DE102014201384A1

DE102014201384A1 - A method comprising low dissolved oxygen concentration culture

Info

Publication number: DE102014201384A1
Application number: DE102014201384.4A
Authority: DE
Inventors: Thomas Haas; Markus Pötter; Eva-Maria Eckl; Simon Przybilla; Anja Thiessenhusen; Martin Demler
Original assignee: Evonik Industries AG
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2014-01-27
Filing date: 2014-01-27
Publication date: 2015-07-30
Also published as: AR100302A1; WO2015110518A1

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren umfassend eine Kultivierung von Zellen unter niedriger Gelöstsauerstoffkonzentration.The invention relates to a method comprising culturing cells under low dissolved oxygen concentration.

Description

Gebiet der ErfindungField of the invention

Stand der TechnikState of the art

Bei der fermentativen Herstellung von Produkten ist man stets bemüht, die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten möglichst zu vermeiden oder auf ein Minimum zu reduzieren. In der Regel kann man so die Produktausbeute erhöhen und auch die Aufreinigung des Endproduktes erleichtern.In the fermentative production of products, efforts are always made to avoid or minimize the formation of undesirable by-products. In general, one can thus increase the product yield and also facilitate the purification of the final product.

Zellen, die als Kohlenstoffquelle anorganischen Kohlenstoff verwenden, um organische Moleküle zu synthetisieren sind insbesondere in Form von Knallgasbakterien bekannt. Organismen, die Polyhydroxyalkanoat produzieren, benutzen als Vorstufe 3-Hydroxyalkanyl-CoA. Dieses Stoffwechselprodukt kann als hervorragende Ausgangssubstanz dienen, um insbesondere auch durch künstlich eingefügte Stoffwechselwege zu weiteren, hochwertigen organischen Substanzen verstoffwechselt zu werden. Insbesondere das Polyhydroxybutyrat produzierende Knallgasbakterium Cupriavidus necator wurde in den letzten Jahren ausführlich charakterisiert und untersucht.Cells that use inorganic carbon as a carbon source to synthesize organic molecules are known in particular in the form of oxyhydrogen bacteria. Organisms producing polyhydroxyalkanoate use as precursor 3-hydroxyalkanyl-CoA. This metabolic product can serve as an excellent starting substance, in particular to be metabolized by artificially inserted metabolic pathways to other, high-quality organic substances. In particular, the polyhydroxybutyrate-producing oxyhydrogen bacterium Cupriavidus necator has been extensively characterized and studied in recent years.

Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren bereitzustellen, welches die Nebenproduktbildung in Fermentationsverfahren reduziert und somit die Ausbeute an Monomereinheiten der in der Biosynthese verminderten Polyhydroxyalkanoats erhöht.The object of the invention was to provide a process which reduces by-product formation in fermentation processes and thus increases the yield of monomer units of the polyhydroxyalkanoate reduced in the biosynthesis.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Überraschenderweise wurde gefunden, dass das im Folgenden beschriebene Verfahren die der Erfindung gestellte Aufgabe zu lösen vermag.Surprisingly, it has been found that the method described below is capable of solving the problem posed by the invention.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren umfassend eine Kultivierung von Knallgasbakterien unter niedriger Gelöstsauerstoffkonzentration. Alle angegebenen Prozent (%) sind, wenn nicht anders angegeben, Massenprozent.The present invention therefore relates to a process comprising culturing oxyhydrogen bacteria under a low dissolved oxygen concentration. All percentages (%) are by mass unless otherwise specified.

Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass durch das limitierte Angebot an Sauerstoff ein Überschussmetabolismus des Mikroorganismus unterbunden wird, bei dem es zur Bildung von unerwünschten Nebenprodukten kommt. Somit für die vorliegenden Erfindung zu einer Erhöhung der Kohlenstoffselektivität. Noch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass durch die verringerte Nebenproduktbildung die Aufreinigung in Verfahrensschritt C vereinfacht und somit kostengünstiger wird. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass hierfür nur ein geringer Anteil an Sauerstoff im H₂-haltigen Substratgas notwendig ist. Somit wird das Risiko der Bildung einer explosionsförmigen Atmosphäre im Inneren des Fermenters minimiert. Somit muss die Apparatur für das vorliegende Verfahren nicht für EX-geschützt ausgelegt sein, wodurch sich beim Bau einer Produktionsanlage deutlich Kosten einsparen lassen. The advantage of the present invention is that the limited supply of oxygen prevents an excess metabolism of the microorganism, which leads to the formation of undesired by-products. Thus, for the present invention, an increase in carbon selectivity. Another advantage of the present invention is that the reduced by-product formation simplifies the purification in process step C and thus becomes more cost-effective. Another advantage of the present invention is that only a small proportion of oxygen in the H ₂ -containing substrate gas is necessary for this purpose. Thus, the risk of the formation of an explosive atmosphere inside the fermenter is minimized. Thus, the apparatus for the present method need not be designed for EX-protected, which can save significant costs in the construction of a production plant.

Gegenstand ist somit ein Verfahren zur Kultivierung von Knallgasbakterien in einem Medium umfassend einen Verfahrensschritt, in dem das Medium mit einem Gas enthaltend H₂, CO₂ und O₂ in Kontakt gebracht wird, und das Medium eine Gelöstsauerstoffkonzentration von 0,001 mg/L bis 0,5 mg/L, bevorzugt von 0,005 mg/L bis 0,3 mg/L, besonders bevorzugt von 0,01 mg/L bis 0,2 mg/L aufweist.The subject matter is thus a method for cultivating oxyhydrogen bacteria in a medium comprising a method step in which the medium is brought into contact with a gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ , and the medium has a dissolved oxygen concentration of 0.001 mg / L to 0, 5 mg / L, preferably from 0.005 mg / L to 0.3 mg / L, particularly preferably from 0.01 mg / L to 0.2 mg / L.

