DE102015211393A1

DE102015211393A1 - Device and method for the automated extraction of nucleic acids

Info

Publication number: DE102015211393A1
Application number: DE102015211393.0A
Authority: DE
Inventors: wird später genannt werden Erfinder
Original assignee: AJ Innuscreen GmbH
Current assignee: AJ Innuscreen GmbH
Priority date: 2015-06-19
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2016-12-22

Abstract

Vorrichtung und Verfahren zur automatisierten Extraktion von Nukleinsäuren, umfassend einen Körper, der teilweise oder vollständig in eine Reaktionskavität eintauchen kann, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens der Teil, der in die Reaktionskavität eintaucht eine nicht-glatte Oberfläche aufweist. Nach Lyse wird eine biologische Probe mit einer organischen Substanz, vorzugsweise Alkohole oder Ketone, versetzt. Dieser Ansatz wird nunmehr mit einem Material, welches durch eine nichtglatte Oberfläche charakterisiert ist, in Kontakt gebracht. Unter diesen Voraussetzungen adsorbieren Nukleinsäuren an die Oberfläche des eingesetzten Materials. Nachfolgend erfolgen ggf. Waschschritte mit bekannten alkoholischen Waschlösungen. Nach Trocknung wird die adsorbierte Nukleinsäure durch Zugabe von Wasser oder eines Niedrigsalzpuffers vom Material abgelöst und kann für downstream-Anwendungen eingesetzt werden.An apparatus and method for the automated extraction of nucleic acids, comprising a body which may partially or completely submerge in a reaction cavity, characterized in that at least the portion immersed in the reaction cavity has a non-smooth surface. After lysis, a biological sample is mixed with an organic substance, preferably alcohols or ketones. This approach is now brought into contact with a material which is characterized by a non-smooth surface. Under these conditions, nucleic acids adsorb to the surface of the material used. Subsequently, if necessary, washing steps with known alcoholic washing solutions. After drying, the adsorbed nucleic acid is removed from the material by adding water or a low salt buffer and can be used for downstream applications.

Description

Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung und ein Verfahren, mit dem Nukleinsäuren schnell und hocheffizient sowie quantitativ automatisiert, isoliert und aufgereinigt werden können.The invention relates to a device and a method with which nucleic acids can be automated, isolated and purified quickly and highly efficiently as well as quantitatively.

Unter klassischen Bedingungen erfolgt die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben dadurch, dass die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen aufgeschlossen, die austretenden Nukleinsäurefraktionen über Phenol-/Chloroform-Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase gewonnen werden ( Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" ). Diese "klassischen Verfahren“ zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden auf Grund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.Under classical conditions, the isolation of DNA from cells and tissues by the nucleic acids containing starting materials under strongly denaturing and reducing conditions, partially digested using protein degrading enzymes, purified the exiting nucleic acid fractions via phenol / chloroform extraction steps and the nucleic acids by means of Dialysis or ethanol precipitation can be obtained from the aqueous phase ( Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" ). These "classical methods" for the isolation of nucleic acids from cells and especially from tissues are very time-consuming (sometimes longer than 48 h), require a considerable amount of equipment and are moreover not feasible under field conditions, Moreover, such methods are due to the chemicals used such as phenol and chloroform in a not insignificant health hazard.

Die nächste Verfahrensgeneration zur Isolierung von Nukleinsäuren basiert auf einer von Vogelstein und Gillespie ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619 ) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung der die zu isolierende DNA-Bande enthaltenden Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und danach von den Trägerpartikeln abgelöst. Diese Methode erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Herkünften angewendet und ist letztlich die Basis für fast alle kommerziell verfügbaren Kits zur manuellen wie auch automatisierten Isolierung von Nukleinsäuren. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von Patenten und Veröffentlichungen, die sich auf das Basisprinzip der Isolierung von Nukleinsäuren beziehen, welches von Vogelstein und Gillespie erstmals publiziert wurde und ggf. weitere Vorteile innehaben. Diese Varianten betreffen sowohl die Verwendung unterschiedlicher mineralischer Trägermaterialien als auch die Art der für die Bindung der Nukleinsäuren eingesetzten Puffer.The next generation of procedures for the isolation of nucleic acids is based on a von Vogelstein and Gillespie ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615-619 ) and first described method for the preparative and analytical purification of DNA fragments from agarose gels. The method combines the dissolution of the agarose containing the DNA band to be isolated in a saturated solution of a chaotropic salt (NaJ) with a binding of the DNA to glass particles. The DNA fixed to the glass particles is then washed with a washing solution (20 mM Tris HCl [pH 7.2], 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50% v / v ethanol) and then removed from the carrier particles. To date, this method has undergone a number of modifications and is currently being applied to different methods of extracting and purifying nucleic acids from different sources and is ultimately the basis for almost all commercially available kits for both manual and automated isolation of nucleic acids. In addition, there are a large number of patents and publications which refer to the basic principle of the isolation of nucleic acids, which was first published by Vogelstein and Gillespie and possibly have further advantages. These variants relate both to the use of different mineral carrier materials and to the type of buffer used for the binding of the nucleic acids.

