe von Körperflüssigkeit, zum Beispiel Blut, in ausreichender Menge auf den Test. Auch wenn die Probe eine gewisse Zeit in der ersten Stufe verbleibt, ergeben sich daraus keine negativen Effekte auf die nachfolgende zweite Stufe. Beispielsweise ein teilweises Eintrocknen der Probe führt nur zu einer Reduktion des Probenvo lumens. Die Probe ist jedoch in ausreichender Menge vorhanden, so dass dies ohne negative Folgen bleibt. Zudem sind chemische Interferenzen ausgeschlossen.

In der zweiten Stufe wird der Test in einer zeitlich effektiven als auch räumlich getrennten Weise durchgeführt, die eine völlig neue Reaktionsdynamik realisiert. Der Test läuft schnell und ausgerichtet auf das Nachweisziel ab, indem Trägermaterialien und Reagenzien optimal aufeinander abgestimmt sind. Der Test ist auf diese Weise auf ein kleines Zeitfenster beschränkt, um chemische oder physikalische Nebeneffekte auszuschließen. Außerdem kann dieses Zeitfenster in Abhängigkeit von einzustellenden Nebenbedingungen beliebig geöffnet werden, d. h. der Test gestartet und zeitlich effektiv vollendet werden. Die erfindungsgemäße Dynamik des Tests gewährleistet auch eine Durchflussdynamik der Probe mit einem optimierten Kontakt zwischen der Probe und den chemischen Reagenzien, die zeitlich so effektiv wie notwendig ist. Des Weiteren ist das Reagenskissen optimal angepasst, um das Entfernen, beispielsweise das Ausfällen und Separieren oder das Binden, von Nicht-HDL- Verbindungen zu unterstützen.

Als weiterer Vorteil wird eine räumliche Trennung zwischen unterschiedlichen Nachweisreaktionen realisiert, die jedoch parallel ausgehend von der gleichen Probe in der Untersuchungsvorrichtung durchgeführt werden können. Zu diesem Zweck sind verschiedene räumlich getrennte Testkissen vorgesehen, so dass eine chemische Interferenz zwischen enthaltenen Reagenzien und Reaktionsprodukten wie im Stand der Technik ausgeschlossen ist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Untersuchungsvorrichtung zum Messen von Serumcholesterin in Verbindung mit Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) in einer flüssigen Blutprobe mit enthaltenen Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL) oder Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDL) offenbart, umfassend eine Probenverteilungsmatrix zum effektiven Verteilen einer flüssigen Blutprobe von einer Probenauftragsregion innerhalb der Matrix zu einer oder mehreren Probensammelregionen innerhalb der Matrix, ein HDL-Untersuchungselement, in dem HDL-Konzentration untersucht werden können und das von der Probenverteilungsmatrix beabstandet ist, ein Reagenskissen, das zwischengeordnet ist zwischen dem HDL- Untersuchungselement und der Probenverteilungsmatrix und das von der Matrix beabstandet ist, wobei das Reagenskissen einen Reagens zum gezielten Entfernen von Nicht-HDL-Lipoproteinen aus der flüssigen Probe enthält und Befestigungsmittel zum (a) Halten der Vorrichtung in einer Probenverteilungsposition, wobei das HDL-Untersuchungselement und das Reagenskissen von der Matrix beabstandet sind, und (b) zum Versetzen der Vorrichtung in eine Testposition, wodurch das HDL-Untersuchungselement platziert oder in Kontakt mit dem Reagenskissen gehalten wird und wodurch das Reagenskissen gleichzeitig mit oder nachfolgend zu diesem Kontakt mit der Matrix in Kontakt gebracht wird.

Weiterhin bevorzugt umfasst die Vorrichtung einen Reaktionsbalken, der durch Befestigungsmittel an dem Hauptkörper befestigt ist, um ein Versetzen des Reaktionsbalkens zu realisieren zwischen einer Probenverteilungsposition, in der unteren Oberfläche des Reaktionsbalkens befestigt sind, so dass diese Kissen in Flüssigkeitskontakt mit der Probenverteilungsmatrix gebracht werden, wenn der Reaktionsbalken zu einer Testposition bewegt wird, und so dass dieser Flüssig keitskontakt unterbrochen ist, wenn der Reaktionsbalken in die beabstandete Po sition versetzt wird.

Die oben genannte Kassette oder der Hauptkörper umfasst einen Reaktionsbalken, der beabstandet von dem Testkissen (beabstandete Position) in die Testposition bewegt werden kann, beispielsweise durch Einsetzen der Vorrichtung in einen entsprechenden Analysierer. Basierend auf diesem Versetzen von der beabstan deten Position in die Testposition wird das HDL-Untersuchungselement sowie das Reagenskissen in einen Flüssigkeitskontakt mit der Probenverteilungsmatrix mit der Blutprobe gebracht, um das Entfernen des Nicht-HDL sowie die Bestimmung des HDL während des Durchflusses der flüssigen Blutprobe durch das Rea genskissen und das HDL-Untersuchungselement zu starten. Der Test wird dann automatisch abgeschlossen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Untersuchungsvorrichtung ist eine untere Oberfläche des HDL-Untersuchungselements an einer oberen Oberflä che des Reagenskissens befestigt.

Basierend auf dieser Konfiguration wird ein schneller Durchfluss der Probe reali siert, der den zeitlichen Kontakt der Blutprobe mit den entsprechenden Reagenzi en limitiert. Weiterhin wird eine Platz sparende Anordnung gewährleistet, indem keine weiteren übereinander angeordneten Schichten zwischen dem HDL- Untersuchungselement und dem Reagenskissen verwendet werden.

Es ist weiterhin gemäß der Erfindung bevorzugt, dass die Probenverteilungsmatrix mit einem Siebkissen verbunden ist.

Diese Anordnung gestattet das Bereitstellen eines geeigneten Reservoirs für eine flüssige Blutprobe mittels eines Siebkissens und der Probenverteilungsmatrix so wie einen vorgeschalteten Filter zum Abfiltern der zellulären Blutbestandteile mittels des genannten Siebkissens.

Gemäß der Erfindung ist es weiterhin bevorzugt, dass die Vorrichtung einen Hauptkörper mit einem Behälter zum Aufnehmen der flüssigen Blutprobe um fasst, der im Flüssigkeitsausgleich mit dem Siebkissen und der Probenvertei lungsmatrix steht, zu der die flüssige Blutprobe transportiert wird.

Die obige Vorrichtung ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform in einer Kassette untergebracht, die den Hauptkörper bildet. Dieser Körper weist einen Behälter zum Aufnehmen beispielsweise der tropfenförmigen Blutprobe auf. Der Körper arbeitet mit der Probenverteilungsmatrix über die genannte Siebmatrix zusammen, so dass die Blutprobe von den zellulären Bestandteilen getrennt wird. Weiterhin wird eine Art von Kanalsystem bereitgestellt, das die Blutprobe von dem Behälter zu der Probenverteilungsmatrix transportiert.

Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der genannte Reaktionsbalken optisch transparent, enthält optisch transparente Fenster oder Öffnungen, durch die die Testkissen und das HDL- Untersuchungselement sichtbar sind. Entsprechend enthält das HDL- Untersuchungselement Reagenzien, die bei der Anwesenheit von HDL- Cholesterin eine Änderung in dem HDL-Untersuchungselement produzieren, die optisch detektiert werden kann. Daher wird der HDL-Gehalt in der Blutprobe be vorzugt unter Verwendung von Farbreaktionen bestimmt, die leichter ausgewertet werden können.

Bevorzugt werden das Reagenskissen sowie das HDL-Untersuchungselement wie eine asymmetrische polymerische Membran bereitgestellt, die eine Oberfläche kleinerer Poren und eine entgegengesetzte Oberfläche größerer Poren aufweisen, wobei die Oberfläche größerer Poren des HDL-Untersuchungselements in Rich tung des Reagenskissens gerichtet ist.