Unter dem Begriff „Knallgasbakterium“ ist ein Bakterium zu verstehen, das in der Lage ist chemolithoautotroph zu wachsen und aus H₂ und CO₂ in Gegenwart von Sauerstoff Kohlenstoffgerüste mit mehr als einem C-Atom aufzubauen, wobei der Wasserstoff oxidiert und der Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor benutzt wird. Es können erfindungsgemäß sowohl solche Bakterien eingesetzt werden, die von Natur aus Knallgasbakterien darstellen, oder aber auch Bakterien, welche durch gentechnische Modifikation zu Knallgasbakterien wurden, wie beispielsweise eine E. coli Zelle, die durch rekombinantes Einfügen der notwendigen Enzyme in die Lage versetzt wurde, aus H₂ und CO₂ in Gegenwart von Sauerstoff Kohlenstoffgerüste mit mehr als einem C-Atom aufzubauen, wobei der Wasserstoff oxidiert und der Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor benutzt wird. Bevorzugt handelt es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Knallgasbakterien um solche, welche bereits als Wildtyp Knallgasbakterien darstellen. Erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Knallgasbakterien sind ausgewählt aus den Gattungen Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Alcaligenes, Anabena, Ancyclobacter, Aquifex, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobium, Cupriavidus, Derxia, Helicobacter, Herbaspirillum, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum, Hydrogenophaga,, Hydrogenophilus, Hydrogenothermus, Hydrogenovibrio, Ideonella sp. O1, Kyrpidia, Metallosphaera, Mycobacterium, Nocardia, Oligotropha, Paracoccus, Pelomonas, Polaromonas, Pseudomonas, Pseudonocardia, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Seliberia, Streptomyces, Thiocapsa, Variovorax, Xanthobacter, Wautersia, wobei Cupriavidus besonders bevorzugt ist, besonders aus den Spezies Cupriavidus necator (alias Ralstonia eutropha, Wautersia eutropha, Alcaligenes eutrophus, Hydrogenomonas eutropha), Achromobacter ruhlandii, Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidovorax facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes latus, Anabena cylindrica, Anabena oscillaroides, Anabena sp., Anabena spiroides, Ancyclobacter vacuolatus, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus, Arthrobacter strain 11X, Bacillus schlegelii, Bradyrhizobium japonicum, Derxia gummosa, Escherichia coli, Heliobacter pylori, Herbaspirillum autotrophicum, Hydrogenobacter hydrogenophilus., Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobaculum acidophilum, Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga pseudoflava, Hydrogenophaga taeniospirales, Hydrogeneophilus thermoluteolus, Hydrogenothermus marinus, Hydrogenovibrio marinus, Ideonella sp. O-1, Kyrpidia tusciae, Metallosphaera sedula, Myobacterium gordonae, Nocardia autotrophica, Oligotropha carboxidivorans, Paracoccus denitrificans, Pelomonas saccharophila, Polaromonas hydrogenivorans, Pseudomonas hydrogenovora, Pseudomonas thermophila, Rhizobium japonicum, Rhodococcus opacus, Rhodopseudomonas palustris, Seliberia carboxydohydrogena, Thiocapsa roseopersicina, Variovorax paradoxus, Xanthobacter autrophicus, Xanthobacter flavus, wobei Cupriavidus necator besonders bevorzugt ist, insbesondere aus den Stämmen Cupriavidus necator H16, Cupriavidus necator H1 oder Cupriavidus necator Z-1. Besonders bevorzugt wird der Stamm Cupriavidus necator H 16 PHB-4, DSM 541 eingesetzt.The term "explosive gas bacterium" is to be understood as meaning a bacterium capable of growing chemolithoautotrophically and of building carbon skeletons with more than one C atom from H ₂ and CO ₂ in the presence of oxygen, the oxygen being oxidized and the oxygen being terminal Electron acceptor is used. According to the invention, it is possible to use both bacteria which are naturally oxyhydrogen bacteria, or also bacteria which have been converted into oxyhydrogen bacteria by genetic modification, for example an E. coli cell which has been made capable of recombinant insertion of the necessary enzymes. from H ₂ and CO ₂ in the presence of oxygen to build carbon skeletons with more than one carbon atom, wherein the hydrogen is oxidized and the oxygen is used as a terminal electron acceptor. The oxyhydrogen bacteria used in the process according to the invention are preferably those which already represent oxyhydrogen bacteria as wild-type. Bacteriostatic bacteria preferably used according to the invention are selected from the genera Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Alcaligenes, Anabena, Ancyclobacter, Aquifex, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobium, Cupriavidus, Derxia, Helicobacter, Herbaspirillum, Hydrogenobacter, Hydrogenophaculum, Hydrogenophaga, Hydrogenophilus, Hydrogenothermus, Hydrogenovibrio, Ideonella sp. O1, Kyrpidia, Metallosphaera, Mycobacterium, Nocardia, Oligotropha, Paracoccus, Pelomonas, Polaromonas, Pseudomonas, Pseudonocardia, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Seliberia, Streptomyces, Thiocapsa, Variovorax, Xanthobacter, Wautersia, with Cupriavidus being particularly preferred the species Cupriavidus necator (also known as Ralstonia eutropha, Wautersia eutropha, Alcaligenes eutrophus, Hydomonomonas eutropha), Achromobacter ruhlandii, Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidovorax facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes latus, Anabena cylindrica, Anabena oscillaroides, Anabena sp., Anabena spiroides, Ancyclobacter vacuolatus, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus, Arthrobacter strain 11X, Bacillus schlegelii, Bradyrhizobium japonicum, Derxia gummosa, Escherichia coli, Heliobacter pylori, Herbaspirillum autotrophicum, Hydrogenobacter hydrogenophilus, Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobaculum acidophilum, Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga pseudoflav, Hydrogenophaga taeniospirales, Hydrogeneophilus thermoluteolus, Hydrogenothermus marinus, Hydrogenovibrio marinus, Ideonella sp. O-1, Kyrpidia tusciae, Metallosphaera sedula, Myobacterium gordonae, Nocardia autotrophica, Oligotropha carboxidivorans, Paracoccus denitrificans, Pelomonas saccharophila, Polaromonas hydrogenivorans, Pseudomonas hydrogenovora, Pseudomonas thermophila, Rhizobium japonicum, Rhodococcus opacus, Rhodopseudomonas palustris, Seliberia carboxydohydrogena, Thiocapsa roseopersicina, Variovorax paradoxus, Xanthobacter autrophicus, Xanthobacter flavus, Cupriavidus necator is particularly preferred, in particular from the strains Cupriavidus necator H16, Cupriavidus necator H1 or Cupriavidus necator Z-1. Particular preference is given to using the strain Cupriavidus necator H 16 PHB-4, DSM 541.

Geeignete Verfahren zur Messung der Gelöstsauerstoffkonzentration sind beispielsweise in Suresh et al. (2009) Techniques for oxygen transfer measurement in bioreactors: a review, J Chem Technol Biotechnol, 84, S. 1091–1103 beschrieben. Insbesondere wird die Gelöstsauerstoffkonzentration durch Messung mit einer amperometrischen Gelöstsauerstoffsonde nach dem Clark-Prinzip eingesetzt. Diese Sonde wird unter Prozessbedingungen bei der eingesetzten Sauerstoffkonzentration im Gas auf 100% pO₂ und unter Stickstoff auf 0% O₂ kalibriert. Die gemessenen pO₂-Werte sind direkt proportional zur jeweiligen Gelöstsauerstoffkonzentration im Medium. Die gemessenen pO₂-Werte werden über die entsprechende Henry-Konstante in die jeweilige Gelöstsauerstoffkonzentration umgerechnet. Henry-Konstanten für Gelöstgase finden sich in Wilhelm et al. (1977) Lowpressure solubility of gases in liquid water (77), S. 219–262 .Suitable methods for measuring the dissolved oxygen concentration are, for example, in Suresh et al. (2009) Techniques for oxygen transfer measurement in bioreactors: a review, J Chem Technol Biotechnol, 84, pp. 1091-1103 described. In particular, the dissolved oxygen concentration is used by measurement with an amperometric dissolved oxygen probe according to the Clark principle. This probe is calibrated under process conditions at the oxygen concentration used in the gas to 100% pO ₂ and under nitrogen to 0% O ₂ . The measured pO ₂ values are directly proportional to the respective dissolved oxygen concentration in the medium. The measured pO ₂ values are converted into the respective dissolved oxygen concentration via the corresponding Henry constant. Henry's constants for dissolved gases can be found in Wilhelm et al. (1977) Lowpressure solubility of gases in liquid water (77), pp. 219-262 ,

Die Menge an gelöstem Sauerstoff in einem wässrigen Medium ist abhängig von vielen Faktoren, wie beispielsweise Druck, Temperatur und Sauerstoffkonzentration des an das Medium angrenzenden Gases. Der Fachmann kann somit durch gezielte Veränderung dieser Parameter direkten Einfluss auf die Gelöstsauerstoffkonzentration nehmen. In einem Fermenter lässt sich die Gelöstsauerstoffkonzentration beispielsweise durch die Fermentergeometrie, die Art des Rührwerkes, die Rührerdrehzahl und die Art des Sauerstoffeintrages regulieren. Die Gelöstsauerstoffkonzentration lässt sich durch den Einsatz beispielsweise oben genannter Sonden in Echtzeit verfolgen.The amount of dissolved oxygen in an aqueous medium is dependent on many factors, such as pressure, temperature, and oxygen concentration of the gas adjacent to the medium. The skilled person can thus take direct influence on the dissolved oxygen concentration by targeted modification of these parameters. In a fermenter, the dissolved oxygen concentration can be regulated, for example, by the fermenter geometry, the type of stirrer, the stirrer speed and the type of oxygen input. The dissolved oxygen concentration can be monitored in real time by using, for example, the above-mentioned probes.

Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Knallgasbakterium, derart gentechnisch verändert wurde, dass es verglichen zu seinem Wildtyp eine verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese aufweist. Unter einem „Wildtyp“ einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp“ fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind. Unter dem Begriff „verglichen zum Wildtyp verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese“ im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist zu verstehen, dass die betrachteten Zellen, wenn unter gleichen Bedingungen kultiviert wie der Wildtyp, weniger Polyhdroxyalkanoat pro Zellen bilden als der Wildtyp. Die erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzten Knallgasbakterien weisen aufgrund von mindestens einer gentechnischen Veränderung eine verglichen zu ihrem Wildtyp verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese auf. In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die erfindungsgemäß eingesetzten Knallgasbakterien keine nachweisbaren Mengen an Polyhydroxyalkanoat synthetisieren. Bevorzugt ist das Polyhydroxyalkanoat, dessen Synthese vermindert ist, Polyhydroxybutyrat. Die verglichen zum Wildtyp verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese lässt sich bevorzugt durch eine gentechnische Veränderung erreichen, so dass die verglichen zum Wildtyp der Zelle verminderte Aktivität mindestens eines Enzyms, welches die Umsetzung von 3-Hydroxyalkanyl-Coenzym A zu Polyhydroxyalkanoat, bevorzugt von 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu Polyhydroxybutyrat katalysiert. Unter der verwendeten Formulierung „verminderte Aktivität eines Enzyms“ wird dementsprechend vorzugsweise eine um einen Faktor von mindestens 0,5, besonders bevorzugt von mindestens 0,1, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 0,01, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 0,001 und am meisten bevorzugt von mindestens 0,0001 verminderte Aktivität verstanden. Die Formulierung „verminderte Aktivität“ beinhaltet auch keine detektierbare Aktivität („Aktivität von null“). Die Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte Mutation oder durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms erfolgen. Verfahren zur Verminderung von enzymatischen Aktivitäten in Mikroorganismen sind dem Fachmann bekannt, diese umfassen Insertion von Fremd-DNA in das Gen kodierend für das Zielenzym, Deletion mindestens von Teilen des Gens kodierend für das Zielenzym, Punktmutationen in der Gensequenz kodierend für das Zielenzym, RNA-Interferenz (siRNA), antisense-RNA oder Modifikation (Insertion, Deletion oder Punktmutationen) von regulatorischen Sequenzen, wie etwa Promotoren und Terminatoren oder von Ribosomenbindestellen, welche das Gen kodierend für das Zielenzym flankieren. Unter Fremd-DNA ist in diesem Zusammenhang jegliche DNA-Sequenz zu verstehen, die dem Gen (und nicht dem Organismus) „fremd“ ist, d.h. auch endogene DNA-Sequenzen können in diesem Zusammenhang als „Fremd-DNA“ fungieren. Bei dem Enzym, welches die Umsetzung von 3-Hydroxyalkanyl-Coenzym A zu Polyhydroxyalkanoat handelt es sich vorzugsweise um eine Polyhydroxyalkanoat Synthase, besonders bevorzugt um eine Polyhydroxybutyrat Synthase. Dieses Enzym wird insbesondere vorzugsweise von den Genen phbC oder phaC kodiert, wobei phaC besonders bevorzugt ist.A method preferred according to the invention is characterized in that the oxyhydrogen bacterium has been genetically engineered such that it has a reduced polyhydroxyalkanoate synthesis compared to its wild type. A "wild type" of a cell is preferably referred to as a cell whose genome is in a state as naturally evolved. The term is used for both the entire cell and for individual genes. The term "wild-type" therefore does not include, in particular, those cells or genes whose gene sequences have been altered at least in part by humans by means of recombinant methods. By the term "reduced polyhydroxyalkanoate synthesis compared to wild-type" in the context of the present invention is meant that the cultured cells, when cultured under the same conditions as the wild-type, produce less polyhydroxyalkanoate per cell than the wild-type. The oxyhydrogen bacteria preferably used according to the invention have, due to at least one genetic modification, a polyhydroxyalkanoate synthesis reduced compared to their wild-type. In this connection, it is particularly preferred that the oxyhydrogen bacteria used according to the invention do not synthesize detectable amounts of polyhydroxyalkanoate. Preferably, the polyhydroxyalkanoate whose synthesis is reduced, polyhydroxybutyrate. The reduced compared to the wild type polyhydroxyalkanoate synthesis can preferably be achieved by a genetic modification, so that compared to the wild-type cell reduced activity of at least one enzyme, which is the conversion of 3-hydroxyalkanyl coenzyme A to polyhydroxyalkanoate, preferably 3-hydroxybutyryl Coenzyme A catalyses to polyhydroxybutyrate. Accordingly, the term "reduced activity of an enzyme" used is preferably selected by a factor of at least 0.5, more preferably of at least 0.1, moreover of at least 0.01, more preferably still more preferably at least 0.001, and most preferably at least 0.0001 decreased activity. The phrase "decreased activity" also does not include any detectable activity ("zero activity"). The reduction of the activity of a specific enzyme can be carried out, for example, by targeted mutation or by other measures known to those skilled in the art for reducing the activity of a particular enzyme. Methods for reducing enzymatic activities in microorganisms are known to the person skilled in the art, these include insertion of foreign DNA into the gene coding for the target enzyme, deletion of at least parts of the gene coding for the target enzyme, point mutations in the gene sequence coding for the target enzyme, RNA Interference (siRNA), antisense RNA or modification (insertion, deletion or point mutations) of regulatory sequences such as promoters and terminators or ribosome binding sites flanking the gene encoding the target enzyme. In this context, foreign DNA is to be understood as any DNA sequence which is "foreign" to the gene (and not to the organism), ie endogenous DNA sequences may also function as "foreign DNA" in this context. The enzyme which is the reaction of 3-hydroxyalkanyl-coenzyme A to polyhydroxyalkanoate is preferably a polyhydroxyalkanoate synthase, more preferably a polyhydroxybutyrate synthase. In particular, this enzyme is preferably encoded by the genes phbC or phaC, with phaC being particularly preferred.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Medium mit einem Gas enthaltend H₂, CO₂ und O₂ in Kontakt gebracht. Hierdurch wird dem Knallgasbakterium das H₂, CO₂ und O₂ enthaltende Gas als Kohlenstoffquelle bereitgestellt. Das Knallgasbakterium synthetisiert mindestens teilweise aus dieser Kohlenstoffquelle Acetoacetyl-CoA, welches zu weiteren organischen Verbindungen verstoffwechselt werden kann. Anders als in einem acetogenen Verfahrensprozess, der unter streng anaeroben Bedingungen stattfindet, wird der hier beschriebene Verfahrensschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Bevorzugt beträgt der Partialdruck des Wasserstoffes in dem H₂, CO₂ und O₂ enthaltenden Gas 0,1 bis 100 bar, bevorzugt 0,2 bis 10 bar, besonders bevorzugt 0,5 bis 4 bar. Der Partialdruck des Kohlendioxids in dem H₂, CO₂ und O₂ enthaltenden Gas beträgt bevorzugt 0,03 bis 100 bar, besonders bevorzugt 0,05 bis 1 bar, insbesondere 0,05 bis 0,3 bar Der Partialdruck des Sauerstoffs in dem H₂, CO₂ und O₂ enthaltenden Gas beträgt bevorzugt 0,04 bis 100 bar, besonders bevorzugt 0,04 bis 1 bar, insbesondere 0,04 bis 0,5 barIn the method according to the invention, the medium is brought into contact with a gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ . As a result, the H ₂ , CO ₂ and O ₂ -containing gas is provided as a carbon source to the oxyhydrogen gas bacterium. The oxyhydrogen bacterium synthesizes at least partially from this carbon source acetoacetyl-CoA, which can be metabolized to other organic compounds. Unlike in an acetogenic process process, which takes place under strictly anaerobic conditions, the process step of the process according to the invention described here is carried out under aerobic conditions. The partial pressure of the hydrogen in the gas containing H ₂ , CO ₂ and O _{2 is} preferably 0.1 to 100 bar, preferably 0.2 to 10 bar, particularly preferably 0.5 to 4 bar. The partial pressure of the carbon dioxide in the gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ is preferably 0.03 to 100 bar, particularly preferably 0.05 to 1 bar, in particular 0.05 to 0.3 bar. The partial pressure of the oxygen in the H ₂ , CO ₂ and O ₂ -containing gas is preferably 0.04 to 100 bar, more preferably 0.04 to 1 bar, in particular 0.04 to 0.5 bar