Beispiele sind u.a. die Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze, bei welchen als Trägermaterial feingemahlene Glaspulver (BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden (Fa.Sigma) oder auch Silicagele bzw. Silcasuspensionen oder Glasfaserfilter oder mineralische Erden ( DE 41 39 664 A1 ; US 5,234,809 ; WO-A 95/34569 DE 4321904 ; DE 20207793 ) zum Einsatz kommen. All diese Patente basieren auf der Anbindung von Nukleinsäuren an ein mineralisches Trägermaterial auf der Basis von Glas oder Silizium unter Anwesenheit chaotroper Salzlösungen. In neueren Patentschriften wird offenbart, dass für die Adsorption von Nukleinsäuren an die dem Fachmann bekannten und eingesetzten mineralischen Materialien auch sogenannte antichaotrope Salze als Bestandteil von Lyse-/Bindungspuffer-Systemen sehr effizient und erfolgreich eingesetzt werden können ( EP 1135479 ). Zusammenfassend kann man den Stand der Technik also dahingehend beschreiben, dass Nukleinsäuren an mineralische Materialien in Anwesenheit von Puffern , die chaotrope oder antichaotrope Salze enthalten oder auch in Anwesenheit von Puffern die Mischungen chaotroper und antichaotroper Salze enthalten, binden und auf diesem Wege dann auch isoliert werden können. Dabei gibt es auch Vorzugsvarianten, bei denen zusätzlich aliphatische Alkohole zur Bindungsvermittlung eingesetzt werden. Dem Fachmann ist auch bekannt, dass alle gängigen kommerziellen Produkte zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren auf dieser Grundlage basieren. Die eingesetzten mineralischen Träger liegen dabei in Form von losen Schüttungen, in Form von Filtermembranen oder auch in Form von Suspensionen vor. Für die Durchführung von automatisierten Extraktionsabläufen werden häufig paramagnetische oder magnetische Partikel eingesetzt. Dabei handelt es sich z.B. um silicatische Materialien, die einen magnetischen oder paramagnetischen Kern besitzen oder aber auch um Eisenoxydpartikel, deren Oberfläche so modifiziert wird, dass diese die für die Anbindung der Nukleinsäuren notwendigen Funktionalitäten tragen. Um insbesondere automatisierte Extraktionen einfacher durchführen zu können, wurden modifizierte Pipettenspitzen eingesetzt. Diese sind dadurch charakterisiert, dass sie die zur Anbindung von Nukleinsäuren notwendigen Trägermaterialien (poröse mineralische Trägermaterialien oder poröse Anionenaustauscher etc.) bereits enthalten. So beschreibt die Patentschrift DE3717211 eine Pipettenspitze mit einem porösen Chromatographiematerial für die Isolierung von Nukleinsäuren. Die Patentschrift EP1951904 offenbart eine Pipettenspitze bestehend aus einem Ober- und Unterteil, zwischen welchem sich ebenfalls ein poröses chromatographisches Trägermaterial befindet und welche für die automatisierte Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden soll. Eine modifizierte Pipettenspitze zur Extraktion von Nukleinsäuren ist auch in der Patentschrift US2013/0078619 offenbart. Auch in dieser Pipettenspitze befindet sich ein poröses mineralisches Trägermaterial (poröses Glas) zur direkten Anbindung von Nukleinsäuren. All diesen modifizierten Pipettenspitzen ist gemeinsam, dass es sich um ein poröses chromatographisches Material handelt (lose Schüttung oder fester poröser Körper). Diese Trägermaterialien befinden sich immer horizontal innerhalb der Pipettenspitze. Die zu prozessierenden Flüssigkeiten strömen durch das eingesetzte poröse Material. Der Extraktionsablauf basiert darauf, dass nach Lyse der Probe und Einstellung notwendiger Bindungsbedingungen für die Adsorption der Nukleinsäuren an das Trägermaterial, dieser Ansatz mittels eines Pipettiervorganges durch das poröse Trägermaterial gezogen wird. Die Nukleinsäuren binden an das Trägermaterial. Nachfolgend werden Waschpuffer durch das Trägermaterial pipettiert. Danach erfolgt ein Trocknungsschritt (häufiges Auf- und Abpipettieren oder Anlegen von Vakuum). Final wird das Elutionsmittel durch das Trägermaterial pipettiert. Dabei wird die gebundene Nukleinsäure vom Trägermaterial abgelöst. Die Verwendung von Trägermaterial enthaltenden Pipettenspitzen soll den (insbesondere) automatisierten Ablauf von Nukleinsäureextraktionen deutlich vereinfachen. Obwohl diese Ideen schon teilweise relativ alt sind (die Patentschrift DE3717211 datiert vom 22.5.1987), hat sich ein solches Verfahren nicht durchgesetzt. Die Ursache liegt dabei in einigen grundsätzlichen Problemen:

1) Das Pipettieren von Nukleinsäure enthaltenden Lysaten hoher Viskosität funktioniert nur eingeschränkt oder führt zum vollständigen Verschluss des chromatographischen Materials. Damit ist keine Extraktion möglich.
2) Das Pipettieren von Lysaten über ein poröses Material führt zur Schaumbildung. Dieses wird mit der zunehmenden Anzahl von Pipettierschritten verstärkt und kann den Extraktionsprozess ebenfalls unmöglich machen.
3) Die Entfernung von alkoholischen Komponenten aus einem porösen Material ist schwierig und ist oftmals nicht zufriedenstellend gelöst.