Weiterhin gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Reagens zum gezielten Entfernen von Nicht-HDL-Lipoproteinen aus der Blutprobe immobilisiert bzw. festgesetzt in dem Reagenskissen.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung um fasst das HDL-Untersuchungselement einen Biosensor. Bevorzugt ist der Biosen sor wirkungsvoll, um die Produktion von Sauerstoff oder Wasserstoffperoxyd elektrochemisch zu messen, die umgekehrt abhängig ist von der HDL- Konzentration im Cholesterin innerhalb der flüssigen Probe. Zusätzliche Untersu chungselemente können ebenfalls Biosensoren aufweisen, die wirkungsvoll bei der elektrochemischen Messung der Produktion von Sauerstoff oder Wasserstoff peroxyd sind, die im Gegensatz abhängig ist von der Analytenkonzentration in nerhalb der flüssigen Probe.

Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Messung des Serumcholesterins in Verbindung mit Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) in einer flüssigen Blutprobe bereit, die ebenfalls Lipoproteine niedriger Dichte (LDL) oder Lipoproteine sehr niedriger Dichte (VLDL) enthält. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Aufbringen der flüssigen Blutprobe auf eine Probenvertei lungsmatrix; Führen der flüssigen Blutprobe durch ein Reagenskissen, das ein wirksames Reagens enthält zum gezielten Entfernen von Nicht-HDL- Lipoproteinen aus der flüssigen Blutprobe; und Bestimmen des Gehalts an HDL- Lipoproteinen in der flüssigen Blutprobe durch ein HDL-Untersuchungselement, in dem die HDL-Konzentration untersucht werden kann, wobei der Flüssigkeits kontakt gezielt zwischen der Probenverteilungsmatrix und dem Reagenskissen, das mit dem HDL-Untersuchungselement verbunden ist, hergestellt werden kann.

Wie bereits oben beschrieben, realisiert die vorliegende Erfindung ein anderes Konzept verglichen mit dem Stand der Technik. Es ist durch die wesentlichen Merkmale gekennzeichnet, dass die Probenpräparation sowie die HDL- Bestimmung in getrennten Schritten ausgeführt werden. Der Präparationsschritt gewährleistet, dass die biologische Flüssigkeit, beispielsweise die Blutprobe, vor bereitet und an den nachfolgenden HDL-Bestimmungsschritt angepasst ist. Die Probenvorbereitung beinhaltet beispielsweise das Filtern von zellulären Blutbe standteilen sowie das Speichern der Blutprobe und das Anpassen der Blutprobe an die Testerfordernisse/-bedingungen, wie beispielsweise Temperatur, Druck und umgebende Atmosphäre. Der HDL-Bestimmungsschritt realisiert ein zeiteffizi entes Entfernen, d. h. Ausfällen oder Binden, der Nicht-HDL-Bestandteile und zusätzlich eine verlässliche HDL-Quantifizierung. Durch diese Maßnahme wird der zeitliche Kontakt der Blutprobe mit den verschiedenen Reagenzien vermindert und jede chemische Störung mit der HDL-Bestimmung wird verhindert. Weiter hin wird die Blutprobe nicht in einem kleinporigen Träger zum Filtern gespei chert, weil der HDL-Bestimmungsschritt in einer kurzen Zeitspanne ausgeführt wird.

Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Messen des Serumcholesterins mit Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) in einer flüssigen Blutprobe offenbart, die ebenfalls Lipoproteine niedriger Dichte (LDL) oder Lipoproteine sehr niedriger Dichte (VLDL) enthält. Das Ver fahren umfasst die folgenden Schritte: In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer absorbierenden Probenverteilungsmatrix, durch die die Probe auf eine oder meh rere Probensammelorte verteilt wird; In-Kontakt-Bringen eines solchen Proben sammelortes mit einer ersten Oberfläche eines Reagenskissens, in das die Probe transportiert wird, wobei das Reagenskissen ein Reagens wirksam zum gezielten Entfernen von Nicht-HDL-Lipoproteinen aus der Blutprobe enthält, wobei an der gegenüberliegenden Oberfläche des Reagenskissens ein gleichzeitiger Kontakt mit einem HDL-Untersuchungselement realisiert ist, in dem die HDL- Konzentration untersucht werden kann, so dass sich aufeinanderfolgende Proben volumina von diesem Reagenskissen zu dem HDL-Untersuchungselement bewe gen und der Gehalt an HDL-Cholesterin in dieser Probe durch optische Bestim mung an dem HDL-Bestimmungselement festgestellt werden kann.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Schritt zum Unterbrechen des Kontaktes zwischen dem Probensammelort und dem Reagenskissen eingearbeitet, wenn eine bestimmte Probenmenge übertragen worden ist.

Durch die obigen Maßnahmen wird einerseits eine effektive Probenverteilung realisiert und andererseits ist ein Überladen der entsprechenden Kissen verhindert.

Weiterhin bevorzugt umfasst das Reagenskissen und das HDL- Untersuchungselement eine asymmetrische polymerische Membran mit einer Oberfläche kleinerer Poren und einer gegenüberliegenden Oberfläche größerer Poren, wobei das Reagenskissen derart orientiert ist, dass seine Oberfläche kleine rer Poren zu dem HDL-Untersuchungselement zeigt. Die Oberfläche größerer Poren des HDL-Untersuchungselements zeigt zu dem Reagenskissen.

Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Biosensor zur Bestimmung des HDL-Gehalts der flüssigen Blutprobe verwendet, der in dem HDL-Untersuchungselement, wie oben beschrieben, ent halten ist.

Diese und andere Ziele und Merkmale der Erfindung werden beim Lesen der fol genden detaillierten Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den beglei tenden Zeichnungen klarer.

3. Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Seitenansicht einer Mehrfachanalyten- Untersuchungsvorrichtung, die in Übereinstimmung mit einer Ausfüh rungsform der Erfindung konstruiert ist;

Fig. 2 ist eine perspektivische Explosionsansicht einer Mehrfachanalyten- Untersuchungsvorrichtung, die in Übereinstimmung mit einer Ausfüh rungsform der Erfindung konstruiert wurde; und

Fig. 3 ist eine Querschnittsansicht von zwei, in Kontakt stehenden, asymme trischen Membranen zur Verwendung als Fällungsreagenskissen und HDL-Untersuchungselement in einer Ausführungsform der Erfindung, gezeigt in einer bevorzugten Orientierung.

4. Detaillierte Beschreibung der Erfindung I. Untersuchungsvorrichtung

Fig. 1 und 2 illustrieren zwei Ausführungsformen einer Mehrfachanalyten- Untersuchungsvorrichtung 14, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Er findung, wie sie in Fig. 2 in einer Explosionsansicht gezeigt ist, konstruiert ist. Die Vorrichtung ist konstruiert insbesondere zur Bestimmung von Serumcholeste rin in Verbindung mit HDL (auf das ebenfalls als mit HDL verknüpftes Choleste rin oder einfach HDL-Cholesterin Bezug genommen wird) unter Verwendung einer kleinvolumigen Blutprobe, typischerweise zwischen 10 bis 50 µl Blut. An dere Untersuchungen, wie beispielsweise auf den Gesamtcholesterin- oder den Triglyceridgehalt, können gleichzeitig an der gleichen Probe durchgeführt wer den. Auf die Bestimmung des mit HDL verknüpften Cholesterins kann einfacher weise als Bestimmung von HDL oder als eine HDL-Untersuchung Bezug ge nommen werden.