Als Quelle für das H₂ und CO₂ ist insbesondere Synthesegas geeignet, welches mit Sauerstoff versetzt eingesetzt wird; daher ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass das Gas enthaltend H₂, CO₂ und O₂ Synthesegas enthält. Synthesegas kann z. B. aus dem Nebenprodukt der Kohlevergasung bereitgestellt werden. Das Knallgasbakterium wandelt folglich eine Substanz, die ein Abfallprodukt ist, in einen wertvollen Rohstoff um. Alternativ kann Synthesegas durch die Vergasung von weit verfügbaren, preiswerten landwirtschaftlichen Rohstoffen für das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellt werden. Es gibt zahlreiche Beispiele an Rohstoffen, die in Synthesegas umgewandelt werden können, da fast alle Vegetationsformen zu diesem Zwecke genutzt werden können. Bevorzugte Rohstoffe sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend perennierende Gräser wie Chinaschilf, Getreiderückstände, Verarbeitungsabfälle wie Sägemehl. Im Allgemeinen wird Synthesegas in einer Vergasungsapparatur aus getrockneter Biomasse gewonnen, hauptsächlich durch Pyrolyse, partielle Oxidation und Dampfreformierung, wobei die Primärprodukte CO, H₂ und CO₂ sind. Normalerweise wird ein Teil des Produktgases aufbereitet, um Produkterträge zu optimieren und Teerbildung zu vermeiden. Das Cracken des unerwünschten Teers in Synthesegas und CO kann unter Einsatz von Kalk und/oder Dolomit durchgeführt werden. Diese Prozesse werden im Detail in z. B. Reed, 1981 beschrieben ( Reed, T. B., 1981, Biomass gasification: principles and technology, Noves Data Corporation, Park Ridge, NJ. ) Es können auch Mischungen verschiedener Quellen zur Generierung von Synthesegas eingesetzt werden. Insbesondere ist es bevorzugt, dass der im Synthesegas enthaltene Kohlenstoff mindestens 50 Gew.-%, bevorzugt mindestens 70 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 90 Gew.-% des Kohlenstoffs aller Kohlenstoffquellen, die dem Knallgasbakterium durch das Gas enthaltend H₂, CO₂ und O₂ zur Verfügung stehen, ausmacht, wobei sich die Gewichtsprozente des Kohlestoffs auf die Kohlenstoffatome beziehen. Die restlichen Kohlenstoffquellen können beispielsweise in Form von Kohlenhydraten im wässrigen Medium enthalten sein oder aber auch CO₂ aus einer anderen Quelle als Synthesegas darstellen. Weitere CO₂-Quellen stellen Abgase wie beispielsweise Rauchgas, Erdölraffinerieabgase, durch Hefegärung oder clostridielle Gärung entstandene Gase, Abgase aus der Vergasung zellulosehaltige Materialien oder der Kohlevergasung dar. Diese Abgase müssen nicht notwendigerweise als Nebenerscheinungen anderer Prozesse entstanden sein, sondern können extra für den Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren produziert werden.As a source of the H ₂ and CO ₂ in particular synthesis gas is suitable, which is used mixed with oxygen; therefore, it is preferred in the invention that the gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ contains synthesis gas. Syngas can, for. B. be provided from the by-product of the coal gasification. The oxyhydrogen bacterium thus converts a substance that is a waste product into a valuable raw material. Alternatively, synthesis gas may be provided by the gasification of widely available, inexpensive agricultural raw materials for the process of the present invention. There are many examples of raw materials that can be converted into synthesis gas, since almost all forms of vegetation can be used for this purpose. Preferred raw materials are selected from the group comprising perennial grasses such as miscanthus, cereal residues, processing waste such as sawdust. In general, synthesis gas is recovered in a gasification apparatus from dried biomass, mainly by pyrolysis, partial oxidation and steam reforming, the primary products being CO, H ₂ and CO ₂ . Normally, some of the product gas is treated to optimize product yields and prevent tar formation. The cracking of the undesirable tar in synthesis gas and CO can be carried out using lime and / or dolomite. These processes are described in detail in z. Reed, 1981 ( Reed, TB, 1981, Biomass gasification: principles and technology, Noves Data Corporation, Park Ridge, NJ. ) It is also possible to use mixtures of different sources for the generation of synthesis gas. In particular, it is preferred that the carbon contained in the synthesis gas at least 50 wt .-%, preferably at least 70 wt .-%, particularly preferably at least 90 wt .-% of the carbon of all carbon sources, the explosive gas bacterium by the gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ are available, wherein the weight percent of carbon refers to the carbon atoms. The remaining carbon sources may be contained, for example, in the form of carbohydrates in the aqueous medium or may also be CO ₂ from a source other than synthesis gas. Other sources of CO ₂ are exhaust gases such as flue gas, petroleum refinery emissions, gases resulting from yeast fermentation or clostridial fermentation, gaseous exhaust gases, cellulosic materials or coal gasification. These exhaust gases need not necessarily be by-products of other processes but may be extra for use produced in the process according to the invention.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch insbesondere Generatorgas eingesetzt werden, so dass das Gas enthaltend H₂, CO₂ und O₂ Generatorgas enthältIn particular, generator gas can be used in the method according to the invention, so that the gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ contains generator gas

Zum Erreichen einer hohen Zelldichte in einem kurzen Zeitraum kann es erfindungsgemäß vorteilhaft sein, wenn man zunächst eine größere Menge an Knallgasbakterien mit Hilfe einer Vorkultur anzieht. Somit ist eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dadurch gekennzeichnet, dass es die Verfahrensschritte umfasst

A) Vermehren von Knallgasbakterien in einem Medium bis zu einer Zelldichte X Zellen/Liter und
B) Kultivierung der Knallgasbakterien in einem Medium, wobei das Medium mit einem Gas enthaltend H₂, CO₂ und O₂ in Kontakt gebracht wird, und das Medium eine Gelöstsauerstoffkonzentration von 0,001 mg/L bis 0,5 mg/L, bevorzugt von 0,005 mg/L bis 0,3 mg/L, besonders bevorzugt von 0,01 mg/L bis 0,2 mg/L.