Examples include the binding of nucleic acids to mineral carriers in the presence of solutions of different chaotropic salts, in which as carrier material finely ground glass powder (BIO 101, La Jolla, CA), diatomaceous earth (Fa. Sigma) or silica gels or Silcasuspensionen or glass fiber filters or mineral Earth ( DE 41 39 664 A1 ; US 5,234,809 ; WO-A 95/34569 DE 4321904 ; DE 20207793 ) are used. All of these patents are based on the binding of nucleic acids to a mineral carrier material based on glass or silicon in the presence of chaotropic salt solutions. It is disclosed in more recent patents that also so-called antichaotropic salts can be used very efficiently and successfully for the adsorption of nucleic acids on the mineral materials known and used by the person skilled in the art as a component of lysis / binding buffer systems ( EP 1135479 ). In summary, the state of the art can thus be described in such a way that nucleic acids bind to mineral materials in the presence of buffers which contain chaotropic or antichaotropic salts or even in the presence of buffers contain mixtures of chaotropic and antichaotropic salts, and then also be isolated in this way can. There are also preferred variants in which additional aliphatic alcohols are used for binding mediation. It is also known to the person skilled in the art that all common commercial products for the isolation and purification of nucleic acids are based on this basis. The mineral carriers used are present in the form of loose beds, in the form of filter membranes or in the form of suspensions. Paramagnetic or magnetic particles are often used to perform automated extraction operations. These are, for example, silicate materials which possess a magnetic or paramagnetic core or else iron oxide particles whose surface is modified in such a way that they carry the functionalities necessary for the binding of the nucleic acids. In order to be able to carry out in particular automated extractions more easily, modified pipette tips were used. These are characterized in that they already contain the carrier materials necessary for the binding of nucleic acids (porous mineral carrier materials or porous anion exchangers, etc.). This is how the patent describes DE3717211 a pipette tip with a porous chromatography material for the isolation of nucleic acids. The patent EP1951904 discloses a pipette tip consisting of an upper and lower part, between which is also a porous chromatographic support material and which is to be used for the automated isolation of nucleic acids. A modified pipette tip for the extraction of nucleic acids is also disclosed in the patent US2013 / 0078619 disclosed. Also in this pipette tip is a porous mineral carrier material (porous glass) for direct attachment of nucleic acids. All these modified pipette tips have in common is that it is a porous chromatographic material (loose bed or solid porous body). These substrates are always located horizontally within the pipette tip. The liquids to be processed flow through the porous material used. The extraction procedure is based on the fact that after lysis of the sample and adjustment of necessary binding conditions for the adsorption of the nucleic acids to the carrier material, this approach is drawn by means of a pipetting process through the porous carrier material. The nucleic acids bind to the carrier material. Subsequently, wash buffers are pipetted through the carrier material. This is followed by a drying step (frequent pipetting up or down or applying a vacuum). Finally, the eluent is pipetted through the carrier material. In this case, the bound nucleic acid is detached from the carrier material. The use of carrier-containing pipette tips should significantly simplify the (in particular) automated course of nucleic acid extractions. Although these ideas are already relatively old (the patent DE3717211 dated 22.5.1987), such a procedure has not prevailed. The cause lies in some fundamental problems:

1) The pipetting of nucleic acid-containing high viscosity lysates functions only to a limited extent or leads to complete occlusion of the chromatographic material. Thus, no extraction is possible.
2) Pipetting lysates over a porous material results in foaming. This is intensified with the increasing number of pipetting steps and can also make the extraction process impossible.
3) The removal of alcoholic components from a porous material is difficult and often unsatisfactory.

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zu Grunde, die bekannten Probleme zu lösen und damit die automatisierte Extraktion von Nukleinsäuren deutlich einfacher und schneller als bisher durchführen zu können. Ein weites Ziel der Erfindung besteht darin, zu ermöglichen, vorhandene Liquidhandling-Geräteplattformen für die automatisierte Nukleinsäureextraktion zu nutzen. Dies soll mit einfachen Mitteln universell möglich sein.The invention was therefore based on the object to solve the known problems and thus to be able to carry out the automated extraction of nucleic acids much easier and faster than before. A broad object of the invention is to enable existing liquid handling device platforms to be used for automated nucleic acid extraction. This should be universally possible with simple means.

Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.The problem has been solved according to the features of the claims.

