DE102015211394A1

DE102015211394A1 - Apparatus and method for extraction of nucleic acids

Info

Publication number: DE102015211394A1
Application number: DE102015211394.9A
Authority: DE
Inventors: wird später genannt werden Erfinder
Original assignee: AJ Innuscreen GmbH
Current assignee: IST Innuscreen GmbH
Priority date: 2015-06-19
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2016-12-22
Anticipated expiration: 2035-06-20
Also published as: DE102015211394B4

Abstract

Vorrichtung und Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren, umfassend einen Hohlkörper, vorzugsweise eine Pipettenspitze, durch den eine Flüssigkeit geleitet wird, dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Hohlkörper ein Material mit strukturierter Oberfläche so angeordnet ist, das es von einer Flüssigkeit umspült werden kann. Nach Lyse der Probe und Einstellung notwendiger Bindungsbedingungen für die Adsorption der Nukleinsäuren an das Trägermaterial wird der Ansatz mittels eines Pipettiervorganges am vertikal in der Pipettenspitze verbrachten nukleinsäurebindenden Material mehrmals „vorbei pipettiert“. Die Nukleinsäuren binden an das Material. Nachfolgend werden Waschpuffer ebenfalls am nukleinsäurebindenden Material „vorbei pipettiert“. Danach erfolgt ein Trocknungsschritt. Final wird das Elutionsmittel wiederum mehrmals am vertikal angeordneten nukleinsäurebindenden Material „vorbei pipettiert“ und dabei die gebundene Nukleinsäure abgelöst. Die Nukleinsäure liegt nun für notwendige downstream-Applikation vor.Device and method for extracting nucleic acids, comprising a hollow body, preferably a pipette tip, through which a liquid is passed, characterized in that in this hollow body, a material with a structured surface is arranged so that it can be lapped by a liquid. After lysis of the sample and adjustment of the necessary binding conditions for the adsorption of the nucleic acids to the carrier material, the batch is "pipetted" by means of a pipetting operation on the nucleic acid-binding material that is vertically placed in the pipette tip. The nucleic acids bind to the material. Subsequently, wash buffers are also "pipetted" past the nucleic acid binding material. Thereafter, a drying step. Finally, the eluent is again "pipetted" past the vertically arranged nucleic acid-binding material, thereby detaching the bound nucleic acid. The nucleic acid is now available for necessary downstream application.

Description

Gegenstand der Erfindung ist eine neuartige Vorrichtung, mit der Nukleinsäuren schnell und hocheffizient sowie quantitativ isoliert oder aufgereinigt werden können. Die neuartige Vorrichtung zur Extraktion von Nukleinsäuren kann sowohl für eine manuelle Extraktion im Labor als auch unter Feldbedingungen eingesetzt werden. Besondere Vorteile offenbart es im Kontext mit der Automatisierung von Nukleinsäureextraktionen.The invention relates to a novel device with which nucleic acids can be isolated and purified quickly and highly efficiently as well as quantitatively. The novel device for extraction of nucleic acids can be used both for manual extraction in the laboratory and under field conditions. It discloses particular advantages in the context of the automation of nucleic acid extractions.

Unter klassischen Bedingungen erfolgt die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben dadurch, dass die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen aufgeschlossen, die austretenden Nukleinsäurefraktionen über Phenol-/Chloroform-Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase gewonnen werden ( Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" ). Diese "klassischen Verfahren“ zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden auf Grund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.Under classical conditions, the isolation of DNA from cells and tissues by the nucleic acids containing starting materials under strongly denaturing and reducing conditions, partially digested using protein degrading enzymes, purified the exiting nucleic acid fractions via phenol / chloroform extraction steps and the nucleic acids by means of Dialysis or ethanol precipitation can be obtained from the aqueous phase ( Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" ). These "classical methods" for the isolation of nucleic acids from cells and especially from tissues are very time-consuming (sometimes longer than 48 h), require a considerable amount of equipment and are moreover not feasible under field conditions, Moreover, such methods are due to the chemicals used such as phenol and chloroform in a not insignificant health hazard.