In diesem Fall entspricht Verfahrensschritt B) dem eingangs erläuterten Verfahrensschritt, in dem das Medium mit einem Gas enthaltend H₂, CO₂ und O₂ in Kontakt gebracht wird, und das Medium eine Gelöstsauerstoffkonzentration von 0,001 mg/L bis 0,5 mg/L, bevorzugt von 0,005 mg/L bis 0,3 mg/L, besonders bevorzugt von 0,01 mg/L bis 0,2 mg/L aufweist. In Verfahrensschritt A) kann erfindungsgemäß jegliche Form von Kohlenstoffquelle eingesetzt werden, also auch beispielweise Zucker. Auch die niedrige Gelöstsauerstoffkonzentration ist in Verfahrensschritt A) nicht zwingend vorgeschrieben, erfindungsgemäß bevorzugt ist es gar, die Zellen bezüglich jeglichen Nährstoffes nicht zu limitieren. Die Zelldichte X in Verfahrensschritt A beträgt bevorzugt mindestens 1 × 10⁵, besonders bevorzugt mindestens 1 × 10⁷, insbesondere mindestens 1 × 10⁸ Zellen/ml Gesamtkultur. Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt B) die Zelldichte 2 X Zellen/ml, insbesondere 1,5 X Zellen/ml, besonders bevorzugt 1,2 X Zellen/ml nicht übersteigt. To achieve a high cell density in a short period of time, it may be advantageous according to the invention to first attract a larger quantity of oxyhydrogen bacteria with the aid of a preculture. Thus, a preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that it comprises the method steps

A) Increase pop-up gas bacteria in a medium up to a cell density X cells / liter and
B) culturing the oxyhydrogen bacteria in a medium, wherein the medium is brought into contact with a gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ , and the medium has a dissolved oxygen concentration of 0.001 mg / L to 0.5 mg / L, preferably 0.005 mg / L to 0.3 mg / L, more preferably from 0.01 mg / L to 0.2 mg / L.

In this case, method step B) corresponds to the method step explained in the introduction, in which the medium is brought into contact with a gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ , and the medium has a dissolved oxygen concentration of 0.001 mg / L to 0.5 mg / L , preferably from 0.005 mg / L to 0.3 mg / L, particularly preferably from 0.01 mg / L to 0.2 mg / L. In method step A), any form of carbon source can be used according to the invention, including, for example, sugar. The low dissolved oxygen concentration is not compulsory in process step A). According to the invention, it is even preferable not to limit the cells with respect to any nutrient. The cell density X in method step A is preferably at least 1 × 10 ⁵ , particularly preferably at least 1 × 10 ⁷ , in particular at least 1 × 10 ⁸ cells / ml of total culture. A method preferred according to the invention is characterized in that in method step B) the cell density does not exceed 2 × cells / ml, in particular 1.5 × cells / ml, particularly preferably 1.2 × cells / ml.

Verfahrensschritt B) wird vorteilhaft und somit bevorzugt mindestens über einen Teilzeitbereich hinweg zur Produktproduktion genutzt. Das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellende Zielprodukt ist bevorzugt ausgewählt aus Substanzen umfassend drei oder vier Kohlenstoffatome, insbesondere Butanol, Buten, Propen, Aceton, 2-Hydroxyisobuttersäure und 2-Propanol. Alternativ bevorzugte mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellende Zielprodukte sind ausgewählt aus Substanzen, dessen Bildung über das Zwischenprodukt Acetyl-Coenzym A erfolgt; solche Zielprodukte sind beispielsweise Fettsäuren, Fettsäureester, Fettalkohole, Fettaldehyde sowie substituierte Derivate der vorgenannten Verbindungen, wobei als Substitutionsreste insbesondere Amino-, Hydroxyl- und Keto-Gruppen in Frage kommen, bevorzugt ist in diesem Zusammenhang eine omega-Substitution, insbesondere einer Aminogruppe. Process step B) is used advantageously and thus preferably for at least part of the time range for product production. The target product to be produced by the process according to the invention is preferably selected from substances comprising three or four carbon atoms, in particular butanol, butene, propene, acetone, 2-hydroxyisobutyric acid and 2-propanol. Alternatively preferred target products to be prepared by the method according to the invention are selected from substances whose formation takes place via the intermediate acetyl-coenzyme A; Such target products are, for example, fatty acids, fatty acid esters, fatty alcohols, fatty aldehydes and substituted derivatives of the abovementioned compounds, substitution radicals being in particular amino, hydroxyl and keto groups, preference being given in this context to an omega substitution, in particular an amino group.

Weitere alternativ bevorzugte mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellende Zielprodukte sind ausgewählt aus Substanzen, dessen Bildung über Metabolite des Zitronensäurezyklus, wie z. B. Succinat erfolgt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Verfahrensschritt B) durch die Knallgasbakterien Zielprodukte synthetisiert, dessen Bildung über das Zwischenprodukt 3-Hydroxyalkanyl-CoA, insbesondere 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, erfolgt. Der Begriff „Zwischenprodukt“ definiert in diesem Zusammenhang eine chemische Verbindung, die durch den Einsatz mindestens eines Enzymes auf enzymatischem Weg zu dem gewünschten Produkt umgesetzt werden kann, wobei als „chemische Verbindung“ solche mit oder ohne Coenzym A-Thioester-Funktionalisierung als gleichwertig betrachtet werden sollen und somit die Thioester bildenden bzw. -spaltenden Enzyme nicht mitgezählt werden.Further alternatively preferred to be produced by the process according to the invention target products are selected from substances whose formation on metabolites of the citric acid cycle such. B. succinate occurs. In a preferred embodiment of the process according to the invention, target products are synthesized in process step B) by the oxyhydrogen gas bacteria, the formation of which takes place via the intermediate 3-hydroxyalkanyl-CoA, in particular 3-hydroxybutyryl-coenzyme A. The term "intermediate" in this context defines a chemical compound that can be enzymatically converted to the desired product by the use of at least one enzyme, the "chemical compound" being considered equivalent to those with or without coenzyme A thioester functionalization should be and thus the thioester-forming or -spaltenden enzymes are not counted.