Basis der Erfindung ist die Beobachtung, dass Nukleinsäuren an die Oberfläche von strukturierten bzw. rauen Materialien (z.B. an Polymermaterialien) adsorbieren. Dazu ist es nur notwendig, eine Nukleinsäure enthaltende biologische Probe zu lysieren, um die Nukleinsäure freizusetzen. Dies kann mit dem Fachmann bekannten Puffern erfolgen. Nach Lyse wird die Probe mit einer organischen Substanz, vorzugsweise Alkohole oder Ketone, versetzt. Dieser Ansatz wird nunmehr mit einem Material, welches durch eine nichtglatte Oberfläche charakterisiert ist, in Kontakt gebracht. Unter diesen Voraussetzungen adsorbieren Nukleinsäuren an die Oberfläche des eingesetzten Materials. Nachfolgend erfolgen ggf. Waschschritte mit bekannten alkoholischen Waschlösungen. Nach Trocknung wird die adsorbierte Nukleinsäure durch Zugabe von Wasser oder eines Niedrigsalzpuffers (z.B. 10 mM Tris HCl) vom Material abgelöst und kann für downstream-Anwendungen eingesetzt werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren nutzt diese Möglichkeit für einen einfachen und automatisierbaren Extraktionsprozess. Die Vorrichtung besteht dabei aus einem Körper, der teilweise in eine Reaktionskavität eintauchen kann, wobei der Teil, der in diese Reaktionskavität eintaucht, eine nicht-glatte Oberfläche aufweist. Vorzugsweise verwendet man einen Hohlkörper, welcher Flüssigkeiten aufnehmen und abgeben kann. Besonders bevorzugt wird eine Pipettenspitze eingesetzt. Die Pipettenspitze ist so aufgebaut, dass sich an ihrer Außenfläche im letzten unteren Drittel ein strukturiertes bzw. raues Material befindet. Dies kann z.B. durch das Aufstecken eines passenden Ringes erfolgen (z.B. kann ein solcher Ring auf gängige Pipettenspitzen gesteckt werden, was die Universalität unterstreicht). Der Hohlkörper selbst kann aber ebenfalls über eine solche konstruktive Besonderheit (Rauheit) verfügen und somit aus einem Teil bestehen und in einem Spritzgusswerkzeug produziert werden. In der 1 ist die erfindungsgemäße Vorrichtung beispielhaft für eine modifizierte Pipettenspitze skizziert. Der Begriff „raue Oberfläche“ ist so zu verstehen, dass durch Berühren der Oberfläche erkennbar ist, dass diese nicht glatt ist.The basis of the invention is the observation that nucleic acids adsorb to the surface of structured or rough materials (eg polymer materials). For this purpose, it is only necessary to lyse a nucleic acid-containing biological sample to release the nucleic acid. This can be done with buffers known to those skilled in the art. After lysis, the sample is mixed with an organic substance, preferably alcohols or ketones. This approach is now brought into contact with a material which is characterized by a non-smooth surface. Under these conditions, nucleic acids adsorb to the surface of the material used. Subsequently, if necessary, washing steps with known alcoholic washing solutions. After drying, the adsorbed nucleic acid is removed from the material by the addition of water or a low salt buffer (eg 10 mM Tris HCl) and can be used for downstream applications. The device according to the invention and the method according to the invention make use of this possibility for a simple and automatable extraction process. The device consists of a body that can partially dip into a reaction cavity, wherein the part that dips into this reaction cavity, has a non-smooth surface. Preferably, a hollow body is used which can absorb and deliver liquids. Particularly preferred is a pipette tip is used. The pipette tip is constructed so that there is a structured or rough material on its outer surface in the last lower third. This can be done, for example, by attaching a suitable ring (eg, such a ring can be placed on common pipette tips, which underscores the universality). However, the hollow body itself may also have such a structural feature (roughness) and thus consist of one part and be produced in an injection mold. In the 1 the device according to the invention is sketched by way of example for a modified pipette tip. The term "rough surface" is understood to mean that touching the surface reveals that it is not smooth.

