DE102015003113A1 - Coated magnetic particles for the separation of biological cells and process for their preparation - Google Patents

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Thomas Heinze
Jana Wotschadlo
Joachim Clement
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Abstract

Aufgabe war es, die Selektivität in der unterschiedlichen Beladung der voneinander zu trennenden biologischen Zellen mit bioaktiven Magnetpartikeln zu erhöhen und über einen Zeitraum von zumindest 30 Minuten im Wesentlichen zu erhalten. Insbesondere soll damit erreicht werden, dass für die Separierung der Zellen in der Praxis keine zusätzlich erforderlichen bioaktiven Seitenfunktionen, wie Proteine oder Proteinfragmente, an den Magnetpartikeln gebunden werden müssen und die Separierung ohne notwendige zusätzliche Prozess-Schritte, wie die Gabe von Plasma, durchführbar ist. Erfindungsgemäß werden die Magnetpartikel (4) mit einer Umhüllungsschicht aus einem hinsichtlich der Substituentenbindung blockartig verteilten bioaktiven Polysaccharidderivat (2b) versehen (Reaktionsschema b)).The object was to increase the selectivity in the different loading of the biological cells to be separated from each other with bioactive magnetic particles and to obtain them substantially over a period of at least 30 minutes. In particular, it is intended to ensure that, in practice, no additionally required bioactive side functions, such as proteins or protein fragments, have to be bound to the magnetic particles for separation of the cells, and separation can be carried out without necessary additional process steps, such as the administration of plasma , According to the invention, the magnetic particles (4) are provided with a coating layer of a bioactive polysaccharide derivative (2b) which is distributed in a block-like manner with regard to the substituent binding (reaction scheme b)).

Description

Die Erfindung betrifft vorzugsweise einfach beschichtete bioaktive Magnetpartikel für die Trennung biologischer Zellen, beispielsweise zur Entfernung von im Blut zirkulierenden Tumorzellen mittels Magnetkraft, wobei die vorgeschlagenen bioaktiven Magnetpartikel bereits bei einer einstufigen Zellseparation eine hohe bisher nicht erreichte Wirksamkeit zeigen.The invention preferably relates to simply coated bioactive magnetic particles for the separation of biological cells, for example for the removal of tumor cells circulating in the blood by means of magnetic force, wherein the proposed bioactive magnetic particles already show a high level of efficiency not achieved in a single-stage cell separation.

Außerdem sind ein Verfahren zur Synthese ( , rechte Spalte) der vorgeschlagenen bioaktiven Magnetpartikel sowie deren Verwendung angegeben.In addition, a method for synthesis ( , right column) of the proposed bioactive magnetic particles and their use.

Die Separation der Zellen verschiedenen Typs erfolgt durch die Beladung der Zellen mit den bioaktiven Magnetpartikeln, wobei unterschiedliche Aufnahmegeschwindigkeiten von den zu separierenden Zellen und damit für die Trennung essentielle zeitlich unterschiedliche Beladungen der Zellen realisiert werden. Die aufgrund der unterschiedlichen Aufnahmezeiten mit den Magnetpartikeln beladenen Zellen können dann aus dem Blut durch Magnetfeldwirkung, beispielsweise sog. Magnetabscheider, entfernt werden. Mit dieser Magnetabscheidung werden alle magnetisch beladenen Zellen abgetrennt, was im besten Fall nur Zellen eines Typs sind und diese Zellen damit vollständig entfernt werden.The separation of the cells of different types is carried out by loading the cells with the bioactive magnetic particles, wherein different rates of absorption of the cells to be separated and thus for the separation of essential temporally different loadings of the cells are realized. The loaded due to the different recording times with the magnetic particles cells can then be removed from the blood by magnetic field effect, for example, so-called. Magnetic separator. With this magnetic separation all magnetically loaded cells are separated, which are in the best case only cells of one type and thus these cells are completely removed.

An sich bekannte Magnetpartikel zeigen eine solche Differenzierung in der Zellbeladung nicht (vgl. ).Magnetic particles known per se do not show such a differentiation in the cell loading (cf. ).

Daher werden die Oberflächen der Magnetpartikel, z. B. durch Polymerumhüllung, modifiziert. Diese Umhüllung führt zu einer spezifischen Wechselwirkung zwischen den Magnetpartikeln und Zellen und damit zur gewünschten differenzierten Aufnahmegeschwindigkeit (vgl. ).Therefore, the surfaces of the magnetic particles, e.g. B. by polymer sheath modified. This coating leads to a specific interaction between the magnetic particles and cells and thus to the desired differentiated absorption rate (cf. ).

Aus der DE 100 46 508 A1 ist ein Verfahren zur Herstellung oberflächenmodifizierter magnetischer Partikel bekannt, die Bindungen an Biomakromoleküle auf der Zelloberfläche eingehen können, so dass durch Einwirkung eines äußeren Magnetfeldes eine Separation der Zellen mit den aufgenommenen Magnetpartikeln ermöglicht wird. Zu diesem Zweck werden die Partikel mit einer Schicht aus handelsüblichen, konventionellen Carboxymethyldextran beschichtet. Diese Modifizierung führt zu einer Differenzierung der Geschwindigkeit, mit welcher die Carboxymethyldextran-beschichteten Magnetpartikel von unterschiedlichen Zellen aufgenommen werden (vgl. ). Das Ausmaß der Differenzierung ist aber für die beabsichtigte Zellseparation in der Praxis nicht ausreichend. Es konnte eine Separierungsrelation zwischen den zu trennenden biologischen Zellen von maximal 76:21 erreicht werden. Sowohl dieser initiale Unterschied in der Beladung als auch der zeitliche Verlauf der Beladung sind für eine besagte praxiswirksame magnetische Separation nicht ausreichend, d. h. alle Zellen weisen nach ca. 15 min bereits eine gleichhohe magnetische Dotierung auf. Daher müssen für die Zellseparierung zusätzlich zur Zellbeladung mit den bioaktiven Magnetpartikeln in einem aufwendigen und wenig reproduzierbaren Prozess an die Polymeroberfläche weitere bioaktive Komponenten gebunden werden, was den Aufwand deutlich erhöht und die praktische Anwendung dennoch hinsichtlich einer wirksamen Zellseparierung als fraglich erscheinen lässt.From the DE 100 46 508 A1 discloses a method for producing surface-modified magnetic particles, which can bind to biomacromolecules on the cell surface, so that by the action of an external magnetic field, a separation of the cells is made possible with the magnetic particles. For this purpose, the particles are coated with a layer of commercially available, conventional carboxymethyldextran. This modification leads to a differentiation of the rate at which the carboxymethyldextran-coated magnetic particles are taken up by different cells (cf. ). However, the extent of differentiation is not sufficient for the intended cell separation in practice. It was possible to achieve a separation ratio between the biological cells to be separated of a maximum of 76:21. Both this initial difference in the loading and the time course of the loading are not sufficient for a said practical magnetic separation, ie all cells already show an equally high magnetic doping after about 15 minutes. Therefore, in addition to the cell loading with the bioactive magnetic particles, additional bioactive components must be bound to the polymer surface in a complex and less reproducible process, which considerably increases the expense and nevertheless makes the practical application questionable with regard to effective cell separation.

Andere Oberflächenbeschichtungen der Magnetpartikel als die vorgenannte Polymerschicht, welche ohne erforderliche Anbindung zusätzlicher bioaktiver Funktionen, wie Proteinfragmente, eine bereits hinreichende Selektivität der Zellbeladung ermöglichen, sind der Fachwelt nicht bekannt geworden.Other surface coatings of the magnetic particles than the aforementioned polymer layer, which allow already without sufficient binding of additional bioactive functions, such as protein fragments, an already sufficient selectivity of the cell loading, have not become known in the art.

Die gezielte Abtrennung (Separation) von Zellen aus Zell-Gemischen stellt heute in verschiedenen Bereichen der Biomedizin eine wichtige Technik dar ( I. Safarik and M. Safarikova: Use of magnetic techniques for the isolation of cells, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1999, 722(1–2), 33–53 ).The selective separation (separation) of cells from cell mixtures is today an important technique in various fields of biomedicine ( I. Safarik and M. Safarikova: Use of Magnetic Techniques for the Isolation of Cells, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1999, 722 (1-2), 33-53 ).

Neben der Unterscheidung nach Größe kann eine Trennung basierend auf optischen oder magnetischen Eigenschaften erfolgen. Für Letzteres wird die Markierung von Zellen mit magnetischen Nanopartikeln genutzt, die superparamagnetische Eigenschaften haben.Besides discrimination by size, separation can be based on optical or magnetic properties. For the latter, the labeling of cells with magnetic nanoparticles is used, which have superparamagnetic properties.