Es kann vorteilhaft sein, wenn die Knallgasbakterien entsprechend des gewünschten Zielproduktes durch genetische Modifikation derart verändert wurden, dass das Zielprodukt verstärkt durch die Knallgasbakterien gebildet wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein bevorzugtes Zielprodukt 2-Hydroxyisobuttersäure. Für dieses Zielprodukt ist es bevorzugt, wenn die im erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte Knallgasbakterien derart gentechnisch verändert wurden, dass sie eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp erhöhte Aktivität des Enzyms E₁ aufweisen, welches die Umsetzung von 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu 2-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A katalysiert. Bei dem Enzym E₁ handelt es sich vorzugsweise um eine Hydroxyl-Isobutyryl-CoA Mutase, um eine Isobutyryl-CoA Mutase (EC 5.4.99.13) oder um eine Methylmalonyl-CoA Mutase (EC 5.4.99.2), jeweils bevorzugt um eine Coenzym B12-abhängige Mutase. Bei dem Enzym E₁ handelt es sich bevorzugt um solche Enzyme, die sich aus den Mikroorganismen Aquincola tertiaricarbonis L108, DSM18028, DSM18512, Methylibium petroleiphilum PM1, Methylibium sp. R8, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029), Nocardioides sp. JS614, Marinobacter algicola DG893, Sinorhizobium medicae WSM419, Roseovarius sp. 217, Pyrococcus furiosus DSM 3638 isolieren lassen, besonders bevorzugt um die in PCT/EP2007/052830 beschriebenen Coenzym B12-abhängigen Mutase, sowie Enzyme, die in mindestens einer ihrer Teilsequenz eine Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz der kleinen bzw. großen Untereinheit der in PCT/EP2007/052830 beschriebenen Mutase (accession number DQ436457.1 und DQ436456.1) von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt mindestens 99% auf Aminosäureebene aufweisen, bestimmt nach dem blastp Algorithmus mit einem expect threshold von 10, einer word size von 3, einer blosum62 Matrix mit gap costs von existence: 11 und extension: 1 und einem conditional compositional score matrix adjustment.It may be advantageous if the oxyhydrogen bacteria were modified by genetic modification according to the desired target product such that the target product is increasingly formed by the oxyhydrogen bacteria. In the context of the present invention, a preferred target product is 2-hydroxyisobutyric acid. For this target product, it is preferred if the oxyhydrogen bacteria used in the process according to the invention have been genetically engineered such that they have an increased activity of the enzyme E ₁ in comparison to their wild type, which inhibits the conversion of 3-hydroxybutyryl-coenzyme A to 2-hydroxyisobutyryl Coenzyme A catalyses. The enzyme E ₁ is preferably a hydroxyl isobutyryl-CoA mutase, an isobutyryl-CoA mutase (EC 5.4.99.13) or a methylmalonyl-CoA mutase (EC 5.4.99.2), in each case preferably a coenzyme B12 dependent mutase. The enzyme E ₁ is preferably those enzymes which are selected from the microorganisms Aquincola tertiaricarbonis L108, DSM18028, DSM18512, Methylibium petroleiphilum PM1, Methylibium sp. R8, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029), Nocardioides sp. JS614, Marinobacter algicola DG893, Sinorhizobium medicae WSM419, Roseovarius sp. 217, Pyrococcus furiosus DSM 3638, most preferably the in PCT / EP2007 / 052830 described coenzyme B12-dependent mutase, as well as enzymes having in at least one of their partial sequence a sequence identity to the amino acid sequence of the small or large subunit of in PCT / EP2007 / 052830 described mutase (accession number DQ436457.1 and DQ436456.1) of at least 60%, preferably of at least 80%, more preferably of at least 95%, most preferably at least 99% at the amino acid level, determined by the blastp Algorithm with an expect threshold of 10, a word size of 3, a blosum62 matrix with gap costs of existence: 11 and extension: 1 and a conditional compositional score matrix adjustment.

Der Begriff „gesteigerte Aktivität eines Enzyms“, wie er vorstehend im Zusammenhang mit dem Enzym E₁ und in den nachfolgenden Ausführungen im Zusammenhang mit den Enzymen E₂ usw. verwendet wird, ist vorzugsweise als gesteigerte intrazelluläre Aktivität zu verstehen. Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivität des Enzyms E₁ als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann. Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet, die Kodonnutzung des Gens verändert, auf verschiedene Art und Weise die Halbwertszeit der mRNA oder des Enzyms erhöht, die Regulation der Expression des Gens modifiziert oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Insbesondere wird somit das für das Enzym E_x kodierende Gen überexpremiert, was zu einer gesteigerten Aktivität durch Überexpresssion führt. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Zellen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder eine Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Promotor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einem extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt. Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999 , die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet. Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1- und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1- oder 2-dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper ( Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989 ) und anschließender optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung ( Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32–39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630–2647 ) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA-Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden ( Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151–2155 ). Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden ( Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989 ). Die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten können nach verschiedenen beschriebenen Methoden ( Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624–5627 ; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277–2284 ; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816–823 ) bestimmt werden. Sofern in den nachfolgenden Ausführungen keine konkreten Methoden zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten Enzyms angegeben werden, erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Enzymaktivität und auch die Bestimmung der Verminderung einer Enzymaktivität vorzugsweise mittels der in Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712–23 (2001) , Lohaus et al., Biospektrum 5 32–39 (1998) , Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630–2647 (1999) und Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151–2155 (2001) beschriebenen Methoden. Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie etwa durch UV-Bestrahlung oder durch mutationsauslösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nukleotidaustausch(e). Durch diese Mutationen werden veränderte Zellen erhalten. Besonders bevorzugte Mutanten von Enzymen sind insbesondere auch solche Enzyme, die nicht mehr oder zumindest im Vergleich zum Wildtyp-Enzym vermindert feedback-inhibierbar sind. Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung der Synthese eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch sogenannte "Enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifiziert. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)) , bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)) , Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)) , bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)) , in EP-A-0 472 869 , im US 4,601,893 , bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991) , bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) , bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)) , in WO-A-96/15246 , bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993) , in JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer ( Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998) ) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Die vorstehend beschriebenen Maßnahmen führen ebenso wie die Mutationen zu gentechnisch veränderten Zellen. Zur Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weitere bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I–III, IRL Press Ltd., Oxford ; Rodriguez, R. L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179–204 , Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3–7 ; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York . Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756–759 (1994) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356–362 (1988) , Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067–1070 (1989) und Tauch et al., FEMS Microbiology Let-ters 123: 343–347 (1994) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines „cross-over“-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens. Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen verwendeten Formulierung „eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E_x“ ist vorzugsweise stets eine um einen Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1.000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms E_x zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemäße Zelle, welche „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E_x“ aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wildtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms E_x aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymaktivität, beispielsweise durch Überexpression, eine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms E_x zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Überexpression“ oder die in den nachfolgenden Ausführungen verwendete Formulierung „Erhöhung der Expression“ auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wildtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Synthese des Enzyms E_x induziert wird.The term "increased activity of an enzyme" as used above in connection with the enzyme E ₁ and in the following statements in connection with the enzymes E ₂ , etc., is preferably to be understood as increased intracellular activity. The following statements on increasing the enzyme activity in cells apply both to the increase in the activity of the enzyme E ₁ and to all the enzymes mentioned below, the activity of which may optionally be increased. In principle, an increase in enzymatic activity can be achieved by increasing the copy number of the gene sequence or gene sequences which code for the enzyme, using a strong promoter, changing the codon usage of the gene, in various ways the half-life of the mRNA or of the enzyme, modifies the regulation of the expression of the gene or uses a gene or allele which codes for a corresponding enzyme with an increased activity and optionally combines these measures. In particular, thus, the gene coding for the enzyme E _x is overexpressed, which leads to an increased activity by overexpression. Genetically modified cells according to the invention are produced, for example, by transformation, transduction, conjugation or a combination of these methods with a vector which contains the desired gene, an allele of this gene or parts thereof and a promoter which enables the expression of the gene. In particular, heterologous expression is achieved by integration of the gene or alleles into the chromosome of the cell or an extrachromosomally replicating vector. An overview of the possibilities for increasing the enzyme activity in cells using the example of pyruvate carboxylase gives DE-A-100 31 999 , which is hereby incorporated by reference, and the disclosure of which relates to the potential for increasing enzyme activity in cells forms part of the disclosure of the present invention. The expression of the above and all of the enzymes or genes mentioned below can be detected in the gel with the aid of 1- and 2-dimensional protein gel separation and subsequent optical identification of the protein concentration with appropriate evaluation software. If the increase in enzyme activity is based solely on an increase in the expression of the corresponding gene, the quantification of the increase in enzyme activity can be determined in a simple manner by comparing the 1- or 2-dimensional protein separations between wild type and genetically modified cell. A common method for preparing the protein gels in coryneform bacteria and for identifying the proteins is that of Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) described procedure. The protein concentration can also be determined by Western blot hybridization with an antibody specific for the protein to be detected ( Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY USA, 1989 ) and subsequent optical evaluation with appropriate software for concentration determination ( Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647 ) to be analyzed. The activity of DNA-binding proteins can be measured by DNA band-shift assays (also called gel retardation) ( Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155 ). The effect of DNA-binding proteins on the expression of other genes can be demonstrated by various well-described methods of the reporter gene assay ( Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY USA, 1989 ). The intracellular enzymatic activities can be determined by various methods described ( Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627 ; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284 ; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823 ). Unless specific methods for the determination of the activity of a particular enzyme are specified in the following, the determination of the increase in the enzyme activity and also the determination of the reduction of an enzyme activity is preferably carried out by means of in Hermann et al., Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001) . Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998) . Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) and Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001) described methods. If the increase in enzyme activity is accomplished by mutation of the endogenous gene, such mutations can be generated either undirected by classical methods, such as by UV irradiation or by mutagenic chemicals, or specifically by genetic engineering methods such as deletion (s), insertion (s) and / or nucleotide exchange (s). These mutations result in altered cells. Particularly preferred mutants of enzymes are, in particular, also those enzymes which are no longer or at least less feedback-inhibitable in comparison with the wild-type enzyme. If the increase in enzyme activity is accomplished by increasing the synthesis of an enzyme, for example, one increases the copy number of the corresponding genes or mutates the promoter and regulatory region or ribosome binding site located upstream of the structural gene. In the same way, expression cassettes act, which are installed upstream of the structural gene. Inducible promoters also make it possible to increase expression at any time. Furthermore, the enzyme gene can be assigned as regulatory sequences but also so-called "enhancers", which have an improved interaction between RNA polymerase and DNA also cause increased gene expression. Measures to extend the lifetime of mRNA also improve expression. Furthermore, by preventing degradation of the enzyme protein, enzyme activity is also enhanced. The genes or gene constructs are either present in plasmids with different copy numbers or are integrated and amplified in the chromosome. Alternatively, overexpression of the genes in question can be achieved by changing the composition of the medium and culture. Instructions for this, the expert finds among others Martin et al. (Bio / Technology 5, 137-146 (1987)) , at Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)) . Tsuchiya and Morinaga (Bio / Technology 6, 428-430 (1988)) , at Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)) , in EP-A-0 472 869 , in the US 4,601,893 , at Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991) , at Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) , at LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) , in WO-A-96/15246 , at Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993) , in JP-A-10-229891 , Jensen and Hammer ( Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998) ) and in well-known textbooks of genetics and molecular biology. The measures described above as well as the mutations lead to genetically modified cells. To increase the expression of the respective genes, episomal plasmids are used, for example. In principle, all embodiments which are available to the person skilled in the art for this purpose are suitable as plasmids or vectors. Such plasmids and vectors may, for. B. the brochures of the companies Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech or Gibco BRL be removed. Further preferred plasmids and vectors can be found in: Glover, DM (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford ; Rodriguez, RL and Denhardt, D.T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204 . Butterworth, Stoneham; Goeddel, DV (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7 ; Sambrook, J .; Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York , The plasmid vector containing the gene to be amplified is then converted by conjugation or transformation into the desired strain. The method of conjugation is for example at Schäfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994) described. Methods for transformation are for example Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988) . Dunican and Shivnan, Bio / Technology 7: 1067-1070 (1989) and Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994). described. After homologous recombination by means of a cross-over event, the resulting strain contains at least two copies of the gene of interest. The expression "an increased activity of an enzyme E _{x, which} is increased in comparison with its wild type, is preferably always a factor greater than or equal to at least 2, particularly preferably at least 10, more preferably at least 100, moreover even more preferably at least 1,000 and most preferably at least 10,000 increased activity of the respective enzyme E _x . Furthermore, the cell according to the invention comprises "an activity of an enzyme E _x increased compared to its wild type, in particular also a cell whose wild type has no or at least no detectable activity of this enzyme E _x and which only after increasing the enzyme activity, for example by overexpression , a detectable activity of this enzyme E _x shows. In this context, the term "overexpression" or the expression "increase in expression" used in the following also encompasses the case that a starting cell, for example a wild-type cell, has no or at least no detectable expression and only by recombinant methods a detectable Synthesis of the enzyme E _{x is} induced.