Die nächste Verfahrensgeneration zur Isolierung von Nukleinsäuren basiert auf einer von Vogelstein und Gillespie ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619 ) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung der die zu isolierende DNA- Bande enthaltenden Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und danach von den Trägerpartikeln abgelöst. Diese Methode erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Herkünften angewendet und ist letztlich die Basis für fast alle kommerziell verfügbaren Kits zur manuellen wie auch automatisierten Isolierung von Nukleinsäuren. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von Patenten und Veröffentlichungen, die sich auf das Basisprinzip der Isolierung von Nukleinsäuren beziehen, welches von Vogelstein und Gillespie erstmals publiziert wurde und ggf. weitere Vorteile innehaben. Diese Varianten betreffen sowohl die Verwendung unterschiedlicher mineralischer Trägermaterialien als auch die Art der für die Bindung der Nukleinsäuren eingesetzten Puffer. Beispiele sind u.a. die Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze, bei welchen als Trägermaterial feingemahlene Glaspulver (BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden (Fa.Sigma) oder auch Silicagele bzw. Silcasuspensionen oder Glasfaserfilter oder mineralische Erden ( DE 41 39 664 A1 ; US 5,234,809 ; WO-A 95/34569 DE 4321904 ; DE 20207793 ) zum Einsatz kommen. All diese Patente basieren auf der Anbindung von Nukleinsäuren an ein mineralisches Trägermaterial auf der Basis von Glas oder Silizium unter Anwesenheit chaotroper Salzlösungen. In neueren Patentschriften wird offenbart, dass für die Adsorption von Nukleinsäuren an die dem Fachmann bekannten und eingesetzten mineralischen Materialien auch sogenannte antichaotrope Salze als Bestandteil von Lyse-/Bindungspuffer-Systemen sehr effizient und erfolgreich eingesetzt werden können ( EP 1135479 ). Zusammenfassend kann man den Stand der Technik also dahingehend beschreiben, dass Nukleinsäuren an mineralische Materialien in Anwesenheit von Puffern, die chaotrope oder antichaotrope Salze enthalten oder auch in Anwesenheit von Puffern die Mischungen chaotroper und antichaotroper Salze enthalten, binden und auf diesem Wege dann auch isoliert werden können. Dabei gibt es auch Vorzugsvarianten, bei denen zusätzlich aliphatische Alkohole zur Bindungsvermittlung eingesetzt werden. Dem Fachmann ist auch bekannt, dass alle gängigen kommerziellen Produkte zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren auf dieser Grundlage basieren. Die eingesetzten mineralischen Träger liegen dabei in Form von losen Schüttungen, in Form von Filtermembranen oder auch in Form von Suspensionen vor. Für die Durchführung von automatisierten Extraktionsabläufen werden häufig paramagnetische oder magnetische Partikel eingesetzt. Dabei handelt es sich z.B. um silicatische Materialien, die einen magnetischen oder paramagnetischen Kern besitzen oder aber auch um Eisenoxydpartikel, deren Oberfläche so modifiziert wird, dass diese die für die Anbindung der Nukleinsäuren notwendigen Funktionalitäten tragen. Um insbesondere automatisierte Extraktionen einfacher durchführen zu können, wurden modifizierte Pipettenspitzen eingesetzt. Diese sind dadurch charakterisiert, dass sie die zur Anbindung von Nukleinsäuren notwendigen Trägermaterialien (poröse mineralische Trägermaterialien oder poröse Anionenaustauscher etc.) bereits enthalten. So beschreibt die Patentschrift DE3717211 eine Pipettenspitze mit einem porösen Chromatographiematerial für die Isolierung von Nukleinsäuren. Die Patentschrift EP1951904 offenbart eine Pipettenspitze, bestehend aus einem Ober-und Unterteil, zwischen welchem sich ebenfalls ein poröses chromatographisches Trägermaterial befindet und welche für die automatisierte Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden soll. Eine modifizierte Pipettenspitze zur Extraktion von Nukleinsäuren ist auch in der Offenlegungsschrift US2013/0078619 offenbart. Auch in dieser Pipettenspitze befindet sich ein poröses mineralisches Trägermaterial (poröses Glas) zur direkten Anbindung von Nukleinsäuren. All diesen modifizierten Pipettenspitzen ist gemeinsam, dass es sich um ein poröses chromatographisches Material handelt (lose Schüttung oder fester poröser Körper). Diese Trägermaterialien befinden sich immer horizontal innerhalb der Pipettenspitze. Die zu prozessierenden Flüssigkeiten strömen durch das eingesetzte poröse Material. Der Extraktionsablauf basiert darauf, dass nach Lyse der Probe und Einstellung notwendiger Bindungsbedingungen für die Adsorption der Nukleinsäuren an das Trägermaterial, dieser Ansatz mittels eines Pipettiervorganges durch das poröse Trägermaterial gezogen wird. Die Nukleinsäuren binden an das Trägermaterial. Nachfolgend werden Waschpuffer durch das Trägermaterial pipettiert. Danach erfolgt ein Trocknungsschritt (häufiges Auf- und Abpipettieren oder Anlegen von Vakuum). Final wird das Elutionsmittel durch das Trägermaterial pipettiert. Dabei wird die gebundene Nukleinsäure vom Trägermaterial abgelöst. Die Verwendung von Trägermaterial enthaltenden Pipettenspitzen soll den (insbesondere) automatisierten Ablauf von Nukleinsäureextraktionen deutlich vereinfachen. Obwohl diese Ideen schon teilweise relativ alt sind (die Patentschrift DE3717211 datiert vom 22.5.1987), hat sich ein solches Verfahren nicht durchgesetzt. Die Ursache liegt dabei in einigen grundsätzlichen Problemen:

1) Das Pipettieren von Nukleinsäure enthaltenden Lysaten hoher Viskosität funktioniert nur eingeschränkt oder führt zum vollständigen Verschluss des chromatographischen Materials. Damit ist keine Extraktion möglich.
2) Das Pipettieren von Lysaten über ein poröses Material führt zur Schaumbildung. Dieses wird mit der zunehmenden Anzahl von Pipettierschritten verstärkt und kann den Extraktionsprozess ebenfalls unmöglich machen.
3) Die Entfernung von alkoholischen Komponenten aus einem porösen Material ist schwierig und ist oftmals nicht zufriedenstellend gelöst.