Die Vorrichtung umfasst einen Hauptkörper oder Unterstützer 15, der einen Be hälter 16 definiert, der zum Aufnehmen einer Menge einer Blutprobe dimensio niert und in Größe eingestellt ist, die typischerweise zwischen ungefähr 25 bis 50 µl liegt. Der Behälter ist in Flüssigkeitskontakt mit einer Siebmatrix 22, die in einer gekerbten Region 20 ausgeformt in einer oberen Kante des Unterstützers untergebracht sein kann. Der Flüssigkeitskontakt kann direkt sein oder, wie es in der Vorrichtung gezeigt in Fig. 1 der Fall ist, bereitgestellt werden durch eine ka pillare Leitung 18, die in der Platte am Grund des Behälters ausgebildet ist. Der Unterstützer ist bevorzugt eine Plastikplatte mit dem Behälter, der gekerbten Re gion und/oder der Kapillarleitung, die durch formende oder maschinelle Stan dardverfahren ausgebildet wird.

Das in der Region 20 getragene Siebkissen 22 wirkt, um teilweise große Sub stanzbestandteile (einschließlich Blutzellen) zu entfernen, wenn die Probe die Kissenmatrix in einer Richtung von unten nach oben durchläuft, wie es in der Fi gur gezeigt ist. Das Kissen 22 ist bevorzugt aus einer Glasfasermatrix aus einem Material gebildet, das konstruiert ist, um wässrige Flüssigkeit durch Oberflächen benetzung zu ziehen und um die Bewegung der Blutzellen zu verzögern, wenn die Blutprobe durch die Matrix gezogen wird. D. h. das Kissen dient als ein chromato graphisches Medium zum Trennen zellgroßer Bestandteile von löslichen Serum komponenten auf der Grundlage unterschiedlicher Migrationsraten durch das Me dium. Ein Beispiel gebendes Kissen ist ein Glasfaserfilter, wie beispielsweise ein GF/D oder PD008-Filter, geliefert durch Whatman, der eine Packungsdichte von ungefähr 0,16 g/cm³ aufweist. Das Kissen wird mit seitlichen Dimensionen von ungefähr 3 × 8 mm zugeschnitten und weist eine Dicke von ungefähr 1 mm auf. Das Kissen ist ausgelegt, um ein definiertes Volumen einer flüssigen Probe zu absorbieren, bevorzugt zwischen ungefähr 10 bis 25 µl. Das Siebkissen 22 kann zusätzlich Reagenzien zum Einfangen roter Blutzellen enthalten, wie beispiels weise Lezithin für rote Blutzellen spezifische Antikörper, Proteine von Oberflä chenmembranen, Trombin oder Ionenaustauschagenzien.

Das Siebkissen 22 kontaktiert wiederum einen verlängerten Streifen oder eine Probenverteilungsmatrix 26, die sich entlang der oberen Kante der Platte 15 er streckt. Dieser Streifen kann ebenfalls durch Schaumpolsterungen 27 oder andere Unterstützer unterstützt werden, wie es in Fig. 2 gezeigt ist. Die Matrix 26 dient dem Verteilen der Probenflüssigkeit von einer zentralen Probenauftrageregion 28 des Streifens, der in Flüssigkeitskontakt mit dem Kissen 22 steht, zu gegenüber liegenden Probensammelregionen 30, 32, die an die Enden der Matrix angrenzen. Die Matrix wird bevorzugt aus Glasfasern gebildet. Die Packungsdichte und -dic ke der Matrix sind derart gewählt, um Volumina der Probenflüssigkeit, beispiels weise 10 bis 25 µl, die der Probenauftrageregion des Streifens zugeführt werden, zu absorbieren und auf die Probensammelregionen des Streifens zu verteilen. Die Matrix hat eine bevorzugte Packungsdichte zwischen ungefähr 0,16 g/cm³ und 4,0 g/cm³. Ein exemplarisches Streifenmaterial ist ein F-165-25A-Glasfaserfilter, der bei Whatman erhältlich ist und eine Packungsdichte von ungefähr 0,2 g/cm³, eine Breite von ungefähr 3 mm, eine Länge von ungefähr 3 cm und eine Dicke von ungefähr 0,12 mm aufweist.

Da die Probe nicht die Glasfasern des Siebkissens und der Probenverteilungsma trix bei Vorhandensein von Fällungs- oder Bindungsreagenzien kontaktiert, ist ein Beschichten, wie es in dem US-Patent 5,451,370 beschrieben ist, nicht erforder lich, um ein Anhaften des HDL zu verhindern. Wenn es jedoch gewünscht ist, können die Glasfasern beschichtet werden, beispielsweise mit 5 Gew.-% Po lyvinylalkohol.

Die Vorrichtung 14 umfasst ebenfalls einen Reaktionsbalken 60, der aus einer verlängerten Unterstützung 62 und mehreren benetzbaren absorbierenden Reakti onstestkissen 66, 68, 70 und einem HDL-Untersuchungselement 64 besteht, die an der unteren Oberfläche der Unterstützung an den gezeigten Positionen getragen werden. Die Unterstützung 62 ist transparent oder umfasst transparente Fenster, beispielsweise Fenster 76 (Fig. 2), die das Betrachten der Kissen und des HDL- Untersuchungselementes durch die Unterstützung gestatten. Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Unterstüt zung 62 Öffnungen, durch die die Kissen betrachtet werden können. Die Reakti onstestkissen in dem Reaktionsbalken sind an der Unterstützung durch ein trans parentes oder lichtdurchlässiges klebendes Material oder durch Ultraschall- Schweißen oder durch andere passende Verbindungsverfahren befestigt. Jedes in einer bestimmten Untersuchung verwendete Kissen enthält Analyt abhängige Reagenzien, die wirkungsvoll sind, um eine Analyt abhängige Veränderung in dem Kissen zu produzieren, die optisch entweder visuell oder durch einen Detek tor in einer bekannten Weise festgestellt werden kann, wie weiter unten beschrie ben wird. Alle oder jede integrale Teilmenge der Kissen kann für eine bestimmte Untersuchung genutzt werden.

Wünschenswerterweise sind die Reaktionstestkissen porös polymere Membranen, die bevorzugt eine Dicke von ca. 100 bis 150 µm und seitliche Abmessungen von ungefähr 3 mm aufweisen. Das Absorptionsvolumen jedes Kissens befindet sich bevorzugt zwischen ungefähr 0,5 bis 1 µl. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Reaktionskissen und insbesondere das HDL-Untersuchungselement 54, das für die HDL-Untersuchung verwendet wird, asymmetrische Membranen, d. h. Membrane mit einem Porositätsgradienten über die Dicke der Membran, wie es weiter unten beschrieben ist.

Der Reaktionsbalken ist an dem Unterstützer 15 durch Befestigungsmittel befe stigt, die effektiv sind, um (a) die Vorrichtung in einer Probenverteilungsposition zu halten, wobei die Testkissen und die Reagenskissen von der Matrix beabstan det sind, und (b) um die Vorrichtung in eine Testposition zu bewegen, wo das HDL-Untersuchungselement in Kontakt mit dem Reagenskissen platziert ist (oder in Kontakt gehalten wird, wenn die zwei Kissen aneinander befestigt sind) und wo das Reagenskissen gleichlaufend oder nachfolgend in Kontakt mit der Matrix 26 an einem Probensammelort gebracht wird. Die Befestigungsmittel können eben falls zum Unterbrechen eines solchen Kontaktes genutzt werden, nachdem eine gewünschte Probenmenge in die Testkissen und das HDL-Untersuchungselement 64 eingetreten ist und/oder nach einer bestimmten Kontaktzeit, indem die Vor richtung von der Testposition zu einer Position bewegt wird, in der die Testkissen, das HDL-Untersuchungselement 64 und die Reagenskissen von der Matrix beab standet sind (die die gleiche wie die Probenverteilungsposition sein kann). Eine solche Bewegung kann durch die Überwachung des Reflektionsvermögens an der oberen Oberfläche des Testkissens gesteuert werden, die den Grad der Benetzung reflektiert, wie es in dem US-Patent 5,114,350 beschrieben ist. Wenn alternativ die Absorptionskapazität und die Rate der Probenaufnahme des Kissenmaterials bekannt sind, kann die Probenmenge mit ausreichender Genauigkeit einfach über die Verwendung einer vorbestimmten Kontaktzeit gesteuert werden.