In den letzten Jahren wurden verschiedene Ansätze erarbeitet, um basierend auf diesem Konzept eine selektive Abtrennung von epithelialen, zirkulierenden Tumorzellen (circulating epithelial tumor cells; CETCs) aus peripherem Blut zu erreichen. Diese Zellen werden von Primärtumoren abgesondert und können sich über die Blutbahn sowie die Lymphe schnell und weiträumig im menschlichen Körper verbreiten. ( K. Hekimian, S. Meisezahl, K. Trompelt, C. Rabenstein, K. Pachmann: Epithelial Cell Dissemination and Readhesion: Analysis of Factors Contributing to Metastasis Formation in Breast Cancer, ISRN Oncology Volume 2012, Article ID 601810, 8 pages ) Disseminierte Tumorzellen werden als eine der Hauptursachen für die hämatogene Metastasierung von Malignomen angesehen.In recent years, various approaches have been developed to selectively remove epithelial circulating epithelial tumor cells (CETCs) from peripheral blood based on this concept. These cells are secreted by primary tumors and can spread rapidly and widely in the human body through the bloodstream and lymph. ( K. Hekimian, S. Meisezahl, K. Trompelt, C. Rabenstein, K. Pachmann: Epithelial Cell Dissemination and Readhesion: Analysis of Factors Contributing to Metastasis Formation in Breast Cancer, ISRN Oncology Volume 2012, Article ID 601810, 8 pages Disseminated tumor cells are considered to be one of the main causes of hematogenous metastasis of malignancies.

Auf Grundlage der magnetischen Abtrennung von Tumorzellen aus einem Zellgemisch besteht ein visionärer Ansatz zur Krebstherapie.Based on the magnetic separation of tumor cells from a cell mixture, there is a visionary approach to cancer therapy.

In WO 02/094350 A2 wird ein Verfahren zum magnetischen Markieren von Zellen des peripheren Blutes und ihre Abtrennung beschrieben. Das Ziel ist die Entwicklung eines in vivo anwendbaren Verfahrens zur Depletion disseminierter Zellen aus dem peripheren Blut von Tumorpatienten. Visionäre Therapieansätze gehen dabei von einer Art Dialyse mit umhüllten Magnet-Nanopartikeln (MNPs) basierend auf der Methode der magnetischen Zellseparation aus. Das periphere Blut des behandelten Patienten würde dazu zunächst einer Leukapherese unterzogen werden, d. h. alle weißen Blutzellen werden aus dem Blut isoliert. Die angereicherten Leukozyten und die zusätzlich in dieser Fraktion enthaltenen Tumorzellen würden dann über einen definierten Zeitraum (bis zu 30 min) mit den MNP inkubiert und anschließend einer magnetischen Separation zugeführt werden. Aufgrund der zelltyp- und zeitabhängigen Interaktion zwischen Partikeln und Zellen sollte so eine Abreicherung der malignen Zellen möglich sein. Die nach der Separation erhaltene Positivfraktion mit den angereicherten Tumorzellen würde entfernt, während die Negativfraktion, welche die Leukozyten enthalten und frei von Tumorzellen sein sollte, zu dem Patienten zurückgeführt werden würde.In WO 02/094350 A2 For example, a method for magnetically labeling cells of the peripheral blood and their separation will be described. The aim is the development of an in vivo applicable method for depleting disseminated cells from the peripheral blood of tumor patients. Visionary therapeutic approaches are based on a type of dialysis with coated magnetic nanoparticles (MNPs) based on the method of magnetic cell separation. The peripheral blood of the treated patient would first be subjected to leukapheresis, ie all white blood cells are isolated from the blood. The enriched leukocytes and the tumor cells additionally contained in this fraction would then be incubated with the MNP over a defined period of time (up to 30 minutes) and then sent to a magnetic separation. Due to the cell-type and time-dependent interaction between particles and cells, a depletion of the malignant cells should be possible. The positive fraction containing the enriched tumor cells obtained after separation would be removed while the negative fraction containing the leukocytes and being free of tumor cells would be returned to the patient.

Um das ohnehin durch Krankheit und Therapie geschwächte Immunsystem des Patienten zu stabilisieren, ist es daher notwendig die MNPs so zu modifizieren, dass möglichst wenige Leukozyten mit den Kern-Hülle Nanopartikeln interagieren und dass der Unterschied in der Beladung über den Zeitraum der Behandlung und Abtrennung nahezu konstant bleibt. Andernfalls würden sie im Rahmen der „Dialyse” zusammen mit den Tumorzellen als Positivfraktion abgereichert und verworfen werden. Die wichtigste Voraussetzung für die Tumorzelldepletion ist daher die zelltypspezifische Wechselwirkung mit den MNPs über einen Zeitraum von wenigstens 30 min.In order to stabilize the patient's immune system, which is already weakened by illness and therapy, it is therefore necessary to modify the MNPs so that as few leukocytes interact with the core-shell nanoparticles and that the difference in loading over the period of treatment and separation almost remains constant. Otherwise, they would be depleted in the context of "dialysis" together with the tumor cells as a positive fraction and discarded. The most important requirement for tumor cell depletion is therefore the cell-type-specific interaction with the MNPs over a period of at least 30 minutes.

Reine MNPs zeigen eine sehr schnelle und unspezifische Beladung der Zellen (vgl. wiederum ). Für eine Erhöhung der Selektivität erfolgt eine Funktionalisierung der Partikeloberfläche mit Antikörpern (immunomagnetische Beads) ( W. S. Prestvik, A. Berge, P. C. Mork, P. M. Stenstad and J. Ugelstad: Preparation and application of monosized magnetic particles in selective cell separation, Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers, 1997, 11–35 ; A. A. Neurauter, M. Bonyhadi, E. Lien, L. Nokleby, E. Ruud, S. Camacho and T. Aarvak: Cell isolation and expansion using dynabeads®, in Cell Separation, Springer 2007, 41–73 ; D. Antolovic, L. Galindo, A. Carstens, N. Rahbari, M. W. Büchler, J. Weitz and M. Koch: Heterogeneous detection of circulating tumor cells in patients with colorectal cancer by immunomagnetic enrichment using different epcam-specific antibodies, BMC Biotechnology, 2010, 10(1), 35–42 ), mit Antigenen, Oligosacchariden oder Phagen ( I. Safarik and M. Safarikova: Use of magnetic techniques for the isolation of cells, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1999, 722(1–2), 33–53 ).Pure MNPs show a very fast and unspecific loading of the cells (cf. ). In order to increase the selectivity, a functionalization of the particle surface with antibodies (immunomagnetic beads) ( WS Prestvik, A. Berge, PC Mork, PM Stenstad and J. Ugelstad: Preparation and application of monosized magnetic particles in selective cell separation, Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers, 1997, 11-35 ; AA Neurauter, M. Bonyhadi, E. Lien, L. Nokleby, E. Ruud, S. Camacho and T. Aarvak: Cell isolation and expansion using dynabeads®, in Cell Separation, Springer 2007, 41-73 ; D. Antolovic, L. Galindo, A. Carstens, N. Rahbari, MW Büchler, J. Weitz, and M. Koch: Heterogeneous Detection of Circulating Tumor Cells in Patients with Colorectal Cancer by Immunoassay Using Different Epcam-Specific Antibodies, BMC Biotechnology , 2010, 10 (1), 35-42 ), with antigens, oligosaccharides or phages ( I. Safarik and M. Safarikova: Use of Magnetic Techniques for the Isolation of Cells, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1999, 722 (1-2), 33-53 ).

Eine solche Oberflächenmodifizierung mit z. B. Antikörpern führt gewöhnlich zu einer hohen Selektivität. Nachteilig sind jedoch der hohe Verbrauch von teuren und oft schlecht zugänglichen Antikörpern, eine schlecht kontrollierbare Kopplung der Antikörper sowie eventuelle Kreuzreaktionen, was sich störend auf den Separationsvorgang auswirken kann.Such surface modification with z. B. Antibody usually results in high selectivity. Disadvantages, however, are the high consumption of expensive and often poorly accessible antibodies, poorly controllable coupling of the antibodies and possible cross-reactions, which can have a disruptive effect on the separation process.

Daher ist der gegenwärtig wichtigste Lösungsansatz eine Ummantelung der MNPs mit einer Polysaccharidhülle. Dextran-umhüllte Eisenpartikel wurden erstmals 1982 von Molday und Mackenzie zur spezifischen Markierung und Separation von Zellen eingesetzt. ( R. S. Molday, D. Mackenzie: Immunospecific ferromagnetic iron-dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells, J Immunol Methods, 1982, 52(3), 353–67 ).Therefore, the currently most important approach is a sheath of the MNPs with a polysaccharide sheath. Dextran-coated iron particles were first used by Molday and Mackenzie in 1982 for the specific labeling and separation of cells. ( RS Molday, D. Mackenzie: Immunospecific Ferromagnetic Iron-Dextran Reagents for the Labeling and Magnetic Separation of Cells, J. Immunol. Methods, 1982, 52 (3), 353-67 ).