Das erfindungsgemäße Vorrichtung wird für das erfindungsgemäße Verfahren zur automatisierten Extraktion von Nukleinsäuren wie folgt eingesetzt: Vorzugsweise nutzt man ein klassisches walk-away-Prinzip, d.h. die für die Extraktion benötigten Lösungen werden vorgelegt und sukzessive in den Extraktionsprozess einbezogen. Entsprechend der Zielstellung der vorliegenden Erfindung können für den automatisierten Extraktionsablauf sogar kommerziell verfügbare Extraktionsautomaten oder Pipettierautomaten eingesetzt werden, wenn diese über die notwendigen technischen Voraussetzungen verfügen. Die Probe wird in eine Reaktionskavität gegeben und mit Lysepuffer und ggf. proteolytischen Enzymen versetzt. Danach erfolgt die Probenlyse. Nach Lyse der Probe mit bekannten Lysepuffern wird dem Lysat eine organische Komponente zugegeben. In diese Lösung taucht die erfindungsgemäße Vorrichtung ein und wird in der Lösung mehrere Male vertikal auf- und ab bewegt. Nun befinden sich die Nukleinsäuren an dieser Vorrichtung. Danach wird die Vorrichtung aus der Lösung entfernt und in eine neue Reaktionskavität bewegt. In dieser befindet sich ein alkoholischer Waschpuffer (auch hierbei können bekannte Waschpuffer verwendet werden) bzw. nur ein Alkohol. In diese Lösung taucht das erfindungsgemäße Mittel ein und wird in der Lösung mehrere Male vertikal auf- und ab bewegt. Die Waschschritte können mehrere Male wiederholt werden. Nach dem letzten Waschschritt wird das die Vorrichtung aus der Lösung entfernt und außerhalb der Kavität kurz getrocknet, damit der restliche Alkohol entfernt wird. Im letzten Schritt wird die erfindungsgemäße Vorrichtung in eine weitere Kavität getaucht, in welcher sich Wasser oder ein anderer Niedrigsalzpuffer befindet. Auch in diese Kavität taucht die erfindungsgemäße Vorrichtung ein und wird in der Lösung mehrere Male vertikal auf- und abbewegt. Dies führt zum Ablösen der gebundenen Nukleinsäure. Aus diesem allgemeinem Ablaufprotokoll wird ersichtlich, wie einfach die automatisierte Extraktion nunmehr ist. Es muss keine Separation von magnetischen Partikeln mehr vorgenommen werden, wie dies bei der automatisierten Extraktion mittels Magnetpartikeln der Fall ist. Das Verfahren benötigt keine Vakuumfiltrationschschritte, wie bei der Nutzung von Filterplatten notwendig. Es benötigt lediglich die erfindungsgemäße Vorrichtung sowie eine Pipettierplattform. Vorteilhaft ist dabei natürlich die Universalität und Einfachheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung, da man kommerziell verfügbare Standardpipettenspitzen nehmen kann. Diese Pipettenspitzen werden durch aufstecken z.B. eines Ringes mit der für die Isolierung von Nukleinsäuren notwendigen spezifischen Oberflächeneigenschaft so modifiziert, dass sie zur erfindungsgemäßen Vorrichtung werden und somit auf beliebigen Pipettierplattformen für die Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden können.The device according to the invention is used for the method according to the invention for the automated extraction of nucleic acids as follows: Preferably, a classical walk-away principle is used, ie the solutions required for the extraction are presented and successively included in the extraction process. According to the objective of the present invention, even commercially available extraction machines or automatic pipetting machines can be used for the automated extraction process if they have the necessary technical prerequisites. The sample is placed in a reaction cavity and mixed with lysis buffer and possibly proteolytic enzymes. Thereafter, the sample lysis takes place. After lysing the sample with known lysis buffers, an organic component is added to the lysate. In this solution, the device according to the invention immersed and is in the solution several times vertically moved up and down. Now the nucleic acids are on this device. Thereafter, the device is removed from the solution and moved to a new reaction cavity. In this there is an alcoholic wash buffer (this well known wash buffer can be used) or only one alcohol. The agent according to the invention is immersed in this solution and is moved up and down vertically several times in the solution. The washing steps can be repeated several times. After the last washing step, the device is removed from the solution and briefly dried outside the cavity to remove the residual alcohol. In the last step, the device according to the invention is immersed in a further cavity in which water or another low-salt buffer is located. The device according to the invention also dips into this cavity and is moved up and down vertically several times in the solution. This leads to detachment of the bound nucleic acid. From this general flowchart it becomes clear how easy the automated extraction is now. Separation of magnetic particles is no longer required, as is the case with automated magnetic particle extraction. The process does not require any vacuum filtration steps, as is necessary with the use of filter plates. It only requires the device according to the invention and a pipetting platform. Of course, the universality and simplicity of the device according to the invention is advantageous since commercially available standard pipette tips can be used. These pipette tips are modified by attaching eg a ring with the specific surface property necessary for the isolation of nucleic acids in such a way that they become the device according to the invention and thus can be used on arbitrary pipetting platforms for the isolation of nucleic acids.