The next generation of procedures for the isolation of nucleic acids is based on a von Vogelstein and Gillespie ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615-619 ) and first described method for the preparative and analytical purification of DNA fragments from agarose gels. The method combines the dissolution of the agarose containing the DNA band to be isolated in a saturated solution of a chaotropic salt (NaJ) with a binding of the DNA to glass particles. The DNA fixed to the glass particles is then washed with a washing solution (20 mM Tris HCl [pH 7.2], 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50% v / v ethanol) and then removed from the carrier particles. To date, this method has undergone a number of modifications and is currently being applied to different methods of extracting and purifying nucleic acids from different sources and is ultimately the basis for almost all commercially available kits for both manual and automated isolation of nucleic acids. In addition, there are a large number of patents and publications which refer to the basic principle of the isolation of nucleic acids, which was first published by Vogelstein and Gillespie and possibly have further advantages. These variants relate both to the use of different mineral carrier materials and to the type of buffer used for the binding of the nucleic acids. Examples include the binding of nucleic acids to mineral carriers in the presence of solutions of different chaotropic salts, in which as carrier material finely ground glass powder (BIO 101, La Jolla, CA), diatomaceous earth (Fa. Sigma) or silica gels or Silcasuspensionen or glass fiber filters or mineral Earth ( DE 41 39 664 A1 ; US 5,234,809 ; WO-A 95/34569 DE 4321904 ; DE 20207793 ) are used. All of these patents are based on the binding of nucleic acids to a mineral carrier material based on glass or silicon in the presence of chaotropic salt solutions. It is disclosed in more recent patents that also so-called antichaotropic salts can be used very efficiently and successfully for the adsorption of nucleic acids on the mineral materials known and used by the person skilled in the art as a component of lysis / binding buffer systems ( EP 1135479 ). In summary, the state of the art can thus be described in such a way that nucleic acids bind to mineral materials in the presence of buffers which contain chaotropic or antichaotropic salts or even in the presence of buffers contain mixtures of chaotropic and antichaotropic salts, and then also be isolated in this way can. There are also preferred variants in which additional aliphatic alcohols are used for binding mediation. It is also known to the person skilled in the art that all common commercial products for the isolation and purification of nucleic acids are based on this basis. The mineral carriers used are present in the form of loose beds, in the form of filter membranes or in the form of suspensions. Paramagnetic or magnetic particles are often used to perform automated extraction operations. These are, for example, silicate materials which possess a magnetic or paramagnetic core or else iron oxide particles whose surface is modified in such a way that they carry the functionalities necessary for the binding of the nucleic acids. In order to be able to carry out in particular automated extractions more easily, modified pipette tips were used. These are characterized in that they already contain the carrier materials necessary for the binding of nucleic acids (porous mineral carrier materials or porous anion exchangers, etc.). This is how the patent describes DE3717211 a pipette tip with a porous chromatography material for the isolation of nucleic acids. The patent EP1951904 discloses a pipette tip consisting of a top and bottom part, between which is also a porous chromatographic support material and which is to be used for the automated isolation of nucleic acids. A modified pipette tip for the extraction of nucleic acids is also available in the published patent US2013 / 0078619 disclosed. Also in this pipette tip is a porous mineral carrier material (porous glass) for direct binding of nucleic acids. All these modified pipette tips have in common is that it is a porous chromatographic material (loose bed or solid porous body). These substrates are always located horizontally within the pipette tip. The liquids to be processed flow through the porous material used. The extraction procedure is based on the fact that after lysis of the sample and adjustment of necessary binding conditions for the adsorption of the nucleic acids to the carrier material, this approach is drawn by means of a pipetting process through the porous carrier material. The nucleic acids bind to the carrier material. Subsequently, wash buffers are pipetted through the carrier material. This is followed by a drying step (frequent pipetting up or down or applying a vacuum). Finally, the eluent is pipetted through the carrier material. In this case, the bound nucleic acid is detached from the carrier material. The use of carrier-containing pipette tips should significantly simplify the (in particular) automated course of nucleic acid extractions. Although these ideas are already relatively old (the patent DE3717211 dated 22.5.1987), such a procedure has not prevailed. The cause lies in some fundamental problems:

1) The pipetting of nucleic acid-containing high viscosity lysates functions only to a limited extent or leads to complete occlusion of the chromatographic material. Thus, no extraction is possible.
2) Pipetting lysates over a porous material results in foaming. This is intensified with the increasing number of pipetting steps and can also make the extraction process impossible.
3) The removal of alcoholic components from a porous material is difficult and often unsatisfactory.

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zu Grunde, die bekannten Probleme zu lösen und ein einfaches und schnelles Verfahren der Extraktion von Nukleinsäuren mittels einer modifizierten Pipettenspitze zu ermöglichen. The invention was therefore based on the object to solve the known problems and to enable a simple and rapid method of extraction of nucleic acids by means of a modified pipette tip.

Dier Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Überraschender Weise kann dies mit einfachen Mitteln erreicht werden. Es wurde entdeckt, dass man ein nukleinsäurebindendes Material nicht horizontal in eine Pipettenspitze verbringt, sondern vertikal, so dass an einer oder an beiden Seiten des nukleinsäurebindenden Materials die Flüssigkeit unbehindert vorbei fließen kann. Dies bedeutet, die für die Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzten Flüssigkeiten werden nicht durch ein chromatographisches Material hindurch, sondern an einem nukleinsäurebindenden Material vorbei bewegt. The task has been solved according to the features of the claims. Surprisingly, this can be achieved by simple means. It has been discovered that a nucleic acid-binding material is not placed horizontally in a pipette tip, but vertically, so that liquid can pass unobstructed past one or both sides of the nucleic acid-binding material. This means that the liquids used for the isolation of nucleic acids are not moved through a chromatographic material, but moved past a nucleic acid binding material.

Praktisch befindet sich das nukleinsäurebindende Material in einer Pipettenspitze und die Flüssigkeit strömt an diesem Material vorbei. Das Material muss auch kein poröses Material sein. Die Anordnung des nukleinsäurenbindenden Materials ist unter 1 schematisch dargestellt. Der Prozess der Extraktion von Nukleinsäuren ist ähnlich zu den beschriebenen Verfahren unter Verwendung einer mit chromatographischem Material befüllten Pipettenspitzen in horizontaler Anordnung, allerdings mit wesentlichen Unterschieden.Practically, the nucleic acid binding material is in a pipette tip and the liquid flows past this material. The material does not have to be a porous material either. The arrangement of the nucleic acid binding material is under 1 shown schematically. The process of extraction of nucleic acids is similar to the described methods using a pipette tips filled with chromatographic material in a horizontal arrangement, but with significant differences.