Die Befestigungsmittel können beispielsweise ein Paar federnder Elemente um fassen, wie zum Beispiel elastomerische Blöcke 71, 72, die bewirken, dass die Kissen in eine Nicht-Übertragungs- oder Probenverteilungsposition vorgespannt sind, in der die Kissen von der Probenverteilungsmatrix beabstandet sind mit ei nem typischen Abstand von ungefähr 0,5 bis 1 mm. Durch Zusammendrücken oder Lösen der federnden Elemente kann ein Kontakt zwischen der Probenvertei lungsmatrix 26 und dem Reagenskissen 74 und dem HDL-Untersuchungselement 64 gezielt hergestellt oder getrennt werden. Die Unterstützungsblöcke können mittels Federn oder einem kolbenähnlichen Vorgang komprimiert werden. Alter nativ können externe mechanische Vorrichtungen in den Hauptkörper 15 und/oder die Unterstützung 62 eingreifen und einen zum anderen bewegen. Solche Vor richtungen können konventionelle Komponenten, wie beispielsweise Klemmen, Kolben, Schrittmotoren, Schneckengetriebe oder dergl. umfassen. Ein Beispiel gebendes System ist der Cholestech-LDX®-Analysierer, ein in sich abgeschlosse ner, automatisierter Analysierer, der vorteilhaft bei der Verwendung mit den hierin beschriebenen Untersuchungsvorrichtungen ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist an dem HDL-Untersuchungselement 64, das an einer beliebigen Position platziert und zum Untersuchen von HDL verwendet wird, ein Reagenskissen 74 befestigt, wie es in den Figuren gezeigt ist. Alternativ kann ein solches Reagenskissen 74 auch in einer im Wesentlichen ko planaren Position zwischen dem HDL-Untersuchungselement 64, mit dem es in direktem Kontakt oder nicht stehen kann, und einer Probensammelregion der Ma trix 26 unterstützt sein. Beispielsweise kann ein kompressibles Unterstützungs element das Reagenskissen oberhalb der Matrix unterstützen, so dass eine Bewe gung des Reaktionsbalkens in Richtung des Hauptkörpers (oder umgekehrt) zuerst das HDL-Untersuchungselement 64 in Kontakt mit der oberen Oberfläche des Reagenskissens 74 bringen würde, und dann die untere Oberfläche des Rea genskissens in Kontakt mit der Probenverteilungsmatrix bringen würde. Das Rea genskissen hat eine bevorzugte Dicke von ungefähr 100 bis 150 µm, seitliche Abmessungen von ungefähr 3 mm und ein Absorptionsvolumen von ungefähr 0,5 bis 1,0 µl.

Das Reagenskissen 74, das bevorzugt in Kontakt mit dem HDL- Untersuchungselement 64 steht, enthält ein Reagens, das zum gezielten Entfernen von LDL- und VLDL-Teilchen aus der flüssigen Probe verwendet wird. Solche Reagenzien, die im Stand der Technik als Fällungsmittel bekannt sind, umfassen polyanionische Verbindungen, wie z. B. sulfonierte Polysacharide, Heparin oder Phosphorwolframat, bei Anwesenheit von Kationen der zweiten Hauptgruppe, wie beispielsweise Mg²⁺, Mn²⁺ und Cr²⁺. Ein bevorzugtes Reagens ist ein sulfoniertes Polysacharid, wie beispielsweise Dextransulfat, das ein typisches Molekularge wicht von 50.000 bis 500.000 Daltons aufweist, in Verbindung mit Magnesiuma cetat oder Chlorid und gepuffert, um den neutralen pH-Wert aufrecht zu erhalten.

Das Reagenskissen ist wirksam, um gebundene oder ausgefällte Nicht-HDL- Lipoproteine innerhalb des Reagenskissens einzufangen/festzuhalten und um zu verhindern, dass sie in das HDL-Untersuchungselement 64 eintreten. Während ein Glasfaserfilter für einen solchen Zweck genutzt werden kann, sollte ein solcher Glasfaserfilter beschichtet sein, um das Anbinden an HDL bei Vorhandensein der Reagenzien zu verhindern, wie es in dem oben zitierten US-Patent 5,451,370 be schrieben ist. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Reagenskissen 74 aus einer porösen polymerischen Membran, wie es weiter unten beschrieben ist.

Das Reagenskissen enthält Reagenzien zum selektiven Entfernen von Nicht-HDL- Lipoproteinen, wie oben beschrieben. In einer Ausführungsform ist eine Membran mit solchen Reagenzien imprägniert. Beispielsweise ist eine asymmetrische Poly sulfonmembran, wie sie unten beschrieben ist, mit einer wässrigen Lösung mit Dextransulfat und einem Magnesiumsalz imprägniert und getrocknet, wie bei spielsweise Magnesiumacetat. Ein Beispiel gebendes Verfahren zum Herstellen solcher Membranen zum Einbau in die Vorrichtung ist in Beispiel 1 beschrieben. In diesem Fall werden die löslichen Fällungsmittel in der Probenlösung freige setzt, wenn sie in die Membran eindringt.

In einer anderen Ausführungsform sind die Reagenzien in der Membran immobi lisiert oder festgesetzt. Bevorzugt wird das negativ geladene Reagens, beispiels weise Dextransulfat durch elektrostatische Kräfte und/oder kovalent an einer Membran mit positiv geladenen Oberflächengruppen immobilisiert oder festge setzt. Ein Beispiel gebendes Material für diesen Zweck ist eine Nylonmembran mit quaternären Ammoniumoberflächengruppen, wie beispielsweise die AM080- Membran der Fa. Cuno Corp. (Meridian, CT).

In diesem Fall wirkt die Membran als ein affines Trennungsmodul, so dass Nicht- HDL-Lipoproteine eher an das Reagens gebunden werden, das an der Membran befestigt ist, als ausgefällt zu werden, so dass sie dadurch von der flüssigen Probe getrennt werden.

Andere kommerzielle polymerische Membranen mit einer kationischen Oberflä che weisen die Immobilon-Ny+™ (Millipore Corp., Bedford, MA), Zetabind® (auch von der Cuno Corp.), GeneScreen® (NEN/DuPont, Boston, MA), Hybond N+ (Amersham, Piscataway, NJ) und Posidyne® (Pall Corp., Glen Cove, NY). U.S.-Patent 5,543,054 (Charkoudian et al.) beschreibt ein Verfahren zum kova lenten Binden negativ geladener Kohlenhydrate an eine Membran mit reaktiven Anteilen in der Nähe der positiv geladenen Anteile an ihrer Oberfläche. Die Membran ist beispielsweise ein poröses Polymer, z. B. Polytetrafluorethylen, Po lyvinylidenfluorid, Polyester, Polyamid, Polycarbonat, Polypropylen, Polyme thylmethakrylat, Polymethakrylat, Polysulfon oder Polystyren, das mit Hercules R-4308™, einem Polyamido-Polyamine-Epichlorohydrin-Harz beschichtet ist.