Mehrere Arbeiten von Schwalbe und Clement et al. ( M. Schwalbe, C. Jörke, N. Buske, K. Höffken, K. Pachmann, and J. H. Clement: Selective reduction of the interaction of magnetic nanoparticles with leukocytes and tumor cells by human plasma, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2005, 293(1), 433–437 ; J. H. Clement, M. Schwalbe, N. Buske, K. Wagner, M. Schnabelrauch, P. Görnert, K. O. Kliche, K. Pachmann, W. Weitschies and K. Höffken: Differential interaction of magnetic nanoparticles with tumor cells and peripheral blond cells, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 2006, 132(5), 287–292 ) zeigen, dass Tumorzellen deutlich schneller mit Carboxymethyldextran (CMD)-umhüllten, superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln interagieren als Leukozyten (vgl. ), was für verschiedene Zelllinien des Mammakarzinoms (MCF-7, BT-20) oder chronischer myeloischer Leukämie (K562) gezeigt werden konnte ( M. Schwalbe, N. Buske, M. Vetterlein, K. Höffken, K. Pachmann and J. H. Clement: The carboxymethyl dextran shell is an important modulator of magnetic nanoparticle uptake in human cells, Zeitschrift für Physikalische Chemie, 2006, 220(1/2006), 125–131 ) und somit offenbar unabhängig vom zellulären Ursprung ist.Several papers by Schwalbe and Clement et al. ( M. Schwalbe, C. Jörke, N. Buske, K. Höffken, K. Pachmann, and JH Clement: Selective reduction of the interaction of magnetic nanoparticles with leukocytes and tumor cells by human plasma, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2005, 293 (1), 433-437 ; JH Clement, M. Schwalbe, N. Buske, K. Wagner, M. Schnabelrauch, P. Görnert, KO Kliche, K. Pachmann, W. Weitschies and K. Höffken: Differential interaction of magnetic nanoparticles with tumor cells and peripheral blond cells , Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 2006, 132 (5), 287-292 ) show that tumor cells interact significantly faster with carboxymethyldextran (CMD) -coated, superparamagnetic iron oxide nanoparticles than leukocytes (cf. ), which could be shown for different mammalian carcinoma cell lines (MCF-7, BT-20) or chronic myeloid leukemia (K562) ( M. Schwalbe, N. Buske, M. Vetterlein, K. Höffken, K. Pachmann, and JH Clement: The carboxymethyl dextran shell is an important modulator of magnetic nanoparticle uptake in human cells, Journal of Physical Chemistry, 2006, 220 (1 / 2006), 125-131 ) and thus apparently independent of cellular origin.

Die CMD-Hülle der Nanopartikel scheint auf die Aufnahmegeschwindigkeit von Tumorzellen keinen Einfluss zu haben – die Aufnahmerate ist mit der von nicht-umhüllten Primärpartikeln vergleichbar. Leukozyten hingegen nehmen die CMD-umhüllten Nanopartikel deutlich schlechter auf. ( K. Wagner, A. Kautz, M. Räder, M. Schwalbe, K. Pachmann, J. H. Clement and M. Schnabelrauch: Synthesis of oligonucleotidefunctionalized magnetic nanoparticles and study on their in vitro cell uptake, Applied Organometallic Chemistry, 2004, 18(10), 514–519 ; K. Aurich, M. Schwalbe, J. H. Clement, W. Weitschies and N. Buske: Polyaspartate coated magnetite nanoparticles for biomedical applications, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2007, 311(1), 1–5 ; J. Wotschadlo, T. Liebert, T. Heinze, K. Wagner, M. Schnabelrauch, S. Dutz, R. Müller, F. Steiniger, M. Schwalbe, T. C. Kroll, K. Höffken, N. Buske and J. H. Clement: Magnetic nanoparticles coated with carboxymethylated polysaccharide shells–interaction with human cells, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2009, 321(10), 1469–1473 ).The CMD shell of the nanoparticles does not appear to affect the uptake rate of tumor cells - the uptake rate is comparable to that of uncoated primary particles. Leucocytes, on the other hand, absorb the CMD-coated nanoparticles significantly worse. ( K. Wagner, A. Kautz, M. Wheels, M. Schwalbe, K. Pachmann, JH Clement and M. Schnabelrauch: Synthesis of oligonucleotide functionalized magnetic nanoparticles and study on their in vitro cell uptake, Applied Organometallic Chemistry, 2004, 18 (10 ), 514-519 ; K. Aurich, M. Schwalbe, JH Clement, W. Weitschies, and N. Buske: Polyaspartates coated magnetite nanoparticles for biomedical applications, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2007, 311 (1), 1-5 ; J. Wotschadlo, T. Liebert, T. Heinze, K. Wagner, M. Schnabelrauch, S. Dutz, R. Müller, F. Steiniger, M. Schwalbe, TC Kroll, K. Höffken, N. Buske and JH Clement: Magnetic nanoparticles coated with carboxymethylated polysaccharide shells-interaction with human cells, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2009, 321 (10), 1469-1473 ).

Diese deutliche zeitabhängige Interaktion von CMD-umhüllten MNPs mit Tumorzellen und Leukozyten erlaubt die gewünschte Anreicherung der Tumorzellen. Bei einer Kurzzeit-Inkubation von 4–8 min ist eine Abtrennung der Tumorzellen von den Leukozyten möglich. Jedoch haben sich die Leukozyten den Tumorzellen nach 30 min in der aufgenommenen Menge an Nanopartikeln angepasst. Dies ist für eine Zelltrennung in der Praxis nicht ausreichend. In auf solchen Partikeln basierenden Verfahren muss die weitere Interaktion der Zellen mit den Partikeln durch gleichzeitige Plasmagabe aufwendig unterbunden werden.This marked time-dependent interaction of CMD-enveloped MNPs with tumor cells and leukocytes allows the desired accumulation of tumor cells. In a short-term incubation of 4-8 min, a separation of the tumor cells from the leukocytes is possible. However, the leukocytes have adapted to the tumor cells after 30 min in the absorbed amount of nanoparticles. This is not sufficient for cell separation in practice. In methods based on such particles, the further interaction of the cells with the particles must be complicatedly prevented by simultaneous plasma administration.

Stand der Technik ist, dass Dextran mit verschiedenen Molmassen (1 6000 g/mol, 2 16000 g/mol, 3 200000 g/mol und 4 2000000 g/mol) in Lösungsmitteln wie Alkoholen oder Wasser bzw. Mischungen der beiden mit Monochloressigsäure in Gegenwart wässriger NaOH umgesetzt wird. Für die Carboxymethylierung von Dextran wird heutzutage fast ausschließlich eine Umsetzung in Isopropylalkohol/Wasser-Gemischen genutzt ( R. Huynh, F. Chaubet, and J. Jozefonvicz: Carboxymethylation of dextran in aqueous alcohol as the first step of the preparation of derivatized dextrans, Die Angewandte Makromolekulare Chemie 254(1), 1998, 61–65 ; V. B. Sokolov, K. A. Krasnov, I. Y. Matyashichev and B. V. Passet: Carboxymethylation of dextran, Russian Journal 72, 1999, 349–350, 1999 ; Th. Heinze, T. Liebert, B. Heublein, St. Hornig: Functional Polymers Based on Dextran, In: Advances in Polymer Science, Polysaccharides II, Ed. D Klemm, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, 2006, 199–291 ).The prior art is that dextran with different molecular weights (1 6000 g / mol, 2 16000 g / mol, 3 200000 g / mol and 4 2 000 000 g / mol) in solvents such as alcohols or water or mixtures of the two with monochloroacetic acid in the presence aqueous NaOH is reacted. For the carboxymethylation of dextran today almost exclusively a reaction in isopropyl alcohol / water mixtures is used ( R. Huynh, F. Chaubet, and J. Jozefonvicz: Carboxymethylation of dextran in aqueous alcohol as the first step of the preparation of derivatized dextrans, The Applied Macromolecular Chemistry 254 (1), 1998, 61-65 ; VB Sokolov, KA Krasnov, IY Matyashichev and BV Passet: Carboxymethylation of dextran, Russian Journal 72, 1999, 349-350, 1999 ; Th. Heinze, T. Liebert, B. Heublein, St. Hornig: Functional Polymers Based on Dextran, In: Advances in Polymer Science, Polysaccharides II, Ed. D Klemm, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, 2006, 199-291 ).