Es kann weiterhin vorteilhaft sein, wenn die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Knallgasbakterien derart gentechnisch verändert wurden, dass sie eine verglichen zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E₂, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A katalysiert, aufweisen. Bei dem Enzym E₂ handelt es sich vorzugsweise um ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe enthaltend:
eine 3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase (EC 1.1.1.35),
eine Acetoacetyl-Coenzym A Reduktase (EC 1.1.1.36),
eine Long-Chain-3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase ((EC 1.1.1.211) und
eine 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.1.1.157).
Dieses Enzym wird vorzugsweise von den Genen kodiert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus phaB, phbB, fabG, phbN1, phbB2 oder, wobei phaB, phbB besonders bevorzugt sind. Die Nukleotidsequenz dieser Gene können beispielsweise der „Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes“ (KEGG-Datenbank), den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) oder der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) entnommen werden.It may furthermore be advantageous if the oxyhydrogen bacteria used in the process according to the invention have been genetically engineered such that they have an increased activity of an enzyme E ₂ , which catalyzes the conversion of acetoacetyl-coenzyme A to 3-hydroxybutyryl-coenzyme A, compared to its wild-type. exhibit. The enzyme E ₂ is preferably an enzyme selected from the group comprising:
a 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (EC 1.1.1.35),
an acetoacetyl-coenzyme A reductase (EC 1.1.1.36),
a long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase ((EC 1.1.1.211) and
a 3-hydroxybutyryl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.1.1.157).
This enzyme is preferably encoded by the genes selected from the group consisting of phaB, phbB, fabG, phbN1, phbB2 or, with phaB, phbB being particularly preferred. The nucleotide sequence of these genes may be, for example, the "Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG database), the National Library of Biotechnology Information (NCBI) databases of the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) or the nucleotide sequence database of the European Molecular Biology Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany and Cambridge, UK).

Das erfindungsgemäße Verfahren weist bevorzugt einen Verfahrensschritt C) Aufreinigung des Zielproduktes auf.The process according to the invention preferably has a process step C) purification of the target product.

In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll. In the examples given below, the present invention is described by way of example, without the invention, the scope of application of which is apparent from the entire description and the claims, to be limited to the embodiments mentioned in the examples.

Beispiele: Examples:

Beispiel 1 Autotrophe Kultivierung von C. necator bei unterschiedlichen Rührerdrehzahlen im RührkesselreaktorExample 1 Autotrophic cultivation of C. necator at different stirrer speeds in a stirred tank reactor

Im folgenden Beispiel wird der gentechnisch veränderte Stamm C. necator H16 PHB-4 pBBR1MCS-2::hcmA-hcmB(lac) (im Folgenden RITA genannt), der zur Produktion von 2-Hydroxyisobuttersäure (2HIB) eingesetzt wird, autotroph kultiviert. Es wurde ein definiertes Medium eingesetzt, bestehend aus 9 g/l Na₂HPO₄ × 12H₂O, 1,5 g/l KH₂PO₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,2 g/l MgSO₄, 0,2 g/l CaCl₂, 6 mg/l FeCl₃, 0,1 mg/l ZnSO₄ × 7H₂O, 0,03 mg/l MnCl₂ × 4H₂O, 0,3 mg/l H₃BO₃, 0,2 mg/l CoCl₂ × 6H2O, 0,01 mg/l CuCl₂ × 2H₂O, 0,02 mg/l NiCl₂ × 6H₂O und 0,03 mg/l Na₂MO4 × 2H₂O.In the following example, the engineered strain C. necator H16 PHB-4 pBBR1MCS-2 :: hcmA-hcmB (lac) (hereinafter called RITA), which is used for the production of 2-hydroxyisobutyric acid (2HIB), is cultured autotrophically. A defined medium was used, consisting of 9 g / l Na ₂ HPO ₄ × 12H ₂ O, 1.5 g / l KH ₂ PO ₄ , 1 g / l NH ₄ Cl, 0.2 g / l MgSO ₄ , 0.2 g / l CaCl ₂ , 6 mg / l FeCl ₃ , 0.1 mg / l ZnSO ₄ × 7H ₂ O, 0.03 mg / l MnCl ₂ × 4H ₂ O, 0.3 mg / l H ₃ BO ₃ , 0.2 mg / L CoCl ₂ × 6H ₂ O, 0.01 mg / L CuCl ₂ × 2H ₂ O, 0.02 mg / L NiCl ₂ × 6H ₂ O and 0.03 mg / L Na ₂ MO 4 × 2H ₂ O.