In einer Ausführungsform besteht das Reagenskissen 74 aus einer asymmetri schen Membran, d. h. einer Membran mit einem Gradienten in der Porengröße über ihre Dicke. Eine asymmetrische Membran ist insbesondere bei der Verwen dung in Verbindung mit Fällungsmitteln, die in löslicher Form in die Membran eingearbeitet sind, bevorzugt, um ein optimales Festhalten des Fällungsproduktes zu gewährleisten. Die Herstellung von asymmetrischen Membranen ist beispiels weise in dem US-Patent 4 620 563, 5 171 445, 5 886 059, 5 536 408, 5 562 826 und 4 774 192, in D. R. Lloyd, "Materials Science of Synthetic Membranes", ACS Symposium 269: 1-21 (1985) beschrieben. Sie sind kommerziell in einer Vielzahl von Porengrößen und Porengrößenverhältnissen erhältlich. Die Herstellungsmate rialien umfassen Polysulfone, Polyethersulfone, Polyamide, Polyetheramide, Polyu rethane, Zelluloseacetat, Polyvinylpyrrolidon, Polystyrene und modifizierte Polysty rene sowie Mischungen, Kopolymere und laminare Verbundstoffe. Eine Beispiel gebende asymmetrische Membran ist eine Polysulfon- oder Polyethersulfonmem bran, wie die FILTERITE™ Membrane, die durch USF Filtration and Separations (San Diego, CA) bereitgestellt wird. Minimale Porengrößen befinden sich typi scherweise in dem Bereich von 0,01 bis 1,0 µm mit maximal zu minimal Porenver hältnissen bis zu 100 oder mehr. Die Dicke beträgt typischerweise 100 bis 150 µm.

Die asymmetrische Membran ist bevorzugt mit ihrer großporigen Oberfläche in Richtung der Probenauftrageregion orientiert, d. h. sie ist in den Fig. 1 und 2 ab wärts gerichtet und ihre kleinporige Oberfläche ist gerichtet auf und kontaktiert be vorzugt ein Reaktionstestkissen, beispielsweise das HDL-Untersuchungselement 64, das Reagenzien zum Untersuchen des HDL-Gehalts enthält, wie es weiter unten beschrieben ist. Diese Orientierung gestattet einen freien Zugang der Probe in das Kissen durch die größeren Poren und verhindert den Durchgang von ausgefälltem Material, das durch den Kontakt der Lösung mit dem löslichen Fällungsmittel gebil det wurde mittels der kleineren Poren, die für gewöhnlich in ihrem Durchmesser 1 µm oder kleiner sind. Diese Porengröße ist ebenfalls für nicht asymmetrische Mem branen bevorzugt.

In einer Ausführungsform besteht das Reagenskissen 74 aus einer Einzelmembran. Die Erfindung beinhaltet ebenfalls die Verwendung von mehrfach gestapelten Membranen als Reagenskissen 74, d. h. bis zu ungefähr 6, wo zumindest eine oder bevorzugt jede Membran Reagenzien zum Binden oder Ausfällen von Nicht-HDL- Lipoproteinen enthält. Sie können immobilisierte oder festgehaltene Reagenzien, wie oben beschrieben, enthalten oder sie können mit löslichen Reagenzien imprägniert sein. Im letzteren Fall sind asymmetrische Membranen bevorzugt und sie sind be vorzugt derart orientiert, dass die Oberfläche mit kleineren Poren der obersten Mem bran in Richtung des HDL-Untersuchungselements 64 orientiert ist und dass die Oberfläche mit den größeren Poren der untersten Membran in Richtung der Proben auftrageregion orientiert ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das HDL-Untersuchungselement 64 eben falls eine polymerische Membran mit Reagenzien zum Untersuchen des HDL- Gehalts und sie kann eine asymmetrische Membran sein, wie oben beschrieben. Um eine gleichförmige Oberfläche zum optischen Abtasten und Quantifizieren der Un tersuchungsergebnisse zu präsentieren, ist die für das HDL-Untersuchungselement 64 verwendete asymmetrische Membran mit ihrer kleinerporigen Oberfläche auf wärts zeigend orientiert und ihre größerporige Oberfläche ist in Richtung des Rea genskissens 74 gerichtet.

Alternativ kann eine für das HDL-Untersuchungselement 64 genutzte asymmetri sche Membran mit ihrer größerporigen Oberfläche aufwärts gerichtet und mit ihrer kleinerporigen Oberfläche zu dem Reagenskissen gerichtet orientiert sein. Die Ori entierung ist für Untersuchungen geeigneter, in denen ein visuelles, qualitatives Le sen von der oberen Oberfläche durchgeführt wird.

Wenn gewünscht, können die HDL-Untersuchungsreagenzien, wie beispielsweise Peroxidase, in der Membran des HDL-Untersuchungselements immobilisiert oder festgesetzt sein gemäß gut bekannten Verfahren zur Enzymimmobilisierung. (Siehe z. B. U.S. Patent 4,999,287; U.S. Patent 5,419,902; Blum, L. J. et al., Anal. Lett. 20(2): 317-26 (1987); Kiang, S. W. et al., Clin. Chem. 22(8): 1378-82 (1976); Guil bault, G. G., Ed., Modern Monographs in Analytical Chemistry, Vol. 2: Analytical Uses of Immobilized Enzymes (1984); Torchilin, V. P., Progress in Clinical Bio chemistry and Medicine, Vol. 11: Immobilized Enzymes in Medicine (1991). In einer anderen Ausführungsform kann ein Reagens, wie beispielsweise Katalase, in dem Reagenskissen 74 enthalten sein, das wirksam ist zum Abbauen jedes er zeugten Wasserstoffperoxyds, das von dem HDL-Untersuchungselement 64 ab wärts diffundieren kann.

In einer bevorzugten Ausführungsform, in der jeweils zwei verbundene polymeri sche Membranen für das HDL-Untersuchungselement 64 und das Reagenskissen 74 genutzt werden, sind die geeigneten Reagenzien imprägniert oder immobili siert und die Membranen werden als eine Zwei-Membran-Schicht in die Untersu chungsvorrichtung während der Herstellung eingebaut. Eine beispielhafte Zwei- Membran-Schicht, die zwei asymmetrische Membranen aufweist, ist im Quer schnitt in Fig. 3 gezeigt, wobei eine bevorzugte Orientierung mit den größeren Poren mit dem Bezugszeichen 78 und den kleineren Poren mit dem Bezugszei chen 80 gezeigt ist.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das HDL- Untersuchungselement 64 einen Biosensor, wie er beispielsweise in der PCT- Anmeldung WO 99/58966 (Dobson et al.) beschrieben ist, die hierin durch Refe renz aufgenommen ist. Dieses Dokument offenbart eine Biosensorvorrichtung im Mikromaßstab umfassend eine leitende Oberfläche, eine Schicht dielektrischen Materials der leitenden Oberfläche überlagert und eine Vielzahl von Poren, die sich durch die dielektrische Schicht erstrecken. Jede der Poren kann durch die Wirkung eines Biopolymers innerhalb der Pore in Kontakt mit der leitenden Ober fläche als eine Mikroelektrode durch Umwandeln einer chemischen Antwort in ein elektrisches Signal agieren. Bei der Verwendung wird eine Flüssigkeit mit einem zu untersuchenden Analyten auf die Poren aufgebracht, so dass sie in Kontakt mit dem Biopolymer ist. In der vorliegenden HDL- Untersuchungsvorrichtung kann dies durch das Platzieren des Reagenskissens 74 in Flüssigkeitskontakt mit dem HDL-Untersuchungselement 64, d. h. mit der Po ren enthaltenden Oberfläche des Biosensors, erzielt werden.

Eine Gegenelektrode wird bereitgestellt, die in elektrischem Kontakt mit der lei tenden Oberfläche über die Probenflüssigkeit steht. Eine Spannung wird zwischen der Gegenelektrode und der leitenden Oberfläche angelegt und der dazwischen fließende Strom wird gemessen. Der gemessene Strom zeigt an, welcher Gehalt eines gewählten Analyten in der untersuchten Flüssigkeit enthalten ist.