Die Veretherungsreaktion kann auch in komplett wässrigen Medien erfolgen. ( E. Antonini, L. Bellelli, M. R. Bruzzesi, A. Caputo, E. Chiancon, B. Mondovi, A. R. Fanelli, and R. Zito: Studies on dextran and dextran derivates part 3. preparation and properties of carboxymethyl and diethylaminoethyl derivates of native dextran, Italian Journal of Biochemistry 14, 1965, XVIII, 90–100 ; F. Chaubet, J. Champion, O. Maïga, S. Mauray, and J. Jozefonvicz: Synthesis and structure anticoagulant property relationships of functionalized dextrans: Cmdbs. Carbohydrate Polymers 28(2), 1995, 145–152 ; L. Krentsel, F. Chaubet, A. Rebrov, J. Champion, I. Ermakov, P. Bittoun, S. Fermandjian, A. Litmanovich, N. Platé and J. Jozefonvicz: Anticoagulant activity of functionalized dextrans, structure analyses of carboxymethylated dextran and first monte carlo simulations, Carbohydrate Polymers 33(1), 1997, 63–71 , A. E. J. de Nooy, D. Capitani, G. Masci and V. Crescenzi: Ionic polysaccharide hydrogels via the passerini and ugi multicomponent condensations: synthesis, behavior and solidstate NMR characterization, Biomacromolecules 1(2), 2000, 259–267 ) Derartige CMD sind kommerziell erhältlich und werden im Folgenden daher als „kommerzielle CMD” bezeichnet (Synthese entsprechend , linke Spalte).The etherification reaction can also be carried out in completely aqueous media. ( E. Antonini, L. Bellelli, MR Bruzzesi, A. Caputo, E. Chiancon, B. Mondovi, AR Fanelli, and R. Zito: Studies on Dextran and Dextran Derivatives Part 3. Preparation and Properties of Carboxymethyl and Diethylaminoethyl Derivatives of Native dextran, Italian Journal of Biochemistry 14, 1965, XVIII, 90-100 ; Chaubet, J. Champion, O. Maïga, S. Mauray, and J. Jozefonvicz: Synthesis and structure anticoagulant property relationships of functionalized dextrans: Cmdbs. Carbohydrate Polymers 28 (2), 1995, 145-152 ; L. Krentsel, F. Chaubet, A. Rebrov, J. Champion, I. Ermakov, P. Bittoun, S. Fermandjian, A. Litmanovich, N. Platé and J. Jozefonvicz: Anticoagulant activity of functionalized dextrans, structure analyzes of carboxymethylated dextran and first monte carlo simulations, Carbohydrate Polymers 33 (1), 1997, 63-71 . AEJ de Nooy, D. Capitani, G. Masci and V. Crescenzi: Ionic polysaccharide hydrogels via the passerini and multicomponent condensations: synthesis, behavior and solid state NMR characterization, Biomacromolecules 1 (2), 2000, 259-267 Such CMD are commercially available and are therefore hereinafter referred to as "commercial CMD" (Synthesis accordingly , left column).

Bei diesen Umsetzungen kann man über die Menge der eingesetzten Reagenzien, die Reaktionszeit und die Temperatur den Grad der Funktionalisierung (degree of substitution, DS, Menge der eingeführten chemischen Funktionen bezogen auf die Polymergrundeinheit, Anhydroglucose-Einheit, kann maximal 3 betragen) einstellen (vgl. Tab. 1) und über die Wahl der Ausgangspolymere (Dextran unterschiedlicher Molmassen von 6000 – 2 × 106 g/mol 1–6) die Molmassen kontrollieren. Beide Parameter sind jedoch nicht geeignet, den Trenneffekt zwischen Tumorzellen und Leukozyten signifikant zu erhöhen.In these reactions, it is possible via the amount of reagents used, the reaction time and the temperature, the degree of functionalization (degree of substitution, DS, amount of introduced chemical functions based on the polymer unit, anhydroglucose unit, can be a maximum of 3) (see Table 1) and the choice of the starting polymers (dextran of different molecular weights of 6000 - 2 × 10 6 g / mol 1-6) the molecular weights control. However, both parameters are not suitable for significantly increasing the separation effect between tumor cells and leucocytes.

So wird mit Partikeln die eine Hülle aus derartigen CMDs aufweisen keine Differenzierung im Beladungsverhältnis von wenigstens 90% (Tumorzellen) zu 20% (Leukozyten) oder besser erreicht (vgl. ). Die Differenzierung ist bereits nach 12 min Inkubation nahezu aufgehobenThus, with particles which have a shell of such CMDs, no differentiation in the loading ratio of at least 90% (tumor cells) to 20% (leukocytes) or better is achieved (cf. ). The differentiation is already almost eliminated after 12 min incubation

Darüber hinaus wurden für spezielle technische Verwendungen als Viskositätsregler, insbesondere für die Ölförderung, Cellulosederivate mit diskontinuierlicher Struktur untersucht ( G. Mann, J. Kunze, F. Loth, H. P. Fink: Cellulose ethers with a block-like distribution of the substituents by structure selective derivatization of cellulose, Polymer 39, 1998, 3155–3165 ; J. Einfeldt, Th. Heinze, T. Lieben, A. Kwasniewski: Influence of the p-Toluenesulfonation of Cellulose on the Polymer Dynamics Investigated by Dielectric Spectroscopy, Carbohydrate Polymers 49, 2002, 357–365 ).In addition, for specific technical uses as viscosity regulators, in particular for oil extraction, cellulose derivatives with a discontinuous structure have been investigated ( G. Mann, J. Kunze, F. Loth, HP Fink: Cellulose ethers with a block-like distribution of the substituents by structure selective derivatization of cellulose, Polymer 39, 1998, 3155-3165 ; J. Einfeldt, Th. Heinze, T. Lieben, A. Kwasniewski: Influence of the p-Toluenesulfonation of Cellulose on the Polymer Dynamics Investigated by Dielectric Spectroscopy, Carbohydrate Polymers 49, 2002, 357-365 ).

Über andere Verwendungen solcher Viskositätsregler ist in der Fachwelt nichts bekannt geworden.Other uses of such viscosity regulators have not been disclosed in the art.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Selektivität in der unterschiedlichen Beladung der voneinander zu trennenden biologischen Zellen mit bioaktiven Magnetpartikeln zu erhöhen und über einen Zeitraum von zumindest 30 Minuten im Wesentlichen zu erhalten.The object of the invention is to increase the selectivity in the different loading of the biological cells to be separated from one another with bioactive magnetic particles and to obtain them substantially over a period of at least 30 minutes.

Insbesondere soll damit erreicht werden, dass für die Separierung der Zellen in der Praxis keine zusätzlich erforderlichen bioaktiven Seitenfunktionen, wie Proteine oder Proteinfragmente, an den Magnetpartikeln gebunden werden müssen und die Separierung ohne notwendige zusätzliche Prozess-Schritte, wie die Gabe von Plasma, durchführbar ist.In particular, it is intended to ensure that in practice no additionally required bioactive side functions, such as proteins or protein fragments, have to be bound to the magnetic particles for the separation of the cells, and that the Separation without necessary additional process steps, such as the administration of plasma, is feasible.

Diese Aufgabe wird durch beschichtete Magnetpartikel für die Separation biologischer Zellen, mit einer Polysaccharidderivat-Umhüllungsschicht für zellselektive Beladungen mit den Magnetpartikeln, dadurch gelöst, dass die Polysaccharidderivat-Umhüllungsschicht der Magnetpartikel aus einem hinsichtlich der Substituentenbindung blockartig verteilten bioaktiven Polysaccharidderivat besteht (vgl. , rechtes Reaktionsschema). Diese Verteilung kann durch kompletten Abbau der Polymere mittels Säurehydrolyse und Analyse der erhaltenen Molfraktionen der Bausteine des Polymers analysiert werden. Wird im Vergleich zu statistischen Berechnungen ( ) eine Übereinstimmung gefunden handelt es sich um ein statistisches Substituenten-Muster. Die hier beschriebenen Proben weichen von diesem Muster ab ( , Probe 19), was den blockartigen Aufbau belegt.This object is achieved by coated magnetic particles for the separation of biological cells, with a polysaccharide derivative coating layer for cell-selective loading of the magnetic particles, in that the polysaccharide derivative coating layer of the magnetic particles consists of a substituent binding block-distributed bioactive polysaccharide derivative (see. , right reaction scheme). This distribution can be analyzed by complete degradation of the polymers by acid hydrolysis and analysis of the resulting mole fractions of the building blocks of the polymer. Is compared to statistical calculations ( ) found a match is a statistical substituent pattern. The samples described here differ from this pattern ( , Sample 19), which occupies the block-like structure.

Überraschend hat sich gezeigt, dass derartige bioaktive Magnetpartikel mit einer Umhüllungsschicht aus einem hinsichtlich der Substituentenbindung blockartig verteiltem bioaktivem Polysaccharidderivat bei ihrer Aufnahme in die Zellen eine zellselektive Beladung erfahren, die im Gegensatz zu bekannten magnetischen Nanopartikeln mit statistisch verteilter Substituentenbindung selektiver ist und länger erhalten bleibt, ohne dass dafür zusätzlich bioaktive Seitenfunktionen, wie Proteine oder Proteinfragmente, an den Magnetpartikeln gebunden werden müssen und ohne dass aufwendige Prozess-Schritte, wie die Gabe von Plasma, oder sonstige zusätzliche Zellbehandlungsschritte erforderlich werden.Surprisingly, it has been found that such bioactive magnetic particles with a coating layer of a substituent binding block-distributed bioactive polysaccharide derivative undergo cell-selective loading upon their uptake into the cells, which is more selective and longer lasting than known magnetic nanoparticles with randomly distributed substituent binding. without having to additionally bioactive side functions, such as proteins or protein fragments, bound to the magnetic particles and without complex process steps, such as the administration of plasma, or other additional cell treatment steps are required.