Nach Lyse der Probe und Einstellung notwendiger Bindungsbedingungen für die Adsorption der Nukleinsäuren an das Trägermaterial wird der Ansatz mittels eines Pipettiervorganges am vertikal in der Pipettenspitze verbrachten nukleinsäurebindenden Material mehrmals „vorbei pipettiert“. Die Nukleinsäuren binden an das Material. Nachfolgend werden Waschpuffer ebenfalls am nukleinsäurebindenden Material „vorbei pipettiert“. Danach erfolgt ein Trocknungsschritt (z.B. häufiges Auf- und Abpipettieren). Final wird das Elutionsmittel wiederum mehrmals am vertikal angeordneten nukleinsäurebindenden Material „vorbei pipettiert“ und dabei die gebundene Nukleinsäure abgelöst. Die Nukleinsäure liegt nun für notwendige downstream-Applikation vor. Das Verfahren ist extrem schnell und einfach in der Durchführung und kann vollständig automatisiert sowie auch manuell und unter Feldbedingungen vor Ort durchgeführt werden. Es gibt keine Probleme mit viskösen Lösungen und keine Probleme mit der Entfernung von alkoholischen Komponenten bzw. mit einer extremen Schaumbildung, wie dies alles bei der Verwendung horizontal angeordneter poröser Trägermaterialien oder bei Pipettenspitzen, die mit einem porösen chromatographischen Material befüllt sind, der Fall ist. Das Verfahren offenbart noch einen weiteren Vorteil. Bisher eingesetzte Materialien zur Anbindung von Nukleinsäuren waren entweder poröse Ionenaustauscher-Materialien sowie poröse silicatische Träger bzw. poröse Gläser. Überaschenderweise zeigte sich Folgendes. Wenn man eine Nukleinsäure enthaltende Proben mit Extraktionsreagenzien von kommerziell verfügbaren Kits (z.B. innuPREP Blood DNA Kit/IPC16, Analytik Jena AG; DNeasy Blood & Tissue Kit; Fa. Qiagen) bearbeitet und man anstelle eines mineralischen Trägermaterials ein Polymermaterial (z.B.Polypropylen) einsetzt und dieses in Kontakt mit der in Bearbeitung befindlichen Probe bringt, bindet Nukleinsäure an das Plastikmaterial. Die nachfolgenden Schritte des Waschens können mit bekannten alkoholhaltigen Waschpuffern oder auch nur mit einem Alkohol durchgeführt werden, ebenso können für die Elution bekannte Niedrigsalzpuffer oder auch Wasser eingesetzt werden. Wesentlich dabei ist, dass das Plastikmaterial keine glatte Oberfläche besitzt, sondern die Oberfläche strukturiert bzw. aufgeraut ist. Dabei reichen schon einige Rillen im Material aus, um das Material als ein geeignetes Material zur Bindung von Nukleinsäuren zu nutzen. Als Extraktionsreagenzien können klassische Kitreagenzien unterschiedlicher Art verwendet werden. Ebenso arbeitet das Extraktionsprotokoll nach dem bekanntem Schema Lysieren-Binden-Waschen-Eluieren. Verbringt man solche neuartigen Materialien vertikal in eine Pipettenspitze, dann können diese Materialien in exzellenter Weise für die Extraktion von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren läuft damit wie folgt ab:

1. Lysieren einer Nukleinsäure enthaltenden Probe (oder Bereitstellen einer Nukleinsäure enthaltenden Probe). Dazu wird die Probe mit einem klassischen Lysepuffer oder einem Puffer versetzt, die man bisher aus Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren kennt. Diese Puffer können chaotrope Salze oder nichtchaotrope Salze oder Mischungen dieser beiden Gruppen enthalten. Darüber hinaus können diese Puffer weitere Komponenten enthalten wie Chealtbildner, Trispuffer, Netz- und Dispergiermittel etc. Das Verfahren funktioniert aber auch mit Puffern, welche keine Salze enthalten und z.B. nur aus einem Detergenz, Tris und EDTA bestehen. Zusätzlich können auch noch proteolytische Enzyme eingesetzt werden.
2. Zugabe eines Bindungspuffers, welcher eine organische Komponente (vorzugsweise Alkohole oder Ketone) und ggf. weitere Zusätze enthält.
3. Aufziehen dieser Mischung mit einer Pipettenspitze, in welcher sich vertikal angeordnet das nukleinsäurebindende Material befindet (z.B. Plastikmaterial, dessen Oberfläche angeraut ist). Mehrmaliges Auf und Abpipettieren (die Flüssigkeit bewegt sich dabei am Material vorbei). Nach letztem Auspipettieren ist die erfindungsgemäße Pipettenspitze leer.
4. Entfernen der erfindungsgemäßen Pipettenspitzes aus der Probe
5. Eintauchen der erfindungsgemäßen Pipettenspitze in eine Waschpufferlösung. Mehrmaliges Auf und Abpipettieren (die Flüssigkeit bewegt sich dabei am Material vorbei). Nach letztem Auspipettieren ist die erfindungsgemäße Pipettenspitze leer.
6. Trocknung durch z.B. multiple Pipettierschritte zur Entfernung des restlichen Alkohols vom Waschpuffer. Auch ist eine mögliche Trocknung mittels erhöhter Temperatur möglich.
7. Ablösen der Nukleinsäure mit einem Elutionspuffer (Niedrigsalzpuffer oder Wasser). Dazu mehrmaliges Auf und Abpipettieren (der Elutionspuffer bewegt sich dabei am Material vorbei). Nach letztem Auspipettieren befindet sich die Nukleinsäure in der flüssigen Phase.