Die Mikroelektroden arbeiten bevorzugt als strommesstechnische Biosensoren. Kurz gesagt funktioniert ein strommesstechnischer Biosensor durch die Produkti on eines Stroms, wenn ein Potential zwischen zwei Elektroden angelegt wird. Ein Beispiel ist die Clark-Sauerstoffelektrode, die den durch die Reduktion des Sauer stoffs oder die Oxidation des Wasserstoffperoxyds produzierten Strom misst.

Die Abhängigkeit solcher Biosensoren von der gelösten Sauerstoffkonzentration kann durch die Verwendung von "Vermittlern" überwunden werden, die die Elektronen direkt an die Elektrode übertragen, wobei die Reduktion des Sauer stoffkosubstrats umgangen wird. Metallozen repräsentiert eine allgemein genutzte Familie von Vermittlern.

Das Biopolymer innerhalb der Poren der Mikroelektrode ist typischerweise ein Enzym, beispielsweise für die Messung von HDL in Verbindung mit Cholesterin, Cholesterinoxidase. Cholesterin wird durch Cholesterinoxidase zu einem entspre chenden Keton oxidiert, wobei Wasserstoffperoxyd freigesetzt wird, das dann in Wasser und Sauerstoff durch das Enzym Peroxidase umgesetzt werden kann. Entweder Sauerstoff oder Wasserstoffperoxyd wird dann elektrochemisch an dem Biosensor gemessen.

II. Untersuchungsverfahren

Im Betrieb wird eine Blutprobe in dem Behälter 16 platziert und aufgrund kapilla rer Wirkung durch die Siebmatrix 22 gesaugt, wo große Teilchen einschließlich roter Blutzellen entfernt werden und folglich in die Probenverteilungsmatrix 26 gelangen. Diese Schritte finden statt, während sich die Vorrichtung in einer Pro benverteilungsposition befindet, derart, dass die Probenverteilungsmatrix nicht das Reagenskissen oder die Testkissen oder das HDL-Untersuchungselement kontaktiert. Wenn die Serumprobe die Probensammelorte erreicht, wie beispiels weise die Orte 30 und 32 angrenzend an die Enden der Matrix 26, wird die Vor richtung auf eine Testposition eingestellt, bevorzugt durch das Bewegen des Re aktionsbalkens 60, um die Testkissen 66, 68 und 70 und das Reagenskissen/HDL- Untersuchungselement 74/64 (in der Ausführungsform gezeigt in den Figuren) in Kontakt mit der Matrix zu bringen. In dieser Position wird die Probenflüssigkeit in der Matrix durch kapillaren Fluss in jedes kontaktierte Kissen gezogen, wobei die Flüssigkeitsbewegung in einer Richtung normal zu den Kissenoberflächen stattfindet. Die Platte wird in dieser Position gehalten, bis ein gewünschter Grad der Benetzung der Kissen erzielt wurde. Die Platte wird dann bewegt, wenn es gewünscht ist, um den Kontakt zwischen der Probenverteilungsmatrix und den Testkissen/dem HDL-Untersuchungselement und dem Reagenskissen zu unter brechen, wenn ein gewünschter Gehalt an Probenflüssigkeit in die Testkissen/das HDL-Untersuchungselement eingetreten ist und/oder nach einer geeigneten Kon taktzeit, beispielsweise wie in Beispiel 2 unten beschrieben.

In Ausführungsformen der Vorrichtung, in denen das Reagenskissen 74 nicht an dem HDL-Untersuchungselement 64 befestigt ist, wird zuerst das HDL- Untersuchungselement 64 durch die jeweilige Bewegung des Reaktionsbalkens und des Hauptkörpers zueinander, typischerweise durch das Bewegen des Reakti onsbalkens abwärts, mit dem Reagenskissens 74 in Kontakt gebracht, um die An ordnung der in den Figuren gezeigten Elemente anzunähern und die weitere Be wegung platziert dann das Reagenskissen in Kontakt mit der Probenverteilungs matrix. Der Kontakt wird aufrechterhalten bis ein gewünschter Grad an Benet zung erzielt wurde, wie oben beschrieben. In einer weiteren bevorzugten Ausfüh rungsform der Vorrichtung ist das Reagenskissen 74 in direktem Kontakt mit dem HDL-Untersuchungselement 64. Das genannte Reagenskissen 74 und das HDL- Untersuchungselement 64 werden mit der Probenverteilungsmatrix 26 durch ent sprechendes Bewegen des Reaktionsbalkens 60 in Richtung der Probenvertei lungsmatrix 26 in Kontakt gebracht.

Das Probenserum tritt in das Reagenskissen 74 ein und kontaktiert Fällungs- oder Bindungsmittel, die in der Membran enthalten sind, so dass Nicht-HDL- Lipoproteine gezielt ausgefällt und im Falle von löslichen Mitteln durch Filtration zurückgehalten werden, oder an die Membran gebunden werden im Falle von immobilisierten Reagenzien. Die Membran ist daher wirksam, um Nicht-HDL- Lipoproteine festzuhalten, während der Durchgang von Serum mit Flüssigphasen- HDL zu dem HDL-Untersuchungselement 64 gestattet ist. Das HDL- Untersuchungselement 64 enthält Reagenzien zur Quantifizierung von HDL in Verbindung mit Cholesterin. Bevorzugt enthalten diese Cholesterinesterase zum Lösen freien Cholesterins von HDL, Cholesterinoxidase zum Produzieren von H₂O₂ durch Reaktion mit freiem Cholesterin, Peroxidase und ein gekoppeltes Farbsystem, das bei Anwesenheit von Peroxidase und H₂O₂ als Reaktionsprodukt in ein unterscheidbares Farbsignal umgewandelt wird.

Während des Betriebs, wenn die Probenflüssigkeit den HDL-Untersuchungspfad passiert, umfassend die Kissen 74 und 64, läuft ihr führender Rand in einer Auf wärtsrichtung durch das Kissen 74, wo Nicht-HDL-Lipoproteine reagieren und festgehalten werden, und direkt zu dem angrenzenden Untersuchungskissen 64, wo HDL mit den Untersuchungsreagenzien darin reagiert zur Messung von HDL in Verbindung mit Cholesterin. Weitere Bestandteile der Probe sind weiterhin in Kontakt mit dem Kissen 74 während dieser Zeit und bewegen sich von dem Kis sen 74 zu dem Kissen 64 in gleicher Weise, bis die Aufnahmekapazität des Kis sens 74 erreicht ist. Demgemäss erfolgt die Quantifizierung des HDL in Verbin dung mit Cholesterin in dem HDL-Untersuchungselement gleichlaufend mit der Fällungs- oder Bindungsreaktion, die in dem Reagenskissen 74 stattfindet. Bevor zugt ist das von der Probenverteilungsmatrix über den HDL-Untersuchungspfad (umfassend das Kissen 74 und das Element 64) übertragene Volumen der Proben flüssigkeit gleich oder größer als die Absorptionskapazität des HDL- Untersuchungselements 64 und kleiner als oder gleich der kombinierten Absorpti onskapazität des HDL-Untersuchungselements 64 und des Reagenskissens 74.

Die verbleibenden Testkissen enthalten ebenfalls Untersuchungsreagenzien, die eine Änderung in dem Kissen produzieren, die optisch entweder visuell oder durch einen Detektor in einer bekannten Weise bestimmt werden kann. Ein Vor teil der bestehenden Vorrichtung und des Verfahrens ist, dass der Probenvertei lungspfad keine Nicht-HDL ausfällenden oder bindenden Reagenzien enthält, weil solche Reagenzien nur in dem Reagenskissen 74 vorhanden sind. Daher wird die Möglichkeit der Störung durch diese Reagenzien bei der Untersuchung von anderen als den HDL-Analyten eliminiert.