Es wurden zwei identische autotrophe Kultivierungen in Biostat B 2L-Rührkeselreaktoren von Sartorius gefüllt mit 1L Medium durchgeführt, einmal bei 1000 min^–1 und einmal ohne Rühren. Der Gaseintrag ins Medium erfolgte durch einen Begasungsfritte mit einer Porengröße von 20 µm, die zentral unter der Rührwelle der Reaktoren angebracht war. Die Kultivierungen erfolgten bei 28 °C ohne Kontrolle des pH. Begast wurden die Reaktoren mit einem vorgemischtem, nicht-explosiven Gasgemisch der Zusammensetzung H₂ 90 %, CO₂ 6 %, O₂ 4 % bei Atmosphärendruck mit einer Begasungsrate von 0,25 vvm. Bei Versuchsstart wurde der Reaktor mit 2 Kolonien von einer Agarplatte (300 mg/L Kanamycin) angeimpft. Bei Probenahme wurden jeweils 10 ml Probe entnommen zur Bestimmungvon OD₆₀₀, Biotrockenmasse und des Produktspektrums. Die Bestimmung der Produktkonzentration erfolgte mittels quantitativer ¹H-NMR-Spektroskopie. Als interner Quantifizierungsstandard diente Trimethylpropionsäure.There were in Biostat B 2L Rührkeselreaktoren Sartorius filled with 1L medium performed two identical autotrophic cultivations, even at 1000 min ^-1 and once without stirring. The gas was introduced into the medium through a gassing frit with a pore size of 20 microns, which was mounted centrally under the stirrer shaft of the reactors. The cultivations were carried out at 28 ° C without pH control. The reactors were fumigated with a premixed, non-explosive gas mixture of composition H ₂ 90%, CO ₂ 6%, O ₂ 4% at atmospheric pressure with a gassing rate of 0.25 vvm. At the start of the experiment, the reactor was inoculated with 2 colonies from an agar plate (300 mg / L kanamycin). On sampling, 10 ml of each sample was taken to determine OD ₆₀₀ , dry biomass and product spectrum. The product concentration was determined by quantitative ¹ H NMR spectroscopy. The internal quantification standard was trimethylpropionic acid.

Es wurde festgestellt, dass in der Kultivierung ohne Rühren die Geschwindigkeit des Wachstums deutlich reduziert war gegenüber der Kultivierung mit 1000 min^–1. Im Vergleich wurde jedoch keine Bildung der Nebenprodukte Acetat, Pyruvat, 3-Methyl-Butyrat und iso-Butyrat festgestellt. Versuch 1 (ohne Rühren) Produktbildung NMR-Analytik

Versuch 2 (bei 1000 rpm gerührt) Produktbildung NMR-Analytik

It was found that in the cultivation without stirring the rate of growth was significantly reduced compared to the cultivation at 1000 min ^-1 . In comparison, however, no formation of the by-products acetate, pyruvate, 3-methyl-butyrate and iso-butyrate was found. Experiment 1 (without stirring) Product formation NMR analysis

Experiment 2 (stirred at 1000 rpm) Product formation NMR analysis

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Claims

A method of cultivating oxyhydrogen bacteria in a medium comprising a step of contacting the medium with a gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ and the medium having a dissolved oxygen concentration of 0.001 mg / L to 0.5 mg / L , preferably from 0.005 mg / L to 0.3 mg / L, particularly preferably from 0.01 mg / L to 0.2 mg / L.

A method according to claim 1, characterized in that the blast gene is selected from the genera Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Alcaligenes, Anabena, Ancyclobacter, Aquifex, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobium, Cupriavidus, Derxia, Helicobacter, Herbaspirillum, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum, Hydrogenophaga, Hydrogenophilus, Hydrogenothermus, Hydrogenovibrio, Ideonella sp. O1, Kyrpidia, Metallosphaera, Mycobacterium, Nocardia, Oligotropha, Paracoccus, Pelomonas, Polaromonas, Pseudomonas, Pseudonocardia, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Seliberia, Streptomyces, Thiocapsa, Variovorax, Xanthobacter, Wautersia, with Cupriavidus being particularly preferred.

Process according to at least one of the preceding claims, characterized in that the gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ contains synthesis gas.

Process according to Claim 3, characterized in that the carbon contained in the synthesis gas contains at least 50% by weight, preferably at least 70% by weight, particularly preferably at least 90% by weight, of the carbon of all carbon sources containing the oxyhydrogen gas by the gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ are available.

A method according to any one of claims 1-4, characterized in that the CO ₂ in process step B) at least 50 wt .-%, preferably at least 70 wt .-%, particularly preferably at least 90 wt .-% of all carbon sources, the explosive gas bacterium in process step B) are available.

Method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ contains generator gas.

Method according to at least one of the preceding claims, characterized in that it comprises the method steps A) propagating oxyhydrogen bacteria in a medium up to a cell density X cells / liter and B) culturing the oxyhydrogen bacteria in a medium, the medium containing a gas containing H ₂ , CO ₂ and O ₂ , and the medium has a dissolved oxygen concentration of from 0.001 mg / L to 0.5 mg / L, preferably from 0.005 mg / L to 0.3 mg / L, most preferably from 0.01 mg / L to 0.2 mg / L.

A method according to claim 7, characterized in that in step B) the cell density does not exceed 2 X cells / ml.

A method according to claim 7 or 8, characterized in that the oxyhydrogen bacteria synthesize in step B) target product.

A method according to claim 9, characterized in that the target product is selected from substances whose formation takes place via the intermediate acetyl-coenzyme A; Such target products are, for example, fatty acids, fatty acid esters, fatty alcohols, fatty aldehydes and substituted derivatives of the abovementioned compounds

A method according to claim 9, characterized in that the target product is selected from substances whose formation on metabolites of the citric acid cycle, such as. B. succinate occurs.

A method according to claim 9, characterized in that the target product is selected from substances comprising three or four carbon atoms, in particular butanol, butene, propene, acetone, 2-hydroxyisobutyric acid and 2-propanol.

A method according to claim 9, characterized in that the oxyhydrogen bacteria in step B) synthesize target product whose formation via the intermediate 3-hydroxyalkanyl-CoA, in particular 3-hydroxybutyryl-coenzyme A, takes place.

A method according to any one of claims 7 to 9, characterized in that the oxyhydrogen bacteria in step B) synthesize 2-hydroxyisobutyric acid and the oxyhydrogen bacteria have been genetically engineered such that they have a compared to their wild type increased activity of the enzyme E ₁ , which Reaction of 3-hydroxybutyryl-coenzyme A catalyzed to 2-hydroxyisobutyryl-coenzyme A.

A method according to claim 14, characterized in that the oxyhydrogen bacteria have been genetically engineered such that they compared to their wild-type increased activity of an enzyme E ₂ , which catalyzes the conversion of acetoacetyl-coenzyme A to 3-hydroxybutyryl-coenzyme A.

A method according to any one of claims 7 to 15, characterized in that it comprises the process step C) purification of the target product.