Magnetische Nanopartikel, umhüllt mit dem erfindungsgemäßen Polysaccharidderivat zeigen in Separationsexperimenten eine sehr hohe Beladung von Krebszellen, wohingegen die bluteigenen Zellen kaum dotiert waren. So wird die nötige Differenzierung von 20:90 erzielt. Diese Differenzierung kann für verschiedene Zellkombinationen noch vergrößert werden durch einen zusätzlichen Austausch der Gegenionen an der Carboxy-Funktion. So lassen sich die Natrium-Ionen der synthetisierten CMDs gegen andere Kationen oder Protonen austauschen.Magnetic nanoparticles coated with the polysaccharide derivative according to the invention show a very high loading of cancer cells in separation experiments, whereas the blood-own cells were hardly doped. So the necessary differentiation of 20:90 is achieved. This differentiation can be further increased for different cell combinations by an additional replacement of the counterions on the carboxy function. Thus, the sodium ions of the synthesized CMDs can be exchanged for other cations or protons.

Bei der Herstellung des die Magnetpartikel zu umhüllenden Polysaccharidderivates, wird das Polysaccharid, insbesondere Dextran, in einem organischen Lösungsmittel vorzugsweise in Kombination mit einem Salz aufgelöst und mit einer festen Base insbesondere einem Alkalihydroxid, beispielsweise NaOH, und einem Reagenz vorzugsweise einem Veretherungsreagenz wie Monochloressigsäure oder deren Natriumsalz zur Reaktion gebracht (siehe Tab. 2 Probe 19). Infolge der Reaktion mit der festen Base wie NaOH bildet sich ein hinsichtlich der Substituentenbindung blockartig substituiertes Derivat als Hüllmaterial für die bioaktiven Magnetpartikel aus (siehe , rechtes Reaktionsschema).In the preparation of the polysaccharide derivative to be enveloped in the magnetic particles, the polysaccharide, especially dextran, is dissolved in an organic solvent, preferably in combination with a salt, and with a solid base, especially an alkali hydroxide, for example NaOH, and a reagent, preferably an etherification reagent, such as monochloroacetic acid or its Sodium salt reacted (see Tab. 2 sample 19). As a result of the reaction with the solid base, such as NaOH, a substituent-bond-like substituted derivative forms as a shell material for the bioactive magnetic particles (see , right reaction scheme).

Bei Langzeitexperimenten zeigt sich überraschend auch nach 30 min noch ein Beladungsverhältnis von 100:14, d. h auch nach dieser Zeit sind nur 14% der Leukozyten magentisch markiert (vgl. ). Mit dem hergestelltem blockartigen Carboxymethyldextran (CMC) in protonierter Form ist daher, ohne Anbindung zusätzlicher bioaktiver Substituenten, eine selektive Beladung von Krebszellen im Beladungsverhältnis von wenigstens 20:100 (Leukozyten:Krebszellen) über Zeiträume von sogar bis 30 min realisierbar und somit die oben beschriebene Apherese möglich.Surprisingly, long-term experiments show a loading ratio of 100: 14 even after 30 minutes. Even after this time, only 14% of leukocytes are labeled magenta (cf. ). Therefore, with the block-type carboxymethyldextran (CMC) in protonated form prepared, without the addition of additional bioactive substituents, selective loading of cancer cells in the loading ratio of at least 20: 100 (leukocytes: cancerous cells) over periods of even up to 30 minutes can be realized and thus the one described above Apheresis possible.

Die Umhüllung von MNPs, vorzugsweise von superparamagnetischen Eisenoxidkernen, kann in an sich bekannter Art und Weise erfolgen. Das blockartige CMD bildet mit den Kernen definierte und stabile Partikel. Die umhüllten Partikel haben eine Größe von ca. 130 nm.The encapsulation of MNPs, preferably of superparamagnetic iron oxide cores, can be carried out in a manner known per se. The block-like CMD forms defined and stable particles with the cores. The coated particles have a size of about 130 nm.

Die vorgeschlagenen Magnetpartikel eignen sich beispielsweise hervorragend für die Abtrennung von zirkulierenden Krebszellen aus Körperflüssigkeiten wie Blut und Lymphe und sind somit aufgrund von durch die Erfindung nicht mehr zwingend erforderlichen zusätzlichen Zellbehandlungsmaßnahmen zur Verwendung in Kliniken, Praxen und Labors, auch zur Anwendung bei Zellen mit hohem Membrandurchsatz, geeignet.The proposed magnetic particles are, for example, excellent for the separation of circulating cancer cells from body fluids such as blood and lymph and are thus due to not necessarily required by the invention additional cell treatment measures for use in clinics, practices and laboratories, also for use in cells with high membrane throughput , suitable.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention will be explained below with reference to exemplary embodiments illustrated in the drawing.

Es zeigen:Show it:

: Schematische Darstellung der Herstellung von umhüllten Magnet-Nanopartikeln (MNP) mit einem chemisch modifizierten Polysaccharidderivat

  • a) auf konventionellem Weg (linker Teil der Abbildung) und
  • b) Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Magnet-Nanopartikel mit blockartiger Substituentenstruktur (rechter Teil der Abbildung)
: Schematic representation of the production of coated magnetic nanoparticles (MNP) with a chemically modified polysaccharide derivative
  • a) by conventional means (left part of the figure) and
  • b) Method for Producing the Magnet Nanoparticles of the Invention Having a Block-Type Substituent Structure (Right Part of the Drawing)

: allgemeine Reaktion für die Funktionalisierung von Dextran als Polymer (Carboxymethylierung) : general reaction for the functionalization of dextran as a polymer (carboxymethylation)

: Diagrammdarstellung der Interaktion von Tumorzellen (schwarz) und Leukozyten (grau) mit unumhüllten MNPs : Diagram showing the interaction of tumor cells (black) and leukocytes (gray) with unencapsulated MNPs

: Diagrammdarstellung der Interaktion von Tumorzellen (schwarz) und Leukozyten (grau) mit MNPs, umhüllt mit CMD mit statistisch verteilten CM-Gruppen (vgl. , linkes Reaktionsschema) : Diagram of the interaction of tumor cells (black) and leukocytes (gray) with MNPs, coated with CMD with randomly distributed CM groups (cf. , left reaction scheme)

: Molfraktionen Glucose (Glue), Mono-O-Carboxymethylglucose (Mono), Di-O-Carboxymethylglucose (Di) und Tri-O-Carboxymethylglucose (Tri) als statistisch berechnete Werte über den gesamten DS-Bereich in Abhängigkeit vom durchschnittlichen Substitutionsgrad (DS) : Mole fractions glucose (Glue), mono-O-carboxymethylglucose (mono), di-O-carboxymethylglucose (Di) and tri-O-carboxymethylglucose (Tri) as statistically calculated values over the entire DS range depending on the average degree of substitution (DS )

: Verteilung der Molfraktionen (Gluc(☐), Mono(o), Di(Δ) und Tri(∇) nach säurehydrolytischem Abbau mit Perchlorsäure und HPLC-Analyse von Carboxymethyldextran (CMD), hergestellt in DMSO (Proben 14–18) und in DMSO/LiCl (19) im Vergleich mit statistischen Berechnungen (durchgehend dargestellte Linien) : Distribution of the mole fractions (Gluc (□), mono (o), Di (Δ) and Tri (∇) after acid hydrolysis with perchloric acid and HPLC analysis of carboxymethyldextran (CMD) prepared in DMSO (Samples 14-18) and in DMSO / LiCl (19) compared to statistical calculations (continuous lines)

: Diagrammdarstellung der Interaktion von Tumorzellen (CETCs, weiß) und Leukozyten (schwarz) mit MNPs, umhüllt mit CMD mit hinsichtlich der Substituentenbindung erfindungsgemäßer blockartiger Struktur : Diagram showing the interaction of tumor cells (CETCs, white) and leukocytes (black) with MNPs coated with CMD with respect to the substituent binding of the block-like structure according to the invention

Tab. 1: Darstellung der eingesetzten Molverhältnisse, Reaktionsmedien, Reaktionsbedingungen und Polysaccharidkonzentrationen (PS-Konz.) bei der Carboxymethylierung von Dextran zu CMD sowie des daraus resultierenden durchschnittlichen Substitutionsgrades (DS) Natronlauge (NaOH) wurde als Lösung (15wt%) zugegeben.Tab. 1: Representation of the molar ratios used, reaction media, reaction conditions and polysaccharide concentrations (PS conc.) In the carboxymethylation of dextran to CMD and the resulting average degree of substitution (DS) Sodium hydroxide (NaOH) was added as a solution (15wt%).