Darüber hinaus können die für die Extraktion benötigten Reagenzien in entsprechenden Reaktionskavitäten bereits vorgelegt sein, so dass der Extraktionsprozess nach dem walk-away-Prinzip ablaufen kann. Ein weiterer besonderer Vorteil offenbart sich dadurch, dass das erfindungsgemäße Mittel nicht nur die Anbindung der Nukleinsäure ermöglicht, sondern darüber hinaus auch in separater Art noch Flüssigkeiten bewegen kann. In dieser kombinierten Funktion kann der Extraktionsablauf noch weiter optimiert werden. So kann bereits die Lyse der Probe auf einem Automaten erfolgen. Die während der Lyse notwendige kontinuierliche Bewegung der Probe wird durch die Pipettierfunktion der erfindungsgemäßen Vorrichtung erreicht. Weiterhin kann nach dem finalen Elutionsschritt das Eluat auch aus der Elutionskavität mittels der Pipettierfunktion entfernt und in ein Lagergefäß überführt werden. Durch diese einfach umsetzbare Doppelfunktion des erfindungsgemäßen Mittels kann damit der Grad der Automatisierung flexibel erhöht werde.In addition, the reagents required for the extraction can already be presented in corresponding reaction cavities, so that the extraction process can proceed on the walk-away principle. A further particular advantage is revealed by the fact that the agent according to the invention not only enables the binding of the nucleic acid but, moreover, can also move liquids in a separate manner. In this combined function, the extraction process can be further optimized. Thus, the lysis of the sample can already be done on a machine. The necessary during the lysis continuous movement of the sample is achieved by the pipetting function of the device according to the invention. Furthermore, after the final elution step, the eluate can also be removed from the elution cavity by means of the pipetting function and transferred to a storage vessel. By means of this simply implementable double function of the agent according to the invention, the degree of automation can thus be flexibly increased.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele stellen dabei keine Limitierung der Erfindung dar.The invention will be explained in more detail with reference to embodiments. The embodiments do not represent a limitation of the invention.

Ausführungsbeispielembodiment

Automatisierte Extraktion von Nukleinsäure aus NIH 3T3 Zellen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und unter Verwendung einer modifizierten Pipettenspitze sowie unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren ExtraktionsautomatenAutomated extraction of nucleic acid from NIH 3T3 cells by the method according to the invention and using a modified pipette tip and using a commercially available extraction machine

Variante A: halbautoamischer Extraktionsablauf (Probenlyse erfolgt separat)Variant A: semi-autoclave extraction procedure (sample lysis is done separately)

Als Beispiel für einen Standard-Extraktionsautomat wurde der InnuPure C16 (Analytik Jena AG) verwendet. Bei diesem System handelt es sich um einen Magnetpartikelbasiertes Extraktionssystem, dass für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zweckentfremdet eingesetzt wurde. An das untere Ende der für den InnuPure C16 Automaten eingesetzten Pipettenspitzen wurde von außen ein Ring aufgesteckt in der Art, dass die Pipettierfunktion nicht beeinträchtigt wird. Der außen aufgesteckte Ring besteht dabei aus einem Polymer und weist eine strukturierte Oberfläche auf. Die Kombination aus Hohlkörper und daran befestigtem Ring bilden das Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. The InnuPure C16 (Analytik Jena AG) was used as an example for a standard extraction machine. This system is a magnetic particle-based extraction system that was used for the implementation of the method according to the invention for other purposes. A ring was attached to the bottom of the pipette tips used for the InnuPure C16 machine in such a way that the pipetting function is not impaired. The externally plugged ring consists of a polymer and has a textured surface. The combination of hollow body and attached ring form the means for carrying out the method according to the invention.

Für die Nukleinsäureextraktion wurden unterschiedlichen Mengen an NIH 3T3 Zellen eingesetzt. Die für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzte Extraktionschemie wurde dabei teilweise aus dem kommerziellen Extraktionskit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16X (Analytik Jena AG) genommen. Mittels eines Lysepuffers (Lysis Solution CBV) sowie von Proteinase K wurden die Zellen bei 60°C für 15 min in einem 2.0 ml Reaktionsgefäß lysiert. Die Lyse erfolgte dabei nicht im Extraktionsautomaten. Nachfolgend wurde das automatisierte Verfahren des Innupure C16 für die Aufreinigung der Nukleinsäuren verwendet. Die für die Extraktion benötigten Lösungen lagen in einer vorbefüllten Deep-Well-Platte vor. Die oben beschriebenen Lysate wurden in Kavitäten gegeben, die mit 400 µl Isopropanol befüllt waren. Die mit dem Ring versehenen Pipettenspitzen (das erfindungsgemäße Mittel) vollzogen 80x eine vertikale Eintauchbewegung in diese Kavitäten, wobei am Boden der Kavität jeweils eine Inkubation von 2 s abgewartet wurde. Danach wurden die mit dem Ring modifizierten Piepettenspitzen sukzessive je 10x in drei weiteren Kavitäten eingetaucht, die alkoholische Waschpuffer (Washing Solution LS, 80%iger Ethanol, 80%iger Ethanol) enthielten. For nucleic acid extraction, different amounts of NIH 3T3 cells were used. The extraction chemistry used for the isolation of the nucleic acids was partially taken from the commercial extraction kit innuPREP Blood DNA Kit / IPC16X (Analytik Jena AG). Using a lysis buffer (Lysis Solution CBV) and proteinase K, the cells were lysed at 60 ° C for 15 min in a 2.0 ml reaction vessel. The lysis was not carried out in the extraction machine. Subsequently, the automated procedure of the Innupure C16 was used for the purification of the nucleic acids. The solutions required for the extraction were in a pre-filled deep-well plate. The lysates described above were placed in wells filled with 400 μl of isopropanol. The pipette tips provided with the ring (the agent according to the invention) completed a vertical immersion movement into these cavities 80 times, the am Floor of the cavity was awaited each incubation of 2 s. Thereafter, the ring-modified pipette tips were successively immersed 10x each in three additional wells containing alcoholic wash buffer (Washing Solution LS, 80% ethanol, 80% ethanol).