After lysis of the sample and adjustment of the necessary binding conditions for the adsorption of the nucleic acids to the carrier material, the batch is pipetted "pipetted" by means of a pipetting process on the nucleic acid-binding material vertically placed in the pipette tip. The nucleic acids bind to the material. Subsequently, wash buffers are also "pipetted" past the nucleic acid binding material. This is followed by a drying step (eg frequent pipetting up and down). Finally, the eluent is again "pipetted" past the vertically arranged nucleic acid-binding material, thereby detaching the bound nucleic acid. The nucleic acid is now available for necessary downstream application. The process is extremely fast and easy to carry out and can be carried out fully automated as well as manually and under field conditions on site. There are no problems with viscous solutions and no problems with the removal of alcoholic components or with extreme foaming, as is the case with the use of horizontally arranged porous carrier materials or with pipette tips which are filled with a porous chromatographic material. The method discloses yet another advantage. Previously used materials for binding nucleic acids were either porous ion exchange materials as well as porous silicate supports or porous glasses. Surprisingly, the following emerged. If samples containing nucleic acid are processed with extraction reagents from commercially available kits (eg innuPREP Blood DNA Kit / IPC16, Analytik Jena AG, DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen) and a polymeric material (eg polypropylene) is used instead of a mineral carrier material In contact with the sample being processed, nucleic acid binds to the plastic material. The subsequent steps of washing can can be carried out with known alcohol-containing washing buffers or even with an alcohol, as well as low-salt buffer known for the elution or water can be used. It is essential that the plastic material has no smooth surface, but the surface is structured or roughened. There are already enough grooves in the material to use the material as a suitable material for binding nucleic acids. As extraction reagents classical Kitreagenzien of different kind can be used. Likewise, the extraction protocol works according to the known scheme lysing-binding-washing-elution. If such novel materials are placed vertically in a pipette tip, then these materials can be used excellently for the extraction of nucleic acids. The process according to the invention thus proceeds as follows:

1. Lysing a sample containing nucleic acid (or providing a sample containing nucleic acid). For this purpose, the sample is mixed with a classical lysis buffer or a buffer which has hitherto been known from methods for isolating nucleic acids. These buffers may contain chaotropic salts or non-chaotropic salts or mixtures of these two groups. In addition, these buffers may contain other components such as chelating agents, Tris buffer, wetting and dispersing agents, etc. The method also works with buffers which contain no salts and consist for example only of a detergent, Tris and EDTA. In addition, proteolytic enzymes can also be used.
2. Addition of a binding buffer which contains an organic component (preferably alcohols or ketones) and optionally further additives.
3. Prepare this mixture with a pipette tip, in which the nucleic acid-binding material is located vertically (eg plastic material whose surface is roughened). Repeated pipetting up and down (the liquid moves past the material). After final pipetting, the pipette tip according to the invention is empty.
4. Remove the pipette tip according to the invention from the sample
5. Immerse the pipette tip according to the invention in a wash buffer solution. Repeated pipetting up and down (the liquid moves past the material). After final pipetting, the pipette tip according to the invention is empty.
6. Drying by, for example, multiple pipetting steps to remove the residual alcohol from the wash buffer. Also, a possible drying by means of elevated temperature is possible.
7. Peel off the nucleic acid with an elution buffer (low salt buffer or water). To do this several times up and down pipetting (the elution buffer moves past the material). After final pipetting, the nucleic acid is in the liquid phase.

Das Verfahren ist universell einsetzbar und kann sowohl automatisiert als auch manuell durchgeführt werden. Es ist in idealster Weise für den Einsatz einer automatisierten Nukleinsäurextraktion geeignet, da die notwendigen Schritte zur Anbindung von Nukleinsäuren, zum Waschen der gebundenen Nukleinsäuren sowie zum Ablösen der Nukleinsäuren nur noch multiple Pipettierschritte sind. Dabei umgeht die erfindungsgemäße Pipettenspitze die bekannten Nachteile aus dem Stand der Technik, welche durch die bisherige konstruktive Anordnung bzw. Befüllung von Pipettenspitzen mit porösen chromatographischen Materialien bedingt sind.The method is universally applicable and can be carried out both automatically and manually. It is ideally suited for the use of an automated nucleic acid extraction, since the necessary steps for binding nucleic acids, for washing the bound nucleic acids and for detaching the nucleic acids are only multiple pipetting steps. In this case, the pipette tip according to the invention avoids the known disadvantages of the prior art, which are due to the previous constructive arrangement or filling of pipette tips with porous chromatographic materials.