Tab. 2: Darstellung der eingesetzten Molverhältnisse, Reaktionsmedien, Reaktionsbedingungen und Polysaccharidkonzentrationen (PS-Konz.) bei der Carboxymethylierung von Dextran zu CMD sowie des daraus resultierenden durchschnittlichen Substitutionsgrades (DS) Natronlauge (NaOH) wurde als Pulver zugegeben.Tab. 2: Representation of the molar ratios used, reaction media, reaction conditions and polysaccharide concentrations (PS conc.) In the carboxymethylation of dextran to CMD and the resulting average degree of substitution (DS) Sodium hydroxide (NaOH) was added as a powder.

In sind die Darstellungen von Magnet-Nanopartikeln (MNP) gezeigt, wobei der MPN im Bild linksseitig eine Polysaccharidderivatumhüllung mit an sich bekannter statistischer Verteilung der Substituentenbindung (Reaktionsschema a)) und der MPN im Bild rechtsseitig eine Polysaccharidderivatumhüllung mit erfindungsgemäßer blockartiger Verteilung der Substituentenbindung (Reaktionsschema b)) aufweist.In the representations of magnetic nanoparticles (MNP) are shown, the MPN in the image on the left a Polysaccharidderivatumhüllung with known statistical distribution of the substituent bond (reaction scheme a)) and the MPN in the picture on the right side Polysaccharidderivatumhüllung with inventive block-like distribution of the substituent bond (Reaction Scheme b )) having.

In beiden senkrecht dargestellten Reaktionsabläufen wird jeweils ein Polysaccharid 1 in einem ersten Schritt (symbolisiert jeweils als Pfeildarstellung) durch chemische Funktionalisierung in ein Polysaccharidderivat 2a bzw. 2b umgewandelt. Im linken Reaktionsschema a) erfolgt eine Funktionalisierung, mit welcher das Polysaccharidderivat 2a mit statistischer Verteilung der Substituentenbindung entsteht, während sich im rechten Reaktionsschema b) das Polysaccharidderivat 2b mit der vorgeschlagenen blockartigen Substituentenbindung ausbildet.In both vertical reactions shown in each case a polysaccharide 1 in a first step (symbolized in each case as an arrow) by chemical functionalization into a polysaccharide derivative 2a respectively. 2 B transformed. In the left reaction scheme a) is carried out a functionalization with which the polysaccharide derivative 2a with statistical distribution of the substituent bond is formed, while in the right reaction scheme b) the polysaccharide derivative 2 B forms with the proposed block-like substituent bond.

In einem zweiten Schritt (symbolisiert jeweils wieder durch Pfeildarstellung) werden die entstandenen Polysaccharidderivate 2a bzw. 2b jeweils zur Umhüllung von an sich bekannten Magnet-Nanopartikeln 4 (MNP) verwendet, wobei im Reaktionsschema a) ein umhüllter Magnet-Nanopartikel 3a mit statistischer Verteilung der Substituentenbindung in dem umhüllenden Polysaccharidderivat entsteht. Diese Magnet-Nanopartikel 3a weisen bekannter Weise eine geringe Selektivität in der unterschiedlichen Beladung von zu trennenden biologischen Zellen auf (vgl. auch ), wenngleich die Selektivität schon höher ist als gegenüber unumhüllten Magnet-Nanopartikeln 4 (vgl. ).In a second step (again symbolized by arrows), the resulting polysaccharide derivatives 2a respectively. 2 B in each case for the coating of known magnetic nanoparticles 4 (MNP), wherein in Reaction Scheme a) a coated magnetic nanoparticle 3a with statistical distribution of substituent binding in the enveloping polysaccharide derivative. These magnetic nanoparticles 3a have a known manner a low selectivity in the different loading of biological cells to be separated (see also ), although the selectivity is already higher than that of uncoated magnetic nanoparticles 4 (see. ).

Im rechten Reaktionsschema b) entsteht ein umhüllter Magnet-Nanopartikel 3b mit besagter blockartiger Verteilung der Substituentenbindung in dem umhüllenden Polysaccharidderivat. Solche Magnet-Nanopartikel 3b zeigen erfindungsgemäß hingegen in der unterschiedlichen Beladung von zu trennenden biologischen Zellen überraschend hohe Selektivität und Bioaktivität (vgl. auch ).In the right reaction scheme b), a coated magnetic nanoparticle is formed 3b with said blocky distribution of the substituent bond in the enveloping polysaccharide derivative. Such magnetic nanoparticles 3b In contrast, according to the invention, surprisingly high selectivity and bioactivity are present in the different loading of biological cells to be separated (cf. ).

Für den Fall, dass die chemische Funktionalisierung im Reaktionsschema b) von eine Carboxymethylierung und das Polysaccharid Dextran sind, gilt zur Funktionalisierung die allgemeine Reaktion in .In the event that the chemical functionalization in the reaction scheme b) of a carboxymethylation and the polysaccharide are dextran, functionalization is the general reaction in ,

In sind Molfraktionen Glucose (Gluc), Mono-O-Carboxymethylglucose (Mono), Di-O-Carboxymethylglucose (Di) und Tri-O-Carboxymethylglucose (Tri) dargestellt, wobei die durchgehenden Linien die entsprechenden statistisch berechneten Werte über den gesamten DS-Bereich) in Abhängigkeit vom durchschnittlichen Substitutionsgrad (DS) zeigen. Es sind jeweils zwei Wertepaare als codierte Symbole (Gluc(☐), Mono(o), Di(Δ) und Tri(∇) eingetragen, die einerseits eine statistische Verteilung (Polysaccharidderivate hergestellt gemäß Reaktionsschema a), vgl. , linker Teil der Abbildung) und andererseits eine blockartige Verteilung (Polysaccharidderivate hergestellt gemäß Reaktionsschema b), vgl. , rechter Teil der Abbildung) repräsentieren. Bei den blockartig funktionalisierten Polysaccharidderivaten stimmen die gefundenen Werte (Symbole) nicht mit den berechneten Werten (durchgehende Linien) überein.In Mole fractions glucose (Gluc), mono-O-carboxymethylglucose (mono), di-O-carboxymethylglucose (di) and tri-O-carboxymethylglucose (tri) are shown, with the solid lines representing the corresponding statistically calculated values over the entire DS range ) depending on the average degree of substitution (DS). In each case, two pairs of values are entered as coded symbols (Gluc (□), mono (o), Di (Δ) and tri (∇) which on the one hand have a statistical distribution (polysaccharide derivatives prepared according to Reaction Scheme a), cf. , left part of the figure) and on the other hand a block-like distribution (polysaccharide derivatives prepared according to Reaction Scheme b), cf. , right part of the figure). In the block-like functionalized polysaccharide derivatives, the values found (symbols) do not match the calculated values (solid lines).

zeigt die Verteilung der in dargestellten Molfraktionen (Gluc(☐), Mono(o), Di(Δ) und Tri(∇) nach säurehydrolytischem Abbau mit Perchlorsäure und HPLC-Analyse von Carboxymethyldextran (CMD), hergestellt in Dimethylsulfoxid (DMSO), betreffend die Proben 14–18, sowie in Dimethylsulfoxid/Lithiumchlorid (DMSO/LiCl), betreffend Probe 19, im Vergleich mit statistischen Berechnungen (durchgehend dargestellte Linien). shows the distribution of in shown mole fractions (Gluc (□), mono (o), Di (Δ) and Tri (∇) after acid hydrolysis degradation with perchloric acid and HPLC analysis of carboxymethyldextran (CMD) prepared in dimethylsulfoxide (DMSO), concerning samples 14-18 , as well as in dimethyl sulfoxide / lithium chloride (DMSO / LiCl), concerning sample 19, in comparison with statistical calculations (continuous lines).

Für Probe 19 wird eine nicht-statistische, blockartige Verteilung gefunden.For sample 19, a non-statistical, block-like distribution is found.

In ist die Diagrammdarstellung der Interaktion von Tumorzellen (CETCs, weiß) und Leukozyten (schwarz) mit MNPs, umhüllt mit Carboxymethyldextran (CMD) mit hinsichtlich der Substituentenbindung erfindungsgemäßer blockartiger Struktur dargestellt.In Figure 3 is a graph showing the interaction of tumor cells (CETCs, white) and leucocytes (black) with MNPs coated with carboxymethyldextran (CMD) having a block-like structure according to the invention in terms of substituent binding.

Selbst nach 30 min wird noch eine Schere der Beladung von 100:14 gefunden.Even after 30 minutes, a shear of the load of 100: 14 is still found.

In den Tabellen 1 und 2 sind jeweils die eingesetzten Molverhältnisse, Reaktionsmedien, Reaktionsbedingungen und Polysaccharidkonzentrationen (PS-Konz.) bei der Carboxymethylierung von Dextran zu Carboxymethyldextran sowie des daraus resultierenden durchschnittlichen Substitutionsgrades (DS) dargestellt.Tables 1 and 2 respectively show the molar ratios, reaction media, reaction conditions and polysaccharide concentrations (PS conc.) Used in the carboxymethylation of dextran to carboxymethyldextran and the resulting average degree of substitution (DS).