Im Anschluss an den letzten Waschschritt wurde der Ring an dem Hohlkörper 10 Minuten lang außerhalb der Kavität getrocknet und damit der restliche Ethanol entfernt. Die Elution der Nukleinsäuren erfolgte durch 30 Wiederholungen einer Ein- und Auftauchbewegung in 200 µl Elution Buffer, der durch das Gerät zuvor auf 50° C temperiert worden war. Es schloss sich in derselben Kavität ein Mischschritt mittels 80-maligem Pipettieren von 100 µl bei 40° C an. Dazu wurde die erfindungsgemäße doppelte Funktion des erfindungsgemäßen Mittels genutzt.Following the last washing step, the ring on the hollow body was dried outside the cavity for 10 minutes, thereby removing the residual ethanol. The elution of the nucleic acids was carried out by 30 repetitions of an entry and emergence movement in 200 ul elution buffer, which had previously been tempered by the device to 50 ° C. It was followed in the same cavity, a mixing step by 80 pipetting 100 ul at 40 ° C on. For this purpose, the double function of the agent according to the invention was used.

Das Verfahren ist extrem einfach in der Durchführung und dadurch extrem schnell. Im Vergleich zum Standardverfahren einer Nukleinsäureextraktion mit dem InnuPure C16 und der Verwendung von Magnetpartikeln für die Anbindung der Nukleinsäuren beträgt die Zeitersparnis über 50 %.The process is extremely easy to carry out and extremely fast. Compared to the standard method of nucleic acid extraction with the InnuPure C16 and the use of magnetic particles for the binding of the nucleic acids, the time saved is over 50%.

Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung und geleletrophoretischer Darstellung in einem Agarosegel.The detection of the isolated nucleic acid was carried out by means of spectrophotometric measurement and geletrophoretischer representation in an agarose gel.

Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung: Probe Konzentration (ng/µl) Ausbeute (µg) Ratio A₂₆₀:A₂₈₀ Ratio A₂₆₀:A₂₃₀ 1 5 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 72,52 14,5 1,79 1,53 2 5 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 64,11 12,8 1,96 1,58 3 2,5 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 45,19 9,0 1,74 1,41 4 2,5 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 32,88 6,8 1,91 1,29 5 1,25 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 19,4 3,9 1,8 1,1 6 1,25 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 10,47 2,1 1,76 1,05 7 0,62 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 5,65 1,1 1,34 0,76 8 0,62 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 5,84 1,2 1,9 0,7 Results of spectrophotometric measurement: sample Concentration (ng / μl) Yield (μg) Ratio A ₂₆₀ : A ₂₈₀ Ratio A ₂₆₀ : A ₂₃₀ 1 5 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 72.52 14.5 1.79 1.53 2 5 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 64.11 12.8 1.96 1.58 3 2.5 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 45.19 9.0 1.74 1.41 4 2.5 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 32.88 6.8 1.91 1.29 5 1.25 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 19.4 3.9 1.8 1.1 6 1.25 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 10.47 2.1 1.76 1.05 7 0.62 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 5.65 1.1 1.34 0.76 8th 0.62 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 5.84 1.2 1.9 0.7

Wie die Ergebnisse zeigen, ist es mit dem erfindungsgemäßen Mittel möglich, allein unter Verwendung einer Standard-Extraktionschemie und kommerziell erhältlicher Extraktionsplattformen Nukleinsäure zu binden und zu isolieren. Es zeigt sich, dass die Ausbeuten extrem hoch sind und dass in Abhängigkeit der eingesetzten Zellmengen auch Abstufungen bei den Ausbeuten zu beobachten sind. As the results show, it is possible with the agent according to the invention to bind and isolate nucleic acid using only a standard extraction chemistry and commercially available extraction platforms. It turns out that the yields are extremely high and that, depending on the amounts of cells used, gradations in the yields can also be observed.

2 zeigt die gelelektrophoretische Auftrennung der isolierten Nukleinsäure. Dargestellt ist die in einem 0,8 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennte Nukleinsäure, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens isoliert wurde. Die Proben wurden von links nach rechts, beginnend mit Probe 1 aufgetragen. Das aufgetragene Volumen betrug 5 µl. 2 shows the gel electrophoretic separation of the isolated nucleic acid. Shown is the electrophoretically separated in a 0.8% agarose gel nucleic acid isolated by the method according to the invention. The samples were applied from left to right beginning with sample 1. The applied volume was 5 μl.