Die einzusetzenden vertikal in die Pipettenspitze verbrachten Materialien zur Anbindung von Nukleinsäuren können extrem unterschiedlich sein. Neben mineralischen Materialien können auch modifizierte Plastikmaterialien eingesetzt werden, deren Oberfläche nicht glatt sondern strukturiert sind. Dazu zählen auch sogenannte Kompositmaterialien, die Mischungen aus Polymeren und z.B. organischen Komponenten oder metallischen Komponenten darstellen. Wesentlich ist nur die Bereitstellung einer angerauten bzw. strukturierten Oberfläche (keine glatte Oberfläche). Die Architektur des Plastikmaterials ist ebenfalls nicht limitierend (rund, rechteckig, etc.). Wichtig ist nur, dass das Material in eine Pipettenspitze verbracht werden kann und auch an dieser Position verbleibt und jederzeit von einer Flüssigkeit umspült werden kann, ohne dass die Flüssigkeit durch das eingebrachte Material hindurch muss. Auch kann eine Pipettenspitze eingesetzt werden, in welcher sich (aus einem Spritzgussteil gefertigt) dass Bindungsmaterial schon befindet und dieses nicht mehr in die Spitze verbracht werden muss.The inserted vertically into the pipette tip materials used to attach nucleic acids can be extremely different. In addition to mineral materials and modified plastic materials can be used, the surface is not smooth but structured. These include so-called composite materials containing blends of polymers and e.g. represent organic components or metallic components. It is only essential to provide a roughened or structured surface (no smooth surface). The architecture of the plastic material is also not limiting (round, rectangular, etc.). The important thing is that the material can be brought into a pipette tip and also remains in this position and can be washed around at any time by a liquid, without the liquid must pass through the introduced material. Also, a pipette tip can be used in which (made of an injection molded part) that binding material is already and this no longer needs to be spent in the top.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele stellen dabei keine Limitierung der Erfindung dar.The invention will be explained in more detail with reference to embodiments. The embodiments do not represent a limitation of the invention.

Ausführungsbeispiele embodiments

Beispiel 1: Manuelle Extraktion von Nukleinsäure aus NIH 3T3 Zellen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung einer modifizierten PipettenspitzeExample 1: Manual extraction of nucleic acid from NIH 3T3 cells by means of the method according to the invention using a modified pipette tip

In eine 1 ml Pipettenspitze (Fa. Sarstedt) wurde eine Scheibe aus Polyethylen senkrecht im letzten Drittel fixiert. Eingesetzt wurden 5 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen Die für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzte Extraktionschemie wurde dabei teilweise aus dem kommerziellen Extraktionskit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16X (Analytik Jena AG) genommen. Mittels eines Lysepuffers (Lysis Solution CBV) sowie von Proteinase K wurden die Zellen bei 60°C für 15 min lysiert. Die Lyse erfolgte in einem 2.0 ml Reaktionsgefäß. Nach Lyse wurde der Ansatz mit 400 µl Isopropanol versetzt. Nachfolgend wurde die modifizierte Pipettenspitze eingesetzt und mittels einer Pipette wurde der Ansatz 20 × auf- und abpipettiert. Danach wurden 3 weitere 2 ml- Reaktionsgefäße mit den alkoholischen Waschpuffern (Washing Solution LS, 80%iger Ethanol, 80%iger Ethanol) befüllt. Die Pipettenspitze wurde dann sukzessive in die jeweiligen Waschpuffer getaucht und es wurde jeweils 5 × auf- und abpipettiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde die Spitze getrocknet und damit der restliche Ethanol entfernt. Die Elution der gebundenen Nukleinsäure erfolgte mit 100 µl Elution Buffer. Dieser wurde wiederum in ein 2 ml- Reaktionsgefäß gegeben. Es wurde 30 × auf- und abpipettiert. Nach Entfernung der Pipettenspitze liegt die isolierte Nukleinsäure im Reaktionsgefäß vor. Das Verfahren ist extrem einfach und schnell. In a 1 ml pipette tip (Sarstedt) a disk of polyethylene was fixed vertically in the last third. 5 × 10 ⁵ NIH 3T3 cells were used. The extraction chemistry used for the isolation of the nucleic acids was partially taken from the commercial extraction kit innuPREP Blood DNA Kit / IPC16X (Analytik Jena AG). Using a lysis buffer (Lysis Solution CBV) and proteinase K, the cells were lysed at 60 ° C for 15 min. The lysis was carried out in a 2.0 ml reaction vessel. After lysis, the batch was mixed with 400 ul of isopropanol. Subsequently, the modified pipette tip was used and by means of a pipette, the approach was pipetted up and down 20 ×. Thereafter, 3 more 2 ml reaction tubes were filled with the alcoholic washing buffers (Washing Solution LS, 80% ethanol, 80% ethanol). The pipette tip was then successively immersed in the respective wash buffer and pipetted up and down 5 × each time. After the last washing step, the tip was dried, thereby removing the residual ethanol. The elution of the bound nucleic acid was carried out with 100 μl elution buffer. This was again placed in a 2 ml reaction vessel. It was pipetted up and down 30 times. After removal of the pipette tip, the isolated nucleic acid is present in the reaction vessel. The process is extremely simple and fast.

Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung. Ergebnisse spektrophotometrische Vermessung Probe Konzentration (ng/µl) Ausbeute (µg) Ratio A₂₆₀:A₂₈₀ Ratio A₂₆₀:A₂₃₀ 1 ca. 1 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 264 26,4 1.95 2,10 2 ca. 1 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 228 22,8 1.94 2,09 3 ca. 1 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 222 22,2 1.97 2.11 The detection of the isolated nucleic acid was carried out by spectrophotometric measurement. Results spectrophotometric survey sample Concentration (ng / μl) Yield (μg) Ratio A ₂₆₀ : A ₂₈₀ Ratio A ₂₆₀ : A ₂₃₀ 1 about 1 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 264 26.4 1.95 2.10 2 about 1 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 228 22.8 1.94 2.09 3 about 1 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 222 22.2 1.97 2.11

Wie die Ergebnisse zeigen, ist es mit dem erfindungsgemäßen Mittel möglich, allein unter Verwendung einer Standard Extraktionschemie und mittels weniger Pipettierschritte mit einer Standardpipette Nukleinsäure zu binden und zu isolieren. Es zeigt sich, dass die Ausbeuten extrem hoch sind.As the results show, it is possible with the agent according to the invention to bind and isolate nucleic acid using a standard extraction chemistry alone and by means of a few pipetting steps with a standard pipette. It turns out that the yields are extremely high.