Bezüglich Tab. 1 wurde Natronlauge (NaOH) als Lösung (15wt%) zugegeben, bezüglich Tab. 2 NaOH als Pulver.With reference to Table 1, sodium hydroxide solution (NaOH) was added as a solution (15% by weight), with respect to Tab. 2 NaOH as a powder.

Ausführungsbeispiel 1:Embodiment 1

Blockartiges Carboxymethyldextran in Dimethylsulfoxid/LithiumchloridBlocky carboxymethyldextran in dimethyl sulfoxide / lithium chloride

Als beispielhafte Reaktion erfolgte die Carboxymethylierung in einem Molverhältnis AGU:NaOH:MCA von 1:10:5. 6,2 mmol. 1 g Dextran (getrocknet) werden in 30 mL DMSO (trocken) und unter Stickstoff auf 120°C erhitzt und 2 h gerührt. Im Laufe des Abkühlens werden bei 80°C 1,8 g Lithiumchlorid (LiCl) zugegeben und bei Raumtemperatur (RT) über Nacht gerührt. Am nächsten Tag werden 61,7 mmol (2,47 g) NaOH (gemörsert und getrocknet) in 4 mL DMSO (trocken) mit einem Ultra-Turrax behandelt zum Reaktionsansatz gegeben. Anschließend werden 30,9 mmol (3,6 g) Natrium-Monochloracetat (MCA) in Pulverform zugegeben und 4 h bei 70°C gerührt. Nach Abkühlen auf RT wird der Ansatz in 300 mL Methanol gefällt, mit 1:1 verdünnter Essigsäure neutralisiert und zwei Mal mit je 100 mL Methanol gewaschen. Anschließend wird das Carboxymethyldextran (CMD) in 20 mL deionisiertem Wasser gelöst, in 200 mL Isopropylalkohol gefällt und drei Mal gewaschen. Das pulvrige Produkt wird für zwei Tage bei 50°C im Vakuum getrocknet.As an exemplary reaction, the carboxymethylation was carried out in a molar ratio AGU: NaOH: MCA of 1: 10: 5. 6.2 mmol. 1 g of dextran (dried) are heated in 30 mL of DMSO (dry) and under nitrogen to 120 ° C and stirred for 2 h. In the course of cooling, 1.8 g of lithium chloride (LiCl) are added at 80 ° C. and stirred at room temperature (RT) overnight. The next day, 61.7 mmol (2.47 g) of NaOH (mortared and dried) in 4 mL of DMSO (dry) are treated with an Ultra-Turrax and added to the reaction mixture. Subsequently, 30.9 mmol (3.6 g) of sodium monochloroacetate (MCA) are added in powder form and stirred at 70 ° C for 4 h. After cooling to RT, the mixture is precipitated in 300 ml of methanol, neutralized with 1: 1 dilute acetic acid and washed twice with 100 ml of methanol. Subsequently, the carboxymethyl dextran (CMD) is dissolved in 20 ml of deionized water, precipitated in 200 ml of isopropyl alcohol and washed three times. The powdery product is dried for two days at 50 ° C in a vacuum.

Herstellung der superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikel (Fe3O4, MNP)Preparation of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles (Fe 3 O 4 , MNP)

In einem 500 mL Becherglas werden Eisen(II)chlorid (23,7 mmol; 3,0 g) und Eisen(III)chlorid (47,3 mmol; 7,7 g) eingewogen und in 100 mL entionisiertem, gasfreien Wasser gelöst, wobei es zu einer exothermen Reaktion kommt. Zu der entstandenen klaren bräunlichen Lösung werden unter Rühren 20 mL einer 25%igen Ammoniaklösung zügig eingegossen. Schwarzer Magnetit fällt aus und wird kurzzeitig fest. Anschließend wird 15 min bei 75°C und 500 Umdrehungen gerührt. Der Magnetit wird mit Hilfe eines Magneten (Seltenerde; NdFeB) abgetrennt. Nach 20 min wird der klare Überstand verworfen und das Sediment mit entionisiertem, entgastem Wasser gewaschen bis ein pH < 7,5 erreicht ist. Der pH-Wert wird mit einer Elektrode gemessen und nach jedem Waschschritt kontrolliert. Durch Zugabe von 1 M Salzsäure wird der pH-Wert der Suspension auf pH 2 eingestellt. Diese saure Suspension wurde anschließend mehrmals mit bidestilliertem, entgastem Wasser gewaschen, wobei der pH-Wert (pH ~2) ständig kontrolliert wird. Zusätzlich wird die elektrische Leitfähigkeit kontrolliert, der Endwert sollte bei ~3 mS cm–1 liegen. Das erhaltene Hydrosol wird über Glaswolle filtriert und anschließend mittels Ultraschallbehandlung (30% Amplitude, 2 min) stabilisiert. Für die Ultraschallbehandlung wird der Ultraschall-Desintegrator 250 Digital Sonifier der Firma BRANSON genutzt. (Eisengehalt 3,6 mg mL–1; die Kristallitgröße aus der Röntgendiffraktometrie (XRD) am IPHT Jena ergab 8 nm ± 1 nm; die Oberflächenbestimmung nach Brunauer Emmet & Teller (BET) am IPHT Jena ergab Werte zwischen 12 und 13 nm sowie 86–95 m2 g–1)In a 500 mL beaker, weigh iron (II) chloride (23.7 mmol, 3.0 g) and iron (III) chloride (47.3 mmol, 7.7 g) and dissolve in 100 mL of deionized, gas-free water. which leads to an exothermic reaction. 20 ml of a 25% strength ammonia solution are rapidly poured into the resulting clear brownish solution with stirring. Black magnetite precipitates and becomes momentary. The mixture is then stirred for 15 min at 75 ° C and 500 revolutions. The magnetite is separated by means of a magnet (rare earth, NdFeB). After 20 minutes, the clear supernatant is discarded and the sediment washed with deionized, degassed water until a pH <7.5 is reached. The pH is measured with an electrode and checked after each washing step. By addition of 1 M hydrochloric acid, the pH of the suspension is adjusted to pH 2. This acidic suspension was then washed several times with bidistilled, degassed water, the pH (pH ~ 2) is constantly monitored. In addition, the electrical conductivity is controlled, the final value should be ~ 3 mS cm -1 . The hydrosol obtained is filtered through glass wool and then stabilized by means of ultrasound treatment (30% amplitude, 2 min). For ultrasonic treatment, the ultrasonic disintegrator 250 Digital Sonifier from BRANSON is used. (Iron content 3.6 mg mL -1 , the XRD at the IPHT Jena was 8 nm ± 1 nm, and the surface area determined by Brunauer Emmet & Teller (BET) at IPHT Jena was between 12 and 13 nm and 86 -95 m 2 g -1 )

Ausführungsbeispiel 2:Embodiment 2:

Umhüllung von MNP mit CMD für die magnetische ZellseparationEnvelope of MNP with CMD for magnetic cell separation

250 mg Carboxymethyldextran (CMD) werden in 3 mL bidestilliertem Wasser gelöst und mit 10 mL der Nanopartikelsuspension (Konzentration 10 mg·mL–1) in einem Reaktionsgefäß (15 mL Falcon) gemischt. Nach permanentem Schütteln für 90 min bei 37°C werden die Nanopartikel mit einer CMD-Hülle über einen Magneten sedimentiert. Der klare Überstand wird abgenommen und das Sediment mit 100 mL deionisiertem Wasser gewaschen und abschließend mit 10 mL bidestilliertem Wasser aufgefüllt. Anschließend erfolgt eine Behandlung der Nanopartikelsuspension mit einem Ultraschallfinger bei 30% für 30 s um zusammengelagerte Aggregate voneinander zu trennen.250 mg of carboxymethyldextran (CMD) are dissolved in 3 mL bidistilled water and mixed with 10 mL of the nanoparticle suspension (concentration 10 mg · mL -1 ) in a reaction vessel (15 mL Falcon). After continuous shaking for 90 min at 37 ° C, the nanoparticles are sedimented with a CMD shell over a magnet. The clear supernatant is removed and the sediment is washed with 100 ml of deionized water and finally filled up with 10 ml bidistilled water. Thereafter, the nanoparticle suspension is treated with an ultrasonic finger at 30% for 30 seconds to separate aggregates from one another.

Ausführungsbeispiel 3:Embodiment 3

Magnetische Separation in in vitro ExperimentenMagnetic separation in in vitro experiments

Für die Einzeluntersuchungen werden jeweils 1·106 Zellen der MCF-7 und 2,5·106 Zellen der Leukozyten in 500 μL PE-Puffer eingesetzt. Anschließend erfolgt die Inkubation für 4, 8 und 12 min mit 2,5 μL der Nanopartikel (MNP1@CMD, MNP1@CMP oder MNP1@CMC; Endkonzentration 50 μg·mL–1) bei 37°C.For the individual investigations, in each case 1 × 10 6 cells of the MCF-7 and 2.5 × 10 6 cells of the leukocytes are used in 500 μl PE buffer. The incubation is then carried out for 4, 8 and 12 min with 2.5 μL of the nanoparticles (MNP1 @ CMD, MNP1 @ CMP or MNP1 @ CMC; Final concentration 50 μg.ml -1 ) at 37 ° C.