Bevorzugt enthält jedes der Testkissen Reagenskomponenten zum Umwandeln von H₂O₂ in ein Farbsignal als Reaktionsprodukt. Solche Komponenten umfassen Peroxidase und ein gekoppeltes Farbsystem, das durch die Peroxidase bei Anwe senheit von H₂O₂ in ein unterscheidbares Reaktionsprodukt als Farbsignal umge wandelt wird. Enzymatische Farbreaktionen, die eine Vielzahl von substratspezi fischen Oxidasen zum enzymatischen Erzeugen von H₂O₂ und nachfolgender Oxidation einer Farbe zum Bilden eines farblichen Reaktionsproduktes verwen den, sind gut bekannt.

Bevorzugt gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält jedes Testkissen und das HDL-Untersuchungselement Reagenskompo nenten zum Produzieren von H₂O₂ über die Reaktion des Analyten mit einem En zym, wobei das H₂O₂ nachfolgend ein Substratreagens in ein Reaktionsprodukt als Farbsignal umwandelt oder indem das H₂O₂ elektrochemisch, wie oben beschrie ben, gemessen wird.

Eine Vorrichtung mit vier oder mehr Reaktionskissen kann zur gleichzeitigen Messung von HDL-Cholesterin (HDL), Glykose, Gesamtcholesterin (TCh) und Triglyceridlipid (TG) verwendet werden. Jedes Kissen enthält die Komponenten des oben beschriebenen allgemeinen Durchlaufs (Peroxidase und ein gekoppeltes Farbsystem), so dass das erzeugte H₂O₂ ein Reaktionsprodukt als ein unter scheidbares Farbsignal produziert. Das Testkissen für Gesamtcholesterin, das dem Serum ohne den Kontakt mit einem Fällungs- oder Bindungsreagens ausgesetzt ist, und das HDL-Untersuchungselement 64 umfassen jeweils in Ergänzung zu den allgemeinen Durchlaufkomponenten Cholesterinesterase zum Lösen vere sterten Cholesterins in freier Cholesterinform aus den Serumlipoproteinen umfas send HDL-, LDL- und VLDL-Teilchen, und Cholesterinoxidase zum Produzieren von H₂O₂ durch die Reaktion mit freiem Cholesterin in der Probenflüssigkeit, wie oben beschrieben. Das Glykoseuntersuchungskissen umfasst Glykoseoxidase in Ergänzung zu den allgemeinen Durchlaufkomponenten. Das Triglyceridkissen umfasst in Ergänzung zu den allgemeinen Durchlaufkomponenten Lipase, L- Glycerolkinase und L-Glycerol-3-Phosphatoxidase zum Erzeugen von H₂O₂ aus Triglycerid über die Zwischenverbindung L-Glycerol-3-Phosphat. Die in das TG- Kissen gezogene Serumprobe wird nicht Fällungs- oder Bindungsreagenzien aus gesetzt und enthält daher alle Serumlipoproteine, so dass das TG-Signal das ge samte Serumtriglycerid repräsentiert.

Referenz-Standardkissen können ebenfalls verwendet werden, siehe beispielswei se das in dem US-Patent 5 114 350 beschriebene System, das hierin durch Refe renz aufgenommen ist.

Wie oben bezeichnet, ist ein Vorteil der bestehenden Vorrichtung und des Verfah rens, dass die Probenverteilungsmatrix keine Nicht-HDL-Fällungs- oder Bin dungsreagenzien enthält, so dass die Reagenzien nur in dem Reagenskissen 74 vorhanden sind. Dadurch wird die Möglichkeit der Störung durch diese Reagenzi en bei der Untersuchung von Analyten, wie beispielsweise Gesamtserumcholeste rin und Gesamttriglycerid, eliminiert.

Beispiel 1 Vorbereitung einer Reagensmembran mit lösbaren Fällungsmitteln und HDL- Testmembran

Zum Präparieren einer Reagensmembran mit lösbaren Fällungsmitteln wird eine wässrige Lösung mit 1 mg/ml Dextransulfat (500.000 MW) und 12,5 mM Mg(OAc)₂ auf einer asymmetrischen Polysulfonmembran mit einer Breite von 0,22 Inch verteilt. Die Membrandicke beträgt 127 +/- 5 µm mit einem Blasen punkt von 85 +/- 5 pse. Das Reagens wird mit einer Rate von 16,6 ul/Inch verteilt und die Membran wird für 20 min bei 50°C in einem kontinuierlichen Rollenpro zess getrocknet. Längen von beispielsweise 100 Fuß werden auf diese Weise pro duziert und geschnitten, um zu den Untersuchungsvorrichtungen zu passen.

Um eine HDL-Reaktionsmembran zu präparieren wird eine ähnlich asymmetri sche Polysulfonmembran mit dem folgenden wässrigen Ansatz imprägniert: Cho lesterinoxidase 36,5 Einheiten/ml, Cholesterinesterase: 215 Einheiten/ml, Peroxi dase 200 Einheiten/ml, 4-Aminoantipyrine 1,88 µm/ml, und TOOS (3-[Ethyl(3- methylphenyl)amino]-2-hydroxy-propansulfonsäure) 12,05 µm/ml. Verteilungs rate und Trocknungszeit sind gleich der oben beschriebenen für die Reagensmem bran. Die zwei Membrane können getrennt (sequentiell) an dem Reaktionsbalken durch Ultraschall-Schweißen befestigt werden oder sie können gleichzeitig mit einem einzelnen Ultraschall-Schweißschritt befestigt werden.

Beispiel 2 Untersuchungsverfahren

Die folgenden Untersuchungen wurden in einem LDX®-Analysierer unter Ver wendung des Reagenskissens und des HDL-Untersuchungselements, die im We sentlichen wie in Beispiel 1 präpariert wurden, durchgeführt. Die Probe (35 µl Serum oder Vollblut) wurde auf den Probenbehälter aufgebracht und ihr wurde gestattet, sich für zwei Minuten durch die Probenverteilungsmatrix zu verteilen. Der Reaktionsbalken wurde dann für drei Sekunden mit der Matrix in Verbindung gebracht, was eine ausreichende Zeit zum Übertragen von ausreichend Serum ist, um das Reaktionskissen und das Testkissen/HDL-Untersuchungselement zu füllen (kombinierte Kapazität von ungefähr 1,5 µl), wobei nach dieser Zeit der Balken in seine Originalposition zurückbewegt wurde. Das Reflektionsvermögen wurde von der oberen Oberfläche des HDL-Untersuchungselements alle drei Sekunden für 150 Sekunden abgelesen, um das Fortschreiten der HDL-Untersuchungsreaktion zu überwachen. Der erhaltene minimale Reaktionswert wurde dann umgewandelt in mg/dL von HDL-Cholesterin gemäß einer zuvor festgelegten Kalibrierungskur ve.

Die unten angegebenen Konzentrationswerte (mg/dL) wurden von fünf Serum proben, wie oben beschrieben, mit Hilfe eines Beckman-Referenz-Analysierers analysiert und zeigen eine exzellente Korrelation.

Claims

1. Eine Untersuchungsvorrichtung (14) zum Messen von Serumcholesterin in Verbindung mit Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) in einer flüssigen Blutprobe, ebenfalls enthaltend Lipoproteine niedriger Dichte (LDL) oder Lipoproteine sehr niedriger Dichte (VLDL), wobei die Vorrichtung um fasst:

a) eine Probenverteilungsmatrix (26) zum Verteilen der flüssigen Blutprobe in der Untersuchungsvorrichtung (14);
b) ein ein Reagenz enthaltendes Kissen (74), das wirksam ist, um ge zielt Nicht-HDL-Lipoproteine aus der flüssigen Probe zu entfernen;
c) ein HDL-Untersuchungselement (64), in dem HDL- Konzentrationen untersucht werden können;
d) Mittel (60, 71, 72), um eine Verschiebung des gennannten HDL- Untersuchungselementes (64) von einer Probenverteilungsposition, bei der das HDL-Untersuchungselement (64) von der genannten Probenverteilungsmatrix (26) beabstandet ist, hin zu einer Testpo sition zu bewirken, bei der das HDL-Untersuchungselement (64) mit der Probenverteilungsmatrix (26) in Flüssigkeitskontakt steht;

dadurch gekennzeichnet, dass

a) das genannte Reagenskissen (74) und das genannte HDL- Untersuchungselement (64) in direktem Kontakt miteinander ange ordnet sind, und sowohl das Reagenskissen (74) als auch das HDL- Untersuchungselement (64) von der genannten Probenverteilungs position zu der genannten Testposition verschoben werden.

2. Untersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die genannten Ver schiebungsmittel (60, 71, 72) einen Reaktionsbalken (60) umfassen, der durch Befestigungsmittel (71, 72) an einem Hauptkörper (15) der Untersu chungsvorrichtung befestigt ist.

3. Untersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 2, die zusätzliche Testkissen (66, 68, 70) enthält, die zusammen mit dem Reagenskissen (74) und dem HDL-Untersuchungselement (64) an der unteren Oberfläche des Reakti onsbalkens (60) befestigt sind, derart, dass die zusätzlichen Testkissen (66, 68, 70) in Flüssigkeitskontakt mit der Probenverteilungsmatrix (26) ge bracht werden, wenn der Reaktionsbalken (60) in die Testposition bewegt wird, und dass der Flüssigkeitskontakt unterbrochen ist, wenn der Reakti onsbalken (60) in die Probenverteilungsposition bewegt wird.

4. Untersuchungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine untere Oberfläche des HDL-Untersuchungselements (64) an einer oberen Oberfläche des Reagenskissens (74) befestigt ist.

5. Untersuchungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probenverteilungsmatrix (26) mit einem Siebkissen (22) ver bunden ist.

6. Untersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 5, sofern er sich auf den An spruch 2 zurückbezieht, wobei der Hauptkörper (15) einen Behälter (16) zum Aufnehmen der Probe aufweist, der in Flüssigkeitsaustausch mit dem Siebkissen (22) und der Probenverteilungsmatrix (26) steht.

7. Untersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 6, wobei der Reaktionsbalken (60) optisch transparent ist oder optisch transparente Fenster oder Öffnun gen enthält, durch die die Testkissen (66, 68, 70)/das HDL- Untersuchungselement (64) sichtbar sind.

8. Untersuchungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das genannte Reagens ein sulfoniertes Polysacharid enthält.

9. Untersuchungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das HDL-Untersuchungselement (64) Mittel enthält, die bei Anwe senheit von HDL-Cholesterin eine Änderung in dem HDL- Untersuchungselement (64) produzieren, die optisch detektiert werden kann.

10. Untersuchungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reagenskissen (74) eine poröse polymerische Membran um fasst.

11. Untersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 10, wobei das Reagenskissen (74) eine asymmetrische polymerische Membran mit einer Oberfläche kleinerer Poren und einer gegenüberliegenden Oberfläche größerer Poren ist.

12. Untersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 11, wobei die Membran derart orientiert ist, dass ihre Oberfläche mit den kleineren Poren auf das HDL- Untersuchungselement (64) gerichtet ist.

13. Untersuchungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das HDL-Untersuchungselement (64) eine poröse polymerische Membran ist.

14. Untersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 13, wobei das HDL- Untersuchungselement (64) eine asymmetrische polymerische Membran mit einer Oberfläche kleinerer Poren und einer gegenüberliegenden Ober fläche größerer Poren ist.

15. Untersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 14, wobei die Membran derart orientiert ist, dass ihre Oberfläche größerer Poren in Richtung des Rea genskissens (74) orientiert ist.

16. Untersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 15, wobei das HDL- Untersuchungselement und das Reagenskisses (74) jeweils asymmetrische polymerische Membranen sind und wobei diese Membranen derart ge schichtet sind, dass die Oberfläche mit den kleineren Poren des Reagens kissens (74) die Oberfläche mit den größeren Poren, des HDL- Untersuchungselements (64) kontaktiert.

17. Untersuchungsvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reagens in dem Reagenskissen (74) immobilisiert/festgesetzt ist.

18. Untersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei das HDL- Untersuchungselement (64) einen Biosensor umfasst.

19. Untersuchungsvorrichtung gemäß Anspruch 18, wobei der Biosensor (64) wirksam ist, um die Produktion von Sauerstoff oder Wasserstoffperoxyd zu messen, die abhängig von der HDL-Konzentration in Verbindung mit dem Cholesterin innerhalb des Elements (64) ist.

20. Ein Verfahren zum Messen von Serumcholesterin in Verbindung mit Li poproteinen hoher Dichte (HDL) in einer flüssigen Blutprobe, ebenfalls enthaltend Lipoproteine niedriger Dichte (LDL) oder Lipoproteine sehr niedriger Dichte (VLDL), die folgenden Schritte aufweisend:

a) Aufbringen der flüssigen Blutprobe auf eine Probenverteilungsmat rix (26);
b) Führen der flüssigen Blutprobe durch ein ein Reagenz enthaltendes Kissen (74), das wirksam ist, um gezielt Nicht-HDL-Lipoproteine aus der flüssigen Blutprobe zu entfernen; und
c) Bewegen eines HDL-Untersuchungselements (64) zum Bestimmen des Gehalts an HDL-Lipoproteinen in der flüssigen Blutprobe von einer Probenverteilungsposition, bei der das HDL- Untersuchungselement (64) von der Probenverteilungsmatrix (26) beabstandet ist, hin zu einer Testposition, bei der das HDL- Untersuchungselement (64) mit der Probenverteilungsmatrix (26) in Flüssigkeitskontakt steht; dadurch gekennzeichnet, dass
das Kissen (74) und das HDL-Untersuchungselement (64) in di rektem Kontakt miteinander angeordnet sind, und sowohl das Kis sen (74) als auch das HDL-Untersuchungselement (64) von der Probenverteilungsposition zu der Testposition bewegt werden.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, gekennzeichnet durch weiterhin aufwei send den Schritt des Unterbrechens des Flüssigkeitskontaktes zwischen der Probenverteilungsmatrix (26) und dem Reagenskissen (74), wenn eine ge wünschte Probenmenge übertragen worden ist.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Rea genskissen (74) eine asymmetrische polymerische Membran mit einer O berfläche kleinerer Poren und einer gegenüberliegenden Oberfläche größe rer Poren umfasst.

23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Memb ran derart orientiert ist, dass ihre Oberfläche kleinerer Poren auf das HDL- Untersuchungselement (64) gerichtet ist.

24. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das HDL- Untersuchungselement (64) eine asymmetrische polymerische Membran mit einer Oberfläche kleinerer Poren und einer gegenüberliegenden Ober fläche größerer Poren ist.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Memb ran derart orientiert ist, dass die Oberfläche größerer Poren auf das Rea genskissen (74) gerichtet ist.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das HDL- Untersuchungselement (64) und das Reagenskissen (74) jeweils eine a symmetrische polymerische Membran ist und wobei die Membranen derart geschichtet sind, dass die Oberfläche kleinerer Poren des Reagenskissens eine Oberfläche größerer Poren des HDL-Untesuchungselements (64) kontaktiert.

27. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Rea gens, das wirksam ist, um gezielt Nicht-HDL-Lipoproteine zu entfernen, in dem Reagenskissen (74) immobilisiert/festgesetzt ist.

28. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das HDL- Untersuchungselement (64) einen Biosensor umfasst.

29. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosen sor (64) wirksam ist, um die Produktion von Sauerstoff oder Wasserstoff peroxyd zu messen, die abhängig ist von der HDL-Konzentration in Ver bindung mit Cholesterin innerhalb des Elements (64).