Beispiel 2: Automatisierte Extraktion von Nukleinsäure aus NIH 3T3 Zellen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und unter Verwendung einer modifizierten Pipettenspitze sowie unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren ExtraktionsautomatenExample 2: Automated extraction of nucleic acid from NIH 3T3 cells by means of the method according to the invention and using a modified pipette tip and using a commercially available extraction machine

Die automatisierte Extraktion wurde mit dem Extraktionsautomaten InnuPure C16 (Analytik Jena AG) durchgeführt. Dieser Extraktionsautomat basiert auf einer Magnetpartikel-Nukleinsäureextraktion. Für die Durchführung einer Nukleinsäureextraktion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden die Pipettenspitzen, die für den Extraktionsautomaten genutzt werden, so geändert, dass sie dem erfindungsgemäßen Mittel entsprechen. In die Pipettenspitzen wurde in das untere Drittel vertikal, eine aus einem angerauten Polymer hergestellte Scheibe eingebracht, die das Lumen nicht verschließt und somit die Pipettierfunktion der Pipettenspitzen erhalten bleibt. Es wurden dabei angeraute Scheiben aus verschiedenen Materialien eingesetzt. Für die Nukleinsäureextraktion wurden jeweils 5 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen eingesetzt. Die für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzte Extraktionschemie wurde dabei teilweise aus dem kommerziellen Extraktionskit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16X (Analytik Jena AG) genommen. Mittels eines Lysepuffers (Lysis Solution CBV) sowie von Proteinase K wurden die Zellen bei 60°C für 15 min in einem 2.0 ml Reaktionsgefäß lysiert. The automated extraction was carried out with the InnuPure C16 extraction machine (Analytik Jena AG). This extraction machine is based on magnetic particle nucleic acid extraction. To carry out a nucleic acid extraction according to the method according to the invention, the pipette tips which are used for the extraction machine were changed so that they correspond to the agent according to the invention. Into the pipette tips, a disc made of a roughened polymer was placed vertically into the lower third, which does not occlude the lumen, thus preserving the pipetting function of the pipette tips. It roughened discs made of different materials were used. For the nucleic acid extraction in each case 5 × 10 ⁵ NIH 3T3 cells were used. The extraction chemistry used for the isolation of the nucleic acids was partially taken from the commercial extraction kit innuPREP Blood DNA Kit / IPC16X (Analytik Jena AG). Using a lysis buffer (Lysis Solution CBV) and proteinase K, the cells were lysed at 60 ° C for 15 min in a 2.0 ml reaction vessel.

Nachfolgend wurde das automatisierte Verfahren des Innupure C16 für die Aufreinigung der Nukleinsäuren verwendet. Die für die Extraktion benötigten Lösungen lagen in einer vorbefüllten Deep Well-Platte vor. Die oben beschriebenen Lysate wurden in Kavitäten gegeben, die mit 400 µl Isopropanol befüllt waren. Diese Lösung wurde daraufhin mittels der Pipettenspitze derart durchmischt, dass die Lösung seitlich an der in der Spitze eingebrachten Scheibe vorbeiströmt. Es wurden 100 Wiederholungen durchgeführt.Subsequently, the automated procedure of the Innupure C16 was used for the purification of the nucleic acids. The solutions required for the extraction were in a pre-filled deep well plate. The lysates described above were placed in wells filled with 400 μl of isopropanol. This solution was then mixed by means of the pipette tip so that the solution laterally flows past the introduced in the tip disc. There were 100 repetitions.

Danach wurde sukzessive in drei weiteren Kavitäten, die alkoholische Waschpuffer (Washing Solution LS, 80%iger Ethanol, 80%iger Ethanol) enthielten je 5 × durchmischt. Thereafter, successively in three further wells, the alcoholic wash buffer (Washing Solution LS, 80% ethanol, 80% ethanol) containing mixed 5 ×.

Im Anschluss an den letzten Waschschritt wurde die erfindungsgemäße Spitze und die in ihr enthaltene Scheibe durch 200 × Pipettieren von Luft getrocknet und damit der restliche Ethanol entfernt. Die Elution der Nukleinsäuren erfolgte durch 120 × durchmischen mit 100 µl Elution Buffer, der durch das Gerät zuvor auf 50° C temperiert worden war. Das Gesamtvolumen an Elution Buffer betrug 200 µl. Following the final washing step, the tip of the invention and the disc contained therein were dried by air pipetting 200 ×, thereby removing the residual ethanol. The elution of the nucleic acids was carried out by mixing 120 × with 100 μl of elution buffer, which had previously been heated to 50 ° C. by the device. The total volume of elution buffer was 200 μl.