Die magnetische Separation erfolgt über das MACS® Cell Separation System der Firma Miltenyi Biotech, bestehend aus einem Dauermagneten (Super-MACSTM II Separator) und einer, mit Eisenkugeln gefüllten, Säule (Typ MS), welche mit 500 μL PE-Puffer vorgewaschen wird. Das Zell-Partikel-Gemisch wird nach der Inkubationszeit auf die Säule (im Magnetfeld befindlich) pipettiert, nach dem Durchlaufen mit 500 μL gespült und als Negativfraktion gesammelt. Die Säule wird außerhalb des Magnetfeldes mit 1 mL PE-Puffer gespült und als Positivfraktion gesammelt. Von beiden Fraktionen wird die Zellzahl bestimmt und die Gesamtzellzahl berechnet. Für die Beurteilung der Zellseparation werden die prozentualen Anteile der Positivfraktionen zueinander in ein Verhältnis gesetzt. Die Negativfraktion ergibt sich aus 100% minus der Positivfraktion und wird aus Übersichtsgründen nicht mit in den Diagrammen aufgetragen.The magnetic separation is carried out on the MACS ® Cell Separation System Miltenyi Biotech, consisting of a permanent magnet (Super-MACS ™ II separator) and one filled with iron balls, column (type MS), which is pre-washed with 500 ul of PE buffer , After the incubation time, the cell-particle mixture is pipetted onto the column (in the magnetic field), rinsed with 500 μL after passing through and collected as a negative fraction. The column is rinsed outside the magnetic field with 1 mL PE buffer and collected as a positive fraction. From both fractions the cell number is determined and the total cell count is calculated. For the evaluation of the cell separation, the percentage proportions of the positive fractions are set in relation to one another. The negative fraction results from 100% minus the positive fraction and is not included in the diagrams for reasons of clarity.

Ausführungsbeispiel 4:Embodiment 4

Magnetische Separation von BlutprobenMagnetic separation of blood samples

Zur Unterscheidung der Zelltypen (CETC und Leukozyten) mittels Durchflusszytometrie (fluorescence activated cell sorting; FACS), werden die Antikörper anti-CD326-FITC (3 μL) sowie anti-CD45-PE (1,5 μL) eingesetzt. Die Anregung beider Fluoreszenzen erfolgt bei λexc 488 nm, die Emission bei λem 514 nm (FITC) sowie λem 575 nm (PE).To differentiate the cell types (CETC and leucocytes) by flow cytometry (FACS), the antibodies anti-CD326-FITC (3 μL) and anti-CD45-PE (1.5 μL) are used. Excitation of both fluorescences occurs at λ exc 488 nm, emission at λ em 514 nm (FITC) and λ em 575 nm (PE).

Die Antikörper werden nach der Separation mit dem MACS® Cell Separation System (4 min Inkubationszeit, Negativ- und Positivfraktion;) und Zellzahlbestimmung zu den Zellsuspensionen dazu pipettiert, um die Zellpopulationen im FACS (FACSCaliburTM von BD) auswerten zu können. Zum Vergleich wird ein Teil der nicht separierten Probe angefärbt.The antibodies are after separation with the MACS ® Cell Separation System (4 min incubation, negative and positive fraction) was pipetted and cell number determination to the cell suspensions to in order to evaluate the cell populations in the FACS (FACSCalibur ™ from BD). For comparison, a part of the non-separated sample is stained.

Für jede Probe wird eine absolute Zellzahl (1·103) unabhängig vom Volumen vermessen. Die Auswertung erfolgt am FACS über das CellQuestTM Programm. Jede gemessene Zelle wird als Ereignis in einem Dot Plot oder einem Histogramm ausgegeben. Das Auswerteprinzip für die Zweifarben-Immunfluoreszenz ist die Quadrantenanalyse eines Dot Plots. Die einzelnen Leukozytensubpopulationen werden zusätzlich im FACS nach Größe (forward scatter; FSC) und Granularität (sideward scatter; SSC) getrennt und ausgewertet.For each sample, an absolute number of cells (1 × 10 3 ) is measured independently of the volume. The evaluation takes place at the FACS via the CellQuest TM program. Each measured cell is output as an event in a dot plot or a histogram. The evaluation principle for the two-color immunofluorescence is the quadrant analysis of a dot plot. The individual leukocyte subpopulations are additionally separated and evaluated in the FACS according to size (forward scatter, FSC) and granularity (sideward scatter, SSC).

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

11
Polysaccharidpolysaccharide
2a, 2b2a, 2b
PolysacchariddervatPolysacchariddervat
3a, 3b3a, 3b
umhüllter Magnet-Nanopartikelcoated magnet nanoparticles
44
Magnet-Nanopartikel (MNP)Magnetic Nanoparticles (MNP)
CETCsCETCs
Circulating Epithelial Tumor CellsCirculating Epithelial Tumor Cells
DSDS
Substitutionsgraddegree of substitution
CMDCMD
Carboxymethyldextrancarboxymethyl
GlueGlue
Glucoseglucose
MonoMono
Mono-O-CarboxymethylglucoseMono-O-Carboxymethylglucose
Didi
Di-O-CarboxymethylglucoseDi-O-Carboxymethylglucose
TriTri
Tri-O-CarboxymethylglucoseTri-O-Carboxymethylglucose
DMSODMSO
Dimethylsulfoxiddimethyl sulfoxide
a), b)a), b)
Reaktionsschemascheme

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Claims (6)

Beschichtete Magnetpartikel für die Separation biologischer Zellen, mit einer Polysaccharidderivat-Umhüllungsschicht für zellselektive Beladungen mit den Magnetpartikeln, gekennzeichnet dadurch, dass die Polysaccharidderivat-Umhüllungsschicht der Magnetpartikel (4) aus einem hinsichtlich der Substituentenbindung blockartig verteilten bioaktiven Polysaccharidderivat (2b) besteht.Coated magnetic particles for the separation of biological cells, having a polysaccharide derivative coating layer for cell-selective loading with the magnetic particles, characterized in that the polysaccharide derivative coating layer of the magnetic particles ( 4 ) from a bioactive polysaccharide derivative which is block-distributed in terms of substituent binding ( 2 B ) consists. Verfahren zur Herstellung der beschichteten Magnetpartikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Synthese des Polysaccharidderivates für die Umhüllung der Magnetpartikel das Polysaccharid in einem organischen Lösungsmittel und vorzugsweise in Kombination mit einem Salz aufgelöst wird.Process for the preparation of the coated magnetic particles according to claim 1, characterized in that in the synthesis of the polysaccharide derivative for the envelopment of the magnetic particles the polysaccharide is dissolved in an organic solvent and preferably in combination with a salt. Verfahren zur Herstellung der beschichteten Magnetpartikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Synthese des Polysaccharidderivates für die Umhüllung der Magnetpartikel das Polysaccharid mit einer festen Base, insbesondere einem Alkalihydroxid wie NaOH, und einem Reagenz, vorzugsweise einem Veretherungsreagenz wie Monochloressigsäure oder deren Natriumsalz, zur Reaktion gebracht wird.Process for the preparation of the coated magnetic particles according to claim 1, characterized in that in the synthesis of the polysaccharide derivative for the envelopment of the magnetic particles, the polysaccharide with a solid base, in particular an alkali metal hydroxide such as NaOH, and a reagent, preferably an etherifying reagent such as monochloroacetic acid or its sodium salt, is reacted. Verfahren gemäß Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Polysaccharid Dextran Verwendung findet.A method according to claim 2 and 3, characterized in that is used as the polysaccharide dextran. Verfahren gemäß Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das bei der Synthese entstandene Carboxymethyldextran mit blockartiger Substituentenverteilung durch Behandlung mit einem Salz, einem Ionenaustauscher oder einer Säure, in eine andere Salzform oder die protonierte Form überführt wird.Process according to Claims 2 to 4, characterized in that the carboxymethyldextran formed in the synthesis with a block-like substituent distribution is converted into a different salt form or the protonated form by treatment with a salt, an ion exchanger or an acid. Verwendung der beschichteten Magnetpartikel gemäß Anspruch 1 für die Abtrennung von zirkulierenden Krebszellen aus Körperflüssigkeiten wie Blut und Lymphe, indem die bioaktiven Magnetpartikel in die Zellen der Körperflüssigkeiten transferiert werden.Use of the coated magnetic particles according to claim 1 for the separation of circulating cancer cells from body fluids such as blood and lymph by transferring the bioactive magnetic particles into the cells of the body fluids.
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