Variante B: vollautomatischer Extraktionsablauf (Probenlyse erfolgt im Gerät)Variant B: fully automatic extraction process (sample lysis takes place in the device)

In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Lyse der Probe ebenfalls automatisiert. Somit ist vom Anwender lediglich die Probe und die Proteinase K zuzugeben, die weitere Präparation erfolgt komplett automatisiert mit der Technik des InnuPure C16. Für die Lyse der Probe wird diese vom Innupure C16 auf 50° C erhitzt und durch 250x Auf- und Abpipettieren die Lyse noch verstärkt. Im Anschluss erfolgt durch die Pipettierfunktion des Hohlkörpers die Verbringung von 400 µl Isopropanol aus einer vorbefüllten Kavität in die Kavität mit dem Lysat. Alle weiteren Schritte erfolgten wie oben beschrieben. Probe Konzentration (ng/µl) Ausbeute (µg) Ratio A₂₆₀:A₂₈₀ Ratio A₂₆₀:A₂₃₀ 1 2,5 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 33,07 6,6 1,72 1,14 2 2,5 × 10⁵ NIH 3T3 Zellen 34,02 6,8 1,62 1,13 In another embodiment, the lysis of the sample is also automated. Thus, the user only has to add the sample and the proteinase K, the further preparation is completely automated with the technique of the InnuPure C16. For the lysis of the sample, this is heated by Innupure C16 to 50 ° C and by 250x up and down pipetting lysis even further. Following the pipetting function of the hollow body, the transfer of 400 ul isopropanol from a prefilled cavity in the cavity with the lysate. All further steps were as described above. sample Concentration (ng / μl) Yield (μg) Ratio A ₂₆₀ : A ₂₈₀ Ratio A ₂₆₀ : A ₂₃₀ 1 2.5 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 33.07 6.6 1.72 1.14 2 2.5 x 10 ⁵ NIH 3T3 cells 34.02 6.8 1.62 1.13

3 zeigt die gelelektrophoretische Auftrennung der isolierten Nukleinsäure. Dargestellt ist die in einem 0,8 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennte Nukleinsäure, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und interner Lyse isoliert wurde. Die Proben wurden von links nach rechts, beginnend mit Probe 1 aufgetragen. Das aufgetragene Volumen betrug 5 µl. 3 shows the gel electrophoretic separation of the isolated nucleic acid. Shown is the electrophoretically separated in a 0.8% agarose gel nucleic acid isolated by means of the method according to the invention and internal lysis. The samples were applied from left to right beginning with sample 1. The applied volume was 5 μl.

1 ist eine exemplarische Ausführungsform des Ringes, der auf einen Hohlkörper aufgesteckt wird. Die Abbildung ist stark vergrößert. 1 is an exemplary embodiment of the ring, which is attached to a hollow body. The picture is greatly enlarged.

Dargestellt ist eine exemplarische Ausführungsform des Ringes, wie er für eine Nukleinsäureextraktion nach dem erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden kann. Dieser Formkörper mit nichtglatter Oberfläche kann auf beliebige kommerziell verfügbare Pipettenspitzen aufgesteckt werden, so dass dieser sich dann im letzten unteren Drittel der Spitze befindet.Shown is an exemplary embodiment of the ring, as it can be used for a nucleic acid extraction according to the inventive method. This non-smooth surface shaped body can be plugged onto any commercially available pipette tips so that it is located in the last lower third of the tip.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

DE 4139664 A1 [0004]
US 5234809 [0004]
WO 95/34569 A [0004]
DE 4321904 [0004]
DE 20207793 [0004]
EP 1135479 [0004]
DE 3717211 [0004, 0004]
EP 1951904 [0004]
US 2013/0078619 [0004]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" [0002]
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615-619 [0003]

Claims

Device for the automated extraction of nucleic acids, comprising a body which can be immersed in a reaction cavity partially or completely, characterized in that at least the part which is immersed in the reaction cavity has a non-smooth surface.

Apparatus according to claim 1, characterized in that it is an at least partially rough hollow body, preferably a pipette tip with a partially rough surface.

Apparatus according to claim 1, characterized in that it is a smooth hollow body, preferably a pipette tip, on which (the) a rough object is attached.

Apparatus according to claim 1, characterized in that it is the attachable object is a ring or a sleeve with non-smooth surface.

Hollow body or pipette tip according to one of claims 2 to 4, characterized in that it can absorb liquid which is located in a reaction cavity.

Device according to the walk-away principle for the automated extraction of nucleic acids, comprising at least one of the device according to one of claims 1 to 5.

Apparatus according to claim 6, characterized in that it is a pipetting or extraction machine.

Method for the automated extraction of nucleic acids, characterized by the following steps: a) A lysed biological sample is placed in a Reaktionskavität and treated with at least one means for binding nucleic acids to a solid phase b) immersing a device according to one of claims 1 to 5 in this cavity, wherein the nucleic acids bind to the rough part of this device c) transferring the device into an at least further cavity for washing the bound nucleic acids d) drying the bound nucleic acids e) transferring the dry bound nucleic acids into another cavity for the elution of the nucleic acids

A method according to claim 8, characterized in that by means of the pipetting function according to claim 5, the liquid of the cavity according to claim 5e is transferred to the device.

An automatic method according to claim 8 or 9 by means of a pipetting machine or an extraction machine.