Das Verfahren ist extrem einfach und schnell und zeigt, dass kommerziell verfügbare Extraktionsautomaten für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem dazu korrespondierenden erfindungsgemäßen Mittel eingesetzt werden können. Der zeitliche Aufwand im Vergleich zu einer Magnetpartikel-basierten Extraktion ist viel geringer. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung: Material Konzentration (ng/µl) Ausbeute (µg) Ratio A₂₆₀:A₂₈₀ Ratio A₂₆₀:A₂₃₀ Polymilchsäure 1 31,67 6,34 1,95 2,19 2 25,18 5,04 1,8 2,11 BioFila linen 3 56,23 11,25 1,87 2,17 4 67,63 13,52 1,85 2,18 Polycarbonat 5 38,12 7,62 1,79 2,13 6 21,9 4,38 2,14 2,36 Polyhydroxyalkanoat 7 30,33 6,06 1,89 2,02 8 42,49 8,5 1,85 2,13 Acryl-Nitril-Styrol 9 27,26 5,45 1,9 1,87 10 32,03 6,4 1,76 2,13 Polystyrol 11 28,85 5,77 1,83 2,02 12 4,75 0,95 1,42 1,3 Polyethylen 13 25,43 5,09 1,76 1,53 14 48,43 9,96 1,85 1,82 The process is extremely simple and fast and shows that commercially available extraction machines can be used for carrying out the process according to the invention with the corresponding agent according to the invention. The time required compared to a magnetic particle-based extraction is much lower. The detection of the isolated nucleic acid was carried out by spectrophotometric measurement. Results of spectrophotometric measurement: material Concentration (ng / μl) Yield (μg) Ratio A ₂₆₀ : A ₂₈₀ Ratio A _260: A ₂₃₀ polylactic acid 1 31.67 6.34 1.95 2.19 2 25.18 5.04 1.8 2.11 BioFila linen 3 56.23 11.25 1.87 2.17 4 67.63 13.52 1.85 2.18 polycarbonate 5 38.12 7.62 1.79 2.13 6 21.9 4.38 2.14 2.36 polyhydroxyalkanoate 7 30.33 6.06 1.89 2.02 8th 42.49 8.5 1.85 2.13 Acrylonitrile-styrene 9 27.26 5.45 1.9 1.87 10 32.03 6.4 1.76 2.13 polystyrene 11 28.85 5.77 1.83 2.02 12 4.75 0.95 1.42 1.3 polyethylene 13 25.43 5.09 1.76 1.53 14 48.43 9.96 1.85 1.82

Eine gelelektrophoretische Analyse der isolierten Nukleinsäure zeigt 2.A gel electrophoretic analysis of the isolated nucleic acid shows 2 ,

Dargestellt ist die in einem 0,8 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennte Nukleinsäure, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens isoliert wurde. Die Proben wurden von links nach rechts, beginnend mit Probe 1 aufgetragen.Shown is the electrophoretically separated in a 0.8% agarose gel nucleic acid isolated by the method according to the invention. The samples were applied from left to right beginning with sample 1.

Wie die Ergebnisse zeigen, ist es mit dem erfindungsgemäßen Mittel, das aus unterschiedlichen Polymeren bestehen kann, möglich, allein unter Verwendung einer Standard Extraktionschemie und mittels weniger Pipettierschritte mit einer Standard Pipettierplattform, Nukleinsäure zu Binden und zu isolieren. Es zeigt sich, dass die Ausbeuten extrem hoch sind. As the results show, it is possible with the agent of the invention, which may consist of different polymers, to bind and isolate nucleic acid using only a standard extraction chemistry and by means of a few pipetting steps with a standard pipetting platform. It turns out that the yields are extremely high.

1: zeigt eine exemplarische Darstellung der vertikal in den Hohlkörper eingebrachten Scheibe aus einem nukleinsäurebindenden Polymermaterial; dargestellt ist eine exemplarische Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mittels, welches für die Nukleinsäureextraktion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann. 1 : shows an exemplary representation of the vertically introduced into the hollow body disc of a nucleic acid-binding polymer material; An exemplary embodiment of the agent according to the invention is shown, which can be used for nucleic acid extraction according to the method of the invention.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

DE 4139664 A1 [0003]
US 5234809 [0003]
WO 95/34569 A [0003]
DE 4321904 [0003]
DE 20207793 [0003]
EP 1135479 [0003]
DE 3717211 [0003, 0003]
EP 1951904 [0003]
US 2013/0078619 A [0003]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" [0002]
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615-619 [0003]

Claims

Device for extracting nucleic acids, comprising a hollow body through which a liquid is passed, characterized in that in this hollow body, a material with a structured surface is arranged so that it can be lapped by a liquid.

Device according to claim 1, characterized in that the hollow body is a pipette tip.

Apparatus according to claim 1 or 2, characterized in that it is the introduced material to polymeric materials or composite materials with a rough surface.

Apparatus according to claim 1, characterized in that it is in the hollow body, is a pipette tip, on the inner wall of the introduced material is immobilized.

Device according to the walk-away principle for the automated extraction of nucleic acids, comprising at least one of the device according to one of claims 1 to 4.

Apparatus according to claim 5, characterized in that it represents a pipetting or an extraction machine.

Method for the automated extraction of nucleic acids, characterized by the following steps: a) A lysed biological sample is treated with at least one means for binding nucleic acids to a solid phase b) applying this mixture under a) with a pipette tip in which a structured material according to any one of claims 1, 3 or 4 is located and repeated pipetting up and down, whereby the liquid thereby moves past the material. c) removing the pipette tip from the sample d) Immerse the pipette tip into a wash buffer solution and pipette up and down several times, moving the fluid past the material. e) Dry the pipette tip to remove the remaining alcohol from the wash buffer f) detaching the nucleic acid with an elution buffer by repeatedly pipetting up and down the elution buffer, the elution buffer thereby moving past the material.

Automatic method according to claim 7 by means of an automatic pipetting or an extraction machine.